CN101535504A - 核酸的多重分析 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定靶标核酸的方法,所述方法包括以下步骤:使含有多个靶标核酸的样品与至少一个系列的核苷酸引物在这样的条件下进行接触,该条件能使得所述引物可以与至少一个所述靶标核酸发生结合,并使得所述结合引物可以用可检测信号进行标记,其中每个系列当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和测量每个标记引物的所述可检测信号,以确定所述靶标核酸的身份。
Description
技术领域
本发明主要涉及对样品中的靶标核酸的检测、鉴定和定量的方法。具体的说,本发明涉及使用多个等级寡核苷酸引物(hierarchicaloligonucleotide primer)来检测、鉴定和定量样品如环境样品或生物样品中的靶标核酸的方法。
背景技术
已开发出多种分子方法来分析含有多个靶标的样品。这些方法在从微生物群落分析、微生物监测和微生物鉴定到基于疾病相关生物标志的患者疾病鉴定的应用中得到了使用。但是,这些方法在检测灵敏度和检测阈、定量能力、易使用性和费用方面各有不同。例如,虽然基于16S rRNA基因的克隆文库方法能够鉴定给定生态系统中的数量上优势微生物群体至种或菌株的水平,但它是费时和费用大的方法。类似地,虽然群落指纹技术如变性梯度凝胶电泳(DGGE)和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)能够快速剖析优势微生物群体至微生物群落结构的总PCR扩增产物的大约0.1%,使得可以对从不同环境获得或者在同一环境的不同时间和地点获得的不同微生物群体结构进行比较,但若对所存在的微生物种没有事先的了解,则这种指纹方法不能够鉴定出给定微生物群落中的各个种,且结果往往受到DNA提取和PCR扩增所伴随出现的不一致性的影响。
还开发出其他的方法来鉴定微生物群落中特定类型的微生物群体,例如全细胞荧光原位杂交(FISH)、膜杂交和实时定量PCR(qPCR)及序列特异性酶切方法。但是,FISH需要冗长的固定和杂交程序,且会受到以下因素的影响:探针对细胞膜的穿透性差、非活性细胞内的rRNA拷贝数低和生态系统种存在着非均一的非生物材料(heterogeneous abiotic materials)。对于膜杂交和qPCR,首先必须用参照菌株建立和优化标准曲线,因此它们不仅费力费时,而且不能够进行高通量应用。
对于高通量应用,例如在微生物的检测和微生物群落结构的监测中,目前有微阵列技术能提供最准确的测量。但是,它目前难以在微阵列上进行多重分析以大规模分析微生物丰度。
另一种最近开发的方法利用序列特异性酶切来定量目的16S rRNA靶标。16S rRNA靶标的丰度是通过比较电泳图中被切割16S rRNA的峰面积(强度)与总16S rRNA的峰面积(强度)来进行评估。虽然这个技术不需要先制作外标曲线或不需要使用内标,但它在每次实验只能分析一个16S rRNA靶标。
有需要提供快速、高通量、灵敏且准确的高再现性方法,来测定样品中的靶标核酸的存在、身份(identity)和/或数量,且这种方法能克服或者至少改进上述的一个或多个缺点。
发明内容
本发明的第一个方面提供鉴定靶标核酸的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使含有多个靶标核酸的样品与至少一个系列的核苷酸引物在这样的条件下进行接触,该条件能使得所述引物可以与至少一个所述靶标核酸发生结合,并使得所述结合引物可以用可检测信号进行标记,其中每个系列当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和
(b)测量每个标记引物的所述可检测信号,以确定所述靶标核酸的身份。
在一个实施方案中,样品包含经扩增的靶标核酸。
在一个实施方案中,靶标核酸包含16S核糖体RNA。
在一个实施方案中,第一个方面的方法还包括在步骤(b)之前对标记引物进行纯化的步骤。纯化步骤可包括色谱分离、基于酶的消化、离心纯化管柱纯化(spin column purification)、化学沉淀或电泳分离。
在一个实施方案中,每个系列包含3-20个核苷酸引物。一个系列当中有至少一个核苷酸引物其长度可与该系列的其他成员不同。或者,一个系列当中的每一个核苷酸引物其长度可与该系列的其他引物不同。
不同的长度可包括约2至约70个核苷酸的差异,可用不同长度的核酸尾(nucleic acid tail)来获得。示例性的核酸尾包括poly dA尾和poly dT尾。一个系列的各个成员的核酸尾可在约2至约50个核苷酸之间。
在一个实施方案中,在核苷酸引物与靶标核酸结合后,所述方法包括用标记有可检测信号的单核苷酸延伸该引物的步骤。示例性的单核苷酸包括双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP。可检测信号可以是荧光信号、化学发光信号、发光信号、放射性信号或生物素酰化信号。示例性的荧光信号包括荧光素、罗丹明、香豆素、花青、荧光纳米颗粒和荧光量子染料。
在一个实施方案中,经标记引物的可检测信号是通过应用一个或多个靶标核酸的校准系数(calibration factor)来定量。校准系数可通过确定特异性水平较高的结合引物的可检测信号强度与特异性水平较低的结合引物的可检测信号强度之比来获得。
在一个实施方案中,第一个方面的方法包括在步骤(b)之前对标记引物进行分离以使得能够确定靶标核酸的身份的步骤。分离可用电泳、色谱或质谱来进行。
在一个实施方案中,能使得引物可以与至少一个靶标核酸发生结合并使得结合引物可以用可检测信号进行标记的条件,包括使引物与靶标核酸发生退火和使引物用至少一个标记有可检测信号的单核苷酸进行延伸的条件,及这种条件的多个循环。
在一个实施方案中,第一个方面的方法的步骤(a)包括使样品的第一等分试样与第一系列的核苷酸引物进行接触和另外地使该样品的第二等分试样与第二系列的核苷酸引物进行接触,其中第一系列和第二系列包括至少一个共同的核苷酸引物。
在一个实施方案中,所述方法是测定异质样品(heterogenous sample)中的组成生物(constituent organism)的方法。组成生物可以是原核生物如细菌和古细菌或者真核生物如真菌和酵母。
在一个实施方案中,核苷酸引物的系列包括多个特异性水平等级的核苷酸引物。该系列可包括一个等级水平较高的引物和多个等级水平较低的引物。
