CN109632734A - 一种利用atp生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，该方法首先将待检测的样品与PBS缓冲液混合后离心得到初始上清液，随后加入消化液进行水浴加热反应，再次离心后得到消化上清液并抽滤，将滤膜浸入ATP释放液中振荡提取，得到ATP提取液，接着将制备得到的发光反应液与ATP提取液在发光反应管中混合，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，从而实现对食品中黄曲霉菌的快速检测。本发明所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法简便快速、灵敏度高，能够准确检测出食品中是否含有黄曲霉菌及相对含量，极大地促进了食品安全检测技术的提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测方法技术领域，特别涉及一种利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法。
背景技术
黄曲霉（Aspergillus flavus）是广泛分布的产生黄曲霉毒素的丝状真菌，可以侵染花生、玉米、棉花等引起多种作物的病害，危害粮食和经济作物的生产，造成严重的经济损失。在粮食储藏以及食品和饲料的加工、运输等环节也及易发生黄曲霉的污染，导致黄曲霉毒素的积累，从而严重威胁人畜健康及食品安全。黄曲霉毒素是真菌生长过程中的次级代谢产物，具有强烈的急性毒性和强烈的致癌、致畸作用，被国际癌症研究机构认定为I类致癌物。此外，黄曲霉菌是仅次于烟曲霉（A.fumigatus）的可引起人畜侵袭性曲霉病的第二大类病原菌，严重危害人畜健康。黄曲霉毒素非常稳定，高温处理、紫外照射都不能使其分解，一旦发生污染很难进行除去。因此，快速有效的对黄曲霉菌进行检测，从源头上控制黄曲霉毒素的污染具有重要意义。
微生物检测的常规方法有培养基法、PCR分子检测法、酶联免疫吸附法和ATP生物发光法等。传统培养基法耗时太长，PCR分子检测方法需要特殊的仪器和器材，需专门提取样品的DNA，样品前处理步骤繁琐，操作人员需要具备专门技能。酶联免疫吸附法以抗体作为识别分子，抗体易受到外界条件尤其是温度的影响，对保藏条件要求苛刻，在很大程度上限制了方法的灵活应用。此外，抗体制备需要经过动物实验或细胞实验，繁琐费事，制备的抗体成本高，发展的方法检测成本也相应偏高。
ATP生物发光法是20世纪80年代发展起来的一种检测技术，该方法是基于萤火虫发光原理，在荧光素酶的催化作用下，ATP与荧光素反应释放荧光，通过测试发光强度来实现微生物的快速检测。ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，每种微生物细胞中的ATP含量是恒定的。通过测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。因无需进行微生物培养、操作简单、检测速度快，是目前国内外研究较多的一种微生物检测方法。但是，对于ATP生物发光法，微生物中ATP的释放量会直接影响到测试结果，若ATP释放不完全，则会使测试结果偏低。并且ATP是一种易降解的能量物质，若释放试剂会破坏ATP，也会导致测试结果偏低。因此，针对不同测试源选择合适的ATP释放试剂至关重要。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，该方法首先将待检测的样品与PBS缓冲液混合后离心得到初始上清液，随后加入消化液进行水浴加热反应，再次离心后得到消化上清液并抽滤，将滤膜浸入ATP释放液中振荡提取，得到ATP提取液，接着将制备得到的发光反应液与ATP提取液在发光反应管中混合，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，从而实现对食品中黄曲霉菌的快速检测。本发明所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法简便快速、灵敏度高，能够准确检测出食品中是否含有黄曲霉菌及相对含量，极大地促进了食品安全检测技术的提高。
技术方案：为了实现上述目的，本发明公开了一种利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，包括以下步骤：
（1）将50 g的待检测的固态/液态样品与950 g的1×PBS缓冲液混合，经研磨/搅拌得到悬浮液/混合液，离心除去不溶物，向得到的初始上清液中加入200 μL消化液，混匀后放入40度水浴锅中进行消化反应15～20 min，然后以3000 g离心1～2 min，弃沉淀后得到消化上清液；
（2）取100 mL步骤（1）得到的消化上清液进行抽滤，随后将滤膜浸入到盛放有50 mLATP释放液的烧杯中，所述ATP释放液包括Triton X-100、三甲基氨基甲烷、氯化铵、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氧化芳樟醇、水饱和酚，随后加入15 μL三磷酸腺苷双磷酸酶，将烧杯转移至40℃水浴锅中速率振荡提取，得到ATP提取液；
（3）在无菌环境中将荧光素酶10μL、可溶性无机镁盐30 mg、二硫苏糖醇15 mg与50 mL无菌水混合，振荡混匀，得到发光反应液；
（4）吸取0.2 mL步骤（2）得到的ATP提取液于发光反应管中，加入pH 7.0～9.0的含0.13～0.15 mol/L NaCl、0.02～0.03 mol/L EDTA、0.06～0.08 mol/L环糊精的Tris-HCl缓冲液将总体积补足至0.9 mL，再加入0.1 mL步骤（3）的发光反应液，充分振荡后将混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为20～30 s。
