CN102796727A - 革兰氏阳性细菌核酸提取方法 - Google Patents
革兰氏阳性细菌核酸提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102796727A CN102796727A CN2012101626460A CN201210162646A CN102796727A CN 102796727 A CN102796727 A CN 102796727A CN 2012101626460 A CN2012101626460 A CN 2012101626460A CN 201210162646 A CN201210162646 A CN 201210162646A CN 102796727 A CN102796727 A CN 102796727A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- centrifugal
- extracting solution
- gram positive
- solution
- positive bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种革兰氏阳性细菌核酸提取方法。本发明提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂，由提取液A和提取液B组成；由提取液A和提取液B组成；所述提取液A按照如下方法制备：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A；所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B。本发明的实验证明，本发明提供了一种高效提取革兰氏阳性细菌核酸的方法，操作简单，成本非常低，提取效果好，尤其在提取RNA中效果非常好，已经优于目前被广泛使用的市售试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种革兰氏阳性细菌核酸提取方法。
背景技术
细菌是引发大多数感染性疾病的病原体，引起临床细菌感染的致病菌均分为革兰氏阳性菌和阴性菌二大类。目前为止，在人类感染的细菌谱中虽然革兰氏阴性菌仍占有主要地位，但是革兰氏阳性菌的感染率却有着逐年增加的趋势，现已可占到全部细菌感染的30-40%，其中95%为凝固酶阴性葡糖球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌。无论是用于致病微生物检测的分子诊断技术，还是用于细菌分子生物学研究的转录组研究技术，其第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸（包括RNA和DNA）的提取，这直接影响着这些检测技术的结果。
众所周知，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁等结构有着很大的差别，革兰氏阳性菌由于细胞壁比较难以破裂，因此在其核酸提取（尤其是RNA）方面，效果一直不很理想。目前革兰氏阳性菌的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用的破壁方法主要包括：超声研磨，加入表面活性剂或变性剂，以及一些提取试剂盒等。目前被广泛采用的市场销售的细菌RNA提取试剂盒产品是Invitrogen公司的RiboPureTM-Bacteria试剂盒和QIAGEN公司的PureLinkTM RNA Mini试剂盒等。这些试剂盒的价格昂贵，操作步骤繁琐，并且提取效果也并不理想。因此，如何从各种革兰氏阳性菌中高效、快捷的提取核酸，已成为了目前分子诊断技术和转录组研究等技术推广和应用的一个瓶颈。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂。
本发明提供的试剂，由提取液A和提取液B组成；
所述提取液A按照如下方法制备：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tri s在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.05%-0.2%（体积百分含量）；所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1-0.5%（体积百分含量）；
所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为（99-98）∶1∶1。
所述提取液A和所述提取液B均为独立包装；
所述提取液A的pH值为7.2-7.8，所述提取液A的pH值具体为7.5；
所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7.5。
所述提取液A中，所述Tri s在所述提取液A中的浓度为10mM；
所述EDTA在所述提取液A中的浓度为10mM；
所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.1%；
所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1%；
所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98∶1∶1。
本发明的第二个目的是提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
先将所述的试剂中的所述提取液A与革兰氏阳性细菌混匀，再加入所述的试剂中的所述提取液B，混合，反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。
所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比为1μg-5g∶400μl∶400μl，所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比具体为5mg∶400μl∶400μl。
所述反应时间为12-18min；所述反应时间具体为15min；
所述反应温度为60-70℃；所述反应温度具体为65℃。
所述离心的温度为0-4℃；所述离心的温度具体为4℃；
所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；
