CN103740824A - 一种两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微量微生物鉴定的方法。通过两核苷酸同时加入到测序反应中,得到一系列峰谱信息图。在峰谱图中,不同模板所需的测序反应次数不同,且在不同的测序方式下得到的测序反应峰谱信号强度不同。通过这一原理可实现微生物菌群的鉴定。该方法有效提高了微生物鉴定的灵敏度、缩短了操作时间,为微生物的分离和鉴定提供了一种可靠的选择。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,是一种实现微生物种群鉴定的方法,具体涉及一种两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法及其应用。
背景技术
微生物的鉴定在疾病预防和治疗方面有广泛的应用。快速、准确地检测微生物在疾病传染和抗菌治疗中有重要的作用,尤其是少量致病微生物的检测。例如,近年来肺结核疾病治疗中抗药株给治疗带来很大的困难,需要对菌株进行有效的鉴定,以便采取个体化用药的针对性治疗。常用的手段是将微生物系统分类发育标记分子(phylogenetic markers)可变区进行PCR扩增分析。目前,基于系统分类发育标记分子的微生物鉴定方法普遍用于微生物的分离和鉴定。这些系统分类发育标记分子有16s rRNA、18s rRNA、rnpB、ropB、gyrB基因等。这些系统分类发育标记分子普遍存在于微生物中,既含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,因而它们适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。基于PCR扩增系统分类发育标记分子序列来鉴定微生物种群的方法主要有Sanger测序,焦磷酸测序,Real-TimePCR、PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)、PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)等。其中,最准确的方法为Sanger测序、焦磷酸测序,即是将PCR产物的序列的碱基信息完全测定,然后与菌株的特征序列的碱基信息进行比对来确定,这些将特征序列的碱基信息完全确认的测序方法被认为是金标准。然而,Sanger测序受特定设备的限制,需要到指定的场所进行测定,使得时间上受限。相对而言,焦磷酸测序需要的仪器价格便宜,简易的焦测序仪甚至可以方便携带于现场进行分析。传统的焦磷酸测序方法通过每次加入一种核苷酸进行实时合成测序。每次测序反应都能得到碱基的具体信息。通过测序得到系统分类发育标记分子的序列,然后与数据库中的菌株序列比对,鉴定具体的菌株。但是,对于传统的焦测序平台用于这些特定PCR产物的序列分析而言,在DNA模板量少,以及老旧的传统焦测序仪器上,要准确获取长度约为50bp的序列信息不仅费时,而且往往很难。所以,需要提出一种有效分离和鉴定微量微生物种群的方法。
本实验室提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法(ZL201210128597.9),该方法通过同时加入未标记的两种dNPTs实时测序,得到一组编码。该方法中两核苷酸测序方式可以有三种方式:AG/CT,AC/GT,AT/CG。采用该方法对PCR产物进行测序,要么将PCR产物分为两份,要么对PCR产物焦测序之后再进行变性。前者,对PCR产物样本的需求量大,不利于微量模板的检测和鉴定。后者,产物变性会相应的增加测序步骤和测序时间,降低测序效率。但是,通过两核苷酸同时加入到测序反应中,相同模板浓度的情况下,测序得到的峰谱信号比传统焦测序的峰谱信号强,即峰高更高。这一特点有利于检测微量样本。另外,通过两核苷酸同时加入到测序反应中,模板所需的测序反应次数会相应的减少,且不同模板在不同的测序方式下得到的峰谱信息不同,以及每次反应得到的峰谱信号强度也不同。所以,可以通过比较模板测序反应次数以及每次反应得到的峰谱信号强度来鉴定微生物。所以,我们提出一种基于两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物的方法。
本发明的目的是提供一种微量微生物鉴定的方法。通过两核苷酸同时加入到测序反应中,得到一系列峰谱信息图。在峰谱图中,不同模板所需的测序反应次数不同,且在不同的测序方式下得到的测序反应峰谱信号强度不同。通过这一原理可实现微生物菌群的鉴定。该方法能有效提高微生物鉴定的灵敏度、缩短操作时间、为微生物的分离和鉴定提供一种可靠的选择。
发明内容
技术问题:本发明的目的是提供一种两核苷酸实时合成测序图谱实现微生物种群鉴定的方法。本发明为微生物种群的分类和鉴定提供了一种可行的检测方法,有助于简化微生物种群的鉴定。
