CN110894527A - 一种树木根腐病的评价方法 - Google Patents

一种树木根腐病的评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种树木根腐病的评价方法，包括如下步骤：(1)采集根际土壤样品；(2)对步骤(1)所得的土壤样品进行DNA抽提和PCR扩增；(3)Illumina Miseq测序；(4)数据处理，得到真菌群分析结果；(5)建立树木健康等级评价表，结合真菌群分析结果，得出评价结果，判断标准如下，正常：有害菌群＜20％；一般：20％≤有害菌群≤40％；衰弱：40％＜有害菌群＜50％；高危：有害菌群≥50％。本发明能快速、安全及精准地完成对古树根腐病的监测，为树木根腐病的防治、古树名木的保育提供技术支撑。

Description

一种树木根腐病的评价方法
技术领域
本发明涉及植物病况的监测与评价技术领域，特别是涉及一种树木根腐病的评价方法。
背景技术
木腐病即由某些木材腐朽菌引起的活立木树体木质的腐烂。病原菌一般先侵染树体伤口，进而侵染和杀死功能木质部及形成层组织，引起根腐、溃疡乃致树体死亡。从分类学地位看，木材腐朽菌主要是担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)的真菌，其中最主要的病原菌种为有害木层孔菌(Phellinus noxius)，该菌种属于担子菌门，层菌纲，非褶菌目，锈革孔菌科，木层孔菌属，生长最适温度30℃，8℃以下不生长。在PDA培养基上生长迅速，菌落初期白色至草黄色，后变成湖泊褐色至暗褐色，产生特征性不规则暗褐色纹线或凹陷，形成节孢子和毛状菌丝。在自然条件下极少形成担子果。该病原菌寄主范围十分广泛，可危害超过59科200种植物，它是中国大陆的检疫性有害生物之一，因此，加强进出境检验检疫措施，防止病害进一步扩散蔓延的意义重大。根据木材腐朽菌感染的植物部位，木腐病可分为根腐病、叶腐病及茎腐病等。古树的根部往往被较厚的土层覆盖，工作人员不能直接观察到其根腐情况，而根系是植物六大营养器官之一，是植物赖以生存的生命线，主要负责吸收、运输养分及固定植物体。因此，根腐病作为其中一种病发于植物根部的木腐病，是最隐晦、最严重的植物木腐病，制定一种根腐病的监测与评价方法显得十分必要。
此外，古树名木具有是重要的森林资源，生态效益好。古树多为典型乡土树种，对当地气候与土壤条件等环境的适应性强，也是本地绿化种植的首选树种之一。古树名木还有历史文化、生态及观赏等重要价值。
现有技术中，真菌多样性的研究主要利用分离培养及形态学检测的方法，该技术在实验室被广泛使用。传统的真菌分类与鉴定都是基于病原菌的形态学特征，如病原菌危害植物时造成的显著症状表现、菌丝形态、孢子形态等。有些真菌(如木材腐朽菌)一般都能产生大型子实体，运用传统方法进行鉴定时主要根据其子实体的特征进行，包括观察其担子果一年或多年生，菌盖的形状、大小及颜色，菌管的颜色、大小，孔口形状、颜色等；对于一个属或一个种的真菌，有时子实体特征差异极小时，还要结合一些显微特点进行鉴定，比如菌丝结构、生殖菌丝的特点、担孢子等。但是，外观特征是细胞内部基因与外界环境综合作用的结果，不同的外界环境容易导致真菌外观形态的差异，仅仅依靠外观形态特征进行鉴定，有时会造成同物异名或同名异物的现象，引起混乱。尽管各种新的培养技术不断出现，但传统的分离培养及形态学检测法费时费力，敏感度和特异性也较低，不能反映全部的真菌群落信息。国外微生物学家曾根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学研究结果认为：通过实验室人工培养方法已经被分离和描述的自然界中的微生物物种数量仅占估计数量的1％～5％，其余大多数微生物种群还仍然未被分离和认识，因此，人们不能利用传统的微生物培养技术获得真菌多样性的全部信息，极大限制了对微生物研究的广泛性。
近年来，随着分子生物学的发展，真菌分类也从传统的依据形态学特征转变为主要依靠现代生物技术、即相关分子生物学方法进行菌物的鉴定和分类，双管齐下。IlluminaMiseq高通量测序技术能够对环境微生物进行高覆盖率、高深度测序，深入挖掘样本中的信息。
