CN108342465A - 一种基于高通量测序检测作物根际原核微生物的方法 - Google Patents
一种基于高通量测序检测作物根际原核微生物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108342465A CN108342465A CN201810180946.9A CN201810180946A CN108342465A CN 108342465 A CN108342465 A CN 108342465A CN 201810180946 A CN201810180946 A CN 201810180946A CN 108342465 A CN108342465 A CN 108342465A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- soil
- rdna
- root
- rhizosphere
- soybean
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 61
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 22
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 20
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 17
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 9
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 239000003864 humus Substances 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 2
- 238000009499 grossing Methods 0.000 claims description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 7
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000425347 Phyla <beetle> Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004178 biological nitrogen fixation Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007269 microbial metabolism Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002186 septum of brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 244000148755 species properties Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000003971 tillage Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明是一种基于16S rDNA高通量测序检测不同作物根际土壤原核微生物的方法，由以下步骤构成：1.采集不同基因型作物在各发育时期的根区外或根系抖落土壤(作为系统对照)及根际土壤；2.从各样品土壤中提取微生物总DNA；3.用双标签引物法做PCR扩增上述总DNA中16S rDNA的V5‑V7高变区片段以构建文库；4.对合格文库用Illumina Miseq平台做双末端300核苷酸模式的边合成边测序；5.得到纯净的成对READS后拼接，每样品产出至少4万条有效TAG用于聚类成可操作分类单元；6.据系统对照，准确测定各样品根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度显著性分析，并比较不同作物之间的异同。
Description
技术领域
本发明属于土壤微生物学技术领域，具体涉及大田种植方式下，一种基于16SrRNA基因(V5-V7高变区)深度高通量测序检测不同作物根际土壤微生物的方法。
背景技术
根际(Rhizosphere)被定义为紧密围绕着有生命力植物根系的生物活性区域，其中包含大量微生物，包括细菌、真菌和放线菌，也包括一些藻类和病毒等，范围一般为距离根表面1cm以内。不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物会对根际微生物的生长繁殖产生影响；而根际微生物又参与土壤中有机物质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环等多种生理生化过程，尤其是其中的固氮菌群，通过生物固氮作用在常温下把氮气转化为能被植物利用于合成各种氨基酸的氨。土壤根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异等不仅受到植物根系影响，也受土壤类型、农业耕作管理、季节变化、重金属污染、杀虫剂处理等影响。另外不同的检测技术对根际微生物群落指标的准确性也有影响。因此，准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础。
传统的用于研究微生物的分离培养法主要有平板培养法和显微镜观察等方法，虽然简单方便，至今仍然是一种不可替代的研究手段，但也存在一些弊端，即上述方法无法研究土壤中大量的且不可培养的微生物。BIOLOG微平板分析法适用于检测可培养的且生长速度较快的微生物及其代谢多样性，但是实验结果并不能完全代表原位条件下微生物代谢多样性的结果，样品的处理方法、培养条件以及BIOLOG微平板的类型等都会对结果造成一定程度的误差。醌指纹法的优点是简单快速，因此也被广泛地应用于微生物细胞结构多样性的分析中，但是醌指纹法也存在一些不足，例如它不能具体反映到哪个属、种的微生物多样性变化等。磷脂脂肪酸(PLFA)分析法是基于PLFA是活体细胞膜的一个重要组成部分，含量大约占细胞干重的5％；用PLFA的变化来反映土壤生态系统中微生物的种类组成和数量变化，该方法不需要进行微生物培养，可直接鉴定微生物群落多样性变化，但该方法与PLFA是否完全提取以及操作过程中PLFA是否稳定有着很大的关系。
土壤微生物的遗传多样性是指土壤生态系统中的微生物在基因水平上所携带的遗传物质和遗传信息的总和；与高等生物相比，微生物的遗传多样性更加突出，不同微生物种群间的遗传物质和遗传信息具有非常显著的差异。土壤微生物遗传多样性的分析方法主要包括两类：第一类是基于杂交的分析方法，第二类是基于PCR的分析方法。杂交分析方法是基于核酸分子的碱基互补配对原理，利用特异性的探针与待测样品的核酸分子进行杂交的过程；杂交技术是通过测定DNA重组率或DNA杂交动力相似度来研究土壤微生物的遗传多样性，用于研究微生物遗传多样性的杂交探针主要包括rRNA基因探针、抗性基因探针和编码代谢酶基因探针等，其中应用比较普遍的杂交技术包括荧光原位杂交(Fluorescence inSitu Hybridization，FISH)技术，肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)杂交技术以及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术等，各有优点，但均是低通量的分析方法。
