CN109879436B - 一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法，包括：调查人工湿地运行概况，包括人工湿地相关参数和污水相关参数；建立人工湿地沉积物样品采集方法，明确微生物提取与分析方法；判断人工湿地微生物测试数据质量；分析人工湿地的微生物群落组成；明确和量化人工湿地的微生物优势菌群；确定人工湿地优势菌群功能；基于微生物优势菌群丰度判断人工湿地处理能力以及基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态。本发明提供的基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法，通过微生物群落丰度和分布模式分析，可有效的监测和评价人工湿地的污水处理能力和运行的稳定状态。
Description
技术领域
本发明涉及生态环境保护技术领域，特别涉及一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法。
背景技术
作为海岸湿地生态系统的重要组成部分，红树林在防浪护岸、维持生物多样性和渔业资源、净化环境等方面具有重要的生态功能。近年来，大量点源和面源污染物排放到江河湖海中，使河口及沿海地区的红树林成为持久性有机污染物的汇集场所。红树林湿地能够有效地富集重金属离子和有机污染物，且有研究发现红树林人工湿地能够稳定且有效地对污水进行净化，维持时间长达10年以上。其中，除了红树植物自身对污染物的吸附作用，红树林湿地环境中的微生物种群被认为是污染物的主要清理者。可见，红树林人工湿地中微生物群落状态将是湿地运行状态的有效指示指标，相关研究成果也将为人工湿地运行状态的调整和改善提供重要科学依据。
当前，关于人工湿地运行状态的判断主要是基于进出水质指标，从污水处理效率或者效果反映。但是，当前方法只能反映人工湿地对污水的处理状况，并不能为人工湿地运行状态的改善提供有效指导，监测评价方法存在局限。因此，为了更有效的监测、评价，进而改善红树林人工湿地的运行状态，亟需构建一种完善的人工湿地监测方法。
发明内容
针对以上问题，本发明专利目的在于设计了一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法，通过微生物群落丰度和分布模式分析，可有效的监测和评价工湿地的污水处理能力和运行的稳定状态。
本发明具体是通过以下技术方案实现的：
一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法，包括：
步骤S101，调查人工湿地运行概况，包括人工湿地相关参数和污水相关参数；
步骤S102，建立人工湿地沉积物样品采集方法，明确微生物提取与分析方法；
步骤S103，判断人工湿地微生物测试数据质量；
步骤S104，分析人工湿地的微生物群落组成；
步骤S105，明确和量化人工湿地的微生物优势菌群；
步骤S106，确定人工湿地优势菌群功能；
步骤S107，基于微生物优势菌群丰度判断人工湿地处理能力以及基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态。
具体的，本发明所述人工湿地相关参数包括湿地类型、运行时长、布局特征、结构特征、填料组成、沉积物理化性质、植物种类、生物量及种植密度、湿地规格和水力负荷；所述污水相关参数包括污水类型、处理流程和滞留时间。
具体的，本发明所述建立人工湿地沉积物样品采集方法，明确微生物提取与分析方法，具体包括标准化样品采集方法、样品提取方法和数据分析方法；所述样品采集方法包括统一取样深度、取样点位设置和样品取样量；所述样品提取方法包括选用成熟的试剂盒，扩增16S rRNA V4区域并纯化，采用Illumina Miseq 2000平台进行双端高通量测序；所述数据分析方法包括选取高质量的序列信息并用于下游分析，所有的高质量序列在97％序列相似度的水平上归类成各个操作分类单元OTUs，选取每个OUT中的代表性序列，，并采用核苷酸数据库工程分类器RDP对各代表序列进行进化分类。
具体的，本发明所述判断人工湿地微生物测试数据质量，具体包括：通过稀释曲线判断，以达到平稳状态为佳。
