CN109329400A - 一种群体感应抑制剂在泡菜防腐保鲜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种群体感应抑制剂在泡菜防腐保鲜中的应用。该应用包括以下步骤：运用Illumina MiSeq对泡菜液中加入群体感应抑制剂以及不加入群体感应抑制剂的微生物菌落进行了测定；利用LB固体培养基培养稀释后的泡菜液，分离出单菌落移至LB液体培养基培养，离心处理后，用去离子水继续离心处理；分离泡菜液中的腐败菌；将分离的腐败菌，利用抑菌实验对泡菜中的四种腐败菌进行测定；将种属的四种腐败菌，利用紫外分光光度计进行生长曲线的测定；将确定种属的四种腐败菌，利用酶标仪进行生物被膜生长的测定。本发明群体感应抑制剂作为一类新型防腐保鲜剂，为泡菜的防腐保鲜提供了一种更有效的可能。
Description
技术领域
本发明属于发酵食品防腐保鲜技术领域，具体地说，涉及一种群体感应抑制剂在泡菜防腐保鲜中的应用。
背景技术
泡菜制品在面临整个食品行业标准化、规范化和安全化以及省外、国外同类产品迅速发展的形势下，如何在保留传统产品特色的前提下，依靠现代生物工程技术改造传统产业，实现生产技术的升级换代，改善其腐败现象，提高其食品安全问题，对整个产业是刻不容缓的。
泡菜的制作方便，储存简单，食用方法多且简单。因其制作过程中不涉及加热，营养成分保留较完整，所以营养丰富，属低热量食品。传统的密封保存方式固然有一定的作用。但是，由于泡菜原料未经过灭菌处理，并且每次开坛的时候难免会有杂菌进入，因此在后期发酵过程中一旦环境温度升高或者存放条件不利，泡菜中的腐败菌就会大量繁殖，菌落结构发生变化从而导致泡菜的腐败变质。而泡菜的制作周期长，且腐败之后无法逆转补救，因此开发有效安全的防腐保鲜技术显得极其重要。
泡菜作为发酵蔬菜类制品，含有丰富的微生物。近年来的研究证明细菌之间存在信息交流，许多细菌都能合成并释放一种被称为自诱导物质(autoinducer,AI)的信号分子，胞外的AI浓度能随细菌密度的增加而增加，达到一个临界浓度时，AI能启动菌体中相关基因的表达，调控细菌的生物行为，这一现象称为群体感应。
食品腐败变质过程受群体感应的调控，群体感应系统在食品腐败变质过程中占主导地位。群体感应(Quorum sensing，QS)系统参与食品腐败变质的过程，与食品腐败相关的酶活性受QS系统的调控。此外，在变质食品中也检测到部分QS系统的信号分子。调控食品腐败变质的相关微生物基因表达的有效途径之一是对其QS系统进行调节。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种群体感应抑制剂在泡菜防腐保鲜中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种群体感应抑制剂在泡菜防腐保鲜中的应用。
可选地，该应用包括以下步骤：
步骤1、运用Illumina MiSeq对泡菜液中加入群体感应抑制剂以及不加入群体感应抑制剂的微生物菌落进行了测定；
步骤2、利用LB固体培养基培养稀释后的泡菜液，分离出单菌落移至LB液体培养基培养，离心处理后，用去离子水继续离心处理；分离泡菜液中的腐败菌；
步骤3、将步骤2中分离的腐败菌，利用抑菌实验对泡菜中的四种腐败菌进行测定；
步骤4、将步骤3确定种属的四种腐败菌，利用紫外分光光度计进行生长曲线的测定；
步骤5、将步骤3确定种属的四种腐败菌，利用酶标仪进行生物被膜生长的测定。
可选地，所述的群体感应抑制剂为D-核糖和肉桂醛。
可选地，步骤1中，D-核糖浓度为100mmol/L-200mmol/L，肉桂醛浓度为100mmol/L-200mmol/L。
可选地，步骤2中，泡菜液稀释至10-6倍-10-7倍。
可选地，步骤2中，离心条件为1.5mL离心管离心，转速为10000rpm，时间为1min。
可选地，步骤4中D-核糖浓度为1mol/L，肉桂醛浓度为1mol/L。
可选地，步骤4中，紫外分光光度仪在OD600nm下测吸光度值。
可选地，步骤5中，D-核糖浓度为0.2mol/L，肉桂醛浓度为0.1mol/L；0.1％结晶紫溶液、95％乙醇。
可选地，步骤5中，酶标仪在OD590nm下测吸光度值。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明的群体感应抑制剂作为一类新型防腐保鲜剂，为四川泡菜的防腐保鲜提供了一种更有效的可能。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明D-核糖对泡菜菌群的影响；
图2是本发明肉桂醛对泡菜菌群的影响；
图3是本发明D-核糖和肉桂醛对泛菌属(wmz-13)生长情况的影响；