所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10cm。
在所述反应后和所述离心前，还包括如下步骤：将所述反应液静置的步骤；所述静置温度为0-4℃，所述静置时间为2-5分钟；所述静置温度具体为0℃，所述静置时间具体为5分钟。
所述混合的方式采用震荡混匀，所述混合的时间为10-15分钟；所述混合的时间具体为15分钟。
在所述离心收集上层水相的步骤后，还包括将所述上层水相与氯仿混匀，得到混合液，离心收集上清液，得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。
所述上层水相与所述氯仿的体积比为1∶（0.8-1.5），所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为1∶1。
所述离心的温度为0-4℃；所述离心的温度具体为4℃；
所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；
所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10cm。
本发明的第三个目的是提供一种革兰氏阳性细菌RNA的提取试剂。
本发明提供的试剂，由所述试剂、结合液和洗涤液组成；
所述结合液为浓度为4.6M的异硫氰酸胍水溶液；
所述洗涤液为70%（体积百分含量）乙醇水溶液。
所述结合液和所述洗涤液的溶剂均为DEPC水。
所述试剂、所述结合液和洗涤液均为独立包装。
本发明的第三个目的是提供一种革兰氏阳性细菌RNA的提取方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）将所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述试剂中的所述结合液和无水乙醇混匀，得到混合液；
2）将步骤1）得到的混合液过柱纯化，用所述试剂中的洗涤液洗脱、收集洗脱液，即得到RNA。
步骤1）中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述结合液和所述无水乙醇的体积比为1∶3∶3；
步骤2）中，所述过柱纯化包括如下步骤：
A、将所述步骤1）得到的混合液转移到结合柱中，离心；
B、向步骤A得到的结合柱中加入所述试剂中的所述洗涤液，离心；
C、向步骤B得到的结合柱再次加入所述洗涤液，离心；
D、向步骤D得到的结合柱中加入DEPC水，离心、收集洗脱液，得到RNA。
步骤2）A、B、C中，所述离心的离心力均为7500-8000g，离心时间均为25-30秒，离心温度均为23-25℃；
步骤2）D中，所述静置时间为2-5分钟，所述静置温度为23-25℃；
步骤2）E中，所述离心力为7500-8000g，所述离心时间为1-1.5分钟。
步骤2）A、B、C中，所述离心的离心力均为8000g，离心时间均为30秒，离心温度均为25℃；
步骤2）D中，所述静置时间为2、3或5分钟，所述静置温度为25℃；
步骤2）E中，所述离心力为8000g，所述离心时间为1分钟。
本发明第四个目的是提供一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的提取方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）将所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液加入RNase A消化，得到消化后溶液；
2）、将步骤1）得到的消化后溶液沉淀DNA，得到基因组DNA。
步骤1）中，所述消化温度为37℃，所述消化时间为30分钟。
本发明的第五个目的是提供一种革兰氏阳性细菌基因组DNA和RNA的提取方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）将所述的方法得到的去除细胞成分的核酸提取液、浓度为3M、pH值为5.2的NaAC水溶液、无水乙醇混匀，得到混合液，
2）将步骤1）得到的混合液离心收集沉淀、75%的乙醇洗涤，得到基因组DNA和总RNA混合物。
步骤1）中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述浓度为3M、pH值为5.2的NaAC水溶液、所述无水乙醇的体积比为1∶0.1∶2.5。
步骤2）中，所述离心的转速为12000rpm，离心半径为10cm，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为15分钟。
步骤1）中，所述浓度为3M、pH值为5.2的NaAC水溶液的溶剂为DEPC水。
在步骤1）后和步骤2）前还包括如下步骤：将所述混合液静置的步骤；
所述静置的时间为30分钟，所述静置的温度为-20℃。
所述革兰氏阳性细菌为耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）或金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。
所述的试剂或所述的方法或所述的试剂或所述的方法在鉴定革兰氏阳性细菌和/或检测革兰氏阳性细菌的基因转录中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明提供了一种高效提取革兰氏阳性细菌核酸的方法，能够同时提取革兰氏阳性细菌的RNA和基因组DNA，或者选择性提取RNA或基因组DNA，其主要特定是操作简单，成本非常低，提取效果好，尤其在提取RNA中效果非常好，已经优于目前被广泛使用的市售试剂盒。
附图说明
图1为耻垢分枝杆菌提取的核酸的甲醛变性胶电泳图
图2为耻垢分枝杆菌提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳
图3为金黄色葡萄球菌提取的核酸的甲醛变性胶电泳图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用的试剂如：
提取液A按照如下方法制备：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为10mM；所述EDTA在所述提取液A中的浓度为10mM；所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.1%（体积百分含量）；所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1%（体积百分含量）；
