CN103196847A

CN103196847A - 重金属胁迫下白腐真菌胞内活性巯基化合物的定量检测方法

Info

Publication number: CN103196847A
Application number: CN2013100919789A
Authority: CN
Inventors: 黄健; 陈桂秋; 曾光明; 晏铭; 陈安伟; 张企华; 易斌; 杜坚坚; 王璐; 尚翠; 周颖; 李欢可
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2013-03-21
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-03-21
Also published as: CN103196847B

Abstract

本发明公开了一种重金属胁迫下白腐真菌胞内活性巯基化合物的定量检测方法，包括以下步骤：将白腐真菌孢子加入培养液中振荡培养至白腐真菌的对数生长期；然后向白腐真菌培养液中添加重金属溶液继续振荡培养至设定的取样时间，将培养物过滤分离并用0℃～4℃的缓冲液洗涤；再将得到菌丝球与0℃～4℃的缓冲液混合并用冰水浴超声破碎，对所得匀浆液进行冷冻离心，最后取上清液作为样品；采用含5,5’-二硫基-2-硝基苯酸溶液的方法测定样品的吸光度，算出样品中活性巯基化合物的含量。本发明的检测方法简单方便、破碎效率高、能快速可靠地获取并定量检测白腐真菌胞内活性巯基化合物的含量。

Description

重金属胁迫下白腐真菌胞内活性巯基化合物的定量检测方法

技术领域

本发明属于环境微生物学领域，涉及一种白腐真菌细胞内的活性巯基化合物含量的测定方法，尤其涉及一种重金属胁迫下白腐真菌胞内活性巯基化合物的定量检测方法。

背景技术

随着社会的发展，环境中的重金属及难降解有机物含量日益增高。这些生物异生物质可以通过食物链在生物体内富集并持久地存在，严重威胁生态环境和人类健康。近年来，微生物处理技术由于成本低廉、对环境影响小、处理效率较高等优点，已经越来越受到环保工作者和广大科技人员的关注。

白腐真菌具有独特的对异生化合物的降解和处理能力，其既能处理难降解的有机物，又能应用于重金属污染的治理。黄孢原毛平革菌作为一种研究得最为广泛的白腐真菌模式菌种，其能有效地络合和降解环境中的重金属。研究重金属胁迫下白腐真菌体内抗氧化活性化合物的种类、含量、功能等，对探讨白腐真菌对重金属的吸附及络合机理，促进白腐真菌特别是黄孢原毛平革菌在环境生物领域内的规模应用具有重要意义。

活性巯基化合物——几乎存在于所有的活性细胞内，其主要生理功能是抗自由基、抗衰老和抗氧化。在外界氧化压力的胁迫下，白腐真菌体内产生过多的自由基会损伤生物膜，侵扰生命大分子，促进机体衰老，导致机体萎缩甚至死亡。而活性巯基化合物可消除自由基，降低体内的氧化压力，维持机体内环境稳定。因此，活性巯基化合物在生物体抵抗各种胁迫（干燥、重金属等）的过程中发挥着重要作用，其含量水平的高低与生物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。因此，在生物体抗氧化反应的研究中，活性巯基化合物的含量往往是一种常用的研究指标。

现有活性巯基化合物的检测方法主要集中用于对动植物等高等生物中活性巯基化合物的检测，其使用的破碎方法基本均为液氮碾磨破碎，其破碎效率较低，工作强度大，操作麻烦，不宜批量破碎，且存在容易冻伤的安全隐患。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种破碎效率高、能快速可靠地获取并定量检测白腐真菌胞内活性巯基化合物含量的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种重金属胁迫下白腐真菌胞内活性巯基化合物的定量检测方法，包括以下步骤：

（1）将白腐真菌孢子加入培养液中振荡培养至白腐真菌的对数生长期，本发明采用的白腐真菌菌种主要是其模式菌种——黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）BKMF-1767；