根际土壤真菌是土壤－植物生态系统的重要组成部分，真菌群落的组成及丰度与植物生长发育、土传病害的发生发展密切相关。根腐病是一种通过土传的病害，因而植物根际土壤真菌群落多样性及生态功能已成为根腐病菌鉴定研究的重点。危害植物根部的木材腐朽菌主要、最可能分布在宿主植物成株周围土壤，且致病真菌相对丰度随距植物根部地理距离的增加而递减。古树名木作为根腐病高危植物，其根际土壤真菌多样性的研究目前尚未见报道。
根腐病害的诊断较其它病害困难,一是由于病害在地下发展，初期不易发现，有时甚至根系腐烂过半，地上部分仍能保持“正常”，因而失去了早期防治的机会，当地上部分表现出明显的症状时，往往已是病害的后期；二是根腐病与各种土壤因素的关系极为密切，侵染性根腐病与生理性根腐病极易混淆。例如，当植物的根为环境中某些非生物因素削弱或致死后，弱寄生的微生物或腐生物往往会侵入垂死的或已死的根，所以不管是什么原因致死的根，诊断时总会分离出一些微生物，这些微生物有可能代替真正的病原物盘踞在根组织中、或者与病原物相伴并存。所有这些都给病原的确定带来不少困难，很容易把腐生物或非主要病原误诊为真正的病原物。因此在根腐病防治中，首先必须注意早期的诊断，才能及时地有针对性地采取措施。为了确诊，除根据地上部分的症状特征外，有时还必须辅以挖开根部进行检查或根据病根长出的子实体来判断，但是，这个时候其下面的根部已经出现腐烂。因此，现有技术无法在早期及时判断树木的患病情况，进而不能在树木患病的早期针对性地采取防治方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中对树木根腐病的检测和评估不准确等问题，提供一种树木根腐病的评价方法，本发明应用Illumina高通量测序技术分析疑似患病树木的根际土壤真菌多样性，根据分析结果对树木进行根腐病评价及健康状况分级。采集根际土壤样本操作简便，Illumina高通量测序技术相较传统菌种鉴定法更加高效准确，能快速、安全及精准地完成对树木根腐病的监测，为树木根腐病的防治、古树名木的保育提供技术支撑。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种树木根腐病的评价方法，包括如下步骤：
(1)采集根际土壤样品；
(2)对步骤(1)所得的土壤样品进行DNA抽提和PCR扩增；
(3)Illumina Miseq测序；
(4)数据处理，得到真菌群分析结果；
(5)建立树木健康等级评价表，结合真菌群分析结果，得出评价结果，判断标准如下，正常：有害菌群＜20％；一般：20％≤有害菌群≤40％；衰弱：40％＜有害菌群＜50％；高危：有害菌群≥50％。
可选地，所述步骤(5)中，将测序发现有木层孔菌的树木评定为患病。本发明发现，木层孔菌一经测出即可定义为患病株，患病之严重程度与其含量有关，一旦高通量检测发现木层孔菌，树木将逐渐出现叶片稀疏凋零，树基及根部有黄色、深褐色至黑褐色菌丝面。木材变褐色并长出褐色网状线纹。最后根部腐败无法输送水份，严重时全株萎凋枯死。
可选地，所述步骤(5)中，判断为衰弱时，还包括有益菌群＜15％。
可选地，所述步骤(5)中，判断为高危时，还包括腐朽菌≥70％。
可选地，所述步骤(5)中，所述有害菌群包括马杜拉分支菌属、柄孢壳属、Ilyonectria、小贝氏孢属、丝衣霉属、透孢黑团壳属及含腐朽菌在内的61个属。
可选地，所述步骤(5)中，所述有益菌群包括毛孢子菌属、隐球菌属、毛壳菌属、绿僵菌属、塔拉霉属、拟盾壳霉属等11个属。
可选地，所述步骤(5)中，所述腐朽菌包括伞菌属、鬼伞属、小包脚菇属、灰球菌属、镰刀霉属、瓶霉属等40个属。
可选地，所述树木为亚热带地区乡土树种，包括但不限于行道树、园林树等，具体可以是古树或其它树种。
可选地，所述树木为榕树，包括但不限于斜叶榕、海红豆、凤凰木、细叶榕、高山榕、印度榕。本发明对于亚热带地区乡土树种均适用。
可选地，所述步骤(4)包括如下步骤：
(4.1)利用质控软件对步骤(3)所得的原始测序序列进行筛选，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50bp的序列；
(4.2)精确匹配条形码，去除模糊碱基；
(4.3)根据重叠碱基，将两端序列进行拼接，重叠碱基＞10bp，去除无法拼接的序列；