技术方案:一种两核苷酸循环实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法,通过对微生物特定可变区的待测核酸序列进行两核苷酸循环的测序反应,由测序反应所得到的测序图谱确定微生物具体的菌株;所述的两核苷酸为dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP中的两种不同的核苷酸,所述两核苷酸循环测序反应指根据微生物不同菌株的特定可变区的待测核酸序列具有特定的测序图谱,从(dATPaS+dCTP)/(dGTP+dTTP)、(dATPaS+dGTP)/(dCTP+dTTP)、(dATPaS+dTTP)/(dCTP+dGTP)三组中任意选择其中一组进行的两核苷酸循环测序反应,其中,dATPαS(deoxyadenosine alfa-thio triphosphate)是dATP的替代物,因为DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dATP的催化效率高。所述的测序反应得到的测序图谱包括参与合成反应的核苷酸种类(峰的类型),以及合成核苷酸的数目(峰的高度或者信号强度)。
进一步地,所述的微生物特定可变区的待测核酸序列先通过PCR扩增后再进行两核苷酸循环实时合成测序。所述测序图谱的特征包括峰的类型、峰的高度,以及峰的排列形式构成的全部信息。
进一步地,dNTPs合成实时释放相同的检测分子,其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐,电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。
进一步地,微生物特定可变区在两核苷酸组合测序方式(AG/CT,AT/CG和AC/GT)下,得到三组不同的测序峰谱信息。根据不同微生物种群的可变区需要进行不同次数的两核苷酸合成反应,以及不是每次测序反应都能得到相同的测序信号强度,我们即可鉴定出该序列所属的菌株。
如果两种菌株在一种测序方式下(AG/CT,AT/CG和AC/GT中的任意一种)得到的峰谱信息图完全相同,则可以选择其他两种中任意一种测序方式进行鉴定;如果两种菌株的特定可变区在AG/CT,AT/CG和AC/GT的测序方式下,得到的菌株都相同(这种情况下可变区完全相同,传统测序的方法也无法鉴定),可以选择其他可变区进行测序。
有益效果:
本发明应用两核苷酸同时加入到测序反应中,测定微生物菌群的特定可变区,根据不同微生物菌群特定的可变区需要不同数目的测序次数,以及不同微生物菌群特定的可变区得到不同测序峰谱信息的原理,不同种、不同属的微生物都能准确地鉴定出来。
1.本发明通过结合菌株测序所需的反应次数以及每次测序所得的信号强度来进一步鉴定微生物。
2.本发明直接采用商品化、非标记的天然核苷酸进行合成测序,在提高测序长度的同时还降低了测序成本。
3.本发明的最大优点是按照微生物种群测序所得到的峰谱信息鉴定微生物种群。
4.本发明与传统测序方法分离鉴定微生物种群相比,不仅减少反应次数,而且对少量样本具有较高的灵敏性,可以用于微量样本的种群鉴定。
5.本发明操作简单。它可以在任何基于合成测序的测序平台进行,操作简单、易行。
附图说明
图1是本发明两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物种群的流程图。选定待测菌群的可变区(a)作为测序靶点。例如,选择rnpB(RNase P RNA)基因作为测序靶点。测序靶点的选择要具备以下两个条件:(1)普遍存在于微生物中;(2)既含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域。理论上根据各菌群的部分可变区核苷酸序列进行两核苷酸实时合成测序图谱预测,得到各可变区焦测序后的峰谱信息图。该峰谱信息图包括参与反应的碱基种类、个数以及测序峰高(即信号强度)。
提取菌群的DNA模板,在聚合酶作用下PCR扩增部分可变区。PCR产物的5’端固定在载体上,测序引物与固定的PCR产物杂交进行焦磷酸测序。测序方式从((dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)、(dATPαS+dCTP)/(dGTP+dTTP)、(dATPαS+dTTP)/(dCTP+dGTP))三种中任选一种。这里以(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)的测序方式为例。首先,按照dATPαS/dGTP=1的比例将两核苷酸加入,在聚合酶作用下反应进行焦磷酸测序。其次,再按照dCTP/dTTP=1的比例将两核苷酸加入,在聚合酶作用下反应进行焦磷酸测序。不断循环加入(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)进行焦磷酸测序,直到得到一组含有碱基种类、信号强度测序图谱为止(b)。测序时通过对核苷酸合成后产生的特定分子浓度(如焦磷酸盐,氢离子或者光学检测的荧光分子等)通过转化为光、电等信号进行实时检测,得到该次测序反应测定的包含碱基种类、个数以及峰高信息的测序峰谱图。