在一个实施方案中,核苷酸引物的系列包括多个种特异性引物和一个非种特异性引物。该系列可包括某个域特异性引物(domain-specific primer)和选自门特异性引物(phylum-specific primer)、纲特异性引物(class-specificprimer)、目特异性引物(order-specific primer)、科特异性引物(famiIy-specificprimer)、属特异性引物(genus-specific primer)和种特异性引物的多个引物,或者可包含一个门特异性引物和选自纲特异性引物、目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个纲特异性引物和选自目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个目特异性引物和选自科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个科特异性引物和选自属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个属特异性引物和多个种特异性引物。
在一个实施方案中,一个系列除了特异性水平较低的那一个成员外每个成员都对一个靶标核酸有特异性。
在一个实施方案中,一个系列当中有至少一个核苷酸引物能够结合多个靶标核酸。
本发明的第二个方面提供在鉴定靶标核酸的方法中使用的试剂盒,所述试剂盒包含:
(i)至少一个系列的能够结合多个靶标核酸的核苷酸引物,其中每个系列当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和
(ii)说明书,说明使含有多个核酸的样品与核苷酸引物在这样的条件下进行接触,该条件能使得引物可以与至少一个靶标核酸发生结合,和使得结合引物可以用可检测信号进行标记,以使得可以测量每个标记引物的可检测信号,从而确定出靶标核酸的身份。
在一个实施方案中,试剂盒还包含一套能够结合核苷酸引物的具有可检测信号的标记(label)。
在一个实施方案中,一个系列当中有至少一个核苷酸引物其长度可与该系列的其他成员不同。
在一个实施方案中,一个系列当中的每一个核苷酸引物其长度与该系列的其他成员不同。
本发明的第三个方面提供诊断受治疗者中的肠道疾病的方法,其中所述疾病与肠道菌群的异常分布有关,所述方法包括鉴定来自该受治疗者的样品中的靶标核酸,该鉴定包括以下步骤:
(a)使含有靶标核酸的样品与至少一个系列的核苷酸引物在这样的条件下进行接触,该条件能使得所述引物可以与至少一个所述靶标核酸发生结合,并使得所述结合引物可以用可检测信号进行标记,其中每个系列当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和
(b)测量每个标记引物的可检测信号以鉴定靶标核酸的身份,其中该鉴定能确定出肠道菌群分布。
定义
本文所用的以下词语和术语应具有以下所示的含义:
术语“多重”指在单个反应容器中进行的多个反应。
本文所用的术语“多个”指至少两个。
术语“核酸”及同意义术语如“多核苷酸”指任何长度的核苷酸多聚形式,如核糖核苷酸(RNA)、脱氧核糖核苷酸(DNA)或肽核酸(PNAs),它们包含嘌呤碱基和嘧啶碱基,或者其他天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。核酸可以是双链的或单链的。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团,如在RNA或DNA中通常所见,或者包含经修饰或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸,如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可被非核苷酸成分所间断。术语核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸的互补物、片段和变体,或者它们的类似物。多核苷酸包括通常包含2至约500个核苷酸的“寡核苷酸”。
本文所用的术语“引物”指能够与靶标核酸发生结合的单链寡核苷酸。通常,结合是选择性结合。引物的精确长度会随特定的应用而异,但通常为约15至约120个核苷酸。引物不需要反映靶标核酸模板的确切序列,但必须有足够的互补性以与模板发生结合。术语“核苷酸引物”包括“寡核苷酸引物”。
术语“系列”指在多重反应的单一反应容器中使用的一套核苷酸引物。在每一个系列当中,各核苷酸引物其长度可相同或不相同,可与发射相同或不同的可检测信号的标记进行偶联,可具有不同的特异性水平,其中一些引物能够结合多个靶标核酸,而一些引物则仅能够结合一个特定的靶标核酸。
术语“种特异性核酸”指衍自生物的一个特定种的核酸。在一些实施方案中,衍自第一生物的种特异性核酸可存在于包含衍自第二生物的种特异性核酸的混合样品中。术语“域特异性核酸”、“门特异性核酸”、“纲特异性核酸”、“目特异性核酸”、“科特异性核酸”和“属特异性核酸”应作相应的解释。
术语“选择性结合”指核苷酸引物优先结合靶标核酸的能力。在表示某核苷酸引物能“选择性结合”这个意义上,该术语包括这样一层意思,即该核苷酸引物在严格结合条件下与靶标核酸的结合程度可检测地大于其与非靶标核酸的结合程度。
术语“可检测标记”指能够产生可检测和可测量的信号,且可与核苷酸引物共价或非共价连接的报道分子或酶。
术语“标记(的)”当与核苷酸引物一起使用时,意指涵盖通过将可检测物质(例如荧光标记)共价或非共价偶联(例如物理连接)到该引物来对该引物进行的直接标记,以及通过与被直接标记的另一试剂的反应性来对该引物进行的间接标记。直接标记可用单核苷酸链延伸来实现,这包括用标记有可检测信号如荧光标记的单核苷酸对核苷酸引物进行的延伸。间接标记的实例包括用荧光标记的第二抗体对第一抗体进行的检测,和为了使DNA引物能用荧光标记的链霉亲和素进行检测而用生物素对DNA引物进行的末端标记。
词语“基本上”并不排除“完全”,例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。在必要的情况下,词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
除非另有指明,否则术语“包含”及其语法变体意指代表“开放的(open)”或“包括在内的(inclusive)”语意,使得它们包括所述及的要素,但还允许包括另外的未述及的要素。
本文所用的术语“约”在成分浓度的情形中,通常指所述值的+/-5%,更通常指所述值的+/-4%,更通常指所述值的+/-3%,更通常指所述值的+/-2%,还更通常指所述值的+/-1%,甚至更通常指所述值的+/-0.5%。