(4.4)根据指定的相似度，对序列进行OTU聚类，产生可操作性分类单元(operational taxonomic units,OTUs)，剔除嵌合体，对每条序列进行物种分类注释，比对真菌数据库，得到真菌群分析结果；真菌数据库具体可以为Unite ITS数据库。
可选地，所述步骤(4.1)中，所述质控软件为Trimmomatic软件，也可以为其它质控软件。
可选地，所述步骤(4.3)中，拼接时，采用的软件为FLASH软件，也可以为其它拼接软件。
可选地，所述步骤(4.4)中，OTU聚类时使用的软件为UPARSE软件。
可选地，所述步骤(4.4)中，所述指定的相似度为97％。
可选地，所述步骤(4.4)中，使用UCHIME软件剔除嵌合体，也可以为其它软件。
可选地，所述步骤(4.4)中，利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，设置比对阈值，比对Unite ITS数据库。上述软件不限于RDP classifier，也可以为其它软件。
可选地，所述步骤(4.4)中，所述对比阈值为70％，该对比阈值可根据实际情况调整。
可选地，所述步骤(1)中，取疑似褐根病病变根的表面0.5～1 cm土壤。
可选地，所述步骤(2)中，利用E.Z.N.A.
Figure BDA0002304785250000041
soil试剂盒提取DNA，不限于前述试剂盒，也可以采用其它类似的试剂盒。
可选地，所述步骤(2)中，PCR扩增时，采用的引物含有如下序列：ITS3F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'(SEQ ID NO：1)；
ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO：2)。
可选地，所述步骤(2)中，PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，27个循环，最后72℃延伸10min。
可选地，所述步骤(2)中，PCR扩增体系为20μl，其组成如下：4μl 5*FastPfu缓冲液，2ul 2.5mM dNTPs，0.8μl 5μM引物，0.4μl FastPfu聚合酶；10ng DNA模板。
本发明具有以下有益效果：
本发明应用Illumina高通量测序技术分析疑似患病树木的根际土壤真菌多样性，根据分析结果对树木进行根腐病评价及健康状况分级。采集根际土壤样本操作简便，Illumina高通量测序技术相较传统菌种鉴定法更加高效准确，能快速、安全及精准地完成对树木根腐病的监测，为树木根腐病的防治、古树名木的保育提供技术支撑。
附图说明
图1显示为本发明实施例1的真菌(种水平)分析结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例旨在通过野外采集土壤样本进行土壤真菌多样性检测，以东莞及香港为例，勘查东莞及香港两地疑似患病的细叶榕(古树)，提供一种有关细叶榕(古树)根腐病的快速监测与评价方法，本发明也适用于其它古树名木或亚热带地区乡土树种根腐病菌的检测鉴定和防治。
实施例1
(一)样品采集
1、根际土壤
寻找疑似褐根病病变根的表面0.5～1cm土壤，将根截断并取出带根土块，再取其表面土壤或直接使用取土器取土。
2、主要工具
(1)取样器：铁铲；
(2)消毒及拭擦：75％酒精、灭菌纱布；
(3)去杂质：20目标准筛；
(4)标号及保存：记号笔、无菌密封袋、干冰。
3、土壤采集
(1)观察：环视待取样古树四周，找到疑似发病的根部组织；
(2)工具消毒：事先对取样器进行消毒灭菌处理(酒精拭擦)；
(3)采样：顺沿发病组织根部挖开取样穴(深度为5～20cm)，取走侧根或须根系表面0.5～1cm范围内的土壤；
(4)样本重量：采集植物根际土壤约5～10g；
(5)纯化处理：去除植物根、动物残骸及其他杂质，较硬或成块的土壤需破碎并过筛；
(6)储藏：将处理后的土壤装在无菌密封袋中，低温运至实验室备用。
(7)注意事项：此为真菌根际土壤，需尽可能去除菌丝体残留，减少对DNA/RNA提取的干扰。
(二)实验内容
1、DNA抽提和PCR扩增
根据E.Z.N.A.