提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为98∶1∶1。
提取液A的pH值具体为7.5；提取液B的pH值具体为7.5。
实施例1、分枝杆菌的核酸提取
分枝杆菌是一类典型的革兰氏阳性菌，其中包含多种高危害的致病菌，例如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等，该类细菌的核酸提取在病原体分子诊断中具有重要意义。选取危险度较低的耻垢分枝杆菌作为模型，验证本发明所述的核酸提取方法在革兰氏阳性菌—耻垢分枝杆菌中的核酸提取效果。
菌株：耻垢分枝杆菌（拉丁名Mycobacterium smegmatis、菌株购自美国ATCC，菌株号19420，）
试剂：提取液A，提取液B，氯仿，无水乙醇，75%乙醇，RNase A（7000units/ml），结合柱（购自MN公司，产品目录号740903），结合液（浓度为4.6M的异硫氰酸胍水溶液），洗涤液（70%（体积百分含量）乙醇水溶液），pH5.2的3M醋酸钠溶液，DEPC水，灭菌水，甲醛，溴酚蓝，MOPs（出售公司Amresco，产品目录号Amresco M215），TBE buffer（配方0.09mol/L Tris-硼酸0.002mol/L EDTA）
培养基：LB培养基
1、提取核酸
1）耻垢分枝杆菌的培养与保存：
在超净工作台内将耻垢分枝杆菌划线接种于LB（Luria-Bertani Agar Medium）培养基平板以进行复苏，将平板在培养箱中倒置，37℃孵育过夜（12h）。待长出单菌落后，挑取单菌落接种于3mlLB液体培养基中，37℃孵育过夜，将菌液按1mL/管进行分装，-20℃冻存备用。
2）去除革兰氏阳性细菌的细胞壁
A、裂解
取1ml的冻存菌液，融化后装入1.5ml的离心管中，在室温（25℃）条件下12000rpm离心2分钟，用移液枪将上清液吸走。
在5mg离心沉淀物（菌体湿重）中加入400ul的提取液A，用移液枪将沉淀物重悬，使微生物充分混合在提取液A中。然后再混合物中加入400ul的提取液B，在涡旋器上剧烈震荡2分钟，在震荡过程中按紧离心管的盖子，防止菌液混合物漏出。
剧烈震荡结束后，将离心管放置于65℃的震荡仪中，温育1个小时，在此期间每间隔30秒剧烈震荡5秒钟。
将装有裂解液离心管在冰上进行冰浴5分钟（0℃），然后将离心管在4℃的条件下，12000rpm进行离心5分钟。离心结束后，离心管中溶液自然分层，小心将上层水相用移液枪吸出转移至新的1.5ml的离心管中，尽量避免吸入中间的蛋白层和下层有机相溶剂。
B、氯仿抽提：
在吸出的装有水相离心管中加入400ul的氯仿（所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为1∶1），将其在涡旋震荡仪上剧烈震荡，使水相与氯仿充分混匀。将装有混合物的离心管在在4℃的条件下，12000rpm进行离心5分钟。离心结束后，离心管中的溶液自然分层，小心将上层水相用移液枪吸出转移至新的1.5ml的离心管中，尽量避免吸入中间的蛋白层和下层有机相溶剂，得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。
3）选择性提取基因组DNA：
将氯仿抽提得到的溶液（去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液）转移至新的1.5ml的离心管中，加入1ul的RNase A，在37℃的条件下反应30分钟，过柱纯化，得到基因组DNA。
CTAB法提取细菌核酸操作步骤。
a）将菌株接种于液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜。
b）取1.5ml培养物与1.5ml离心管中，12000rpm离心2min，将上清弃掉。
c）向沉淀物中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮。TE缓冲液的配置见下表：
| 组分 | 浓度 |
| Tris-HCl(pH 8.0) | 10mmol/L |
| EDTA(pH 8.0) | 1mmol/L |
d）在悬浮液中再加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，充分震荡混匀，于37℃条件下孵育1h。
e）孵育完成后，在溶液中加入100ul 5mol/L NaCl,充分震荡混匀。
f）再加入80ul CTAB溶液，充分震荡混匀后在65℃条件下孵育10min。CTAB溶液的配置见下表：
| 组分 | 浓度 |
| NaCl | 1.4M |
| CTAB（w/v） | 2％ |
| Tris·Cl | 100mM |
| EDTA | 20mM |
| 巯基乙醇 | 0.2％ |
g）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，充分震荡混匀，4℃，12000rpm离心5min。
h）将上清转入一只新的1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来。
i）4℃，12000rpm离心10min，弃掉上清。
j）沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，4℃，12000rpm离心5min，将乙醇弃掉。
k）将沉淀在室温条件下自然干燥，加入50ul蒸馏水，将沉淀充分溶解，得到基因组DNA。
4）选择性提取总RNA：
将氯仿抽提得到的溶液（去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液）转移至新的1.5ml的离心管中，确定好溶液的体积（约300ul），然后将抽提液与结合液（浓度为4.6M的异硫氰酸胍水溶液）和无水乙醇按照1∶3∶3的比例进行混合（结合液与无水乙醇事先要混合好），将混合液剧烈震荡，使其充分混匀，将其转移至结合柱上。
常温（25℃）条件下8000g离心30秒，离心结束后弃掉装有废液的套管，将结合柱放入新的套管中（结合柱的最大容积为700ul，若混合液的体积大于700ul可分批多次进行过柱）。
在结合柱中加入700ul的洗涤液（70%（体积百分含量）乙醇水溶液），常温条件下8000g离心30秒，离心结束后将套管中的废液弃掉，将结合柱再次放回套管中。
再加入350的洗涤液，常温条件下8000g离心2分钟，尽量除去结合柱中的乙醇残留，避免影响下游实验。