运用PCR技术扩增细菌基因组中的16S rRNA基因(简称16S rDNA)或是真菌基因组中的18S rDNA、ITS区域并测序分析，可以对微生物进行分类鉴定，该技术已经普遍应用到探讨微生物的多样性、鉴定微生物的种类以及系统发育关系等领域。基于PCR的分析方法大致分为三阶段：第一，样品的核酸提取和纯化；第二，目的基因的PCR扩增；第三，扩增片段的变性处理与分析检测，包括聚丙烯酰胺变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性(SSCP)、末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)、核糖体基因间隔区分析(RISA)和自动核糖体间隔区基因分析(ARISA)，或者第三，扩增片段的测序与分析，例如16S rDNA高通量测序技术等。其中，实时荧光定量PCR具有很多优点，如高精度、高灵敏度、高特异性、具有实时性等，但同时也存在一些不足之处，例如成本比较高，操作时还要考虑同源和异源DNA背景、寡核苷酸杂交特异性、荧光染料或特异性探针的浓度以及PCR产物的大小等因素，这些因素都会引起结果的偏差。DGGE是一种利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳的方法将具有相同长度但不同序列组成的核酸片段分离开的技术，虽然已经普遍应用到土壤微生物群落多样性分析的研究领域中，但是该技术也存在一些不足之处，例如可重复性差，耗时耗力，而且只能检测土壤中巨量复杂微生物中的很小一部分等。16S rDNA高通量测序技术，也称为16S rDNA深度测序技术，其原理是因为16S rDNA是原核微生物分类学研究中最常用的系统进化“分子钟”，其序列包含9个高可变区(hypervariable region)和8个保守区(constant region)，可变区序列因原核微生物物种不同而异，且变异程度与原核微生物的系统进化密切相关；即提取样品中微生物的总DNA，然后用16S rDNA的不同高可变区的通用引物进行PCR扩增，获得绝大部分微生物16S rDNA高可变区的扩增产物，构建扩增产物的文库，进行大规模、高通量测序，然后比较分析测序数据，对土壤微生物群落的多样性进行研究。
发明内容
本发明需要解决的问题是克服现有技术检测通量低、规模小、对不可培养微生物的覆盖度低等不足，提供一种基于16S rDNA(V5-V7)高通量测序检测不同作物根际土壤微生物的方法，为不同基因型作物包括转基因作物及其受体品种对根际土壤微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。
本发明的技术方案：
本发明所述基于16S rDNA(V5-V7)高通量测序检测不同作物根际土壤原核微生物的方法，由以下步骤构成：
(1)大田试验地设计，每种基因型作物(例如：大豆、玉米、小麦等)种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m2(5m×4m)，每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株；
(2)先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1-2cm的表土，然后将在盛花期或苗期或鼓粒期或成熟期的作物植株连根从土中取出，取根区外土壤或用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛，于零下20℃-零下70℃保存，再用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除断根及根毛，并于零下70℃保存；
(3)从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子的PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories Inc.，Carlsbad，CA，USA)提取高质量微生物宏基因组DNA；
(4)用双标签融合引物法，其一含P5 Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物16S rDNA的799F(5‘-AACMGGATTAGATACCCKG-3’)，另一引物含P7 Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物16S rDNA的1193R(5‘-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’)，做PCR扩增所述宏基因组DNA中16S rDNA的V5-V7高变区片段(约400bp)以构建文库；
(5)对合格的文库用Illumina Miseq平台进行双末端300个核苷酸(英语缩写为PE300)边合成边测序的高通量测序，并对边合成边测序的读段(英语为READS)进行质量控制；
(6)把纯净的成对READS拼接成TAG，然后聚类成“可操作分类学单元”(英语缩写为OTU)，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析；
(7)以根系抖落土壤或根区外土壤微生物群落的组成、结构及多样性作为系统对照，克服土壤异质性的影响，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同大豆之间的异同。
系统对照为大田种植方式下的大豆根系抖落土壤或根区外土壤，每种基因型作物的系统对照土壤样品至少3个生物学重复，每种基因型作物的根际土壤样品至少3个生物学重复。所述的高质量宏基因组DNA用PowerSoil DNA Isolation Kit提取。其中的土壤样品的均质化在康宁LSE涡旋混合器上以最大转速2850rpm运转10分钟完成。
高通量测序是在Illumina Miseq平台上进行，以PE300模式做16S rDNA的V5-V7高变区片段高通量测序，每个土壤样品DNA至少产出4万条以上CONNECT TAG以用于聚类成OTU。
本发明的有益效果是：16S rDNA(V5-V7)高通量测序方法具有很多优点：首先是大规模、高通量，可以检测到土壤中的绝大部分不可培养的原核微生物种类，其次相比于宏基组高通量测序方法，费用较低(500～600元/样品DNA)，因而可以多方面(不同作物品种植前、苗期、花期、成熟期等多个时期；同一时期各品种多点样品)、直接、原位地研究不同作物对于土壤原核微生物群落组成、结构和遗传多样性的影响。准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础，本发明提供的一种基于16S rDNA高通量测序检测大豆根际土壤原核微生物的方法，为不同基因型作物包括转基因作物及其受体品种对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。该方法检测较全面，操作简便，成本低，结果可靠。