具体的，本发明所述分析人工湿地的微生物群落组成，具体包括：基于OTUs结果，分析共有微生物组成比例；基于weighted unifrac距离进行主坐标分析PCoA，分析微生物种群分类特征。
具体的，本发明所述明确和量化人工湿地的微生物优势菌群，具体包括：基于微生物群落丰度数据，确定前10丰度菌群；并进一步通过显著性检验，确定显著富集的优势菌群；分析进水口-中段-出水口优势菌群分布模式。
具体的，本发明所述确定人工湿地优势菌群功能，主要通过文献检索实现。
具体的，本发明所述基于微生物优势菌群丰度判断人工湿地处理能力，具体包括：优势菌群丰度越高，对相关污染物的去除率越高。
具体的，本发明所述基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态，具体包括：基于人工湿地进出水口功能微生物菌群的丰度差异进行判断，湿地运行状态良好的功能菌群分布模式为进水口功能微生物菌群丰度大于出水口，且有显著差异。。
本发明提供的基于微生物技术的人工湿地监测方法与现有技术相比，将更有效的监测和评价红树林人工湿地的污水处理能力和运行的稳定状态，并可确定出适用于不同类型污水处理的特定微生物种群；进一步地，可通过在特定环境中协同利用/优化某些特定微生物种群进行污水净化处理的途径，为人工湿地运行状态的改善提供有效指导。
附图说明
以下参照附图对本发明实施例作进一步说明，其中：
图1是本发明一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提出了一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法，请参阅图1，包括：
步骤S101，调查人工湿地运行概况，包括人工湿地相关参数和污水相关参数调查。具体的，所述人工湿地相关参数包括湿地类型、运行时长、布局特征、结构特征、填料组成、沉积物理化性质、植物种类、生物量及种植密度、湿地规格和水力负荷；所述污水相关参数包括污水类型、处理流程和滞留时间。
步骤S102，建立人工湿地沉积物样品采集方法，明确微生物提取与分析方法。具体包括标准化样品采集方法、样品提取方法和数据分析方法。具体的，标准化样品采集方法，即统一取样深度(5-10cm)、取样点位设置(进水口-中段-出水口)和样品取样量(30～40g)。样品提取方法包括DNA提取选用成熟的试剂盒，扩增16S rRNA V4区域并纯化，采用Illumina Miseq 2000(Illumina Inc.，USA)平台进行双端高通量测序。数据分析方法包括仅高质量(平均每个碱基的质量得分＞30，序列长度＞200bp，且序列中不包含任何不明确的碱基信息)的序列信息得以保留并用于下游分析。所有的高质量序列在97％序列相似度的水平上归类成各个操作分类单元OTUs。选取每个OUT中的代表性序列，并采用核苷酸数据库工程分类器RDP对各代表序列进行进化分类。
步骤S103，判断人工湿地微生物测试数据质量。具体的，通过稀释曲线判断，以达到平稳状态为佳。
步骤S104，分析人工湿地的微生物群落组成。具体的，基于OTUs结果，分析共有微生物组成比例；基于weighted unifrac距离进行主坐标分析PCoA，分析微生物种群分类特征。
步骤S105，明确和量化人工湿地的微生物优势菌群。具体的，基于微生物群落丰度占比数据，确定占比为前10的菌群；进一步地，通过显著性检验，确定显著富集的优势菌群；分析进水口-中段-出水口优势菌群分布模式。
步骤S106，确定人工湿地优势菌群功能。具体的，本发明所述确定人工湿地优势菌群功能，主要通过文献检索实现。
步骤S107，基于微生物优势菌群丰度判断人工湿地处理能力以及基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态。具体的，所述基于微生物优势菌群丰度判断人工湿地处理能力，判断依据为：功能微生物丰度越高，对相关污染物的去除率越高。所述基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态，判断依据为：人工湿地进出水口功能微生物菌群的丰度差异可以较好地表征湿地处理污水的稳定状态；湿地运行状态良好的功能菌群分布模式为：进水口功能微生物菌群丰度大于出水口，且有显著差异。。