优选地，所述步骤（1）中的消化液组成为：0.1～0.3 mol/L Triton X-100、0.05～0.07 mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.02～0.04 mol/L蛋白酶K、0.5～0.9 mol/L 十二烷基硫酸钠。
优选地，所述步骤（2）中滤膜的孔径大小为0.25～0.35 μm。
优选地，所述步骤（2）中ATP释放液的组成为：0.04～0.06 mol/L Triton X-100、0.05～0.07 mol/L 三甲基氨基甲烷、0.03～0.05 mol/L 氯化铵、2～4 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、13～15 mmol/L 氧化芳樟醇、8～12 mmol/L 水饱和酚。
优选地，所述步骤（2）中振荡提取的速率为200 r/min，振荡提取的时间为8～10min。
优选地，所述步骤（3）中可溶性无机镁盐为氯化镁、硝酸镁、和硫酸镁中的任意一种或几种。
优选地，所述步骤（3）中的振荡混匀具体是以150 r/min的速率振荡10～20 min。
优选地，所述步骤（4）中Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。
优选地，所述步骤（4）中混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度的检测响应时间为25 s。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1） 本发明所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法简便快速、灵敏度高，能够准确检测出食品中是否含有黄曲霉菌及相对含量。
（2）本发明所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法针对所检测的特定对象黄曲霉菌设计了专用的ATP释放液，能够针对黄曲霉菌进行特异性裂解，充分释放黄曲霉菌中的ATP，避免其他杂菌中ATP的干扰，大大提高了检测特异性。
具体实施方式
以下通过结合下述具体实施方式进一步说明本发明。需要指出的是，以下具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于对本发明的内容进行限定。
本发明提供的ATP释放液，通过将氯化铵、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氧化芳樟醇、水饱和酚与传统ATP释放液中的Triton X-100、三甲基氨基甲烷进行复配，针对黄曲霉菌菌丝发达、有隔多核的多细胞这一形态特点，以及其细胞壁外层是由葡聚糖和蛋白质构成的网架结构，内层是由壳多糖微丝与蛋白质构成的混合层的特点，由氯化铵、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氧化芳樟醇、水饱和酚共同与黄曲霉菌的菌体发生化学反应，使黄曲霉菌的细胞壁、细胞膜发生分解，从而充分释放细胞内的ATP，实现检测灵敏度和准确度的提高。
下面通过实施例进一步阐明本发明。需要指出的是，本发明并非仅局限于所述实施例。
实施例1
（1）将50 g的待检测的花生饼粉与950 g的1×PBS缓冲液混合，经搅拌得到悬浮液，离心除去不溶物，向得到的初始上清液中加入200 μL消化液，消化液组成为：0.1 mol/LTriton X-100、0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.02 mol/L蛋白酶K、0.5 mol/L 十二烷基硫酸钠，混匀后放入40度水浴锅中进行消化反应15 min，然后以3000 g离心1 min，弃沉淀后得到消化上清液；
（2）取100 mL步骤（1）得到的消化上清液进行抽滤，滤膜的孔径大小为0.25 μm，随后将滤膜浸入到盛放有50 mL ATP释放液的烧杯中，所述ATP释放液的组成为：0.04 mol/LTriton X-100、0.05 mol/L 三甲基氨基甲烷、0.03 mol/L 氯化铵、2 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、13 mmol/L 氧化芳樟醇、8 mmol/L 水饱和酚，随后加入15 μL三磷酸腺苷双磷酸酶，将烧杯转移至40℃水浴锅中速率振荡提取，振荡提取的速率为200 r/min，振荡提取的时间为8 min，得到ATP提取液；
（3）在无菌环境中将荧光素酶10μL、可溶性无机镁盐30 mg、二硫苏糖醇15 mg与50 mL无菌水混合，以150 r/min的速率振荡10 min混匀，得到发光反应液；
（4）吸取0.2 mL步骤（2）得到的ATP提取液于发光反应管中，加入pH 8.0的含0.13 mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA、0.06 mol/L环糊精的Tris-HCl缓冲液将总体积补足至0.9 mL，再加入0.1 mL步骤（3）的发光反应液，充分振荡后将混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为25 s。
实施例2