离心结束后，弃掉装有废液的套管，将结合柱放入新的1.5ml的离心管中，在室温（25℃）条件下放置2-5分钟，从而使残存在结合柱中膜中的乙醇挥发完全。在结合柱中加入60ul的DEPC水，常温条件下8000g离心1分钟，从而得到纯的RNA。
采用Ambion RiboPureTM-Bacteria试剂盒（公司名称Invitrogen，产品目录号AM1925）、Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）（公司名称QIAGEN，产品目录号74004）分别提取耻垢分枝杆菌的RNA。
5）同时提取基因组DNA和总RNA：
将氯仿抽提得到的溶液（去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液）转移至新的1.5ml的离心管中，确定好溶液的体积（约300ul），然后加入1/10体积的DEPC水配制的NaAC（3M，pH5.2）以及2.5倍体积的无水乙醇，在-20℃的条件下静置30分钟。
将离心管立刻在4℃的条件下，12000rpm进行离心15分钟，用移液枪将废液全部吸走弃掉，小心避免将离心管底部的核酸吸走。
加入1ml 75%的乙醇冲洗一次（用移液枪反复吹打几次），在4℃的条件下，12000rpm进行离心5分钟。离心结束后，用移液枪将75%的乙醇全部吸走弃掉，小心避免将离心管底部的核酸吸走，从而导致实验失败。
将离心沉淀至于室温晾干，然后加入50-100ul的DEPC水使基因组DNA和RNA充分溶解，但是切忌晾干之前加入DEPC水溶解基因组DNA和RNA，因为残存的乙醇可能会影响后续实验。
2、检测
1）紫外分光光度计定量核酸：
首先分别用溶解核酸的试剂对紫外分光光度计进行调零，调零后取2ul对应的核酸加到紫外分光光度计上，点击测定按钮进行核酸浓度的测定。
结果如表1所示：
表1为耻垢分枝杆菌提取的核酸浓度与260/280和260/230数值
根据分光光度计检测的结果，可以看出，本发明所述的方法在革兰氏阳性菌总RNA提取效率方面要显著优于目前被广泛使用的市售试剂盒Ambion RiboPureTM-Bacteria试剂盒和Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）。并且，在采用本发明所述方法同时提取的基因组DNA和总RNA中，基因组DNA和总RNA的量大约各占一半。
2）甲醛变性胶电泳检测提取的核酸：
A、甲醛变性胶的配置：
称0.4克琼脂糖，加入30ml TBE buffer中，微波炉融化，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至约50-60℃，再加入600ul甲醛，倒入7.5×5.0cm的凝胶模具中。插入合适长度和宽度的梳子，室温（25℃）放置约30min后即可使用。
B、电泳检测提取的核酸：
取0.3u g提取的核酸，加入3ul的加样缓冲液，65℃加热5min，冰上骤冷，以消除RNA的二级结构。建议上样前在加样缓冲液中加入的溴化乙锭（EtBr，浓度1.0mg/mL），而不在胶中加EtBr，这样电泳后的背景较低。
配好的1.3%的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中电泳15min。
结果如图1所示，1泳道为采用本发明所述方法同时提取基因组DNA和总RNA后的产物，2泳道为采用本发明所述方法选择性提取总RNA后的提取产物，3泳道为Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）提取产物，4泳道为Ambion RiboPureTM-Bacteria试剂盒提取产物，根据提取后的核酸电泳图，可以看出利用本发明所述的方法提取的基因组DNA与总RNA的条带清晰，未发生降解现象，说明该方法提取效果良好。并且，电泳结果也清晰地显示出本发明所述的方法在革兰氏阳性菌总RNA提取效率方面要显著优于目前被广泛使用的市售试剂盒Ambion RiboPureTM-Bacteria试剂盒和Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）。
采用本发明所述方法提取基因组DNA进行琼脂糖电泳，结果如图2所示，1泳道为Marker，2泳道为选择性提取基因组DNA产物的电泳，从这张图中可以看出，利用本发明所述的方法提取的基因组DNA的条带清晰，未发生降解现象，说明该方法可以用来选择性提取基因组DNA，并且提取效果良好。
实施例2、金黄色葡萄球菌的核酸提取
目前为止，在人类细菌感染病例中革兰氏阳性菌的感染率现已可占到全部细菌感染的30-40%，其中金黄色葡萄球菌为主要病原体之一。因此金黄色葡萄球菌是一种极具代表性的革兰氏阳性菌病原体。本实验的目的是验证本发明所述方法在革兰氏阳性菌—金黄色葡萄球菌中的核酸提取效果。
菌株：金黄色葡糖球菌（拉丁名Staphyloccocus aureus、菌株号ATCC25923。）
试剂：提取液A，提取液B，氯仿，无水乙醇，75%乙醇，RNase A，纯化柱，洗涤液，3M，pH5.2NaAC，DEPC水，灭菌水，甲醛，溴酚蓝，MOPs，TBE buffer
培养基：脑心浸出液（BHI）（出售公司OXOID，产品目录号CM1135）
1、提取核酸
1）金黄色葡萄球菌的培养：
在超净工作台内将金黄色葡糖球菌划线接种于血平板上进行复苏，将平板在培养箱中倒置，37℃孵育过夜。
2）核酸的提取和纯化：
方法与实施例1相同，得到基因组DNA、总RNA、基因组DNA和总RNA混合物。
采用Ambion RiboPureTM-Bacteria试剂盒（公司名称Invitrogen，产品目录号AM1925）、Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）（公司名称QIAGEN，产品目录号74004）分别提取耻垢分枝杆菌的RNA。
2、检测
1）紫外分光光度计对核酸定量检测，方法与实施例1相同，结果如表2所示：
表2为金黄色葡萄球菌提取的核酸浓度与260/280和260/230数值
根据分光光度计检测的结果，可以看出，本发明所述的方法在革兰氏阳性菌总RNA提取效率方面要显著优于目前被广泛使用的市售试剂盒Ambion RiboPureTM-Bacteria试剂盒和Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）。并且，在采用本发明所述方法同时提取的基因组DNA和总RNA中，基因组DNA和总RNA的量大约各占一半。