（2）向上述所含白腐真菌处于对数生长期的培养液中添加重金属溶液，继续振荡培养至设定的取样时间，将培养物过滤分离并洗涤（测定干重一般采用蒸馏水进行洗涤，而测定活性巯基化合物的含量一般采用0℃～4℃的缓冲液进行洗涤，优选六偏磷酸钠缓冲液），得到重金属诱导后的菌丝球，所述菌丝球的干重可以利用传统干燥法测得；

（3）将上述菌丝球与0℃～4℃的缓冲液混合（混合后可选择定容至10ml，这时缓冲液一般添加3ml～6ml），然后将得到的混合液用冰水浴超声破碎至匀浆液，再对匀浆液进行冷冻离心，离心后取部分上清液（可选取0.25ml～1ml）作为样品；

（4）采用含5, 5’-二硫基-2-硝基苯酸（DTNB）溶液的方法测定上述样品的吸光度，计算出样品中活性巯基化合物的含量。含5, 5’-二硫基-2-硝基苯酸溶液的方法检测基本原理为：DTNB和活性巯基化合物反应，生成黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB），通过测量其在412 nm处的吸光度来确定活性巯基化合物的浓度。

上述的定量检测方法中，所述步骤（1）和步骤（2）中振荡培养的条件优选为：温度34℃～38℃，转速120r/min～150r/min。

上述的定量检测方法中，所述重金属溶液优选含镉、铅、铜、铬中一种或几种的重金属溶液（这些重金属溶液对黄孢原毛平革菌生长有毒害作用），更优选含镉溶液，特别是含二价镉离子的溶液，其中镉离子的浓度优选2mg·L^-1～25mg·L^-1。

上述的定量检测方法中，所述缓冲液优选含有EDTA的六偏磷酸钠溶液，其中六偏磷酸钠的质量与溶液体积之比（即六偏磷酸钠的质量体积比）优选5%～7%（每百毫升中的克数），EDTA的浓度优选1～3mmol·L^-1，缓冲液pH值优选2.6～2.9。

上述的定量检测方法中，所述步骤（3）中冰水浴超声破碎的条件优选为：超声功率500w～700w，总超声时间4min～7min，单次超声持续3s～4s，单次超声间隔8s~9s。

上述的定量检测方法中，所述步骤（3）中冷冻离心的条件优选为：温度0℃～4℃，转速8000r/min～11000r/min，持续时间15min～20min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明将活性巯基化合物的检测方法从动植物扩展到了白腐真菌领域。本发明的检测方法简单方便，可使用超声破碎，大大提高了白腐真菌的破碎效率，并且能够快速可靠地获取并检测其胞内活性巯基化合物的含量。本发明的检测方法对于进一步研究并测定白腐真菌，特别是黄孢原毛平革菌在处理重金属和难降解有机污染物等异生物质时其体内特殊抗氧化系统的变化具有重要意义，本发明也对白腐真菌在环境生物治理上的应用具有促进作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中测定的黄孢原毛平革菌细胞内的活性巯基化合物含量随镉胁迫浓度的变化图。

图2为本发明实施例2中测定的黄孢原毛平革菌细胞内的活性巯基化合物含量随镉胁迫时间的变化图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1：

本实施例中白腐真菌采用的菌种为白腐真菌的模式菌种黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）BKMF-1767（在美国标准菌种收藏所的保藏编号为ATCC 24725，优先采用此菌种，但不限于此）。

一种本发明的重金属胁迫下白腐真菌胞内活性巯基化合物的定量检测方法，包括以下步骤：

（1）将平板上的黄孢原毛平革菌孢子刮入无菌水中，形成浊度为60的黄孢原毛平革菌孢子悬液（含有的孢子量约为2.5×10⁶个/L）；然后将4ml黄孢原毛平革菌孢子悬液加入液体培养基（即培养液）中（该液体培养基在105℃条件下进行了30min灭菌处理）进行振荡培养，振荡培养的温度为37℃，转速为150r/min，振荡培养时间为60h；