Figure BDA0002304785250000061
soil试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；采用ITS3F(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'，SEQ ID NO：1)和ITS4R(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，SEQ ID NO：2)引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最后72℃延伸10min(PCR仪：ABI GeneAmp
Figure BDA0002304785250000062
9700型)。扩增体系为20μl，其组成如下：4μl 5*FastPfu缓冲液，2ul 2.5mM dNTPs，0.8μl引物(5μM)，0.4μl FastPfu聚合酶；10ng DNA模板。
2、Illumina Miseq测序
使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2％琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina,San Diego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库。构建文库步骤如下：(1)连接“Y”字形接头；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序。原始数据上传至NCBI数据库中。
(三)数据处理
使用Trimmomatic软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接，步骤如下：
(1)设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50bp的序列；
(2)精确匹配barcode(条码)，允许引物中2个碱基的错配，去除模糊碱基；
(3)根据重叠碱基overlap，将两端序列进行拼接，overlap需大于10bp。去除无法拼接的序列。
(4)使用UPARSE软件(version 7.1，http://drive5.com/uparse/)，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对Unite ITS数据库，设置比对阈值为70％。
(四)分析评价
1、真菌群含量组成分析
根据以下真菌库及参考文献，结合外业调查，对根际土壤的真菌进行分类，分为有害真菌群与有益真菌群，其中有害真菌群分为木材腐朽菌群与其它有害真菌群，并分析各类真菌群含量。
真菌库及参考文献如下：
(1)《木材腐朽菌数据库》(国家林业和草原科学数据中心)；
(2)《福州古树名木健康状况调查及木材腐朽菌的研究》(李央央.福州古树名木健康状况调查及木材腐朽菌的研究[D].福建农林大学,2014.)；
(3)《台湾褐根病发生情况及研究进展》(林石明,廖富荣,陈红运,陈青,陈华忠.台湾褐根病发生情况及研究进展[J].植物检疫,2012,26(06):54-60.)；
(4)《森林红壤微生物的功能生态学分析及宏基因组文库构建》(黄钦耿.森林红壤微生物的功能生态学分析及宏基因组文库构建[D].福建师范大学,2009.)；
(5)《大型真菌与立木腐朽》(李姝江,朱天辉.大型真菌与立木腐朽[J].四川林业科技,2011,32(01):59-64.)。
2、根据分析结果，进行健康状况等级评价
(1)真菌群含量组成分析结果如图1所示；
(2)香港古树名木真菌群分类与健康评价如表1所示。
表1香港古树名木土壤菌群分类与健康评价
Figure BDA0002304785250000071
Figure BDA0002304785250000081
基于图1所示的真菌群分析结果，结合层次分析法，建立古树名木健康等级评价表，如表2所示。
表2古树健康等级评价表
Figure BDA0002304785250000082
评定为正常级的古树名木比较健康，树木表面损伤可能会影响边材导水通道，典型的症状出现在树冠，可能会有枯枝掉落，会对人及财产造成损害。例如细叶榕(编号：LCSD_N_38，参见香港政府一站通《古树名木册》，也可参考广东省古树名木信息管理系统，整体上长势良好，但是存在一些枯枝。
评定为一般级的古树名木也比较健康，但是树上会出现一定范围的损伤。例如细叶榕(编号：LCSD_N_31)，整体上长势良好，但是有一些枯枝和空洞。
评定为衰弱级的古树名木中高度损伤，树木会出现更大范围的损伤，树木衰变，木材形成层活动减慢。例如细叶榕(编号：LCSD_YTM_18)，整体长势差，树冠稀疏，枯枝较多。
评定为高危级的古树名木损伤严重，其中ASD_WCH_2(印度榕)与LCSD_YTM_91(细叶榕)两株古树已确诊患木腐病(褐根病)，树木即将对人及财产造成严重威胁。例如细叶榕(编号：LCSD_YTM_66)，整体长势很差，树冠多处被截枝，树身出现多处空洞，倒伏的可能性增强。