2）甲醛变性胶电泳检测提取的核酸：
方法与实施例1相同，结果如图3所示，1泳道为采用本发明所述方法同时提取基因组DNA和总RNA后的产物，2泳道为采用本发明所述方法选择性提取总RNA后的提取产物，3泳道为Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）提取产物，4泳道为Ambion RiboPureTM-Bacteria试剂盒提取产物，根据提取后的核酸电泳图，可以看出利用本发明所述的方法提取的基因组DNA与总RNA的条带清晰，未发生降解现象，说明该方法提取效果良好。并且，电泳结果也清晰地显示出本发明所述的方法在革兰氏阳性菌总RNA提取效率方面要显著优于目前被广泛使用的市售试剂盒AmbionRiboPureTM-Bacteria试剂盒和Qiagen RNeasy Micro试剂盒（溶菌酶破胞）。
Claims (27)
1.一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂，由提取液A和提取液B组成；
所述提取液A按照如下方法制备：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.05%-0.2%（体积百分含量）；所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1-0.5%（体积百分含量）；
所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为（99-98）∶1∶1。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：
所述提取液A和所述提取液B均为独立包装；
所述提取液A的pH值为7.2-7.8，所述提取液A的pH值具体为7.5；
所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7.5。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：
所述提取液A中，所述Tris在所述提取液A中的浓度为10mM；
所述EDTA在所述提取液A中的浓度为10mM；
所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.1%；
所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1%；
所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98∶1∶1。
4.一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的方法，包括如下步骤：
先将权利要求1-3中任一所述的试剂中的所述提取液A与革兰氏阳性细菌混匀，再加入权利要求1-3中任一所述的试剂中的所述提取液B，混合，反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比为1μg-5g∶400μl∶400μl，所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比具体为5mg∶400μl∶400μl。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述反应时间为12-18min；所述反应时间具体为15min；
所述反应温度为60-70℃；所述反应温度具体为65℃。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述离心的温度为0-4℃；所述离心的温度具体为4℃；
所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；
所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10cm。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述反应后和所述离心前，还包括如下步骤：将所述反应液静置的步骤；所述静置温度为0-4℃，所述静置时间为2-5分钟；所述静置温度具体为0℃，所述静置时间具体为5分钟。
9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于：所述混合的方式采用震荡混匀，所述混合的时间为10-15分钟；所述混合的时间具体为15分钟。
10.根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于：在所述离心收集上层水相的步骤后，还包括将所述上层水相与氯仿混匀，得到混合液，离心收集上清液，得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。
11.根据权利要求4-10中任一所述的方法，其特征在于：
所述上层水相与所述氯仿的体积比为1∶（0.8-1.5），所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为1∶1。
12.根据权利要求4-11中任一所述的方法，其特征在于：
所述离心的温度为0-4℃；所述离心的温度具体为4℃；
所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；
所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10cm。
13.一种革兰氏阳性细菌RNA的提取试剂，由权利要求1-3中任一所述试剂、结合液和洗涤液组成；
所述结合液为浓度为4.6M的异硫氰酸胍水溶液；
所述洗涤液为70%（体积百分含量）乙醇水溶液。
14.根据权利要求13所述的试剂，其特征在于：
所述结合液和所述洗涤液的溶剂均为DEPC水。
15.根据权利要求13或14所述的试剂，其特征在于：所述权利要求1-4中任一所述试剂、所述结合液和洗涤液均为独立包装。
16.一种革兰氏阳性细菌RNA的提取方法，包括如下步骤：
1）将权利要求4-12中任一所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、权利要求13-15中任一所述试剂中的所述结合液和无水乙醇混匀，得到混合液；
