CN105296678B - 一种基于光催化淬灭群体感应信号的生物膜控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于光催化淬灭群体感应信号的生物膜控制方法，属于细菌学和环境工程领域；本发明首先将保存在甘油中的细菌于LB固体培养基恒温过夜培养；挑取单克隆接入LB液体培养基振荡培养至对数后期，离心收集菌体；然后配制纳米材料悬浮液，加入离心收集的菌体，加入96孔板中，光照下静置培养，定期取样检测AI‑2信号分子的浓度，分析生物膜的形成量，结果显示，本发明方法使形成的生物膜量显著减小；这种新型的生物膜控制方法不但能够减少膜污染的发生，而且不会因危害菌体代谢而影响生物处理单元的处理效率；本方法具有方便快捷、安全友好等特点，在对生物膜污染的控制等方面具有潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于光催化淬灭群体感应信号的生物膜控制方法，是一种新型的生物膜控制方法，属于细菌学和环境工程领域。
背景技术
生物膜（Bacterial biofilm）是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。生物膜在自然环境中随处可见。生物膜复杂的微观结构使得其具有很强的吸附性能，并广泛地存在于地表水表面、污水处理厂、饮用水管道、船帮、桥墩、建筑表面、医疗器械、甚至牙齿上。生物膜法或者膜生物法在受污染水体修复和污水处理方面具有水环境保护的积极作用。但生物膜在膜-水界面上积累过分生长会造成膜污染进而影响系统性能。膜的生物污染分两个阶段：粘附和生长。粘附的微生物细胞会在进水营养物质的供养下成长繁殖，形成生物膜。生物污染问题是造成膜污染的最主要的原因。目前的主要控制方法是通过往溶液中投入生物杀虫剂或者杀菌剂等，导致细胞死亡或者抑制细菌生长等途径来控制生物膜的形成和生长。但是这些方法不但成本较高，也会投入的化学试剂也可能引起环境的二次污染。因此亟需发展一种新型的生物膜控制方法。
近年的研究证实，细菌生物膜的形成受细菌群体感应系统的调控。细菌可通过自身分泌和感知不同的群体感应信号分子来进行交流，并调节生物膜形成等生理活动。群体感应信号分子的种类众多，其中AI-2是唯一一种能既能进行种内交流，也能介导种间交流的信号分子。自然界中绝大多数环境中都为多种菌种共生，不同菌种间通过信号传递相互调节，因而对广谱性分子AI-2（呋喃硼酸二酯）的抑制更具有可操作性。已有报道证明，通过干扰AI-2群体感应系统可以控制生物膜的形成而不损伤细菌活性。例如，苏云金芽孢杆菌合成的aiiA酶可以降解群体感应信号分子，而呋喃酮类化合物可作为群体感应信号分子的抑制剂，从而影响了细菌生物膜的形成。但前者需进行混菌培养，会引入新的微生物污染，而且向环境引入基因工程菌株，有可能引起潜在生态风险，从而限制了其实际应用；后者加入大量的化学试剂，不但有可能造成二次污染，而且成本大。研究报道显示光催化纳米材料能够在光激发条件下产生光生电子和空穴。这些电子和空穴通过一系列的转化，能够产生多种活性氧，特别是羟基自由基。这些活性氧能够和有机分子反应，从而导致有机污染物的降解。而作为群体感应调控的信号分子AI-2，它本身的化学结构显示其易于被羟基自由基等ROS分子降解。
针对目前水污染处理工艺中评测缺乏安全高效生物膜控制方法的困境，本发明利用光激发纳米材料产生活性氧，以淬灭降解群体感应信号分子，进而控制生物膜的形成。这种新型方法既可以缓解膜分离单元中的堵塞等问题，又不会因为杀死细菌而影响生物处理单元对污水处理的能力，因而对生物膜污染的控制具有重要应用价值。
发明内容
本发明提出了一种基于光催化纳米材料产生活性氧淬灭群体感应信号分子AI-2，从而控制生物膜形成的新方法。
本发明的技术方案如下：
（1）将保存在甘油中的细菌划线于酵母膏蛋白胨固体培养基（LB固体培养基，含酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl l0 g/L、2%琼脂）上，恒温培养箱中过夜培养；
（2）挑取步骤（1）中过夜培养得到的细菌单克隆，接入50 mL酵母膏蛋白胨液体培养基（LB液体培养基，含酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl l0 g/L），在好氧条件下于恒温摇床中180 rpm振荡培养至对数后期；
（3）离心收集菌体：采用6000 rpm转速离心5 min收集菌体，然后用1% NaCl溶液重悬并清洗三次，再次6000 rpm转速离心5 min收集菌体；
（4）用新鲜LB液体培养基配制一定浓度的纳米材料悬浮液，超声30 min待用；
（5）将步骤（3）中离心收集的菌体加入到步骤（4）中纳米材料悬浮液中，并调节菌浓至初始浓度为107 CFU/mL；
（6）将步骤（5）中菌液加入到96孔板中，每孔加200 μL，置于一定强度光照下静置培养，定期取样，利用检测发光弧菌Vibrio harveyi BB170检测AI-2信号分子的浓度（ZhaoL, et al. Staphylococcus aureus AI-2 quorum sensing associates with the KdpDEtwo-component system to regulate capsular polysaccharide synthesis andvirulence. Infection and immunity, 2010, 78(8): 3506-3515）。
（8）实验结束后，利用结晶紫染色分析生物膜的形成量。
其中，步骤（1）中所述的细菌为能够产生AI-2信号分子的细菌。