在本公开说明书通篇中,某些实施方案会以范围形式(range format)进行公开。应认识到,以范围形式(range format)进行的描述仅仅是出于方便和简明起见,不应被解释为对所公开区间的范围的硬性限制。因此,对某范围的描述应被认为是具体公开了所有可能的亚范围(sub-range)以及该范围当中的各个数值。例如,对诸如1-6的范围的描述应被认为是具体公开了诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的亚范围,以及该范围当中的各个数值,例如1、2、3、4、5和6。这不管范围的宽度有多大都是适用的。
附图说明
附图旨在说明所公开的实施方案,帮助解释所公开的实施方案的原理。但应认识到,附图仅出于说明的目的来给出,并不代表对本发明的限制。
图1这个原理图说明进行多重鉴定和定量分析的等级寡核苷酸引物延伸(HOPE)方法的基本原理。
图2显示DNA测序仪进行寡核苷酸分离和荧光测量的灵敏度。(a)在5′末端带有Cy5修饰的合成寡核苷酸的序列。(b)毛细管电泳所分离的四个不同浓度的Cy5标记寡核苷酸的基于大小的电泳图。(c)Cy5标记寡核苷酸的浓度(94-1857pM)与峰面积表示的荧光强度的线性关系。(d)Cy5标记寡核苷酸的浓度(2.4-46.4pM)与峰面积表示的荧光强度的线性关系。
图3显示poly dA尾长度对用染料终止物进行的引物延伸的效率的影响。(a)大肠杆菌(E.coli)16S rRNA基因的选定区域的序列和用不同长度的poly dA尾修饰的寡核苷酸引物(EUB338)的序列。与不带poly dA尾的EUB338引物中存在的核苷酸相同的核苷酸以连字号表示。(b)受加到EUB338引物的5′末端的poly dA尾的长度影响造成的引物延伸效率的下降。以百分数表示的延伸效率是基于ddCTP偶联的每条引物的浓度与每条不带poly dA尾的ddCTP偶联引物EUB338的浓度之比计算的。数据点代表得自两个反应和重复毛细管电泳分析的平均值。误差条代表平均数据点的标准偏差。
图4是拟杆菌属菌种(Bacteroides spp.)的系统树和用于多重HOPE的引物的特异性。该系统树图是用ARB以邻位相连法构建,以大肠杆菌(Escherichia coli)为根。线标尺对应于每100个核苷酸位置10个核苷酸置换。用于4重反应(空心圆圈)、6重反应(实心圆圈)和7重反应(实心方框)的引物在树图的右边显示。引物特异性由引物的位置和括号表示。所延伸的核苷酸的类型在引物名称后面的括号内表示。拟杆菌属菌种的末端限制性片段(tRF)长度在种名后面的括号内表示,这些长度是用ARB中的tRF切割插入程序(tRFcut add-in program)用引物Bac32F和Bac708R及限制性内切核酸酶进行计算机分析得到的。
图5显示退火温度对多重HOPE的效率的影响。各反应是用多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)16S rRNA基因扩增子和含有(a)EUB338Ia、(b)BAC303-5a、(c)BTH274-15a和(d)BTH584-16a的引物混合物进行。应用了25个循环的热循环(96℃变性10sec,高温退火30sec,72℃延伸15sec)。对于每个高温,相应的效率以占该引物所遇到的最大值的百分数来计算。每个引物的解链温度(Tm)不计dA按以下公式计算:2(A+T)+4(G+C)。
图6显示循环数对用染料终止物进行的多重HOPE的影响。各反应是用以下热循环条件进行:96℃变性30sec,60℃退火30sec,72℃延伸30sec。实验是用B.thetaiotaomicron 16S rRNA基因扩增子和含有EUB338Ia、BAC303-5a、BTH274-15a和BTH584-16a的引物混合物进行。数据点代表得自两个反应和重复毛细管电泳分析的平均值。误差条代表平均数据点的标准偏差。
图7显示引物BAC303-5a(●)、BTH274-15a(○)和BTH584-16a对通用引物EUB338Ia的换算系数的分布。引物-靶标比(以摩尔浓度计)在250-16000之间。实验是用固定的引物浓度,通过改变靶标浓度来进行,如下文实施例1所示。数据点代表得自三个反应的平均值。误差条代表平均数据点的标准偏差。
图8显示多重HOPE的特异性。拟杆菌属菌种模板在4重HOPE反应中使用,该反应中包括有引物EUB338、BAC303-5a、BTH274-15a和BTH584-16a。(a)引物的序列和选定的参照靶标的结合区域的序列。对于每个引物,显示了第一个细菌种的互补序列。在后随的菌种中若遇到相同的序列组成,则用双虚线表示。对于引物EUB338,下划线的各核苷酸表示引物EUB338Ia的序列。(b)用染料终止物进行的多重HOPE的特异性。拟杆菌属菌种模板在每个基于大小的电泳图的右上方表示。虚峰和实心峰分别代表D4-ddUTP偶联引物和D2-ddCTP偶联引物。
图9显示用染料终止物进行的HOPE的灵敏度。两个引物(a)BTH274-15A和(b)BTH584-16A与1pg至5000pg的系列浓度的B.thetaiotaomicron 16S rRNA基因扩增子一起使用。各反应是用单独B.thetaiotaomicron扩增子在20μl(空心圆圈),10μl(空心方框)和5μl(空心倒三角)的总体积中进行。还进行了B.thetaiotaomicron加100ngL.acidophilus扩增子的5μl(●)反应。应用了40个循环的热循环条件(96℃变性10sec,60℃退火30sec,72℃延伸15sec)。数据点代表得自重复毛细管电泳分析的一个反应的平均值。误差条代表平均数据点的标准偏差。
图10显示各种形式的可用多重HOPE方法进行分析的核酸,包括基因组DNA(a)和天然RNA(b)。
图11的电泳图分别是:从Bacteroides tectus、Bacteroides fragilis和Bacteroides thetaiotaomicron的混合16S rRNA基因扩增子产生的6重反应产物的电泳图(a);从Bacteroides intestinalis、B.fragilis、Bacteroidesacidifaciens、Bacteroides uniformis和Bacteroides pyogenes的混合16S rRNA基因扩增子产生的7重反应产物的电泳图(b);和从废水流入物的16S rRNA基因扩增子产生的7重反应产物的电泳图(c)。虚线峰、实线峰和实心峰分别代表用D4-ddUTP、D3-ddGTP和D2-ddCTP延伸的引物。受检的引物和内标(GT40-D4和GT46-D2)在(c)小图中的对应峰的旁边标出。