2）将步骤1）得到的混合液过柱纯化，用权利要求13-15中任一所述试剂中的洗涤液洗脱、收集洗脱液，即得到RNA。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述结合液和所述无水乙醇的体积比为1∶3∶3；
步骤2）中，所述过柱纯化包括如下步骤：
A、将所述步骤1）得到的混合液转移到结合柱中，离心；
B、向步骤A得到的结合柱中加入权利要求13-15中任一所述试剂中的所述洗涤液，离心；
C、向步骤B得到的结合柱再次加入所述洗涤液，离心；
D、向步骤D得到的结合柱中加入DEPC水，离心、收集洗脱液，得到RNA。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于：
步骤2）A、B、C中，所述离心的离心力均为7500-8000g，离心时间均为25-30秒，离心温度均为23-25℃；
步骤2）D中，所述静置时间为2-5分钟，所述静置温度为23-25℃；
步骤2）E中，所述离心力为7500-8000g，所述离心时间为1-1.5分钟。
19.根据权利要求16-18中任一所述的方法，其特征在于：
步骤2）A、B、C中，所述离心的离心力均为8000g，离心时间均为30秒，离心温度均为25℃；
步骤2）D中，所述静置时间为2、3或5分钟，所述静置温度为25℃；
步骤2）E中，所述离心力为8000g，所述离心时间为1分钟。
20.一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
1）将权利要求4-12中任一所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液加入RNase A消化，得到消化后溶液；
2）、将步骤1）得到的消化后溶液沉淀DNA，得到基因组DNA。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述消化温度为37℃，所述消化时间为30分钟。
22.一种革兰氏阳性细菌基因组DNA和RNA的提取方法，包括如下步骤：
1）将权利要求4-12中任一所述的方法得到的去除细胞成分的核酸提取液、浓度为3M、pH值为5.2的NaAC水溶液、无水乙醇混匀，得到混合液，
2）将步骤1）得到的混合液离心收集沉淀、75%的乙醇洗涤，得到基因组DNA和总RNA混合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述浓度为3M、pH值为5.2的NaAC水溶液、所述无水乙醇的体积比为1∶0.1∶2.5。
步骤2）中，所述离心的转速为12000rpm，离心半径为10cm，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为15分钟。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述浓度为3M、pH值为5.2的NaAC水溶液的溶剂为DEPC水。
25.根据权利要求22-24中任一所述的方法，其特征在于：
在步骤1）后和步骤2）前还包括如下步骤：将所述混合液静置的步骤；
所述静置的时间为30分钟，所述静置的温度为-20℃。
26.根据权利要求22-25中任一所述的方法，其特征在于：
所述革兰氏阳性细菌为耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）或金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。
27.权利要求1-3中任一所述的试剂或权利要求4-12中任一所述的方法或权利要求13-15任一所述的试剂或权利要求16-26任一所述的方法在鉴定革兰氏阳性细菌和/或检测革兰氏阳性细菌的基因转录中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210162646.0A CN102796727B (zh) | 2011-05-24 | 2012-05-23 | 革兰氏阳性细菌核酸提取方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110135230 | 2011-05-24 | ||
| CN201110135230.5 | 2011-05-24 | ||
| CN201210162646.0A CN102796727B (zh) | 2011-05-24 | 2012-05-23 | 革兰氏阳性细菌核酸提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102796727A true CN102796727A (zh) | 2012-11-28 |
| CN102796727B CN102796727B (zh) | 2014-06-18 |
Family
ID=47196034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210162646.0A Active CN102796727B (zh) | 2011-05-24 | 2012-05-23 | 革兰氏阳性细菌核酸提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102796727B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104845966A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-08-19 | 上海泰坦科技股份有限公司 | 新型细菌rna提取试剂及其制备方法 |
| CN105154430A (zh) * | 2015-07-28 | 2015-12-16 | 福建师范大学 | 一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒 |
| CN106047868A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-10-26 | 厦门基源医疗科技有限公司 | 一种口腔咽拭子细菌宏基因组dna提取方法 |
| CN109632734A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-04-16 | 张丽英 | 一种利用atp生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法 |