其中，步骤（4）中所述的纳米材料为具有光激发性能的半导体纳米材料；所述纳米材料悬浮液的浓度根据纳米材料的光激发效率和纳米材料对细菌的毒性进行优化。
本发明的有益效果：
本发明以群体感应调控的角度入手，本发明利用光催化纳米材料产生活性氧
ROS降解细菌群体感应信号分子AI-2，干扰细菌群体感应系统，进而调控细菌生物膜的形成，而不同于普通的光催化杀菌；两者的区别在于本发明产生的ROS是低浓度的，其本身不会对细菌造成危害，而仅是通过淬灭AI-2信号分子达到控制生物膜生长的目的。本方法避免了传统添加抗菌剂的生物膜控制方法，能够减小成本，避免对环境造成污染，同时也不会对细菌菌体造成毒害，从而在不影响细菌活性的基础上，达到控制细菌生物膜形成的目的；本发明解决了已有的干扰群体感应系统抑制生物膜方法中存在的技术要求高、成本大、易产生二次污染等问题，是一种易于实现、安全高效的生物膜控制新方法，具有较强的实际应用价值。
附图说明
图1是光催化淬灭AI-2信号分子控制生物膜形成的示意图；
图2是光催化淬灭后AI-2信号分子活性变化情况；
图3是生物膜形成分析。
具体实施方式
本发明所使用的纳米材料为TiO2纳米颗粒；所用激发光为紫外光UVA；所用菌株为Escherichia coli K12。具体实施方式如下：
（1）将保存在甘油中的E. coli K12划线于酵母膏蛋白胨固体培养基（LB固体培养基，含酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl l0 g/L、2%琼脂）上，于37oC恒温培养箱中过夜培养；
（2）挑取步骤（1）中过夜培养的待使用的E. coli K12单克隆，接入50 mL酵母膏蛋白胨液体培养基（LB液体培养基，含酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl l0 g/L），在好氧条件下于37oC恒温摇床中180 rpm振荡培养至对数后期；
（3）采用6000 rpm转速离心5 min收集菌体，然后用1% NaCl溶液重悬并清洗三次，再次6000 rpm转速离心5 min收集菌体；
（4）用新鲜LB液体培养基配制100 mg/L的TiO2纳米颗粒悬浮液，超声30 min待用；
（5）将步骤（3）中离心收集好的菌体加入到新鲜LB液体培养基或步骤（4）中TiO2纳米颗粒悬浮液中，并调节菌浓至初始浓度为107 CFU/mL，得到两组菌液，一组为菌体+LC液体培养基；一组为菌体+TiO2纳米颗粒悬浮液；
（6）将步骤（5）中菌液加入到96孔板中，每孔加200 μL，分别置于黑暗和光强为150μW/cm2的UVA下静置培养，得到四组菌液，分别为：A.空白对照组：黑暗条件+菌体+LB液体培养基；B.阴性对照组：黑暗条件+菌体+TiO2纳米颗粒悬浮液（即TiO2处理组）；150 μW/cm2的UVA+菌体+LB液体培养基（即UVA处理组）；C.正式实验组：150 μW/cm2的UVA+菌体+TiO2纳米颗粒悬浮液（即光催化处理组）；四组菌液分别定期取样（取样时间间隔0.5h、1h、2h、4h、8h），利用检测发光弧菌Vibrio harveyi BB170检测AI-2信号分子的浓度。
（8）实验结束后，利用结晶紫染色分析生物膜的形成量。
整个实验的原理图如图1所示。当TiO2颗粒被UVA激发后，会产生活性氧ROS;这些活性氧会降解细菌群体感应信号分子AI-2，阻止细菌群体感应信号通路的启动，从而控制细菌生物膜的形成。实验数据证明：图2中由于AI-2信号分子不稳定，暴露于空气中自身会逐渐被降解，相比于空白对照组，阴性对照组（UVA处理组和TiO2处理组）都不会显著影响AI-2浓度；而当TiO2纳米颗粒受到UVA激发的光催化处理组（正式实验组）中，AI-2信号分子的浓度明显降低，这一结果说明TiO2的光催化作用产生的ROS可淬灭降解AI-2信号分子。图3中由E. coli K12生物膜经结晶紫染色后的形态及相应的生物膜生成量显示，UVA照射和TiO2单独处理（阴性对照组）都不会影响生物膜的形成，而两者联用（正式实验组）时，由于AI-2信号分子被光催化产生的活性氧ROS降解，因而导致形成的生物膜量显著减小。
Claims (2)
1.一种基于光催化淬灭群体感应信号的生物膜控制方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
（1）将保存在甘油中的细菌划线于LB固体培养基上，恒温培养箱中过夜培养；
（2）挑取步骤（1）中过夜培养得到的细菌单克隆，接入LB液体培养基，在好氧条件下于恒温摇床中振荡培养至对数后期；
（3）离心收集菌体；
（4）用新鲜LB液体培养基配制一定浓度的纳米材料悬浮液，超声混匀待用；所述纳米材料为TiO2纳米颗粒，其悬浮液浓度为100 mg/L；
（5）将步骤（3）中离心收集的菌体加入到步骤（4）中得到的纳米材料悬浮液中；
（6）将步骤（5）中菌液加入到96孔板中，置于一定强度光照下静置培养，定期取样，检测AI-2信号分子的浓度；
（7）实验结束后，分析生物膜的形成量；
步骤（1）中所述的细菌菌株为Escherichia coli K12；
步骤（5）中所述离心收集的菌体加入到纳米材料悬浮液中，调节菌浓至初始浓度为107CFU/mL；
步骤（6）中所述一定强度的光照为光强为150 μW/cm2的UVA紫外激发光。
2.根据权利要求1所述的一种基于光催化淬灭群体感应信号的生物膜控制方法，其特征在于，所述群体感应信号为AI-2分子。
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