附图说明
图1蒙豆12(MD12)和NZL06-698(N698)大豆根际土壤(Rh)高质量微生物宏基因组DNA的检测结果。
图2蒙豆12(MD12)和NZL06-698(N698)大豆根际土壤(Rh)中原核微生物ALPHA多样性分析结果。
图3蒙豆12(MD12)和NZL06-698(N698)大豆根际土壤(Rh)中原核微生物群落基于OTU的主成分分析(PCA)结果。
图4蒙豆12(MD12)和NZL06-698(N698)大豆根际土壤(Rh)中原核微生物群落的BETA多样性主关联分析(PCoA)结果。
图5蒙豆12(MD12)和NZL06-698(N698)大豆根际土壤(Rh)中超过95％的主要细菌类别，在门(phyla)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图6蒙豆12(MD12)和NZL06-698(N698)大豆根际土壤(Rh)中主要细菌类别在属(genus)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*，p＜0.05；**，p＜0.01。
具体实施方式
1.大豆材料：蒙豆12(对照品种)；NZL06-698含EPSPS耐除草剂基因。
2.田间试验设计：
大田试验地点在吉林省公主岭市，每一种基因型作物(例如大豆)种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m2(5m×4m)。每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株。
3.样品采集
先除去地面杂草和枯枝落叶等，铲除大田土壤表面1cm左右的表土，然后将在盛花期(或苗期、鼓粒期、成熟期)的大豆植株连根从土中取出，用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛等，于零下70℃保存(至少零下20℃保存)；然后用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除根毛等，并于零下70℃保存。
4.土壤样品中微生物宏基因组DNA的提取：
从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子的PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories Inc.，Carlsbad，CA，USA)提取高质量微生物宏基因组DNA(图1)。
5.用双标签融合引物法构建各样品16S rDNA的V5-V7高变区扩增子文库
双标签融合引物对中的一条含P5Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物799F(5‘-AACMGGATTAGATACCCKG-3’)，另一条引物含P7 Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及1193R(5‘-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’)，做PCR扩增所述宏基因组DNA中16S rDNA的V5-V7高变区片段以构建文库。
6.合格文库的高通量测序
对合格的文库用Illumina Miseq平台进行双末端300个核苷酸(PE300)边合成边测序的深度测序，并对边合成边测序的读取序列(READS)进行质量控制。
7.生物信息学内容分析
把纯净的成对READS拼接成TAG，然后聚类成“可操作分类学单元”(OTU)；然后做ALPHA多样性、BETA多样性、群落结构、组成及在不同分类水平上各物种相对丰度差异的显著性分析等。
8.数据整合与比较分析
以根系抖落土壤(SO)或根区外土壤(BS)为对照，准确测定大豆根际土壤(Rh)原核微生物群落的ALPHA多样性(图2)、结构(主成分分析，图3；BETA多样性，图4)、组成及在门分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图5)、在属分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图6)，比较不同品种大豆根际土壤原核微生物群落之间的异同。
Claims (2)
1.一种基于16S rDNA高通量测序检测不同作物(例如大豆、玉米、小麦等)根际土壤原核微生物的方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)大田试验地设计，每一种基因型大豆种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m2，每个小区有两个取样点，每个取样点取三棵或三棵以上植株；
(2)先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1-2cm的表土，然后将在盛花期或苗期或鼓粒期或成熟期的大豆植株连根从土中取出，用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛，于零下20℃-零下70℃保存，再用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除根毛，并于零下70℃保存；
(3)从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子的PowerSoil DNA Isolation Kit提取高质量微生物宏基因组DNA；
(4)用双标签融合引物法，其一含P5 Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物16S rDNA的799F，799F的核苷酸序列是5‘-AACMGGATTAGATACCCKG-3’，另一引物含P7Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物16S rDNA的1193R，1193R的核苷酸序列是5‘-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’，做PCR扩增所述宏基因组DNA中16S rDNA的V5-V7高变区片段以构建文库；
(5)对合格的文库用Illumina Miseq平台进行双末端300个核苷酸边合成边测序的深度测序，并对边合成边测序的读取序列READS进行质量控制；
(6)把纯净的成对READS拼接，至少产出4万条以上有效CONNECT TAG，然后聚类成“可操作分类学单元”。，英语缩写为OTU，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析；
(7)以根区外土壤或根系抖落土壤微生物群落作为系统对照，克服土壤异质性的影响，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同作物根际土壤原核微生物群落之间的异同。