（2）取5组上述振荡培养60h后的含黄孢原毛平革菌的培养液，向其中分别添加0mg·L^-1、2mg·L^-1、5mg·L^-1、15mg·L^-1、25mg·L^-1的含镉溶液，各培养12h后，从各组中取三份培养物（作为平行样）过滤分离并用蒸馏水洗涤得到菌体，将菌体置于烘箱中在80℃下烘干至恒重，再测定菌体干重，结果如表1所示。从表1中我们可以看出，随着镉胁迫浓度的增高，黄孢原毛平革菌的菌体干重呈下降趋势。

表1：胁迫12h后黄孢原毛平革菌菌体干重随镉胁迫浓度的变化

镉胁迫浓度（mg·L^-1）	0	2	5	15	25
						菌体干重（g）	0.9248	0.8715	0.884	0.7507	0.729

从上述培养了12h后的不同浓度的各组培养液中各取三份培养物（与上述所取培养物按湿重等量）过滤分离并用5ml的4℃缓冲液洗涤两次，得到黄孢原毛平革菌的菌丝球，所用缓冲液为含有EDTA的六偏磷酸钠溶液，其中六偏磷酸钠的质量体积比为6%，EDTA的浓度为1mmol·L^-1，缓冲液的pH值为2.6；

（3）将上述经缓冲液洗涤后得到的黄孢原毛平革菌的菌丝球放入带刻度的小烧杯中，然后向小烧杯中加入4℃的上述缓冲液（即含有EDTA的六偏磷酸钠溶液）定容至10ml，将得到的混合液用冰水浴超声破碎至匀浆液，超声功率为500w，总超声时间为5min，单次超声持续3s，单次超声间隔8s，超声完成后迅速将匀浆液进行冷冻离心，温度设定为4℃，转速为9000r/min，持续离心15min后，取0.25ml的上清液作为样品；

（4）采用含5, 5’-二硫基-2-硝基苯酸溶液（DTNB）的方法测定上述步骤（3）得到的5份样品的在412nm紫外光下的吸光度，利用已制定好的标准曲线计算出样品中活性巯基化合物的含量。

如图1所示，是本实施例中测定的黄孢原毛平革菌细胞内的活性巯基化合物含量随镉胁迫浓度（即镉离子浓度）的变化图。从图1中可以看出，随着镉溶液浓度的增长，黄孢原毛平革菌体内合成的活性巯基化合物的含量呈升高的趋势，这说明活性巯基化合物是黄孢原毛平革菌体内抗氧化系统的重要组成部分，其能清除细胞内的活性自由基，降低细胞内的氧化压力。在处理重金属等异生物质时，黄孢原毛平革菌等白腐真菌能够加速体内活性巯基化合物的合成，以提高对重金属的耐受性。

由以上结果可知，利用本发明的方法测定白腐真菌细胞内的活性巯基化合物含量随重金属浓度的变化，有助于深入研究白腐真菌的胞内抗氧化机制，加快和提高白腐真菌在环境生物技术上的应用。

实施例2：

本实施例中白腐真菌采用的菌种为白腐真菌的模式菌种黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium BKMF-1767。

（1）将平板上的黄孢原毛平革菌孢子刮入无菌水中，形成浊度为60的黄孢原毛平革菌孢子悬液（含有的孢子量约为2.5×10⁶个/L）；然后将4ml黄孢原毛平革菌孢子悬液加入液体培养基中进行振荡培养，振荡培养的温度为37℃，转速为150r/min，振荡培养时间为60h；

（2）向上述振荡培养60h后的含黄孢原毛平革菌的培养液中添加浓度为15mg·L^-1的含镉溶液，培养0h、4h、8h、16h、24h时分别各取3份培养物（即3份平行样）过滤分离并用蒸馏水洗涤，然后将得到的菌体置于烘箱中在80℃下烘干至恒重，再测定菌体干重，结果如表2所示。从表2中我们可以看出，随着镉胁迫时间的延长，白腐真菌的干重开始呈上升趋势，在8h达到最大值0.8186g，其后逐渐下降。

