CN102706821A - 一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，属于食品微生物技术控制领域。本发明的鉴定方法是先检测待鉴定物质的最小抑菌浓度，然后用加入了待鉴定物质的培养基培养食源菌，采用哈氏弧菌BB170为发光菌株，检测混合菌中群体感应信号分子AI-2的活力，AI-2活力值低于不添加该物质对照组的值，即为食源菌生物被膜形成抑制剂。本发明的鉴定方法避免了菌体耐药性的产生，且鉴定时间短，可以在5小时内鉴定出某物质是否为生物被膜抑制剂，对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均适用。简单、方便的鉴定技术能应用在食品、药品加工环境微生物污染控制，食品加工中天然防腐剂的开发使用等。

Description

一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及食品微生物控制技术领域，具体涉及一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法。

背景技术

食品安全已成为全球重要的公共卫生问题，食源性病原菌是引起食源性疾病的首要原因,它对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。据有关专家估计，其中约65％人类细菌性感染是由生物被膜引起的，因此在食品工业中形成的生物被膜才是引起食源性疾病的罪魁祸首。

生物被膜是指细菌附着于生物的或非生物的接表面生长，分泌多糖、蛋白质等多聚物构成胞外基质，将自身包裹其中而形成的大量细菌聚集物。细菌的这种生活方式可以帮助其抵抗环境中的各种不利因素，如大量氧基、抗生素的合成、过酸或过碱的环境、被宿主免疫细胞吞噬等，生物膜细菌对抗生素的抵抗力是浮游细菌的数百倍甚至上千倍。在食品加工环境中，微生物易在富有养分的各种固体表面附着，形成生物被膜。使得加工设备表面受损，热传递效率降低增加，甚至引起金属表面的腐蚀，带来影响食品安全和卫生的隐患。

近年来的研究发现群体感应系统与细菌生物膜的形成亦存在着密切联系。群体感应（quorum sensing , QS）是指细菌自体分泌一类特殊的化学物质——自体诱导物 （autoinducers，AIs）并转运至细胞外，这类化学物质在胞外逐渐累计直至其浓度到达某种域值时，再转至胞内与特定物质结合或直接被细胞内特定物质所感知，进而调控胞内特定基因的表达，完成细菌间的信号交流。通过群体感应系统，细菌能够协调完成一系列生命活动，如生物发光，抗生素合成，固氮基因调控，生物膜的形成等。AI - 2被认为是细菌通用的信号分子，参与细菌间的交流，调控细菌的群体行为。生物被膜的控制是食品加工中的一大难题，由于生物膜的普遍存在性和难以清除性，使得食品的交叉污染相当严重。过去清除生物被膜的一般做法是加大杀菌剂量和提高杀菌温度，但过高的温度会破坏食品营养，还可能会产生有害物质，加大杀菌剂量易产生药物残留，危害人体健康，而天然产物由于来源植物或动物体内对人体健康安全，所以从群体感应角度在天然产物中筛选对信号分子合成的抑制剂对控制细菌成膜具有重大意义，将会给食品加工贮藏业带来广阔的前景。

近些年来已经有很多文献都描述了天然 QSI化合物的存在，Hentzer M, Wu H等发现红藻产的溴化呋喃在很多细菌中都能够抑制QS，大幅降低生物膜对抗生素的敏感性。李斌、董明等人研究了黑木耳提取物对细菌群体感应及生物膜形成的抑制。目前，直接检测抑制生物膜形成的方法主要有显微镜形态学观察和胞外基质染色法。扫描电镜可观察生物膜表面结构，是检测的金标准，但其价格昂贵直接限制了应用。胞外基质的染色法有阿利新兰-刚果红联合染色法、银染法、半定量结晶紫染色法等。但是该方法操作步骤多，且在固定、染色、清洗等各环节中，均可能导致生物膜的脱落与破坏。如果建立群体感应信号分子与生物被膜形成的关系，可以通过检测抑制对群体感应信号分子活性进而鉴定生物被膜抑制剂则更加快速简易。储卫华，刘永旺等人用紫色杆菌报告菌检测细菌型信号分子AHLs及其抑制物，该方法虽然快速，但是AHLs只存在于革兰氏阴性菌中，无法检测革兰氏阳性菌的信号分子。            

 到目前为止，仍未见到对食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

研究发现群体感应信号分子AI-2与生物被膜形成能力存在相关性，在此基础上，进一步选用哈氏弧菌BB170作报告菌株，通过其发光强弱快速检测到群体感应信号分子AI-2的活性，即可判断该抑制剂对食源菌生物被膜形成的抑制效应。

本发明提供以下鉴定食源菌生物被膜形成抑制剂方法的技术方案。

一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，步骤如下：

（1）接种食源菌，加入梯度浓度的待鉴定物质培养，检测待鉴定物质的最小抑菌浓度MIC；

（2）食源菌培养基中加入1/2 MIC的待鉴定物质，以未加待鉴定物质的培养基作为阳性对照，培养食源菌至对数期；

（3）将培养至OD值达到0.9的哈氏弧菌BB170进行稀释，清除自身存在的生物发光干扰，将步骤（2）所得培养物分别离心，取上清液经过滤后加入到哈氏弧菌BB170的稀释液中，检测哈氏弧菌BB170的发光强度，获得群体感应信号分子AI-2的活力值，如果AI-2的活力值低于不添加该物质对照组的值，则待鉴定物质为生物被膜形成抑制剂。

其中，食源菌包括肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法还包括步骤（4），采用微孔板染色法测定食源菌粘附值进行验证。

作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法中，步骤（1）中食源菌的接种量为10⁶CFU，加入待鉴定物质的浓度采用二倍稀释法。食源菌培养时间为16小时.