根据测序图谱信息,比较待测菌群的测序反应数目。首先,如果图谱中测序反应总次数相同(c),则比较每次测序得到的信号强度。依次从第1次测序反应的信号强度开始比较。如果第1~n次反应所得的信号强度相同,则比较第n+1次测序反应的信号强度,直到信号强度不同为止。然后,再与预测的峰谱信息作比较,由此可以依次确定不同菌株。如果测序反应总次数不同(d),则直接与预测得到的菌株测序峰谱信息比较,从第1次测序得到的峰谱信息开始比较,直到可以确定具体的菌株(e)。
如果某两种菌株在特定测序方式下(AG/CT,AT/CG和AC/GT中的任意一种)得到的峰谱信息完全相同,则可以选择其他两种中的任意一种测序方式进行鉴定;如果某两种菌株的特定可变区在AG/CT、AT/CG和AC/GT三种测序方式下得到的菌株峰谱信息都相同(这种情况下可变区完全相同,传统测序方法也无法鉴定),可以选择其他可变区进行测序。
图2是模拟两核苷酸实时合成测序得出的13种分支杆菌(M.paratuberculosis、M.tuberculosis、M.gastri、M.kansasii、M.marinur、M.gordonae、M.malmoense、M.leprae、M.intracellular、M.xenopi、M.celatum、M.fortuitum、M.smegmatis)部分rnpB基因焦测序所得的峰谱信息预测图。该图模拟了循环加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两种核苷酸实时合成焦测序得到的测序图谱。图谱中,横坐标表示每次测序反应所加入的两种核苷酸的种类为(dATPαS+dTTP)和(dGTP+dCTP)。AT代表加入dATPαS和dTTP的混合物进行测序。同理,GT代表加入dGTP和dTTP的混合物进行测序;纵坐标表示每次测序反应得到的峰谱信号强度(即峰的高度或者合成的碱基数目)。
图3为M.paratuberculosis以及M.celaturn菌株的两核苷酸实时焦测序所获得的峰谱信息图。该图为循环加入(dATPαS+dCTPs)以及(dGTP+dTTP)两核苷酸的混合物进行实时焦磷酸测序。该图中,横坐标为循环加入的测序方式为:AC/GT。其中,A代表加入dATPαS和dCTP的混合物进行测序。同理,T代表加入dGTP和dTTP的混合物进行测序。纵坐标表示测序反应的信号强度。峰谱上方的标注表示峰的信号强度和加入反应的两核苷酸种类,如AC2表示加入dATPαS和dCTP的混合物进行焦测序,且测序得到的信号强度是2;GT1表示加入dGTP和dTTP的混合物进行焦磷酸测序,且测序得到的信号强度是1。
其中,dATPαS、dGTP、dCTP、dTTP及反应所需的酶购自凯杰生物技术(上海)有限公司(QIAGENChina(Shanghai)Co.,Ltd),实验中所用的菌株来东南大学中大医院结核病患者的临床分离株。
具体实施方式
实施例一:两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法
1.13种分支杆菌(Mycobacteriumsp.)rnpB基因峰谱预测
以13种分支杆菌(M.paratuberculosis、M.tuberculosis、M.gastri、M.kansasii、M.marinur、M.gordonae、M.malmoense、M.leprae、M.intracellular、M.xenopi、M.celatum、M.fortuitum、M.smegmatis)为例,阐述两核苷酸实时测序峰谱鉴定微生物种群的方法。该例中选取rnpB基因作为测序靶点。这13种分支杆菌的部分rnpB基因可变区的序列如表1所示。首先,根据菌株的基因序列预测这13种分支杆菌属的部分rnpB基因可变区在两核苷酸实时合成测序的情况下得到的峰谱信息。
表1各菌株部分可变区序列
2.13种分支杆菌的分离和鉴定
根据预测所得的峰谱信息,我们模拟出13种分支杆菌部分rnpB基因焦测序所得的峰谱信息图。为验证通过峰谱图能否准确地鉴定出这13种菌株,我们假定各个图谱对应的菌株未知,采用这13种图谱的信息尝试鉴定这13种菌株。