表2：15mg·L^-1的镉浓度下黄孢原毛平革菌菌体干重随镉胁迫时间的变化

镉胁迫时间（h）	0	4	8	12	16	20	24
								菌体干重（g）	0.647	0.773	0.8186	0.7507	0.7375	0.69	0.6245

从上述培养了0h、4h、8h、16h、24h时的培养液中各取3份等量的培养物（即3份平行样）过滤分离并用5ml的4℃缓冲液洗涤两次，得到黄孢原毛平革菌的菌丝球，所用缓冲液为含有EDTA的六偏磷酸钠溶液，其中六偏磷酸钠的质量体积比为6%，EDTA的浓度为1mmol·L^-1，缓冲液的pH值为2.6。

（3）将上述经缓冲液洗涤后的黄孢原毛平革菌的菌丝球放入带刻度的小烧杯中，然后向小烧杯中加入4℃的上述缓冲液（即含有EDTA的六偏磷酸钠溶液）定容至10ml，将得到的混合液用冰水浴超声破碎至匀浆液，超声功率为500w，总超声时间为5min，单次超声持续3s，单次超声间隔8s，超声完成后迅速将匀浆液进行冷冻离心，温度设定为4℃，转速为9000r/min，持续离心15min后，取0.25ml的上清液作为样品；

（4）采用含5, 5’-二硫基-2-硝基苯酸（DTNB）溶液的方法测定上述步骤（3）得到的样品在412nm紫外光下的吸光度，利用已制定好的标准曲线计算出样品中活性巯基化合物的含量。

如图2所示，是本实施例中测定的黄孢原毛平革菌细胞内的活性巯基化合物含量随镉胁迫时间（即取样时间）的变化图。从图2中可以看出，当添加的含镉溶液浓度一定时，随着镉胁迫时间的增长，黄孢原毛平革菌体内合成的活性巯基化合物的含量先呈上升趋势，达到最大值后，其含量逐渐稳定，这说明活性巯基化合物在黄孢原毛平革菌内的抗氧化机制中起着重要的作用。

由以上结果可知，利用本发明的方法测定白腐真菌细胞内的活性巯基化合物含量随重金属胁迫时间的变化，有助于深入研究白腐真菌的胞内抗氧化机制，加快和提高白腐真菌在环境生物技术上的应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.重金属胁迫下白腐真菌胞内活性巯基化合物的定量检测方法，包括以下步骤：

（1）将白腐真菌孢子加入培养液中振荡培养至白腐真菌的对数生长期；

（2）向上述所含白腐真菌处于对数生长期的培养液中添加重金属溶液，继续振荡培养至设定的取样时间，将培养物过滤分离并用0℃～4℃的缓冲液洗涤，得到菌丝球；

（3）将上述菌丝球与0℃～4℃的缓冲液混合，然后将得到的混合液用冰水浴超声破碎得到匀浆液，再对匀浆液进行冷冻离心，最后取上清液作为样品；

（4）采用含5, 5’-二硫基-2-硝基苯酸溶液的方法测定上述样品的吸光度，计算出样品中活性巯基化合物的含量。

2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中振荡培养的条件为：温度34℃～38℃，转速120r/min～150r/min。

3.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述重金属溶液为含镉、铅、铜、铬中一种或几种的重金属溶液。

4.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于，所述重金属溶液为含镉溶液，其中镉离子的浓度为2mg·L^-1～25mg·L^-1。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述缓冲液为含有EDTA的六偏磷酸钠溶液。

6.根据权利要求5所述的定量检测方法，其特征在于，所述缓冲液中六偏磷酸钠的质量与溶液体积之比为5%～7%，EDTA的浓度为1～3mmol·L^-1，缓冲液的pH值为2.6～2.9。

7.根据权利要求1～4中任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中冰水浴超声破碎的条件为：超声功率500w～700w，总超声时间4min～7min，单次超声持续3s～4s，单次超声间隔8s～9s。

8.根据权利要求1～4中任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中冷冻离心的条件为：温度0℃～4℃，转速9000r/min～11000r/min，持续时间15min～20min。