CN107287293A - 一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，先提取环境样品中的DNA，获取DNA样品，通过实时荧光定量PCR方法测定DNA样品中的分类基因总浓度，再通过第二代高通量测序方法获得环境样品中微生物不同界、门、纲、目、科、属、种的分类基因相对丰度，最后将DNA样品的分类基因总浓度与微生物不同界门纲目科属种的分类基因的相对丰度相乘，计算得到微生物不同界门纲目科属种的分类基因的绝对丰度，实现了微生物群落结构绝对丰度的高通量快速测定，使得跨样本比较更为可靠，实质反映物种的增长与减少，为进一步探究微生物群落结构提供技术支撑。

Description

一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法
技术领域
本发明涉及微生物生态学领域，具体涉及一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法。
背景技术
微生物是生态环境系统中重要的组成部分，在地球物质循环和能量流动中发挥了至关重要的作用，因其丰富的物种多样性，基因多样性及生态系统多样性，具有较大的挖掘潜质，一直备受研究者关注。据估计，地球中微生物数量约为4-6×1030个细胞，种类多达106种。
对微生物群落结构的研究是环境微生物生态学的研究基础，在过去的百年中，科学家对于环境微生物群落结构进行了广泛的研究，研发了例如平板计数、显微镜观察、磷脂脂肪酸分析、变性梯度凝胶电泳等多种方法。这些方法都有其优势，例如平板计数，可以非常直观的观察到环境微生物群落结构中不同的微生物以及其数量。但是由于环境中可培养的微生物仅有1％-15％，极大的限制了平板计数的观察能力。
近些年来随着第二代高通量测序技术，如Illumina测序平台等的发明，使得基因测序的通量极大的提高，最高一天可达1.5Gb数据量。这也让应用第二代高通量测序技术研究微生物群落结构的方法替代了先前的研究方法，成为了研究环境细菌群落结构最新的研究方法。然而，第二代高通量测序技术只能获取DNA样品序列数量，从而算出环境细菌群落结构的百分比信息，换而言之，只能获取环境微生物群落结构相对丰度信息。
描述生态学研究主要有三个要素分别为物种绝对丰度、相对丰度以及物种种类数。三者之间相互关联，但又彼此独立。主要体现在相对丰度可以通过单个物种的绝对丰度除以整个群体总量来换算成单个物种的相对丰度。但是两者对于描述单个物种的功能不同，绝对丰度可以用于描述单个物种的绝对含量，表征其在不同或相同的环境群落里数量的增减；相对丰度主要用于描述单个物种占整个环境群落的百分比，描述单个物种的优势程度，而无法用于跨样本间的比较。例如，物种X在样本A和样本B中分别占有10％和3％的比例，当样本A、B微生物总量一致时，A样本中的物种X绝对丰度多于B样本；若A样本(108cellsg-1)中微生物总量少于B样本(109cells g-1)时，A样本中的物种X绝对丰度则少于B样本。
由于受到技术等方面的限制，研究者只能借助高通量测序手段获得群落结构的相对丰度信息，以此来表征环境微生物的增减变化，为更为精确和快速的表征环境微生物的群落结构变化，亟待开发一种既能快速获得微生物群落结构信息，同时能准确了解微生物群落结构绝对丰度信息的技术，从而弥补现有技术方法的不足，对于更为全面研究与了解环境微生物群落结构及其生态学具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，有利于完善环境细菌绝对丰度、群落结构及数量生态学的研究，从而进一步研究利用环境细菌。
本发明提供一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，包括如下步骤：
(1)提取环境样品中的DNA，获取DNA样品；
(2)通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法测定DNA样品中的分类基因总浓度；
(3)通过第二代高通量测序方法对DNA样品进行分类基因扩增子高通量测序，获得环境样品中微生物不同分类单元(界、门、纲、目、科、属、种)的分类基因相对丰度；
(4)将步骤(2)的DNA样品中的分类基因总浓度与步骤(3)的微生物不同界门纲目科属种的分类基因的相对丰度相乘，计算得到微生物不同界门纲目科属种的分类基因的绝对丰度，从而获得环境中微生物群落的绝对丰度。
所述的步骤(1)中，采取的环境样品采用MoBio DNA提取试剂盒进行DNA的提取，操作步骤按照试剂盒标准流程。
所述的步骤(2)中，所测微生物为细菌或古菌时，分类基因为16S rRNA基因；所测微生物为真菌时，分类基因为ITS基因。
所述的步骤(2)中，包括如下步骤：
(2-1)制备质粒标准样品；
(2-2)计算质粒标准品的拷贝数；