作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，步骤（3）中离心条件为13000rpm离心10min，过滤用滤膜孔径为0.22μm。所述哈氏弧菌BB170的稀释液配制为将新鲜的AB培养基以1:5000稀释哈氏弧菌BB170的培养物。AB培养基配方为：0.3M NaCl , 0.05M MgSO₄, 0.2%（W/V）酸水解酪蛋白，用KOH调节PH至7.5，121℃高压灭菌20min。冷却后每100ml培养基中加入1mL 1M    磷酸钾缓冲液，1mL 0.1M精氨酸，2mL 50%甘油。 

作为一种优选方案，上述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，步骤（4）微孔板染色法测定食源菌粘附值具体步骤为：将培养的食源菌取菌悬液加入添加了1/2MIC待鉴定物质的微孔板中，以未接种食源菌的培养基为阴性对照，未添加待鉴定物质的培养基为阳性对照；培养结束后用酶标仪测定各组在波长630nm处的光密度值A ₁ ；倒掉孔板中的培养基，用蒸馏水洗去浮游菌；微孔板在室温下干燥2h后，加入质量浓度为1% 结晶紫100μL/孔，放置20min，随后用蒸馏水洗至水洗液为无色，孔板在室温下再干燥30min，加入体积浓度为95%的乙醇100μL/孔，震荡后用酶标仪测定630nm处的光密度值A ₂ ，采用以下公式计算粘附值B：

待鉴定物质比阳性对照组粘附值B低的，证明待鉴定物质为生物被膜形成抑制剂；其中A _1C 和A _2C 分别为阳性对照组在培养结束后用酶标仪测定各组在波长630nm处的光密度值和震荡后用酶标仪测定630nm处的光密度值。

本发明具有以下有益效果：

抑制菌体生长及生物被膜形成的抗生素药物容易产生菌体的耐药性，而通过抑制AI-2活力来影响微生物的生物被膜形成避免了菌体耐药性的产生。本发明可以在5小时内鉴定出某物质是否为生物被膜抑制剂，对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均适用。简单、方便的鉴定技术能应用在食品、药品加工环境微生物污染控制，食品加工中天然防腐剂的开发使用等。

具体实施方式

实施例1

菌株：食源菌Salmonella enteritidis 07（革兰氏阴性菌）和staphylococcus aureus20（革兰氏阳性菌）购自美国菌种保存中心ATCC。

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是引起食源性疾病最主要的致病菌，在肉、蛋、奶、鱼等食物中极易生长繁殖，容易附着在食品包装及加工器械上，如果人们摄入了含大量沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的畜产品，就会引起细菌感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。

报告菌株哈氏弧菌BB170 购自美国菌种保存中心ATCC。

待鉴定的抑制剂：柠檬醛和肉桂醛（纯度≥99%）购自阿拉丁试剂有限公司；

1、柠檬醛和肉桂醛最小抑菌浓度MIC的测定

将用50%的无水乙醇配置好的柠檬醛原液和肉桂醛原液用TSB（胰蛋白胨大豆肉汤培养基）依次进行二倍稀释，浓度梯度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μL/mL。将培养过夜的两种细菌调麦氏比浊度为0.5，吸取适量加入试管中，充分混匀，置于37℃摇床培养18-24h后取出，首先观察不接菌的对照管的生长情况，在对照管无细菌生长，呈透明状态的前提下，再观察其它管的浑状况，以肉眼看不到细菌生长的最高浓度为最小抑菌浓度。则测的柠檬醛对两株菌的MIC都是0.8μL/mL，肉桂醛对两株菌的MIC都为0.4μL/mL。

2、两株菌AI-2活力的测定

（1）将食源菌Salmonella enteritidis 07接种于含1/2MIC浓度的柠檬醛和肉桂醛TSB培养基中培养至对数期，培养物在13000rpm离心10min，取上清滤过0.22μm滤膜，取300μL上清液冻存-80℃待用，同时将不含该物质的食源菌无细胞上清作为阳性对照，新鲜TSB培养基作为阴性对照。

将报告菌株哈氏弧菌BB170单克隆接种到AB培养基中，于30℃培养箱培养16h OD(600nm)为0.9左右，用新鲜的AB培养基以1：5000稀释哈氏弧菌BB170培养物，以稀释其自身产生的AI-2分子，清除自身存在的生物发光干扰。