图4是本发明D-核糖和肉桂醛对泛菌属(wmz-15)生长情况的影响；
图5是本发明D-核糖和肉桂醛对泛菌属(wmz-18)生长情况的影响；
图6是本发明D-核糖和肉桂醛对腐生葡萄球菌(wmz-19)生长情况的影响；
图7是本发明泛菌属(wmz-13)生物被膜；
图8是本发明泛菌属(wmz-15)生物被膜；
图9是本发明泛菌属(wmz-18)生物被膜；
图10是本发明腐生葡萄球菌(wmz-19)生物被膜。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1D-核糖对泡菜中腐败菌群的调控作用
1.泡菜中菌的富集
收集泡菜样品，不同泡菜样品标记编号(1、2、3、4、5、6、7、8)。
D-核糖实验组。吸取1号泡菜液于10mL培养管中，加入群体感应抑制剂D-核糖使浓度为100mmoL/L、200mmoL/L，标记编号D1-100mm、D1-200mm。8组样品，重复上述操作，依次编号，共16次。
空白对照。吸取1号泡菜液于10mL培养管中，不加入群体感应抑制剂群体感应抑制剂，标记编号对照1。8组样品，重复操作，依次编号，共8次。
将上述所有样品室温条件下培养1个月。
富集样品。将对照1离心，去上清液后，把对照2转入对照1，再次离心，去上清。依次直到将对照8加入后离心去上清，标记为对照组，放冷冻室保存。所有加入D-核糖的样品如上述操作富集在一起。
2.测序：运用Illumina MiSeq对泡菜液中加入群体感应抑制剂以及不加入群体感应抑制剂的微生物菌落进行了测定：
DNA抽提：经过PCR操作提取出DNA产物后，通过琼脂糖凝胶电泳检测抽提出的PCR产物。
PCR扩增按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。从具有代表性的样品中随机选取几组进行预实验，确保绝大多数样本能够在最低循环数条件下扩增出浓度合适的产物。
所有样本按照正式实验条件进行，每个样本重复三次，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱。
荧光定量：根据琼脂糖凝胶电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。进行Miseq测序，其步骤如下：
把DNA片段其中一端固定到芯片上，并且把这端与引物碱基互补；
把DNA片段作为模板，固定在芯片上的碱基序列为引物进行PCR合成，在芯片上合成需要的DNA片段；变性、退火后，芯片上DNA片段的未固定的一端随机与附近的另外一个引物互补，随即也固定在芯片上；
PCR扩增，产生DNA簇；
DNA扩增后变为单链；
加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；
用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复粘性，继续聚合核苷酸；
统计所有收集到的荧光信号结果，得到模板DNA片段的序列。
3.菌落结构柱状图分析
根据图1所示，对照组(1)中除了含有主要的片球菌和非乳杆菌之外，还含有其他的杂菌，而D-核糖组(3)中除了片球菌和非乳杆菌之外，其他微生物含量相对丰度较低。并且片球菌和非乳杆菌的含有比例也发生了变化。由此可以初步判定，D-核糖对泡菜菌群具有调控作用。
二、生长曲线的测定
1.菌的分离，活化与鉴定
菌的分离：收集的泡菜液稀释至10-6倍、10-7倍，涂布于LB固体培养基平板上。30℃培养1-2天。观察菌的生长情况，从中挑取生长状况良好的单菌落进入LB液体培养基培养。培养24h后，把长势较好的培养管放入4℃冰箱保存。
菌的活化：从之前培养的菌液吸取50μL到10mL离心管，加入LB液体培养基至5mL，一一对应编号(1至20号)。震荡培养24h以上。
菌的测定：利用抑菌实验测定上述20号长势较好的的菌，其中13号、15号和18号菌都属泛菌属，而19号菌属腐生葡萄球菌。
2.接种与取样
对照组加入13号原始菌液200μL，再加入LB液体培养基至20mL；D-核糖组加入13号原始菌液200μL，1mol/L的D-核糖溶液4mL，再加入LB液体培养基至20mL。上述样品每隔2h取一次样，至36h，共18次。
15号、18号和19号菌的接种同上述操作。
用紫外分光光度仪在OD600nm下测吸光度值，按照时间顺序排列，做出相应的生长曲线。
3.生长曲线及分析
从曲线图来看，加入了D-核糖的菌的生长曲线都明显低于未加入D-核糖的菌的生长曲线，说明了D-核糖对四种菌的生长都有明显的调控，结合实验例1的结果分析，可以进一步确定，D-核糖对腐败菌的生长有较好的调控作用。
