CN103808703B - 测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：将处理废水后的黄孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液体培养基中继续培养，再向培养后的液体培养基中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠得混合液，将混合液孵育、过滤，过滤后得到的菌球经超声破碎、离心后，提取上悬液，最后测定上悬液中氧化型二氯荧光素的荧光强度。该发明具有操作条件简单、易于实施、能够准确直观的测定处理废水后的黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用领域和废水处理领域，尤其涉及一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法。
背景技术
当下，重金属和有机污染物对环境的危害已经成为一个全球性的问题。在目前废水处理领域，现有技术已经能够利用黄孢原毛平革菌去除废水中的重金属和有机物，然而废水中的污染物对菌体产生的氧化应激作用以及菌体本身对废水的一个耐受性也值得我们关注。
现有活性氧水平的检测方法主要集中用于动植物等高等生物体内活性氧的检测，其使用的检测方法基本为流式细胞术，但流式细胞仪价格高昂，检测费用高，仪器操作复杂，且不宜批量检测。在现有的2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）荧光探针技术中，会存在探针载入细胞失败，以及细胞外残余的未进入细胞内的探针没有被洗净，导致背景值较高等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种准确直观、操作简单、易于实施的测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：将处理废水后的黄孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液体培养基中继续培养，再向培养后的液体培养基中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠得混合液，将混合液孵育、过滤，过滤后得到的菌球经超声破碎、离心后，提取上悬液，最后测定上悬液中氧化型二氯荧光素的荧光强度。
作为本发明的进一步改进，
所述液体培养基中菌体的湿重为4g～8g，所述混合液中2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠的摩尔浓度为2μM～10μM。
所述液体培养基为Kirk液体培养基。
所述孵育的条件为室温、避光孵育，孵育时间为0.5h～1.5h。
所述超声破碎的温度为0℃～4℃，功率为400w～600w，总超声破碎时间为4min～6min，单次超声持续3s～4s，单次超声间隔8s～9s。
本发明中黄孢原毛平革菌菌悬液的制备步骤包括：将黄孢原毛平革菌孢子粉末悬浮于无菌水中制成孢子悬液，并调节浊度值为60%，即每毫升孢子悬液中含2.5×106个孢子，再将孢子悬液接种到Kirk液体培养基中于35℃～39℃，140r/min～160r/min条件下，振荡培养60h～72h，得黄孢原毛平革菌菌悬液。
本发明中黄孢原毛平革菌菌球处理废水的步骤包括：将黄孢原毛平革菌菌悬液中的菌球加入至pH6.0～7.0的镉废水或二氯酚废水中，于35℃～39℃，140r/min～160r/min条件下处理12h，过滤废水，回收菌球，黄孢原毛平革菌菌悬液中菌球的干重质量与废水的体积比为0.3∶1g/L～0.5∶1g/L。
活性氧（ROS）是具有高度反应性的小分子，包括超氧阴离子（O2 -）、羟基自由基（OH）和过氧化氢（H2O2）等；其存在于人类和生物体内并源于氧。ROS能够通过与DNA、蛋白质和脂质分子反应而改变细胞的功能，其通常作为不同代谢途径的副产物存在于生物系统中。它们还在细胞信号转导和免疫系统细胞活性的调节中具有关键作用，过量的ROS会对菌体细胞结构和功能造成很大损害。
氧化应激（OxidativeStress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。氧化应激本身是难以被抓住并在体内进行测定的现象，因此，只能通过间接方法来测定它们的水平。
2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）是活性氧的特异探针，它本身不发荧光，可自由穿过细胞膜进入到细胞内，被胞内的酯酶分解为无荧光的还原型二氯荧光素（DCFH）而保留在胞内，各类ROS会氧化DCFH为发强绿色荧光的氧化型二氯荧光素（DCF），DCFH被氧化成DCF的量（或荧光强度）与自由基的含量成正比，即细胞内DCF的量（或荧光强度）能直接反应细胞内自由基的含量，因此利用荧光分光光度计检测胞内的DCF荧光强度即可反映细胞的ROS水平。
与现有技术相比，本发明的优点为：
1.本发明将活性氧水平的检测方法从动植物领域扩展到了白腐真菌领域，能够直观、准确的对废水处理后受污染物胁迫的黄孢原毛平革菌菌体内产生的ROS水平进行表征，操作条件简单且容易实施。