(2-3)样品分类基因浓度qPCR测定。
所述的制备质粒标准样品包括如下步骤：
(2-1-1)选用相应的引物对分类基因进行PCR扩增，获取目的基因片段；
(2-1-2)采用TA克隆试剂盒将(2-1-1)中目的基因片段与质粒载体相连，并将该质粒载体导入DH5α感受态细胞中；
(2-1-3)将(2-1-2)中50μL含有质粒的DH5α感受态细胞置于300μL液体LB培养基中，在37℃、250rpm条件下培养1h；
(2-1-4)吸取200μL(2-1-3)中培养液，涂布于含有终浓度为100μg mL-1氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃静置过夜培养；
(2-1-5)随机挑选6-8个重组单克隆菌落分别涡旋于10μL无菌水中；
(2-1-6)分别吸取1μL(2-1-5)中菌悬液作为模板采用M13引物(正向引物：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；反向引物：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)进行PCR扩增，并对所得的PCR产物进行测序，剩余9μL菌悬液加于含有氨苄青霉素浓度为100μg mL-1液体LB培养基中，37℃、250rpm条件下培养12-18h后，吸取500μL菌液保存于-80℃环境中；
(2-1-7)将测定序列结果与NBCI数据中序列进行BLAST比对，选择1株成功导入分类基因序列的重组单克隆菌株；
(2-1-8)吸取200μL(2-1-7)中所选取的重组单克隆菌株，加入20mL含有氨苄青霉素浓度为100μg mL-1液体LB培养基中37℃、250rpm条件下培养12-18h；
(2-1-9)吸取4mL(2-1-8)中菌液进行质粒提取，获得质粒标准品。
所述的步骤(2-1-1)中，当所测微生物为细菌，选用正向引物520F(5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’)和反向引物802R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)对16S rRNA基因的V4可变区进行扩增；当所测微生物为古菌，选用正向引物arc915fmc(5’-AGGAATTGGCGGGRGRGCAC-3’)和反向引物arc1059r(5’-GCCATGCACCWCCTCT-3’)对16S rRNA基因进行扩增；当所测微生物为真菌，选用正向引物ITS1F(5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)和反向引物ITS1R(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对ITS1基因进行扩增。
所述的步骤(2-1-2)中TA克隆试剂盒采用Tsingke pClone007Simple Vector Kit(货号：TSV-007S)试剂盒，操作步骤按照试剂盒标准流程。
所述的步骤(2-1-6)中对所得的PCR产物进行测序送于生物技术公司进行。
所述的计算质粒标准品的拷贝数包括如下步骤：
(2-2-1)质粒标准品DNA浓度采用 ND 1000确定其浓度c(ngμL-1)；
(2-2-2)将插入片段与质粒载体长度相加，得到质粒标准品长度L；
(2-2-3)根据质粒标准品测定浓度c，计算质粒标准品的拷贝数(copiesμL-1)，计算公式为(c×6.02×1023)/(L×660×103)。
所述的样品分类基因浓度qPCR测定包括如下步骤：
(2-3-1)将已知浓度的质粒标准品通过10倍梯度稀释，构建浓度为109，108，107，106，105，104，103，102copiesμL-1标准曲线标准样；
(2-3-2)将DNA样品与10倍梯度稀释质粒标准样一同进行实时荧光定量PCR测定，获得Ct值；
(2-3-3)利用统计学中的线性回归方法将10倍梯度稀释质粒标准样的Ct值与拷贝数对数进行方程拟合，得到标准曲线；
(2-3-4)将DNA样品Ct值代入(2-3-3)中标准曲线中，计算DNA样品分类基因浓度。
所述的实时荧光定量PCR测定采用试剂盒ThermoFisher Green qPCR SuperMix-UDG w/ROX(货号：11744-500)，加样体系及反应条件按说明书操作，测定仪器为480。
所述步骤(3)中获取环境样品中微生物相对丰度包括如下步骤：
(3-1)通过第二代高通量测序技术的Illumina Miseq测序平台测定DNA样品中的分类基因的种类和测序条数；
(3-2)将不同分类基因种类与Silva数据库比对，获取分类基因的分类学信息，包括其界门纲目科属种的信息，并通过测序条数计算获得不同界门纲目科属种的分类基因的相对百分比丰度。
所述的步骤(3-1)中高通量测序送于公司进行。