（1）将50 g的待检测的大豆样品与950 g的1×PBS缓冲液混合，经研磨得到悬浮液，离心除去不溶物，向得到的初始上清液中加入200 μL消化液，消化液组成为：0.2 mol/LTriton X-100、0.06 mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.03 mol/L蛋白酶K、0.7 mol/L 十二烷基硫酸钠，混匀后放入40度水浴锅中进行消化反应18 min，然后以3000 g离心1.5 min，弃沉淀后得到消化上清液；
（2）取100 mL步骤（1）得到的消化上清液进行抽滤，滤膜的孔径大小为0.30 μm，随后将滤膜浸入到盛放有50 mL ATP释放液的烧杯中，所述ATP释放液的组成为：0.05 mol/LTriton X-100、0.06 mol/L 三甲基氨基甲烷、0.04 mol/L 氯化铵、3 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、14 mmol/L 氧化芳樟醇、10 mmol/L 水饱和酚，随后加入15 μL三磷酸腺苷双磷酸酶，将烧杯转移至40℃水浴锅中速率振荡提取，振荡提取的速率为200 r/min，振荡提取的时间为9 min，得到ATP提取液；
（3）在无菌环境中将荧光素酶10μL、可溶性无机镁盐30 mg、二硫苏糖醇15 mg与50 mL无菌水混合，以150 r/min的速率振荡15 min混匀，得到发光反应液；
（4）吸取0.2 mL步骤（2）得到的ATP提取液于发光反应管中，加入pH 8.0的含0.14 mol/L NaCl、0.025 mol/L EDTA、0.07 mol/L环糊精的Tris-HCl缓冲液将总体积补足至0.9 mL，再加入0.1 mL步骤（3）的发光反应液，充分振荡后将混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为25 s。
实施例3
（1）将50 g的待检测的牛奶与950 g的1×PBS缓冲液混合，经搅拌得到混合液，离心除去不溶物，向得到的初始上清液中加入200 μL消化液，消化液组成为： 0.3 mol/L TritonX-100、0.07 mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.04 mol/L蛋白酶K、0.9 mol/L 十二烷基硫酸钠，混匀后放入40度水浴锅中进行消化反应20 min，然后以3000 g离心2 min，弃沉淀后得到消化上清液；
（2）取100 mL步骤（1）得到的消化上清液进行抽滤，滤膜的孔径大小为0.35 μm，随后将滤膜浸入到盛放有50 mL ATP释放液的烧杯中，所述ATP释放液的组成为：0.06 mol/LTriton X-100、0.07 mol/L 三甲基氨基甲烷、0.05 mol/L 氯化铵、4 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、15 mmol/L 氧化芳樟醇、12 mmol/L 水饱和酚，随后加入15 μL三磷酸腺苷双磷酸酶，将烧杯转移至40℃水浴锅中速率振荡提取，振荡提取的速率为200 r/min，振荡提取的时间为10 min，得到ATP提取液；
（3）在无菌环境中将荧光素酶10μL、可溶性无机镁盐30 mg、二硫苏糖醇15 mg与50 mL无菌水混合，以150 r/min的速率振荡20 min混匀，得到发光反应液；
（4）吸取0.2 mL步骤（2）得到的ATP提取液于发光反应管中，加入pH 8.0的含0.15 mol/L NaCl、0.03 mol/L EDTA、0.08 mol/L环糊精的Tris-HCl缓冲液将总体积补足至0.9 mL，再加入0.1 mL步骤（3）的发光反应液，充分振荡后将混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为25 s。
对比例（在ATP释放液中以溶菌酶替代氯化铵、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氧化芳樟醇、和水饱和酚）
（1）将50 g的待检测的大豆样品与950 g的1×PBS缓冲液混合，经搅拌得到悬浮液，离心除去不溶物，向得到的初始上清液中加入200 μL消化液，消化液组成为：0.2 mol/LTriton X-100、0.06 mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.03 mol/L蛋白酶K、0.7 mol/L 十二烷基硫酸钠，混匀后放入40度水浴锅中进行消化反应18 min，然后以3000 g离心1.5 min，弃沉淀后得到消化上清液；
（2）取100 mL步骤（1）得到的消化上清液进行抽滤，滤膜的孔径大小为0.30 μm，随后将滤膜浸入到盛放有50 mL ATP释放液的烧杯中，所述ATP释放液的组成为：0.05 mol/LTriton X-100、0.06 mol/L 三甲基氨基甲烷、0.5 g/L 溶菌酶，随后加入15 μL三磷酸腺苷双磷酸酶，将烧杯转移至40℃水浴锅中速率振荡提取，振荡提取的速率为200 r/min，振荡提取的时间为9 min，得到ATP提取液；
（3）在无菌环境中将荧光素酶10μL、可溶性无机镁盐30 mg、二硫苏糖醇15 mg与50 mL无菌水混合，以150 r/min的速率振荡15 min混匀，得到发光反应液；
（4）吸取0.2 mL步骤（2）得到的ATP提取液于发光反应管中，加入pH 8.0的含0.14 mol/L NaCl、0.025 mol/L EDTA、0.07 mol/L环糊精的Tris-HCl缓冲液将总体积补足至0.9 mL，再加入0.1 mL步骤（3）的发光反应液，充分振荡后将混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为25 s。
对照例