图2为模拟两核苷酸实时合成测序在循环加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物时所得到的测序峰谱图。图(a)~(d)中,各个菌株所对应的测序反应次数分别为26、20、20、20、20次。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.tuberculosis所需的测序反应总次数最多(26次)。所以(a)图对应是M.tuberculosis的焦测序图谱。图(b)~(d)中,所需的测序反应总次数相同,但不是每次测序反应所得的峰谱信号强度都相同。图(b)和(d)中,第1次测序反应所得的信号强度值为1,而图(c)中第1次测序反应所得的信号强度值为4。由预测的结果可知,在加入(dATPaS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.gordonae第1次测序反应所得的信号强度值为4。所以,图(c)对应M.gordonae的测序峰谱图。图(b)和(d)中,第3次测序信号强度值分别为4和2。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.marinum和M.leprae第3次测序反应所得的信号强度值分别为4和2。所以,图(b)和(d)分别对应M.marinum和M.leprae的焦测序图谱。由此,可以将M.tuberculosis、M.marinum、M.gordonae和M.leprae准确地区分出来。
图(e)~(h)中,各个菌株所对应的测序反应总次数分别为15、16、16、18次。由测序反应的数目不能确定任何一种菌株。但是,可以从峰谱图中的信号强度值来区分这一组中的菌株。图(e)~(h)中,第1、2次测序反应的信号强度均为1,但是从第3次测序反应开始,测序强度值出现明显差别。图(g)和(h)中,第3次测序反应得到的强度值分别为8和1。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.malmoense和M.xenopi第3次测序反应所得的信号强度值为8和1。所以,图(g)和(h)分别对应M.malmoense和M.xenopi的焦测序图谱。图(e)和(f)中,1~5次测序反应所得的信号强度值均相同,但第6次测序反应的信号强度值不同。图(e)中第6次测序反应所得的信号强度值为2,而图(f)中第6次测序反应所得的信号强度值为1。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.kansasii和M.gastri在第6次测序反应时所得的信号强度值分别为2和1。所以,图(e)和(f)分别对应M.kansasii和M.gastri的焦测序图谱。由此,可以准确地鉴定出M.gastri、M.kansasii、M.malmoense和M.xenopi四种菌株。
图(i)~(m)中,各个菌株所对应的测序反应总次数分别为6、8、8、8、8次。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.intracelluar所需的测序反应总次数为6次。所以(i)图对应M.intracelluar的焦测序图谱。图(j)~(m)中,所需的测序反应次数相同,但不是每次测序反应所得的峰谱信号强度都相同。图(j)~(l)中,第2次测序反应所得的信号强度值为1,而图(m)中第2次测序反应所得的信号强度值为2。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.smeamatis第2次测序反应所得的信号强度值为2。所以,图(m)对应M.smeamatis的测序峰谱图。图(j)~(l)中,图(j)和(k)中第3次测序反应所得的信号强度值为2,而图(l)中第3次测序反应所得的信号强度值为4。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.fortuitum第3次测序反应所得的信号强度值为4。所以,图(l)对应M.fortuitum的测序峰谱图。图(j)和(k)中,第5次测序信号强度值分别为4和5。由预测的结果可知,在加入(dATPαS+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物进行两核苷酸实时合成测序时,M.paratubercuosis和M.celaturn在第5次测序反应时所得的信号强度值分别为4和5。所以,图(i)和(j)分别对应M.paratubercuosis和M.celaturn的焦测序图谱。由此,可以准确地鉴定出M.paratubercuosis、M.intracelluar、M.celaturn、M.fortuitum和M.smeamatis五种菌株。
由以上的推导过程可知,通过比较13种菌株的测序图谱信息,根据不同菌株所需的测序反应次数不同,且在不同的测序方式下得到的测序反应峰谱信号强度不同的原理,成功地鉴定出它们所对应的具体菌株。
实施例二:基于焦磷酸测序平台的两核苷酸实时合成测序图谱鉴定两种分支杆菌
为了验证这种方法在实际样本鉴定中的可行性,两种Mycobacterium paratuberculosis(M.paratuberculosis)以及Mycobacterium celaturn(M.celaturn)分支杆菌属菌株采用了两核苷酸实时合成测序的方法来进行鉴定。本实例中,采用基于实时合成测序的焦测序平台来实现。