图12显示HOPE反应的另一个实施方案。将PCR扩增子、荧光标记ddNTPs、DNA聚合酶和各寡核苷酸引物混合在一起,形成多重HOPE反应混合物。该混合物进行20-25个循环的变性(96℃)、退火(60-640C)和单碱基延伸(72℃)。然后将适当量的产物混合物与合成的寡核苷酸标准品混合,进行毛细管电泳。
图13显示拟杆菌属的系统树和用于多重HOPE的引物的特异性。多重HOPE反应1-5含有种特异性引物和一个对B.fragilis簇(cluster)特异的更高级别引物(Bfrg602_19dA或Bth274[T]_15dA)。多重HOPE反应6含有以亚簇水平(Bth274_15dA)、簇水平(Bfrg602_19dA)、目水平(Bac303_5dA)和域水平(O1390_17dA)进行靶向的引物。
图14显示多重HOPE反应1-6的毛细管电泳图。对于每个样品,将30ng PCR扩增子和2.5μl SNP预混合物(premix)加到多重HOPE反应1-6中。如毛细管电泳图所示,人粪便H3在域水平、目水平和种水平上检测到拟杆菌属细菌。黑色峰、红色峰和绿色峰分别代表用dTAMRA-ddCTP、dROX-ddTTP,dR6G-ddATP延伸的引物。内标在相应的峰的旁边标示。
图15显示以不同的循环数进行的微生物靶标PCR扩增,以确定最佳的循环数。
具体实施方式
现将公开用以检测、鉴定和/或定量多个靶标核酸的新方法的示例性非限制性实施方案。
本发明提供了多重方法即等级寡核苷酸引物延伸(hierarchicaloligonucleotide primer extension,HOPE),用以快速检测、鉴定和/或定量含有不同核酸的混合物的样品中的多个不同靶标核酸。多个在这个情形中指至少两个。
样品可以是任何样品,其至少有一些组分要进行测定。例如,样品可以是环境样品、生物样品或食品样品。
环境样品包括但不限于获自或衍自土壤、水、废水、泥浆、植物提取物、木材、生物材料、海洋或河口沉积物、工业排放物、气体、矿物提取物、砂子、自然排泄物、陨星等的样品。该样品可从不同的地区或条件收集,如热带地区、沙漠、火山地区、森林、农场、工业区、家庭等。
生物样品指获自生物或获自生物的组成成分(如细胞)的样品。该样品可以属任何生物组织或流体。通常,生物样品是衍自患者的“临床样品”。这种样品包括但不限于粪便(feces)、排泄物、大便(stool)、痰、脑脊髓液、血液、血液级份(例如血清、血浆)、血细胞(例如白细胞)、组织或细针穿刺活检样品、尿液、腹膜液和胸液或来自它们的细胞、以及组织切片如为组织学目的获取的冷冻切片。
食品样品指可被动物如人摄取的物质,包括包装食品制品、乳制品、动物制品、植物制品、生食品材料、未经巴氏杀菌或经过巴氏杀菌的食品材料以及水。
样品可以是未经处理的、经处理的、经稀释的或经浓缩的。样品可直接进行分析,或者可在用于本发明公开的方法前先进行一定的制备。这种制备包括但不限于将该样品悬浮/稀释于水或适当缓冲液中,或者例如通过离心除去细胞碎片或其他不需要的成分,或者在分析前先选出该样品的特定级份。
靶标核酸可以是任何要从含有核酸混合物的样品中的其他核酸中挑出来的核酸。靶标核酸可以是RNA、DNA、cDNA或PNA。靶标核酸可以是同一核酸分子的不同区域。例如,靶标核酸可包含特定的基因簇如16SrRNA或者其他功能基因。
在需要的情况下,可用本领域公知的技术将靶标核酸从样品中提取出来,所述技术例如超声处理、去污剂处理、酶消化、盐析、醇沉淀和苯酚-氯仿萃取。
靶标核酸例如基因组DNA和天然RNA可直接用于本发明公开的方法中。在一些实施方案中,可将靶标核酸进行扩增以产生出额外拷贝的一些或所有靶标核酸,再用于本发明公开的方法中。例如,可用PCR技术(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York,1989和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publ.Assoc,and Wiley-Intersciehces,1992),或者本领域公知的其他核酸扩增技术,例如连接酶链式反应(LCR)(参见Wu and Wallace,Genomics 4:560(1989)和Landegren等人,Science 241:1077(1988))、转录扩增(参见Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173(1989))、自动维持序列扩增(参见Guatelli等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:1874(1990))和基于核酸的序列扩增(NASBA)(J.Compton,Nucleic-Acid Based SequenceAmplification,Nature 350(6313):91,Mar.7,1991),来扩增靶标核酸。
在一些实施方案中,可将样品中的大多数或所有的靶标核酸进行扩增。在一些实施方案中,可将所需的靶标核酸亚群(subpopulation)进行扩增。例如,在怀疑或已知包含细菌、分枝杆菌和真菌的废水样品中,可能需要优先地扩增细菌靶标核酸后再用于本发明公开的方法中。在一些实施方案中,可将靶标核酸的选定区域例如rRNA(如16S rRNA)进行扩增。
在一些实施方案中,多个不同的靶标核酸可在一个样品中得到检测、鉴定和/或定量。本文所用的多个指至少两个。在诸如土壤、水、废水、泥浆、植物提取物、木材、生物材料、海洋或河口沉积物、工业排放物、气体、矿物提取物、砂子、自然排泄物、陨星等的环境样品的情形中,样品可能含有不同生物的混合物,可在该样品中检测、鉴定和/或定量出多个不同的靶标核酸,例如可检测、鉴定和/或定量出约2个、约3个、约4个、约5个、约10个、约15个或约20个靶标核酸。
靶标核酸可用一个或多个系列的这种核苷酸引物中的多个核苷酸引物进行检测、鉴定和/或定量。
用于本发明公开的方法和试剂盒的引物通常是长度一般为15-120个碱基的寡核苷酸。这种引物可通过任何合适的方法制备,包括例如直接化学合成或者适当序列的克隆和限制酶切(restriction)。并不需要引物中的所有碱基都反映其将要结合的模板分子的序列;引物仅需要含有足以使它能够结合靶标核酸模板的足够互补碱基。如本文所述,引物可在5′末端包括例如poly dA或poly dT尾形式的额外碱基,以改变一系列引物当中的各引物的长度。