按照常规的PCR分子检测法对实施例1-3所检测的试样及对比例所检测的试样进行平行检测，以分别验证本发明所用的ATP生物发光反应法及对比例所用的ATP生物发光反应法的检测准确性。
将实施例1-3与对比例的荧光发光强度值经换算得到对应的黄曲霉菌总数，具体换算方法为：在检测样品的发光强度时，同时以无菌水作为空白对照检测空白对照的发光强度，样品发光值减去空白发光值后取对数，通过发光曲线计算待测水样中的细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10(A+BLogRLU)）/3×10-16（个/升），N=稀释倍数，RLU为相对光单位，A，B为ATP发光反应液的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。得到的黄曲霉菌总数与经对照例的常规的PCR分子检测法所测定的黄曲霉菌总数进行逐一比较，以常规的PCR分子检测法所测定的黄曲霉菌总数为基准，计算实施例1-3与对比例所测定的黄曲霉菌总数的偏差百分率，结果见表1。可见，本发明的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法只有辅以相应特定组分的ATP释放液才能实现高精度的检测效果，这是现有技术中不曾报道过的，对进一步提高ATP生物发光反应检测法的灵敏度具有重要作用。
表1
| 偏差百分率（%） | |
| 实施例1 | -1.82% |
| 实施例2 | -1.79% |
| 实施例3 | -1.83% |
| 对比例 | -6.26% |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将50 g的待检测的固态/液态样品与950 g的1×PBS缓冲液混合，经研磨/搅拌得到悬浮液/混合液，离心除去不溶物，向得到的初始上清液中加入200 μL消化液，混匀后放入40度水浴锅中进行消化反应15～20 min，然后以3000 g离心1～2 min，弃沉淀后得到消化上清液；
（2）取100 mL步骤（1）得到的消化上清液进行抽滤，随后将滤膜浸入到盛放有50 mLATP释放液的烧杯中，所述ATP释放液包括Triton X-100、三甲基氨基甲烷、氯化铵、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氧化芳樟醇、水饱和酚，随后加入15 μL三磷酸腺苷双磷酸酶，将烧杯转移至40℃水浴锅中速率振荡提取，得到ATP提取液；
（3）在无菌环境中将荧光素酶10μL、可溶性无机镁盐30 mg、二硫苏糖醇15 mg与50 mL无菌水混合，振荡混匀，得到发光反应液；
（4）吸取0.2 mL步骤（2）得到的ATP提取液于发光反应管中，加入pH 7.0～9.0的含0.13～0.15 mol/L NaCl、0.02～0.03 mol/L EDTA、0.06～0.08 mol/L环糊精的Tris-HCl缓冲液将总体积补足至0.9 mL，再加入0.1 mL步骤（3）的发光反应液，充分振荡后将混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为20～30 s。
2. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的消化液组成为：0.1～0.3 mol/L Triton X-100、0.05～0.07 mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.02～0.04 mol/L蛋白酶K、0.5～0.9 mol/L 十二烷基硫酸钠。
3. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）中滤膜的孔径大小为0.25～0.35 μm。
4. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）中ATP释放液的组成为：0.04～0.06 mol/L Triton X-100、0.05～0.07mol/L 三甲基氨基甲烷、0.03～0.05 mol/L 氯化铵、2～4 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、13～15 mmol/L 氧化芳樟醇、8～12 mmol/L 水饱和酚。
5. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）中振荡提取的速率为200 r/min，振荡提取的时间为8～10 min。
6.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（3）中可溶性无机镁盐为氯化镁、硝酸镁、和硫酸镁中的任意一种或几种。
7. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的振荡混匀具体是以150 r/min的速率振荡10～20 min。
8.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（4）中Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。
9. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中黄曲霉菌的方法，其特征在于，所述步骤（4）中混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度的检测响应时间为25 s。
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