2.本发明将处理废水回收后的菌球经去离子水清洗后加入培养液中继续培养，再向混合液中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠。通过继续培养可以使DCFH-DA顺利地通过细胞膜进入细胞内，同时过滤洗净后的细胞外几乎没有残余的探针，不会产生误差。并且使用超声破碎，大大提高了白腐真菌的破碎效率，能够快速可靠地检测其胞内活性氧的水平。
3.本发明所使用的黄孢原毛平革菌菌球是由孢子粉末加入液体培养基中制备而成，制备工艺简单，易于扩大培养，实用性强。
4.本发明除了可以测定处理废水后的黄孢原毛平革菌菌体内的活性氧水平，同样可以测定未处理废水的黄孢原毛平革菌菌体内的活性氧水平，甚至包括其他白腐真菌。并且通过本发明检测处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内DCF的荧光强度，可以得出黄孢原毛平革菌处理废水的最佳浓度，能为重金属和有机污染物对黄孢原毛平革菌产生的氧化应激的毒性机制的研究提供基础。本发明对于进一步研究黄孢原毛平革菌在处理重金属和难降解有机污染物等异生物质时，菌体内特殊抗氧化系统的变化具有重要意义，本发明也对白腐真菌在环境生物治理上的应用具有促进作用。
本发明采用的菌种为黄孢原毛平革菌（BKM-F1767）购自位于武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCATTC24725，优选采用该菌株，但不限于此。
附图说明
图1为本发明实施例1～4中各组黄孢原毛平革菌菌体内氧化型二氯荧光素在荧光分光光度计下DCF的发射光谱图；
图2为本发明实施例1～4中各组黄孢原毛平革菌菌体内氧化型二氯荧光素在荧光分光光度计下DCF的荧光强度柱状图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
本发明采用的菌种为黄孢原毛平革菌（BKM-F1767）购自位于武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCATTC24725，优选采用该菌株，但不限于此。
实施例1：
测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：
（1）生长阶段：将黄孢原毛平革菌孢子粉末从斜面培养基上刮下，于无菌水中制成孢子悬液，将孢子悬液装入测量瓶中，用浊度仪调试孢子悬液浊度值为60%，每毫升孢子悬液中含2.5×106个孢子；再将孢子悬液接种到锥形瓶中的Kirk液体培养基，500mL锥形瓶中装有Kirk液体培养基200mL，于恒温振荡箱中培养，培养温度为37℃，摇床转速为150r/min，培养时间为60h，即得到黄孢原毛平革菌菌悬液。
（2）废水处理阶段：将上述黄孢原毛平革菌菌悬液中的菌球加入至5mg/L的自配镉废水中，每升废水中的黄孢原毛平革菌菌球的质量以干重量计为0.4g，调节废水的酸碱度至pH值至6.5，于37℃、150r/min条件下进行振荡反应12h，完成对废水中镉的吸附，反应后过滤废水，回收菌球。
（3）荧光分析：将上述回收后的菌球经去离子水清洗后，用电子天平称取湿重为6g的菌体，然后将其加入到200mL的Kirk液体培养基得混合液并继续培养，再向混合液中加入0.2mL浓度为5mM的2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠，最后混合液中2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠浓度为5μM。在室温条件下，于避光的摇床中孵育1h后，过滤回收菌球，再于4℃下对回收的菌球进行超声破碎，超声破碎功率为500W，每超声破碎3s即休息8s，总超声破碎时间为5min，再离心，提取上悬液，用荧光分光光度计测定上悬液中DCF的荧光强度，即完成对菌体内ROS水平的测定。
测定结果如表1所示。
实施例2：
测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：
（1）生长阶段：本步骤与实施例1的步骤（1）相同；
（2）吸附降解阶段：将本实施例步骤（1）制备的黄孢原毛平革菌菌悬液中的菌球加入至20mg/L自配二氯酚废水中，每升废水中的黄孢原毛平革菌菌球的质量以干重量计为0.4g，调节废水的酸碱度至pH值至6.5，于37℃、150r/min条件下进行振荡反应12h，完成对废水中二氯酚的降解，反应后过滤废水，回收菌球。
（3）荧光分析：本步骤与实施例1的步骤（3）相同。
测定结果如表1所示。
采用荧光分光光度计测定黄孢原毛平革菌菌体外的DCF荧光强度，并作为背景值；对照样即采用荧光分光光度计测定没有处理废水的黄孢原毛平革菌菌球内的DCF荧光强度，菌球的处理步骤与实施例1步骤（1）和步骤（3）一致。
表1处理自配废水后黄孢原毛平革菌菌体内ROS水平的测定结果
| 样品 | 背景值 | 对照样 | 5mg/L镉 | 20mg/L二氯酚 |
| DCF荧光强度（×106CPS） | 0.0592 | 4.1405 | 7.2103 | 8.1002 |