三、生物被膜形成情况的测定
利用实施例1，步骤二中测定的四种菌。
1.制备
配置1mol/l的D-核糖母液，用0.45μm的过滤器过滤，装入试剂瓶备用。
准备8个10mL的EP管，标号为1-8，2个为1组，共4组，向第一组其中1号管中加入2mL(LB液体培养基)+20μL(13号菌液)，2号管中加入1.6mL(LB液体培养基)+20μL(菌液)+400μL(0.2mol/l的D-核糖)，第二、三、四组管中，除了菌液换成15、18、19号菌液外其余不变，摇匀。将96孔板侧面标号1-8，在孔板1号那一列加入1号管中液体，每个孔加200μL，在孔板2号那一列加入2号管中液体，每个孔加200μL，以此类推。加完之后，将孔板的板盖上，将其静置放在培养箱里36h。
2.测吸光值
取出孔板，倒掉液体，在蒸馏水中浸泡两次，倒扣晾干后，每个孔加入0.1％结晶紫，染色30min后，倒掉，倒扣晾干后加入95％乙醇，然后用酶标仪在OD595nm下测吸光度值。
3.酶标仪测定
将96孔板放入酶标仪。编辑检验项目，波长调整为590nm。震板选择“不震”。选择检验项目，酶标板布局A1为空白，其余全选为样本。执行读板扫描并显示吸光度读数。
4.生物被膜结果分析
观察每组数据，去掉每组最大最小值，制成柱状图
泛菌属(13)：如图7所示，泛菌属(13)在加入了群体感应抑制剂D-核糖之后，其生物被膜吸光度值为0.3533，对比未加入群体感应抑制剂对照组的吸光度值3.1325，降低了7.9倍，作用效果非常明显。
泛菌属(15)：如图8所示，泛菌属(15)在加入了群体感应抑制剂D-核糖之后，其生物被膜吸光度值为0.40185，对比未加入群体感应抑制剂的对照组吸光度值1.9143，降低了3.8倍，作用效果也较明显。
泛菌属(18)：如图9所示，泛菌属(18)在加入了群体感应抑制剂D-核糖之后，其吸光度值为0.3135，对比未加入群体感应抑制剂的对照组的吸光度值2.8052，降低了7.9倍，作用效果非常明显。
腐生葡萄球菌(19)：如图10所示，腐生葡萄球菌(19)在加入了群体感应抑制剂D-核糖之后，其吸光度值分别为0.3058，对比未加入群体感应抑制剂的对照组的吸光度值2.8567，降低了8.3倍，作用效果很明显。
综合上述结果分析，群体感应抑制剂D-核糖四种腐败菌的生物被膜形成有很好的调控作用。
实施例2肉桂醛对泡菜中腐败菌群的调控作用
一、微生物多样性的研究
1.泡菜中菌的富集，
2.测序，具体操作步骤如实施例1所示。
3.菌落柱状图分析
根据图2所示，对照组(1)和肉桂醛组(2)中均含有杂菌，菌群结构基本没发生改变。由此可以初步判定，肉桂醛对泡菜菌群中的杂菌没有调控作用或者调控作用不明显。
二、生长曲线的测定
1.接种与取样，具体操作步骤如实施例1所示。
对照组加入13号原始菌液200μL，再加入LB液体培养基至20mL；肉桂醛组加入13号原始菌液200μL、1mol/L的的肉桂醛溶液2mL，再加入LB液体培养基至20mL。上述样品每隔2h取一次样，至36h，共18次。
15号、18号和19号菌的接种同上述操作。
2.生长曲线及分析
从曲线图来看，加入了肉桂醛的菌的生长曲线有所不同。其中泛菌属(13)和泛菌属(15)在加入了肉桂醛之后，前中期的吸光度值很高，但在后期的时候，依旧低于了未加入群体感应抑制剂组的曲线。而泛菌属(18)和腐生葡萄球菌(19)的肉桂醛组曲线从始至终都高于未加入群体感应抑制剂组的曲线。
但就曲线的涨幅来看，四种菌的肉桂醛组曲线涨幅都低于未加入群体感应抑制剂组曲线的涨幅。分析肉桂醛组曲线起点高，涨幅小的原因，可能是由于肉桂醛作为群体感应抑制剂本身有一定的吸光度值，虽然在实验时，做了未加入菌的肉桂醛对照组，但由于溶液中的肉桂醛容易沉淀，导致实验结果显示的肉桂醛组曲线起点偏高。
并且大量研究发现，肉桂醛是具有杀菌消毒防腐功效的。由此可以认为肉桂醛对腐败菌是具有调控作用的。
三、生物被膜形成情况的测定
1.制备
准备8个10mL的EP管，标号为1-8，2个为1组，共4组，向第一组其中1号管中加入2mL(LB液体培养基)+20μL(13号菌液)，2号管中加入1.8mL(LB液体培养基)+20μL(菌液)+200μL(0.1mol/l的肉桂醛)，第二、三、四组管中，除了菌液换成15、18、19号菌液外其余不变，摇匀。
将96孔板侧面标号1-8，在孔板1号那一列加入1号管中液体，每个孔加200μL，在孔板2号那一列加入2号管中液体，每个孔加200μL，以此类推。加完之后，将孔板的板盖上，将其静置放在培养箱里36h。
2.测吸光值，
3.酶标仪测定，具体操作步骤如实施例1所示。
4.生物被膜结果分析
观察每组数据，去掉每组最大最小值，制成柱状图