制备和使用引物的方法在例如以下文献中有描述:Sambrook,J.and D.W.Russell(2001;Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ea.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor NY),Ausubel,F.M.等人(1999;Short Protocols in Molecular Biology,4d ea.,John Wiley & Sons,NewYork NY)和Innis,M.等人(1990;PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications,Academic Press,San Diego CA)。引物可从已知的序列衍生,例如通过使用预定用于这个用途的计算机程序如Primer(Version 0.5,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge MA)来衍生。
供用作引物的寡核苷酸可用本领域已知用于该用途的软件来选择。例如,OLIGO 4.06引物分析软件(可获自National Biosciences,Plymouth,MN)可用于选择各自最长达30-100个核苷酸的引物,和用于从最长达32千碱基的输入多核苷酸序列中分析最长达5,000个核苷酸的更大多核苷酸。类似的引物选择程序已并入了额外的特征以扩展性能。例如,PrimOU引物选择程序(公众可从University of Texas South West Medical Center(位于Dallas TX)的Genome Center获得)能够从兆碱基序列中选择特异的引物,因此可用于在基因组范围内设计引物。Primer3引物选择程序(公众可从Whitehead Institute/MIT Center for Genome 5 Research,Cambridge MA获得)能让使用者输入“mispriming library”,其中要避免作为引物结合位点的序列是使用者指定的。Primer3对于选择微阵列用核苷酸特别有用。(后两个引物选择程序的源代码也可从它们各自的来源获得,并作修改以符合使用者的具体需要)。PrimeGen程序(公众可从UK Human Genome MappingProject Resource Centre,Cambridge UK获得)基于多个序列比对来设计引物,从而使得可以选择出能与所比对的核酸序列的最保守区域或最不保守区域结合或杂交的引物。因此,这个程序可用于鉴定独特和保守核苷酸以及多核苷酸片段。
多个引物可构成一系列的引物。至少有一个系列的引物用于本发明公开的方法中。每个系列的引物包含约3个至约20个引物。例如,一个系列可包含约3至约5个引物,约5至约10个引物,约8至约12个引物,约10至约15个引物,约13至约18个引物,或者约15至约20个引物。例如,一个系列可包含约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个引物。
每个引物可在一个系列当中以一个或多个拷贝数存在。
某系列当中的不同引物可在分析或测量过程中,通过不同的引物长度或不同的标记或这两方面进行区分。在一个系列当中的各引物基于其长度进行区分的情况中,该系列当中有至少一个引物其长度与该系列的其他成员不同。或者,一个系列当中的每个引物其长度可与该系列的每个其他成员不同。在一个系列中的各引物长度的差异旨在用于区分这些引物的情况中,所述差异必须足以使得能够区分不同引物中的每一个。本发明技术人员(skilled addressee)会认识到,引物的分析方法会影响各引物之间所需的差异程度,其中一些分析方法能够区分约1、2、3、4或5个碱基的差异(例如毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳),而其他的分析方法能够区分大于约5、6、7或8个碱基的差异(例如琼脂糖凝胶电泳)。一般地,差异可在约2至约70个核苷酸的范围内。通常,差异可为约5至约10个核苷酸、约11至约15个核苷酸、约16至约20个核苷酸、约21至约30个核苷酸、约31至约40个核苷酸、约41至约50个核苷酸、约51至约60个核苷酸或者约61至约70个核苷酸。
在一些实施方案中,不同的长度可通过将不同长度的核酸尾整合到一个系列当中的各引物中的一个或多个或者每一个中来获得。可使用的核酸尾的是本领域公知的,包括但不限于poly dA尾和poly dT尾。用于一系列的引物中的各个成员的核酸尾的长度可在约2至约50个核苷酸之间。通常,核酸尾的长度可为约5至约10个核苷酸、约11至约15个核苷酸、约15至约20个核苷酸、约21至约25个核苷酸、约25至约30个核苷酸、约31至约35个核苷酸、约35至约40个核苷酸、约41至约45个核苷酸或者约45至约50个核苷酸。在一些实施方案中,核酸尾的长度为约4、约8、约12、约18、约24或约30个核苷酸。
在一个系列当中的一个或多个引物基于其不同标记进行区分的情况中,该系列当中有至少一个引物其标记与该系列的其他成员不同。或者,一个系列当中的每个引物其标记可与该系列的每个其他成员不同。每个标记能够发射出能区分该系列当中的不同引物的可检测信号。可用于本发明公开的方法的标记是本领域公知的,包括但不限于发射荧光信号、化学发光信号、发光信号、放射性信号或生物素酰化信号的标记。发射荧光信号的标记的实例包括荧光素、罗丹明、香豆素、花青、荧光纳米颗粒和荧光量子染料。荧光染料的具体实例包括3-(ε-羧基戊基)-3′-乙基-5,5′-二甲基氧杂羰花青(CYA)、6-羧基荧光素(FAM)、5和6-羧基罗丹明-110(R110)、6-羧基罗丹明-6G(R6G)、N′,N′,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、2′,4′,5′,7′-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)和2′,7′-二甲氧基-4′,5′,6羧基罗丹明(JOE)。发射化学发光信号的标记的实例包括1,2-二氧杂环丁烷、cyalume、草酰氯、四(二甲氨基)乙烯、连苯三酚、光泽精和鲁米诺,而发射放射性信号的标记的实例包括碘的γ-放射性同位素。