| CN110029104A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-07-19 | 江南大学 | 一种适用于发酵过程中地衣芽孢杆菌rna的提取方法 |
| CN110172497A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-27 | 深圳联合医学科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌dna的提取方法 |
| CN113151256A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-07-23 | 东北农业大学 | Dna提取液以及革兰氏阳性菌dna的提取方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2004313914A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-07-28 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using solid phase material |
| WO2005075680A1 (ja) * | 2004-02-09 | 2005-08-18 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | 核酸検出方法およびその利用 |
| CN1813059A (zh) * | 2003-05-02 | 2006-08-02 | 西格玛-奥尔德利希公司 | 固相细胞裂解和捕获平台 |
| WO2007113614A1 (en) * | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Council Of Scientific And Industrial Research | A method for rapid isolation of rna and a kit thereof |
| CN101230344A (zh) * | 2008-01-16 | 2008-07-30 | 浙江大学 | 一种快速提取真菌dna的sls裂解液及其应用 |
| CN101591650A (zh) * | 2009-06-24 | 2009-12-02 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种用于从生物组织/细胞/血液样品中分离rna的试剂 |
| CN101613696A (zh) * | 2009-08-05 | 2009-12-30 | 公安部物证鉴定中心 | 提取纯化dna的试剂 |
| CN101638651A (zh) * | 2009-07-09 | 2010-02-03 | 昆明理工大学 | 从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总rna的方法 |
-
2012
- 2012-05-23 CN CN201210162646.0A patent/CN102796727B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1813059A (zh) * | 2003-05-02 | 2006-08-02 | 西格玛-奥尔德利希公司 | 固相细胞裂解和捕获平台 |
| AU2004313914A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-07-28 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using solid phase material |
| WO2005075680A1 (ja) * | 2004-02-09 | 2005-08-18 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | 核酸検出方法およびその利用 |
| WO2007113614A1 (en) * | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Council Of Scientific And Industrial Research | A method for rapid isolation of rna and a kit thereof |
| CN101230344A (zh) * | 2008-01-16 | 2008-07-30 | 浙江大学 | 一种快速提取真菌dna的sls裂解液及其应用 |
| CN101591650A (zh) * | 2009-06-24 | 2009-12-02 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种用于从生物组织/细胞/血液样品中分离rna的试剂 |
| CN101638651A (zh) * | 2009-07-09 | 2010-02-03 | 昆明理工大学 | 从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总rna的方法 |
| CN101613696A (zh) * | 2009-08-05 | 2009-12-30 | 公安部物证鉴定中心 | 提取纯化dna的试剂 |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104845966A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-08-19 | 上海泰坦科技股份有限公司 | 新型细菌rna提取试剂及其制备方法 |
| CN105154430A (zh) * | 2015-07-28 | 2015-12-16 | 福建师范大学 | 一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒 |
| CN106047868A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-10-26 | 厦门基源医疗科技有限公司 | 一种口腔咽拭子细菌宏基因组dna提取方法 |