实施例一：
下面结合一个稳定红树林人工湿地的微生物监测为实施例详细说明本发明。
S101，调查人工湿地运行概况。本实施例红树林人工湿地为分别栽种秋茄、桐花树的2个人工红树林湿地和1个未栽种任何红树植物的对照湿地。人工湿地类型：潜流人工湿地。布局特征：3个人工湿地彼此相邻，相距0.5m。人工湿地规格：人工湿地每个池子大小为：33m×3m×0.5m。人工湿地结构特征：每个处理池划分为五个独立的部分，包括1个进水口区，1个出水口区，2个栽种或不栽种红树植物的区域以及介于两者之间的过渡区域。填料组成：植物种植区域从底部到顶部依次填充石子、沙砾和细沙，其余3个储水区域不填充任何填料。污水类型：污水为排入红树林入海口的城市生活污水。处理流程：污水经水泵送到沉淀池，在沉淀池沉淀1h之后，便排入湿地的进水口区域；水流方向为底部进上部出。水力负荷：5m3/d。污水在湿地系统中的滞留处理时间：3d。植物种植间距：0.5m×0.5m。运行时长：自2005年8月起开始运行，运行至今约13年。
S102，建立人工湿地沉积物样品采集方法，明确微生物提取与分析方法。样品采集方法具体为：取样深度为5-10em；表层0-5em的沙样并未浸入污水水体中，其默认为未直接参与污水的净化处理。取样点位置为在污水进水口、中间过渡区和出水口边缘采集沉积物样品。样品取样量为30～40g。沉积物微生物DNA提取与测序：每份土壤样品取0.5g用于基因组的提取，提取试剂盒为E.Z.N.A.
Soil DNA Kit；采用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)对湿地土壤细菌16SrRNA V4区域进行扩增；切割符合分子量大小的DNA电泳条带并用E.Z.N.A.TM Ge 1Extraction Kit进行纯化；等量的扩增纯化产物用于Illumina Miseq 2000平台进行双端高通量测序。沉积物微生物DNA测序数据分析：利用Quantitative Insights IntoMicrobial Ecology对测序获得的原始序列数据进行整理。仅高质量(平均每个碱基的质量得分＞30，序列长度＞200bp，且序列中不包含任何不明确的碱基信息)的序列信息得以保留并用于下游分析。在去除标记条形码之后，所有的高质量序列在97％序列相似度的水平上归类成各个操作分类单元OTUs。选取每个OUT中的代表性序列，并采用核苷酸数据库工程分类器(RDP)对各代表序列进行进化分类。
S103，判断人工湿地微生物测试数据质量。本发明中，利用QIIME软件分析获得各样品组中微生物种群的Shannon指数和稀释曲线，以评价每个人工湿地沉积物样品自身微生物种群的特征和数据测试质量。本实施例中，稀释曲线和Shannon多样性指数曲线均达到了平稳状态，表明通过高通量测序研究，获得了绝大多数的细菌分类信息。
S104，分析人工湿地的微生物群落组成。本实施例中，三种人工湿地沉积物微生物组成特征为：78.31％的OTUs为三种湿地细菌所共有，16.73％的OTUs为两两共有的细菌种类；两种红树林人工湿地在微生物种群组成上具有更相似的特点，即91.3％的OTUs为两栽种红树植物湿地细菌种群所共有；4.96％的OTUs为三种湿地细菌种群所特有，其中未栽种红树植物的湿地拥有最多特有细菌OTUs。同时，基于weighted unifrac距离对样本进行主坐标分析(PCoA)，以对红树林人工湿地环境中的微生物种群进行分类评估。可见，两种红树植物人工湿地细菌种群相比于对照湿地组成更相似。
S105，明确和量化人工湿地的微生物优势菌群。本实施例中，包括未分类鉴定的种群在内，前十丰度的细菌占微生物种群总丰度的91.3％，其中4个门的细菌在人工红树林湿地中丰度显著高于空白对照湿地，包括嗜酸杆菌(Acidobacteria)、硝化螺旋菌(Nitrospirae)、放线菌(Actinobacteria)和芽单胞菌(Gemmatimonadetes)；另有非前10丰度的迷踪菌门(Elusimicrobia)也在红树林人工湿地中具有显著更高的丰度。可见，红树植物的栽种显著提高了人工湿地中本底优势种群的丰度。此外，本实施例中，对人工湿地进水口-中段-出水口细菌在门水平上的丰度占比分析表明：Acidobacteria、Nitrospirae、Actinobacteria和Proteobacteria的丰度百分比在桐花树湿地中为：进水口(68.0％)＞中段(60.9％)＞出水口(56.3％)；在秋茄湿地中为出水口(62.2％)＞中段、进水口(～57％)；在空白对照湿地中为进水口、中段(～55％)＞出水口(51.2％)。