标记可如上所述直接或间接地与引物偶联。在一个实施方案中,可在引物与其靶标核酸结合后,通过单链引物延伸反应将标记与引物偶联,该反应包括用标记有可检测信号的单核苷酸对结合引物进行延伸。可用于这个用途的单核苷酸是本领域公知的,包括但不限于双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP。通常,引物成功地与靶标核酸退火后,将荧光标记的二脱氧核苷三磷酸(ddNTP)或染料终止物(dye-terminator)加到引物的3′末端。由于所加入的ddNTP上缺乏3′-OH基团来形成磷酸二酯键,链延伸反应被终止。ddNTP上的标记因此与核苷酸引物偶联。
每个系列的核苷酸引物当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员。在一个实施方案中,一个系列除了特异性水平较低的那一个成员外每个成员都对某一不同的靶标核酸有特异性。在其他实施方案中,一个系列当中有至少一个核苷酸引物能够结合多个靶标核酸。在其他实施方案中,一个系列的第一多个成员各自能够结合多个靶标核酸,而该系列的第二多个成员各自对某一靶标有特异性。
在一个实施方案中,一个系列当中的各核苷酸引物其特异性水平是分等级的。例如,一个系列可包括一个等级水平较高的引物和多个等级水平较低的引物。等级水平较高的引物其特异性水平较低,原因在于该引物能够比等级水平较低、特异性水平较高的引物结合更多的靶标核酸。一个系列当中的等级水平为最高级别的引物可例如结合样品中的所有靶标核酸。
在一个实施方案中,一个系列可包含多个种特异性引物和一个非种特异性引物。例如,一个系列可包含一个域特异性引物和选自门特异性引物、纲特异性引物、目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包含一个门特异性引物和选自纲特异性引物、目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个纲特异性引物和选自目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个目特异性引物和选自科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个科特异性引物和选自属特异性引物和种特异性引物的多个引物,或者可包括一个属特异性引物和多个种特异性引物。预期具有域水平特异性的引物能够比具有较低等级特异性的引物结合更多的靶标核酸。在这个情形中所用的域(domain)指生物在分类学等级中的最高级别。通常,分类学等级排序为域,接下来为界(kingdom)、门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)和种(species)。每个等级级别(hierarchical rank)可进一步包括前缀,例如前缀“亚”(sub-)表示较下的级别,前缀“超”(super-)表示较上的级别,前缀“次”(infra-)表示低于“亚”的级别。例如,超域的级别较高于域,域的级别较高于亚域,亚域的级别较高于次域。界、门、纲、目、科、属和种的前缀应作相应解释。
如上所述,可将多个系列的核苷酸引物用于本发明公开的方法中。例如,可用两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个系列来分析样品。在进行超过一个多重反应的情况中,可使用几个系列的核苷酸引物。例如,系列‘A’可用于4重反应,系列‘B’可用于6重反应,系列‘C’可用于7重反应。各个多重反应还可以以不同的排列(permutation)进行组合,以进一步增加多种反应的重数(multiplicity)。例如,6重反应中的系列‘B’可与7重反应中的系列‘C’进行组合,以将重数增加到10重反应。
在使用两个系列的情况中,将样品的第一等分试样与第一系列的核苷酸引物进行接触和另外地使该样品的第二等分试样与第二系列的核苷酸引物进行接触,其中第一系列和第二系列具有至少一个共同的核苷酸引物。
类似地,在使用三个系列的情况中,将样品的第一等分试样与第一系列的核苷酸引物进行接触,另外地使该样品的第二等分试样与第二系列的核苷酸引物进行接触,和另外地使该样品的第三等分试样与第三系列的核苷酸引物进行接触。第一系列和第二系列可具有至少一个共同的核苷酸引物,第二系列和第三系列可具有至少一个共同的核苷酸引物,第一系列和第三系列可具有至少一个共同的核苷酸引物。为避免混淆,第一系列、第二系列和第三系列可都具有至少一个共同的核苷酸引物。
在一个实施方案中,所述方法是测定异质样品中的组成生物的方法。组成生物可以是原核生物如细菌(例如革兰氏阳性细菌、绿色丝状细菌(green filamentous bacteria)、螺旋菌、变形细菌、蓝细菌、浮游菌属(planctomyces)、拟杆菌属(bacteroides)、噬纤维菌属(cytophaga)、热袍菌属(thermotoga)、产液菌属(aquifex))和古细菌(例如嗜盐菌(halophiles)、甲烷八叠球菌(methanosarcina)、甲烷杆菌(methanobacterium)、甲烷球菌(methanococcus)、热变形菌属(thermoproteus)、热网菌属(pyrodicticum),或者真核生物如真菌(例如藻菌纲(phycomycetes)、子囊菌纲(ascomycetes)和担子菌纲(basidiomycetes))、酵母(例如酵母菌属(saccharomyces)、克鲁维酵母属(kluyveromyces))和植物(例如藻类、苔藓等)。
能使得引物可以结合靶标核酸的条件是本领域公知的,或者可容易地用普通的实验方案进行确定。在每种情况中,合适的方案和试剂在很大程度上要取决于具体的境况(circumstance)。可从多个来源获得指导,例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring-Harbor,New York,1989和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publ.Assoc,and Wiley-Intersciences,1992。本领域技术人员会容易认识到,可在不造成不能够实现所需的结果的条件下,对这些程序的各个不同参数加以变动。例如,所用的靶标核酸的量,可根据可利用所得的材料或样品(如RNA或DNA)的量或者为进行有效结合所需的靶标核酸的最佳量,来进行变动。