所述的步骤(3-2)中将不同分类基因种类与Silva数据库比对运用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，版本：1.9.1)。
本发明提供了一种以高通量测序平台为基础，结合实时荧光定量PCR法对环境中微生物群落结构的测定方法。在高通量测序技术仅能获得相对丰度的基础上，加以环境DNA微生物分类基因总浓度的获取，实现了微生物群落结构绝对丰度的高通量快速测定，使得跨样本比较更为可靠，实质反映物种的增长与减少，为进一步探究微生物群落结构提供技术支撑。
附图说明
图1为本发明实施例中标准质粒qPCR测量得到的拟合标准曲线图；
图2为本发明实施例中土壤中细菌门水平相对丰度图；
图3为本发明实施例中土壤中细菌门水平绝对丰度图。
具体实施方式
为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
环境中微生物群落结构的测定方法应用于叠氮化钠处理土壤样品，依次进行如下步骤：
1)在土壤中添加0.1％(WT重量比)的叠氮化钠，于28℃下培养28天，分别取培养到0天和28天的土壤样品10g，待用。
2)提取土壤DNA样品：
称取0.25g土壤样品，本实施例采用的是MoBio DNA提取试剂盒，操作步骤按照试剂盒标准流程。
3)土壤DNA样品细菌总16S rRNA基因浓度的qPCR测定：
(1)选用正向引物520F(5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’)和反向引物802R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)对16S rRNA基因V4可变区进行PCR扩增，获取目的基因片段。
(2)采用Tsingke pClone007Simple Vector Kit(货号：TSV-007S)试剂盒将(1)中目的基因片段与质粒载体相连，并将该质粒载体导入DH5α感受态细胞中，操作步骤按照试剂盒标准流程。
(3)将(2)中含有质粒的DH5α感受态细胞50μL置于300μL液体LB培养基中，在37℃、250rpm条件下培养1h。
(4)吸取200μL(3)中培养液，涂布于含有氨苄青霉素(终浓度为100μg mL-1)的LB固体培养基上。37℃静置过夜培养。
(5)随机挑选6-8个重组单克隆菌落分别涡旋于10μL无菌水中。
(6)分别吸取1μL(5)中菌悬液作为模板采用M13引物(正向引物：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；反向引物：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)进行PCR扩增，并将PCR产物送于杭州擎科梓熙生物技术有限公司使用Sanger测序仪测定序列。剩余9μL菌悬液加于含有氨苄青霉素浓度为100μg mL-1液体LB培养基中，37℃、250rpm条件下培养12-18h后，吸取500μL菌液保存于-80℃环境中。
(7)将测定序列结果与NBCI数据中序列进行BLAST比对，选择1株成功导入细菌16SrRNA基因序列的重组单克隆菌株。
(8)吸取200μL(7)中所选取的重组单克隆菌株，加入20mL含有氨苄青霉素浓度为100μg mL-1液体LB培养基中37℃、250rpm条件下培养12-18h。
(9)吸取4mL(8)中菌液，采用试剂盒Thermo Fisher GeneJET Plasmid MiniprepKit(货号：K0502)进行质粒提取，获得细菌16SrRNA基因质粒标准品，操作步骤按照试剂盒标准流程。
(10)细菌16S rRNA基因质粒标准品DNA浓度采用 ND 1000确定其浓度c(ngμL-1)。
(11)将插入片段与质粒载体长度相加，得到质粒标准品长度L。
(12)根据质粒标准品测定浓度c，计算质粒标准品的拷贝数(copiesμL-1)，计算公式为(c×6.02×1023)/(L×660×103)。
所述的样品细菌16S rRNA基因浓度qPCR测定包括如下步骤：
(1)将已知浓度的质粒标准品通过10倍梯度稀释，构建浓度为109，108，107，106，105，104，103，102copiesμL-1标准曲线标准样；
(2)将土壤样品DNA与10倍梯度稀释质粒标准品一同进行实时荧光定量PCR测定，获得Ct值。采用的试剂盒为ThermoFisher Green qPCRSuperMix-UDG w/ROX(货号：11744-500)，加样体系及反应条件按说明书操作，测定仪器为480。
(3)利用统计学中的线性回归方法将10倍梯度稀释质粒标准样的Ct值与细菌16SrRNA基因质粒标准品的拷贝数常用对数进行方程拟合，得到如图1所示的标准曲线，所述的标准曲线为y＝41.61-3.40x，该标准曲线的相关系数为R2＝1.00，其中y为实时荧光定量PCR反应的Ct值，x为细菌16S rRNA基因质粒标准品拷贝数的常用对数值。