| CN106047868B (zh) * | 2016-08-23 | 2019-05-21 | 厦门基源医疗科技有限公司 | 一种口腔咽拭子细菌宏基因组dna提取方法 |
| CN109632734A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-04-16 | 张丽英 | 一种利用atp生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法 |
| CN110029104A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-07-19 | 江南大学 | 一种适用于发酵过程中地衣芽孢杆菌rna的提取方法 |
| CN110172497A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-27 | 深圳联合医学科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌dna的提取方法 |
| CN110172497B (zh) * | 2019-05-10 | 2023-06-23 | 深圳联合医学科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌dna的提取方法 |
| CN113151256A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-07-23 | 东北农业大学 | Dna提取液以及革兰氏阳性菌dna的提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102796727B (zh) | 2014-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102796727A (zh) | 革兰氏阳性细菌核酸提取方法 | |
| JP6853283B2 (ja) | 微生物細胞を抽出するための装置及び方法 | |
| US9944974B2 (en) | Method for the specific isolation of nucleic acids of interest | |
| CN102031249A (zh) | 一种简易纯化核酸的方法 | |
| CN110512008B (zh) | 检测常见十一种食源性致病菌的多重pcr试剂盒及其应用 | |
| CN102286460B (zh) | 一种改进ctab法提取杏鲍菇中的dna | |
| JP2022050415A (ja) | 微生物を検出し同定するための方法およびデバイス | |
| CN103756998A (zh) | 一种动物核酸样本常温保存试剂及其应用 | |
| CN113151397A (zh) | 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒 | |
| CN104152436B (zh) | Dna分离纯化方法及其试剂盒 | |
| CN105385682A (zh) | 快速提取人粪便细菌dna的简易方法 | |
| CN102660537A (zh) | 一种从鸡血中提取大量高纯度dna的方法 | |
| CN108034653A (zh) | 一种高效稳定的细菌总rna提取方法 | |
| CN104404030B (zh) | 一种快速提取植物基因组dna的试剂盒及方法 | |
| US20120271043A1 (en) | Process and device for collecting nucleic acids of microorganisms from a particulate sample | |
| CN107119039A (zh) | 一种组织不研磨直接提取核酸的方法 | |
| EP2888364A1 (en) | Method for efficient isolation of microbial dna from blood | |
| CN112941067A (zh) | 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用 | |
| CN102796726B (zh) | 混合微生物核酸的提取方法 | |
| US7871764B1 (en) | Universal nucleic acids sample preparation method for cells, spores and their mixture | |
| CN106957842B (zh) | Bac克隆dna的提取方法 | |
| JP4831725B2 (ja) | 簡易的核酸抽出法 | |
| CN104845966A (zh) | 新型细菌rna提取试剂及其制备方法 | |
| CN110804611A (zh) | 一种适用于细菌和/或真菌的基因组dna提取方法 | |
| WO2001040505A1 (fr) | Procede d'analyse d'un echantillon pour la presence de bacteries legionella comprenant une etape d'immunocapture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: CAPITALBIO CORPORATION CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: CAPITALBIO CORPORATION |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 102206 Beijing City, Changping District Life Science Park Road No. 18 Patentee after: CAPITALBIO CORPORATION Patentee after: Tsinghua University Address before: 102206 Beijing City, Changping District Life Science Park Road No. 18 Patentee before: Capitalbio Corporation Patentee before: Tsinghua University |