(1)DNA样本制备
首先,提取M.paratuberculosis以及M.celaturn菌株的基因组DNA,保存在-20℃待用。在聚合酶的作用下PCR扩增菌株的部分rnpB基因(RNasePRNAgene)可变区。扩增引物为:F:5’-CGGATGAGTTGGCTGGGCGG-3’;R:5’-GGGTGAAACGGTGCGGTAAGAGC-3’。其中,反向引物5’端标记生物素以获得测序所需的PCR样本。每个样本用5μL的链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液清洗两遍,弃上清。再加入5μL链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液,并在斡旋振荡仪上振荡使磁珠悬浮。在45μL的PCR产物中加入50μL结合反应缓冲液和磁珠的混合物,以便生物素标记的PCR样本和链霉亲和素包裹的磁珠进行连接。利用真空样本制备系统将磁珠释放到96孔样本板,得到单链的测序模板。然后,单链测序模板、测序引物(5’-GCCAAGGCGGATGTACGGTACAG-3’)和结合反应缓冲液的混合物在加热板上80℃加热2分钟,使测序模板和测序引物进行结合,以进行焦测序。
(2)两核苷酸实时合成测序
在试剂仓中加入测序所需的各种试剂(PyroMark Gold Q96SQA Reagents(1x96)),将包含磁珠固定PCR样本的96孔板和试剂仓放入测序仪中,并设定测序参数。此处,dNTPs试剂中分别加入(dATPαS+dCTP)/(dGTP+dTTP)、(dATPαS+dTTP)/(dCTP+dGTP)、(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)三种测序方式中的任意一组进行的两核苷酸同时合成循环测序反应。设置测序循环方式,并点击开始按钮,开始测序。
(3)M.paratuberculosis以及M.celaturn菌株的鉴定
图3为M.paratuberculosis以及M.celaturn种群的两核苷酸实时焦测序所获得的峰谱信息。该图中循环加入的两核苷酸分别为(dATPαS+dCTP)以及(dGTP+dTTP)的混合物。根据M.paratuberculosis以及M.celaturn种群特定的可变区序列,模拟两核苷酸同时合成循环测序反应,预测测序峰谱。其中,预测M.paratuberculosis菌株所得的测序峰谱为:GT(1)AC(1)GT(1)AC(2)GT(1)AC(1)GT(3)AC(1)GT(1)AC(2);预测M.celaturn所得的峰谱信息为:GT(1)AC(1)GT(1)AC(4)GT(1)AC(2)GT(1)AC(1)GT(1)AC(2)。从图3可以看出,两种菌株特定的可变区在(dATPαS+dCTP)以及(dTTP+dGTP)方式下测序得到的测序峰谱图从第4次测序开始出现明显不同。如果第4次焦磷酸测序峰谱为AC(2),即峰谱信号强度为2。对比预测得到的峰谱信息可知,该分支杆菌为M.paratuberculosis;如果第4次焦磷酸测序峰谱为AC(4),即峰谱信号强度为4。对比预测得到的峰谱信息可知,该分支杆菌为M.celaturn。由此可见,分析焦测序所得的图谱,以及比较焦测序图谱和模拟预测所得的峰谱信号,可以正确区分出这两种菌株。
Claims (4)
1.一种两核苷酸循环实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法,其特征在于,通过对微生物特定可变区的待测核苷酸序列进行两核苷酸循环的测序反应,由测序反应所得到的测序图谱确定微生物具体的菌株;所述的两核苷酸为dATPaS、dCTP、dTTP 、dGTP中的两种不同的核苷酸,所述两核苷酸循环测序反应指从(dATPaS+dCTP)/(dGTP+dTTP)、(dATPaS+dGTP)/(dCTP+dTTP)、 (dATPaS+dTTP)/(dCTP+dGTP)三组中选择其中一组进行两核苷酸循环测序反应,所述的测序反应得到的测序图谱包括参与合成反应的核苷酸种类(峰的类型),以及合成核苷酸的数目(峰的高度或者信号强度)。
2.根据权利要求1所述的一种两核苷酸循环实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法,其特征在于,所述的微生物特定可变区的待测核酸序列先通过PCR扩增后再进行两核苷酸循环实时合成测序。
3.根据权利要求1所述的一种两核苷酸循环实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法,其特征在于,所述测序图谱的特征包括峰的类型、峰的高度,以及峰的排列形式构成的全部信息。