通常,适合于引物与靶标核酸的结合的条件包括低于约1M的盐浓度,更通常低于约500mM和低于约200mM。合适的温度可低至5℃,但通常高于22℃,更通常高于约30℃,优选超过约37℃。引物与靶标核酸的结合优选在严格条件下进行。严格条件是取决于序列而定的,在不同的境况下不同。较长的引物可能要求较高的温度来进行特异性结合。由于其他因素会影响结合的严格性(stringency),包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度,参数的组合比任何单个参数的绝对度量(absolute measure)更为重要。一般地,将严格条件选择为比具体序列在确定离子强度和pH下的熔点(Tm)低约5℃。Tm是在平衡时与靶标核酸互补的引物中有50%与靶标核酸结合的温度(在确定的离子强度、pH和核酸组成下)。通常,严格条件包括在pH 7.0-8.3和至少25℃温度下盐浓度为至少0.01M到不超过1M Na离子浓度(或者其他盐)。
虽然引物与核酸靶标的结合优选在如上所述的高严格性条件下进行,但结合也可在中严格性和低严格性条件下进行。低严格性条件可对应于在2 x SSC中50℃下进行的结合。
有多种本领域技术人员公知的条件和因素可用来改变这种结合的严格性。例如,要与靶标核酸结合的引物的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成);盐和其他成分的浓度,如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖和聚乙二醇;和改变结合和/或洗涤步骤的温度。
如本文所讨论,已结合的引物可通过用经标记的单核苷酸对其进行延伸来进行标记。单核苷酸链延伸通常要求单链DNA模板(即靶标核酸)、核苷酸引物、酶(即DNA聚合酶)、经标记的核苷酸和能终止DNA链延伸的经修饰的核苷酸(例如双脱氧核苷酸或ddNTPs)。这些双脱氧核苷酸是链终止核苷酸,缺乏在DNA链延伸过程中两个核苷酸之间为形成磷酸二酯键所需的3′-OH基团。因此,将双脱氧核苷酸掺入到新生的(延伸中的)DNA链中能终止DNA链延伸。经标记的引物可进行热变性,且可通过大小(分辨率达一个核苷酸)进行分离,下文有讨论。
用经标记的单核苷酸来延伸引物的合适条件,与PCR的延伸/延长步骤中所应用的条件基本相同。DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)在通常取决于所用的DNA聚合酶的温度下将ddNTP加到引物。在使用Taq聚合酶的情况中,例如可使用70-74℃的最佳温度。通常使用约72℃的温度。本发明技术人员会认识到,可使用任何合适的延伸引物的酶,另外的实例包括DNA聚合酶I、DNA聚合酶II、DNA聚合酶III全酶、DNA聚合酶IV(DinB)、末端脱氧核苷酸转移酶、RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、T7RNA聚合酶和反转录酶。
用使引物与靶标核酸发生结合并将该引物用至少一个标记有可检测信号的单核苷酸进行延伸的条件,进行多个循环。例如,可进行15-50个循环。通常,进行约20、约25、约30或约35个循环。
产物(即已延伸的标记引物)可在分析前进行纯化,例如以除去剩余在反应混合物中的未掺入的标记单核苷酸。纯化方案是本领域技术人员公知的,包括但不限于各种形式的色谱分离(例如高效液相色谱)、基于酶的消化(例如使用碱性磷酸酶)、离心纯化管柱纯化或电泳分离。
反应产物可按照它们的不同大小和/或不同标记,在对与引物偶联的标记所发射的可检测信号进行检测和测量之前或同时进行分离。可使用的分离技术包括电泳(例如凝胶微通道(gel micro-channel)电泳和毛细管电泳、色谱(例如高效液相色谱)和质谱(例如MALDI-TOF)。
反应产物可用装备有检测器(如荧光检测器、化学发光检测器、发光检测器或放射性检测器)的DNA自动测序仪进行分析。
经延伸的引物的长度和浓度可根据内标来计算,例如由长度在13-88bp之间和浓度在100-1000pM之间的不同荧光标记寡核苷酸组成的内标。知道了各个引物的延伸效率,就可以确定特异性较高的标记引物相对于特异性较低的标记引物的强度,且如果期望的话,可将该相对强度用来计算样品中的不同靶标核酸的相对数量。
经标记的引物的可检测信号可应用一个或多个靶标核酸的校准系数来进行定量。校准系数可通过确定特异性水平较高的经标记或经延伸引物的可检测信号相对于特异性水平较低的经标记或经延伸引物的可检测信号强度之比获得。以下各方程可用于确定靶标核酸的相对丰度。
某特定的经延伸引物的浓度可用以下方程进行定量:
其中Cp代表该样品的HOPE反应中所延伸的某特定引物的摩尔浓度;Cstd代表相关的标准寡核苷酸的摩尔浓度。
每个引物的校准系数可用相关的标准寡核苷酸作为模板来获得,用以下方程进行确定:
其中引物B的特异性水平比引物A低。
然后可如下计算出引物A所靶向的核酸相比于引物B所靶向的核酸的相对丰度:
本文所述的方法的一个实施方案如图1所示。本发明公开的方法的这个实施方案的初始步骤,涉及到引物一旦成功地与经纯化、经PCR扩增的rRNA基因的被靶向区域发生退火,就进行用于“微测序(minisequencing)”的链延伸反应,来在该引物的3′末端延伸经荧光标记的二脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddTTP、ddGTP或ddCTP)或染料终止物。在这个步骤中,加入了多个寡核苷酸引物,这些引物被设计来以不同的特异性水平(即域、门、......、种)靶向序列,并在各自的5′末端用不同长度的poly dA进行修饰。在单碱基延伸后,将HOPE产物进行纯化并用装备有四颜色检测器的DNA自动测序仪进行分析。由于长度和所加入的染料终止物类型/颜色的差异,这些经延伸的等级引物能得到分离和鉴定,它们的长度和浓度按照由不同的荧光标记寡核苷酸组成的内标进行计算。由于具有域水平特异性的引物能比群特异性引物(group-specific primer)在更多的DNA模板上引导延伸,知道了各个引物的延伸效率,就可以获得某特异性的经标记引物与某宽特异性的引物的相对强度,这一比例将代表着PCR混合物中的被靶向rRNA片段的相对丰度。HOPE程序可在90分钟内完成,因此使得可以快速鉴定环境样品中的多个微生物靶标。
还提供了用于本发明公开的方法的试剂盒。试剂盒包含至少一个系列的能够结合多个靶标核酸的核苷酸引物,其中每个系列当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和依照本发明公开的方法的使用说明书。在一些实施方案中,试剂盒可包括多个系列的引物,例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个系列。如本文所述,一系列的引物可包含约3至约20个核苷酸引物。