结果表明，由表1可知，对照样的DCF荧光强度的测定值为4.4105×106CPS，说明DCFH-DA进入到未处理废水的黄孢原毛平革菌菌体内产生的DCFH被氧化后，生成了具有荧光性的DCF，说明黄孢原毛平革菌菌体体内存在一定量的ROS。黄孢原毛平革菌处理5mg/L镉废水或20mg/L二氯酚废水后，荧光强度的测定值分别为7.2103×106CPS和8.1002×106CPS，相对于对照样均有所提高，说明重金属镉或有机物二氯酚对菌体产生了氧化应激，因此黄孢原毛平革菌菌体内ROS水平升高。并且处理5mg/L镉废水或20mg/L二氯酚废水后黄孢原毛平革菌菌体内的ROS水平与对照样在同一个数量级上，说明此浓度的污染物是在菌体的耐受范围之内。
实施例3：
测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：
（1）生长阶段：本步骤与实施例1的步骤（1）相同；
（2）吸附降解阶段：将本实施例步骤（1）制备的黄孢原毛平革菌菌悬液中的菌球加入至50mg/L的工业镉废水中，每升废水中的黄孢原毛平革菌菌球的质量以干重量计为0.4g，调节废水的pH值至6.5，于37℃、150r/min条件下进行振荡反应12h，完成对废水中镉的吸附，反应后过滤废水，回收菌球。
（3）荧光分析：本步骤与实施例1的步骤（3）相同；
结果如表2所示。
实施例4：
测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：
（1）生长阶段：本步骤与实施例1的步骤（1）相同；
（2）吸附降解阶段：将本实施例步骤（1）制备的黄孢原毛平革菌菌悬液中的菌球加入至100mg/L工业二氯酚废水中，每升废水中的添加量以黄孢原毛平革菌菌球干重量计为0.4g，调节废水的pH值至6.5，于37℃、150r/min条件下进行振荡反应12h，完成对废水中二氯酚的降解，反应后过滤废水，回收菌球。
（3）荧光分析：本步骤与实施例1的步骤（3）相同；
结果如表2所示。
表2处理工业废水后黄孢原毛平革菌菌体内ROS水平的测定结果
| 样品 | 背景值 | 对照样 | 50mg/L镉 | 100mg/L二氯酚 |
| DCF荧光强度（×106CPS） | 0.0592 | 4.1405 | 9.6513 | 12.1409 |
结果表明，由表2可知处理工业镉废水和二氯酚废水后，黄孢原毛平革菌菌体内DCF荧光强度明显高于对照样的荧光强度，也高于实施例1和实施例2中处理自配废水后黄孢原毛平革菌菌体内的DCF荧光强度，处理废水的浓度越大，通过荧光分析所得的荧光强度的测定值越大，黄孢原毛平革菌菌体内ROS产生的越多，因此黄孢原毛平革菌菌体内的ROS水平越高，由此可知，通过本发明测定黄孢原毛平革菌菌体内DCF荧光强度，可以得出黄孢原毛平革菌处理废水的最佳浓度。由于大量的ROS会对菌体细胞结构和功能造成很大损害，本发明同样能为重金属或有机污染物对黄孢原毛平革菌产生的氧化应激的毒性机制的研究提供基础。
实施例1～4中的背景值、对照样及处理不同废水后的黄孢原毛平革菌菌体内的DCF的发射光谱图如图1所示，在激发波长为485nm，发射波长为520nm处测得的DCF荧光强度如图2所示。由图1可知，对处理废水后的黄孢原毛平革菌菌体进行荧光分析，在激发波长为485nm下，菌体内氧化型二氯荧光素的发射光谱在520nm处出现了发射波峰，并且发射光谱也表明了处理100mg/L二氯酚的黄孢菌体中产生了最大量的ROS。由图2可知，处理各类废水后黄孢原毛平革菌菌体产生了不同量的ROS，废水的浓度越高，ROS的量越大，并且会伴随有污染物对菌体的氧化应激作用，特别地表现在工业废水处理中。
由以上实施例可知，采用本发明的方法可以直观、准确的测定黄孢原毛平革菌菌体内的ROS水平，废水中的重金属或有机物的浓度不同，对菌体产生了不同的氧化应激作用，浓度越高，氧化应激作用越强，菌体内产生的ROS也越多，对菌体细胞结构和功能也造成很大损害，因此本发明对我们研究黄孢原毛平革菌的抗氧化应激毒性机制提供了参考，以便我们更好地利用该菌体处理工业废水。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，其特征在于包括以下步骤：将处理废水后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌球清洗后，加入液体培养基中继续培养，再向培养后的液体培养基中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠得混合液，将混合液孵育、过滤，过滤后得到的菌球经超声破碎、离心后，提取上悬液，最后测定上悬液中氧化型二氯荧光素的荧光强度；所述液体培养基中菌体的湿重为4g～8g，所述混合液中2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠的摩尔浓度为2μM～10μM；所述超声破碎的温度为0℃～4℃，功率为400w～600w，总超声破碎时间为4min～6min，单次超声持续3s～4s，单次超声间隔8s～9s。
2.根据权利要求1所述的测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，其特征在于：所述液体培养基为Kirk液体培养基。
3.根据权利要求1所述的测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，其特征在于：所述孵育的条件为室温、避光孵育，孵育时间为0.5h～1.5h。
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