4.根据权利要求1所述的一种两核苷酸循环实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法,其特征在于,dNTPs合成实时释放相同的检测分子,其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐,电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104894246A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-09 | 东南大学 | 一种两核苷酸合成测序分析多模板pcr产物的方法 |
CN105132573A (zh) * | 2015-09-25 | 2015-12-09 | 东南大学 | 一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法 |
CN105219851A (zh) * | 2015-09-25 | 2016-01-06 | 东南大学 | 一种焦测序定量检测甲基化的方法 |
CN105256030A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-01-20 | 东南大学 | 一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/snp位点的方法 |
CN106047990A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-10-26 | 东南大学 | 一种基于两核苷酸合成测序的pcr产物snp分型/突变检测方法 |
CN113403372A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-09-17 | 海南微氪生物科技股份有限公司 | 基于核苷酸合成测序图谱的微生物种群鉴定方法及应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102634586A (zh) * | 2012-04-27 | 2012-08-15 | 东南大学 | 一种两核苷酸实时合成dna解码测序方法 |
-
2014
- 2014-01-09 CN CN201410009116.1A patent/CN103740824B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102634586A (zh) * | 2012-04-27 | 2012-08-15 | 东南大学 | 一种两核苷酸实时合成dna解码测序方法 |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104894246A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-09 | 东南大学 | 一种两核苷酸合成测序分析多模板pcr产物的方法 |
CN104894246B (zh) * | 2015-05-21 | 2018-03-20 | 东南大学 | 一种两核苷酸合成测序分析多模板pcr产物的方法 |
CN105132573A (zh) * | 2015-09-25 | 2015-12-09 | 东南大学 | 一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法 |
CN105219851A (zh) * | 2015-09-25 | 2016-01-06 | 东南大学 | 一种焦测序定量检测甲基化的方法 |
CN105132573B (zh) * | 2015-09-25 | 2018-05-25 | 东南大学 | 一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法 |
CN105219851B (zh) * | 2015-09-25 | 2018-05-25 | 东南大学 | 一种焦测序定量检测甲基化的方法 |
CN105256030A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-01-20 | 东南大学 | 一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/snp位点的方法 |
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CN105256030B (zh) * | 2015-10-22 | 2018-05-15 | 东南大学 | 一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/snp位点的方法 |
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