本实施例应用Illumina高通量测序技术分析疑似患病古树根际土壤真菌多样性，根据分析结果对13株古树进行根腐病评价及健康状况分级。采集根际土壤样本操作简便，Illumina高通量测序技术相较传统菌种鉴定法更加高效准确，能快速、安全及精准地完成对细叶榕等古树根腐病的监测，为树木根腐病的防治、古树名木的保育提供技术支撑。本发明实施例的全过程用时5～7天，现有方法主要是组织培养与菌株鉴定，需时约1个月。
综上所述，本发明实施例采集根际土壤全过程操作简单，不伤及植物组织，也不影响植物生存环境，可行性高。采用Illumina Miseq高通量测序技术，对健康及疑似发病的细叶榕等古树根际土壤真菌群落组成的多样性进行对比分析，为古树名木褐根病的染病评估分级提供有效的方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种树木根腐病的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集根际土壤样品；
(2)对步骤(1)所得的土壤样品进行DNA抽提和PCR扩增；
(3)Illumina Miseq测序；
(4)数据处理，得到真菌群分析结果；
(5)建立树木健康等级评价表，结合真菌群分析结果，得出评价结果，判断标准如下，正常：有害菌群＜20％；一般：20％≤有害菌群≤40％；衰弱：40％＜有害菌群＜50％；
高危：有害菌群≥50％。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述步骤(5)中，将测序发现有木层孔菌的树木评定为患病。
3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述步骤(5)中，判断为衰弱时，还包括有益菌群＜15％。
4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述步骤(5)中，判断为高危时，还包括腐朽菌≥70％。
5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述步骤(5)中，所述有害菌群包括马杜拉分支菌属、柄孢壳属、Ilyonectria、小贝氏孢属、丝衣霉属、透孢黑团壳属及腐朽菌，所述腐朽菌包括伞菌属、鬼伞属、小包脚菇属、灰球菌属、镰刀霉属、瓶霉属。
6.根据权利要求3所述的评价方法，其特征在于：所述步骤(5)中，所述有益菌群包括毛孢子菌属、隐球菌属、毛壳菌属、绿僵菌属、塔拉霉属、拟盾壳霉属。
7.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述树木为亚热带地区乡土树种。
8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于：所述树木为榕树，所述榕树包括斜叶榕、海红豆、凤凰木、细叶榕、高山榕、印度榕。
9.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述步骤(4)包括如下步骤：
(4.1)利用质控软件对步骤(3)所得的原始测序序列进行筛选，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50bp的序列；
(4.2)精确匹配条形码，去除模糊碱基；
(4.3)根据重叠碱基，将两端序列进行拼接，重叠碱基＞10bp，去除无法拼接的序列；
(4.4)根据指定的相似度，对序列进行OTU聚类，产生可操作性分类单元(operationaltaxonomic units,OTUs)，剔除嵌合体，对每条序列进行物种分类注释，比对真菌数据库，得到真菌群分析结果。
10.根据权利要求9所述的评价方法，其特征在于：所述步骤(4.1)中，所述质控软件为Trimmomatic软件；
和/或，所述步骤(4.3)中，拼接时，采用的软件为FLASH软件；
和/或，所述步骤(4.4)中，OTU聚类时使用的软件为UPARSE软件，所述指定的相似度为97％，使用UCHIME软件剔除嵌合体，利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，设置比对阈值，比对Unite ITS数据库，所述对比阈值为70％；
和/或，所述步骤(1)中，取疑似褐根病病变根的表面0.5～1cm土壤；
和/或，所述步骤(2)中，PCR扩增时，采用的引物含有如下序列：
ITS3F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'(SEQ ID NO：1)；
ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO：2)；
和/或，所述步骤(2)中，所述步骤(2)中，PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，27个循环，最后72℃延伸10min；
和/或，所述步骤(2)中，PCR扩增体系为20μl，其组成如下：4μl 5*FastPfu缓冲液，2μl2.5mM dNTPs，0.8μl 5μM引物，0.4μl Fast Pfu聚合酶；10ng DNA模板。
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