2.根据权利要求1所述一种基于16S rDNA高通量测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法，其特征在于所述的高通量测序是在Illumina Miseq平台上，以PE300模式做16SrDNA的V5-V7高变区片段的高通量测序，每个土壤样品DNA至少产出4万条有效TAG以用于聚类成OTU。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810180946.9A CN108342465A (zh) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | 一种基于高通量测序检测作物根际原核微生物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810180946.9A CN108342465A (zh) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | 一种基于高通量测序检测作物根际原核微生物的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108342465A true CN108342465A (zh) | 2018-07-31 |
Family
ID=62957910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810180946.9A Pending CN108342465A (zh) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | 一种基于高通量测序检测作物根际原核微生物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108342465A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110669835A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-01-10 | 青海民族大学 | 基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法 |
| CN110819704A (zh) * | 2018-08-10 | 2020-02-21 | 塔塔咨询服务有限公司 | 用于改善基于扩增子测序的微生物群落分类学解析的方法和系统 |
| CN110894527A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-03-20 | 东莞市林业科学研究所(广东省林业区域性试验东莞中心、东莞市林业科技推广站) | 一种树木根腐病的评价方法 |
| CN111011146A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-04-17 | 青岛农业大学 | 一种盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法 |
| CN111518729A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-11 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种作物根系微生物组高通量分离培养方法 |
| CN112176047A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-05 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法 |
| CN112251503A (zh) * | 2020-03-17 | 2021-01-22 | 南京大学 | 一种基于16S rDNA全长高通量测序检测根际细菌群落的方法 |
| CN115841847A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-03-24 | 哈尔滨因极科技有限公司 | 一种微生物信息测定及提取系统和方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102643795A (zh) * | 2012-04-05 | 2012-08-22 | 湖北省农业科学院经济作物研究所 | 一种采用pvp预处理提取土壤微生物总dna的方法 |
| CN105525025A (zh) * | 2016-02-17 | 2016-04-27 | 南京大学 | 基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法 |
| CN106754557A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-05-31 | 贵州省烟草公司贵阳市公司 | 枯草芽孢杆菌ybm‑4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用 |
| CN106967800A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-07-21 | 中国科学院微生物研究所 | 一种解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法 |
-
2018
- 2018-03-02 CN CN201810180946.9A patent/CN108342465A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102643795A (zh) * | 2012-04-05 | 2012-08-22 | 湖北省农业科学院经济作物研究所 | 一种采用pvp预处理提取土壤微生物总dna的方法 |
| CN105525025A (zh) * | 2016-02-17 | 2016-04-27 | 南京大学 | 基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法 |
| CN106754557A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-05-31 | 贵州省烟草公司贵阳市公司 | 枯草芽孢杆菌ybm‑4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用 |
| CN106967800A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-07-21 | 中国科学院微生物研究所 | 一种解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BRAM BECKERS等: "Performance of 16s rDNA Primer Pairs in the Study of Rhizosphere and Endosphere Bacterial Microbiomes in Metabarcoding Studies", 《FRONTIERSINMICROBIOLOGY》 * |