(4)将土壤DNA样品Ct值代入(3)中标准曲线中，计算土壤DNA样品16S rRNA基因浓度。
4)高通量测序：
(4-1)通过第二代高通量测序技术Illumina Miseq测序平台测定土壤DNA样品中的细菌16S rRNA基因的种类和测序条数。样品送浙江天科高新技术发展有限公司按照标准流程进行。
(4-2)运用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，版本：1.9.1)将不同细菌16S rRNA基因种类与Silva等数据库比对，获取细菌16S rRNA基因细菌分类学信息，包括其界门纲目科属种的信息，并通过测序条数计算获得如图2所示的不同界门纲目科属种的细菌16S rRNA基因的相对百分比丰度。
5)将步骤3)中细菌总16S rRNA基因与步骤4)细菌群落各分类水平相对丰度相乘，获取叠氮化钠处理土壤中细菌群落结构绝对丰度及不同分类水平上细菌的绝对丰度。
所得实验结果如图3所示，图中S0为培养0天的土壤样品中细菌门水平绝对丰度，S28为培养28天的土壤样品中细菌门水平绝对丰度。根据土壤细菌高通量绝对定量方法可得知，土壤样品经过叠氮化钠处理28天后，土壤细菌总量由3.01×109cells g-1显著降低至6.62×108cells g-1。门水平上，叠氮化钠对多数门水平下的细菌具有较好的抑制效应，均表现为绝对丰度下降，如图中所示的酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等。
对比实验1
实验设置与实施例1保持一致，具体实施步骤仅开展实施例1中的步骤1)、2)、4)，具体操作步骤如下：
1)在土壤中添加0.1％(WT重量比)的叠氮化钠，于28℃下培养28天，分别取培养到0天和28天的土壤样品10g，待用；
2)提取土壤DNA样品：
称取0.25g土壤样品，本实例采用的是MoBio PowerSoil1绝对定量提取试剂盒，操作步骤如按照试剂盒标准流程；
3)高通量测序：
将土壤DNA样品进行细菌16S rRNA基因扩增子高通量测序(Illumina Miseq平台)，获得土壤样品细菌群落各分类水平(门、纲、目、科、属)的相对丰度。本实例土壤DNA样品送浙江天科高新技术发展有限公司进行，按照标准流程进行。
所得结果为：因为没有通过测定土壤DNA样品中的细菌总16SrRNA基因浓度，因此无法计算出如实施例1中的绝对丰度结果。如图2中所示，S0为培养0天的土壤样品中细菌门水平相对丰度，S28为培养28天的土壤样品中细菌门水平相对丰度。相对丰度结果表明土壤经过叠氮化钠28天处理后，细菌门如厚壁菌门、拟杆菌门的相对丰度明显增加，与实施例1中其实际绝对丰度的下降明显不符(图3)。因此，相对丰度的表征不能真实反映出细菌群落结构丰度的真实变化，其结果可能会导致得出误导性结论。
最后还需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然不局限于以上实施例，根据环境以及样品来源的不同，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，包括如下步骤：
(1)提取环境样品中的DNA，获取DNA样品；
(2)通过实时荧光定量PCR方法测定DNA样品中的分类基因总浓度；
(3)通过第二代高通量测序方法对DNA样品进行分类基因扩增子高通量测序，获得环境样品中微生物不同界、门、纲、目、科、属、种的分类基因相对丰度；
(4)将步骤(2)的DNA样品的分类基因总浓度与步骤(3)的微生物不同界门纲目科属种的分类基因的相对丰度相乘，计算得到微生物不同界门纲目科属种的分类基因的绝对丰度，从而获得环境中微生物群落的绝对丰度。
2.根据权利要求1所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，采取的环境样品采用MoBio DNA提取试剂盒进行DNA的提取。
3.根据权利要求1所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，所测微生物为细菌或古菌时，分类基因为16S rRNA基因；所测微生物为真菌时，分类基因为ITS基因。
4.根据权利要求1所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，包括如下步骤：
(2-1)制备质粒标准样品；
(2-2)计算质粒标准品的拷贝数；
(2-3)样品分类基因浓度实时荧光定量PCR测定。
5.根据权利要求4所述的环境中微生物群落结构的测定方法，其特征在于，所述的制备质粒标准样品包括如下步骤：
(2-1-1)选用相应的引物对分类基因进行PCR扩增，获取目的基因片段；