将稀释的哈氏弧菌液加入96微孔板，每孔加200μL，分别加入取得的Salmonella enteritidis 07菌的上清液20μL，在37℃培养箱震荡培养（130rpm），用多功能酶标仪Infinite200每隔1小时测其发光值，直至5h，选出较稳定的发光值。结果得出：Salmonella enteritidis 07加入1/2MIC柠檬醛与阳性对照比较其抑光率为55.9%；加入1/2MIC肉桂醛的抑光率为88.3%。

（2）以食源菌staphylococcus aureus20为研究对象，测定柠檬醛和肉桂醛对其AI-2活力的影响，测定方法同（1）。结果得出staphylococcus aureus20加入1/2MIC柠檬醛与阳性对照比较其抑光率为71.8%；加入1/2MIC肉桂醛的抑光率为85.1%。

3、微孔板染色法验证柠檬醛和肉桂醛对两株菌的黏附值。

（1）将食源菌Salmonella enteritidis 07在37℃过夜培养24h后，分别吸取菌悬液1μL加入添加了1/2MIC的柠檬醛和肉桂醛TSB培养基的96孔板中，菌悬液与培养基的比例为1：100。以未接菌的培养基为阴性对照，未添加抑制剂的培养基做阳性对照。37℃培养24h。培养结束后用多功能酶标仪测定波长630nm处的光密度值A ₁ ，倒掉孔板中的培养基，用蒸馏水水洗3次去除浮游菌。微孔板在室温下干燥2h后，加入1% 结晶紫100μL/孔，放置20min。随后用蒸馏水水洗6-7次以去除孔壁染液直至水洗液为无色。孔板在室温下再干燥30min，加入95%乙醇100μL/孔，微量震荡器上震荡30min后，用酶标仪测定A630nm,A ₂ ，平行实验3次。黏附值为B,可计算为：

根据公式得出Salmonella enteritidis 07阳性对照黏附值为0.462，添加1/2MIC的柠檬醛黏附值是：0.170；添加1/2MIC肉桂醛的黏附值是0.136。

（2）用staphylococcus aureus20进行（1）的实验，方法步骤与（1）相同，最后得出staphylococcus aureus20阳性对照黏附值为0.593，添加1/2MIC的柠檬醛黏附值是0.177，添加1/2MIC肉桂醛的黏附值是0.141。

以上结果表明，添加1/2MIC的柠檬醛和肉桂醛后两种细菌的黏附值与对照相比均下降，验证得出柠檬醛和肉桂醛为理想的生物膜形成抑制剂。

Claims (5)

1.一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于步骤如下：

（1）接种食源菌，加入梯度浓度的待鉴定物质培养，检测待鉴定物质的最小抑菌浓度MIC；

（2）食源菌培养基中加入1/2 MIC的待鉴定物质，以未加待鉴定物质的培养基作为阳性对照，培养食源菌至对数期；

（3）将培养至OD值达到0.9的哈氏弧菌BB170进行稀释，清除自身存在的生物发光干扰，将步骤（2）所得培养物分别离心，取上清液经过滤后加入到哈氏弧菌BB170的稀释液中，检测哈氏弧菌BB170的发光强度，获得群体感应信号分子AI-2的活力值，如果AI-2的活力值低于不添加该物质对照组的值，则待鉴定物质为生物被膜形成抑制剂。

2.根据权利要求1所述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于还包括步骤（4），采用微孔板染色法测定食源菌粘附值进行验证。

3.根据权利要求1或2所述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于步骤（1）中食源菌的接种量为10⁶CFU，加入待鉴定物质的浓度采用二倍稀释法。

4.根据权利要求1或2所述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于步骤（3）中离心条件为13000rpm离心10min，过滤用滤膜孔径为0.22μm。

5.根据权利要求2所述食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法，其特征在于步骤（4）微孔板染色法测定食源菌粘附值具体步骤为：将培养的食源菌取菌悬液1μL加入添加了1/2MIC待鉴定物质的微孔板中，以未接种食源菌的培养基为阴性对照，未添加待鉴定物质的培养基为阳性对照；培养结束后用酶标仪测定各组在波长630nm处的光密度值A ₁ ；倒掉孔板中的培养基，用蒸馏水洗去浮游菌；微孔板在室温下干燥2h后，加入质量浓度比为1% 结晶紫100μL/孔，放置20min，随后用蒸馏水洗至水洗液为无色，孔板在室温下再干燥30min，加入体积浓度为95%的乙醇100μL/孔，震荡后用酶标仪测定630nm处的光密度值A ₂ ，采用以下公式计算粘附值B：

待鉴定物质比阳性对照组粘附值B低的，证明待鉴定物质为生物被膜形成抑制剂；

其中A _1C 和A _2C 分别为阳性对照组在培养结束后用酶标仪测定各组在波长630nm处的光密度值和震荡后用酶标仪测定630nm处的光密度值。