| 常安然等: "基于宏基因组学16S rDNA测序对烟草根际土壤细菌群落组成分析", 《中国农业科技导报》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110819704A (zh) * | 2018-08-10 | 2020-02-21 | 塔塔咨询服务有限公司 | 用于改善基于扩增子测序的微生物群落分类学解析的方法和系统 |
| CN111011146A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-04-17 | 青岛农业大学 | 一种盐碱地花生/棉花等幅间作交替轮作种植方法 |
| CN110669835A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-01-10 | 青海民族大学 | 基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法 |
| CN110894527A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-03-20 | 东莞市林业科学研究所(广东省林业区域性试验东莞中心、东莞市林业科技推广站) | 一种树木根腐病的评价方法 |
| CN110894527B (zh) * | 2019-11-22 | 2023-09-19 | 东莞市林业科学研究所(广东省林业区域性试验东莞中心、东莞市林业科技推广站) | 一种树木根腐病的评价方法 |
| CN112251503A (zh) * | 2020-03-17 | 2021-01-22 | 南京大学 | 一种基于16S rDNA全长高通量测序检测根际细菌群落的方法 |
| CN111518729A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-11 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种作物根系微生物组高通量分离培养方法 |
| CN112176047A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-05 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法 |
| CN115841847A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-03-24 | 哈尔滨因极科技有限公司 | 一种微生物信息测定及提取系统和方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108342465A (zh) | 一种基于高通量测序检测作物根际原核微生物的方法 | |
| CN105525025A (zh) | 基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法 | |
| Nübel et al. | Quantifying microbial diversity: morphotypes, 16S rRNA genes, and carotenoids of oxygenic phototrophs in microbial mats | |
| CN107904296A (zh) | 一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法及系统 | |
| CN104711361B (zh) | 快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒 | |
| CN110205404B (zh) | 基于石榴全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用 | |
| CN112251503A (zh) | 一种基于16S rDNA全长高通量测序检测根际细菌群落的方法 | |
| CN105624328A (zh) | 鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用 | |
| CN108753987A (zh) | 一种鲢鳙通用微卫星荧光多重pcr的方法 | |
| CN106498048B (zh) | 一种与大豆结瘤数相关的qtl、snp分子标记及应用 | |
| CN113151567B (zh) | 用于鉴别花脸香蘑n006#菌株的ssr分子标记及方法 | |
| CN109811081A (zh) | 一种利用分子标记辅助选择氮高效粳稻的选育方法 | |
| CN108384879A (zh) | 一种用于西瓜杂交品种纯度鉴定的ssr引物及方法 | |
| CN108384873A (zh) | 用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的ssr标记及方法 | |
| CN106701967A (zh) | 调控玉米叶夹角主效qtl的分子标记及其应用方法 | |
| CN106676176B (zh) | 一种利用多重pcr对四倍体紫花苜蓿进行ssr分析的方法 | |
| CN114181934A (zh) | 绵羊血液基因组dna的提取方法及其应用、绵羊资源群体的遗传多样性评价方法 | |
| CN109811044A (zh) | 接种菌剂玉米的根际原核微生物多样性检测方法 | |
| CN110669835A (zh) | 基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法 | |
| CN105861640B (zh) | 一种快速鉴定食用向日葵杂交种sh338真实性和纯度的方法 | |
| US20020086313A1 (en) | Application of bioinformatics for direct study of unculturable microorganisms | |
| CN105861637B (zh) | 用于快速检测食用向日葵杂交种sh338真实性的试剂盒 | |
| CN113234845B (zh) | 鉴别内蒙古地区主栽枣品种的snp分子标记引物及标记方法 | |
| CN107058496A (zh) | 一种适于大豆磷效率筛选的ssr引物序列及其使用方法 | |
| CN102286618A (zh) | 一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的pcr-dgge技术 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180731 |