(2-1-2)采用TA克隆试剂盒将(2-1-1)中目的基因片段与质粒载体相连，并将该质粒载体导入DH5α感受态细胞中；
(2-1-3)将(2-1-2)中50μL含有质粒的DH5α感受态细胞置于300μL液体LB培养基中，在37℃、250rpm条件下培养1h；
(2-1-4)吸取200μL(2-1-3)中培养液，涂布于含有终浓度为100μg mL-1氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃静置过夜培养；
(2-1-5)随机挑选6-8个重组单克隆菌落分别涡旋于10μL无菌水中；
(2-1-6)分别吸取1μL(2-1-5)中菌悬液作为模板采用M13引物：正向引物为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；反向引物为5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’，进行PCR扩增，并对所得的PCR产物进行测序，剩余9μL菌悬液加于含有氨苄青霉素浓度为100μg mL-1液体LB培养基中，37℃、250rpm条件下培养12-18h后，吸取500μL菌液保存于-80℃环境中；
(2-1-7)将测定序列结果与NBCI数据中序列进行BLAST比对，选择1株成功导入分类基因序列的重组单克隆菌株；
(2-1-8)吸取200μL(2-1-7)中所选取的重组单克隆菌株，加入20mL含有氨苄青霉素浓度为100μg mL-1液体LB培养基中37℃、250rpm条件下培养12-18h；
(2-1-9)吸取4mL(2-2-8)中菌液进行质粒提取，获得质粒标准品。
6.根据权利要求4所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的计算质粒标准品的拷贝数包括如下步骤：
(2-2-1)质粒标准品DNA浓度采用 ND 1000确定其浓度c(ngμL-1)；
(2-2-2)将插入片段与质粒载体长度相加，得到质粒标准品长度L；
(2-2-3)根据质粒标准品测定浓度c，计算质粒标准品的拷贝数(copiesμL-1)，计算公式为(c×6.02×1023)/(L×660×103)。
7.根据权利要求4所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的样品分类基因浓度实时荧光定量PCR测定包括如下步骤：
(2-3-1)将已知浓度的质粒标准品通过10倍梯度稀释，构建浓度为109，108，107，106，105，104，103，102copiesμL-1标准曲线标准样；
(2-3-2)将土壤样品DNA与10倍梯度稀释质粒标准样一同进行实时荧光定量PCR测定，获得Ct值；
(2-3-3)利用统计学中的线性回归方法将10倍梯度稀释质粒标准样的Ct值与拷贝数对数进行方程拟合，得到标准曲线；
(2-3-4)将土壤DNA样品Ct值代入(2-3-3)中标准曲线中，计算DNA样品分类基因浓度。
8.根据权利要求5所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的步骤(2-1-1)中，当所测微生物为细菌，选用正向引物520F：5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’和反向引物802R：5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’对16S rRNA基因的V4可变区进行扩增；当所测微生物为古菌，选用正向引物arc915fmc：5’-AGGAATTGGCGGGRGRGCAC-3’和反向引物arc1059r：5’-GCCATGCACCWCCTCT-3’对16S rRNA基因进行扩增；当所测微生物为真菌，选用正向引物ITS1F：5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’和反向引物ITS1R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对ITS1基因进行扩增。
9.根据权利要求1所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中获取环境样品中细菌相对丰度包括如下步骤：
(3-1)通过第二代高通量测序技术的Illumina Miseq测序平台测定DNA样品中的分类基因的种类和测序条数；
(3-2)将不同分类基因种类与Silva数据库比对，获取分类基因的分类学信息，包括其界门纲目科属种的信息，并通过测序条数计算获得不同界门纲目科属种的分类基因的相对百分比丰度。
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