S106，确定人工湿地优势菌群功能。通过文献检索，本实施例中，红树林人工湿地沉积物富集的微生物菌群Acidobacteria、Nitrospirae和Actinobacteria，以及优势菌群变形菌门(Proteobacteria)能够参与反硝化作用或者硝酸盐、亚硝酸盐的还原作用等与N的去除相关的反应过程。
S107，基于优势菌群丰度判断人工湿地处理能力。本实施例中，人工湿地总氮(TN)平均去除率为：桐花树湿地(50.6％)＞秋茄湿地(43.8％)＞对照湿地(37.4％)。可见，功能微生物丰度越高，对相关污染物的去除率越高。
基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态。人工湿地进出水口功能微生物菌群的丰度差异可以较好地表征湿地处理污水的稳定状态。湿地运行状态良好的功能菌群分布模式为：进水口功能微生物菌群丰度大于出水口，且有显著差异。本实施例中，N去除相关微生物在人工湿地进水口-中段-出水口细菌在门水平上的丰度占比为：桐花树湿地中，进水口(68.0％)＞中段(60.9％)＞出水口(56.3％)；秋茄湿地中，出水口(62.2％)＞中段、进水口(～57％)；空白对照湿地中，进水口、中段(～55％)＞出水口(51.2％)。本实施例中，桐花树湿地运行状态最稳定，空白对照湿地次之，秋茄湿地运行状态最不稳定。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.一种基于微生物技术的人工湿地运行状态监测方法，其特征在于，包括：
步骤S101，调查人工湿地运行概况，包括人工湿地相关参数和污水相关参数；所述人工湿地相关参数包括湿地类型、运行时长、布局特征、结构特征、填料组成、沉积物理化性质、植物种类、生物量及种植密度、湿地规格和水力负荷；所述污水相关参数包括污水类型、处理流程和滞留时间；
步骤S102，建立人工湿地沉积物样品采集方法，明确微生物提取与分析方法；具体包括标准化样品采集方法、样品提取方法和数据分析方法；所述标准化样品采集方法包括统一取样深度、取样点位设置和样品取样量；所述样品提取方法包括DNA提取选用成熟的试剂盒，扩增16S rRNA V4区域并纯化，采用Illumina Miseq 2000平台进行双端高通量测序；所述数据分析方法包括选取高质量的序列信息并用于下游分析，所有的高质量序列在97％序列相似度的水平上归类成各个操作分类单元OTUs，选取每个OUT中的代表性序列，并采用核苷酸数据库工程分类器RDP对各代表序列进行进化分类；
步骤S103，判断人工湿地微生物测试数据质量；包括通过稀释曲线判断，以达到平稳状态为佳；
步骤S104，分析人工湿地的微生物群落组成；包括基于OTUs结果，分析共有微生物组成比例；基于weighted unifrac距离进行主坐标分析PCoA，分析微生物种群分类特征；
步骤S105，明确和量化人工湿地的微生物优势菌群；具体包括基于微生物群落丰度占比数据，确定占比为前10的菌群，进一步通过显著性检验，确定显著富集的优势菌群；分析进水口-中段-出水口优势菌群分布模式；
步骤S106，确定人工湿地优势菌群功能；所述确定人工湿地优势菌群功能，主要通过文献检索实现；
步骤S107，基于微生物优势菌群丰度判断人工湿地处理能力以及基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态；所述基于微生物优势菌群丰度判断人工湿地处理能力，具体包括：优势菌群丰度越高，对相关污染物的去除率越高；所述基于功能菌群分布模式判断人工湿地运行稳定状态，具体包括：基于人工湿地进出水口功能微生物菌群的丰度差异进行判断，湿地运行状态良好的功能菌群分布模式为进水口功能微生物菌群丰度大于出水口，且有显著差异。
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