泛菌属(13)：如图7所示，泛菌属(13)在加入了群体感应抑制剂肉桂醛之后，其生物被膜吸光度值为0.3137，对比未加入群体感应抑制剂对照组的吸光度值3.1325，降低了8.9倍，作用效果非常明显。
泛菌属(15)：如图8所示，泛菌属(15)在加入了群体感应抑制剂肉桂醛之后，其生物被膜吸光度值为0.3305，对比未加入群体感应抑制剂的对照组吸光度值1.9143，降低了4.8倍，作用效果也较明显。
泛菌属(18)：如图9所示，泛菌属(18)在加入了群体感应抑制剂肉桂醛之后，其吸光度值为0.2577，对比未加入群体感应抑制剂的对照组的吸光度值2.8052，降低了9.9倍，作用效果非常明显。
腐生葡萄球菌(19)：如图10所示，腐生葡萄球菌(19)在加入了群体感应抑制剂肉桂醛之后，其吸光度值分别为0.4180，对比未加入群体感应抑制剂的对照组的吸光度值2.8567，降低了5.8倍，作用效果很明显。
综合上述结果分析，群体感应抑制剂肉桂醛对四种腐败菌的生物被膜形成都有很好的调控作用。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种群体感应抑制剂在泡菜防腐保鲜中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、运用Illumina MiSeq对泡菜液中加入群体感应抑制剂以及不加入群体感应抑制剂的微生物菌落进行了测定；
步骤2、利用LB固体培养基培养稀释后的泡菜液，分离出单菌落移至LB液体培养基培养，离心处理后，用去离子水继续离心处理；分离泡菜液中的腐败菌；
步骤3、将步骤2中分离的腐败菌，利用抑菌实验对泡菜中的四种腐败菌进行测定；
步骤4、将步骤3确定种属的四种腐败菌，利用紫外分光光度计进行生长曲线的测定；
步骤5、将步骤3确定种属的四种腐败菌，利用酶标仪进行生物被膜生长的测定。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的群体感应抑制剂为D-核糖和肉桂醛。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1中，D-核糖浓度为100mmol/L-200mmol/L，肉桂醛浓度为100mmol/L-200mmol/L。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2中，泡菜液稀释至10-6倍-10-7倍。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2中，离心条件为1.5mL离心管离心，转速为10000rpm，时间为1min。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤4中D-核糖浓度为1mol/L，肉桂醛浓度为1mol/L。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤4中，紫外分光光度仪在OD600nm下测吸光度值。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤5中，D-核糖浓度为0.2mol/L，肉桂醛浓度为0.1mol/L；0.1％结晶紫溶液、95％乙醇。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤5中，酶标仪在OD590nm下测吸光度值。
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| CN111838295A (zh) * | 2020-08-07 | 2020-10-30 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种基于群体感应抑制剂桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法 |
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| CN102706821A (zh) * | 2012-06-15 | 2012-10-03 | 广东工业大学 | 一种食源菌生物被膜形成抑制剂的快速鉴定方法 |
| CN106754506A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 四川东坡中国泡菜产业技术研究院 | 一种低盐泡菜微生态添加剂及其制备方法 |
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