在一些实施方案中,试剂盒还可包含一套能够结合核苷酸引物的具有可检测信号的标记。如本文所述,示例性的标记包括发射荧光信号、化学发光信号、发光信号、放射性信号或生物素酰化信号的标记。
在一些实施方案中,试剂盒可包括包含有约2至约70个核苷酸的核酸尾。如本文所述,示例性的可包括在试剂盒中的核酸尾是poly dA尾和poly dT尾。
在一些实施方案中,试剂盒可包括额外的试剂,如用于样品制备、样品扩增、引物的单核苷酸链延伸和反应产物的纯化的试剂。样品制备用的试剂包括但不限于悬浮或稀释样品用的缓冲液,用于核酸提取的醇(如苯酚、氯仿、异丙醇和乙醇)和盐溶液(如乙酸钠或乙酸铵)。
样品扩增用的试剂包括但不限于适合于延伸引物的酶(如Taq聚合酶或任何其他本文所述的酶)、脱氧核苷酸三磷酸(如dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、缓冲溶液(如氯化钾和Tris-HCl)和二价阳离子(如氯化镁)。
引物的单核苷酸链延伸用的试剂包括但不限于适合于延伸引物的酶(如Taq聚合酶或任何其他本文所述的酶)、双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)(如本文所述的ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP)、合适的缓冲溶液(如氯化钾和Tris-HCl)和二价阳离子(如氯化镁)。如本文所述,ddNTPs可任选与标记进行偶联。
反应产物纯化用的试剂包括但不限于色谱分离用试剂(如洗脱缓冲液如TE缓冲液和Tris-HCl缓冲液)、基于酶的消化用试剂(如碱性磷酸酶)、离心纯化管柱纯化用试剂(如洗脱剂咪唑、氯化铵、组氨酸等)、化学沉淀用试剂(如苯酚、异丙醇、乙酸钠、Tris-EDTA等)和电泳分离用试剂(如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基磷酸钠等)。
在一些实施方案中,试剂盒可包括内标如荧光标记的寡核苷酸,以有助于靶标核酸的定量。
实施例
现将通过以下具体的实施例更详细地进一步描述本发明的非限制性实例,这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
环境样品中的微生物靶标的分析
(a)材料和方法
收集了本地废水处理系统的流入物样品和流出物样品,并离心浓缩得到包含微生物细胞的总悬浮固形物。
提取了各个参照菌株和本地废水处理工厂的各样品的总DNA,用作16S rRNA基因的PCR扩增的DNA模板。PCR反应(100ml)含有1X缓冲溶液(Promega)、2.0mM MgCl2、各200nM的引物[11F,GTT TGA TCC TGGCTC AG和1492R,GG(C/T)TAC CTT GTT ACG ACT T]、各200mM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、0.5U Taq DNA聚合酶(Promega)和50-100ng基因组DNA。PCR扩增是用Bio-Rad iCycler(Hercules,CA)按以下热循环程序进行:初始变性(95℃,3min);95℃(30s),55℃(30s)和72℃(30s),30个循环;最终延伸(72℃,5min)。通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增后,用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)按生产商说明书纯化PCR产物。纯化的PCR产物的浓度用DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Fullerton,CA)通常紫外吸收测量进行定量。
将纯化的PCR扩增产物用于HOPE反应中。在5-20μl的总体积中进行的HOPE反应,含有5-10皮摩尔(pmole)的各个寡核苷酸引物、10-20ng的纯化模板和CEQTM SNP-Primer Extension Kit(Beckman Coulter,Fullerton,CA)的1X预混合溶液。含有试剂盒中所提供的DNA聚合酶(9%,v/v)、反应缓冲液(18.2%,v/v)和荧光标记双脱氧核苷酸(ddUTP、ddGTP、ddATP和ddCTP,18.2%(v/v))的预混合等分试液(2X),是按照生产商的推荐进行制备。ddNTPs或染料终止物标记有四种不同的WellRed荧光染料(D1、D2、D3和D4)(Beckman Coulter)。所用的寡核苷酸引物是合成的,并用HPLC纯化。引物延伸反应是用Bio-Rad iCycler按以下热循环程序进行:96℃(10s),600C(30s)和72℃(15s),20个循环。
引物延伸反应后,向反应混合物加入1U的虾碱性磷酸酶(RocheApplied Science,Penzberg,德国),以水解未掺入的染料终止物的5′磷酸基团。将混合物在37℃下温育60min,通过在85℃下热变性10min终止反应。或者,为缩短反应时间,可用Microcon-YM3 spin column(Millipore)纯化HOPE反应产物。表1b列出了所有用到的引物。
HOPE反应产物用具有四颜色检测能力的CEQTM 8000遗传分析系统(Beckman Coulter)进行分析。在进行毛细管电泳前,将1μL的经稀释HOPE反应产物与1μL的浓度和大小内标(见下,500-1000pM)、0.2μL的GenomeLabTM(DNA大小标准80试剂盒)DNA size standard 80 kit(Beckman Coulter)和39.8μL的样品加样缓冲液(Beckman Coulter)进行混合。将所得混合物转移到96孔板中,覆盖上一滴矿物汕。然后将该板连同充满着分离缓冲液(Beckman Coulter)的缓冲液板装入CEQTM 8000系统中。电泳程序包括变性步骤(90℃,120s)、在2.1kV电压下15s(或者6kV下5s)的注射步骤和在6.0kV电压下的分离步骤(58℃,16min)。为了检测出以低浓度存在的标记寡核苷酸,将注射样品体积和注射时间分别增加到2μL和40s。荧光强度数据被自动收集,随后通过提供给CEQTM 8000系统的软件进行分析。
各个寡核苷酸的电泳大小(electrophoretic size)是用装入该软件中的默认线性模型和染料校准参数(SNP ver 1)进行测定并用大小内标校准。所用的浓度和大小内标含有四个不同长度的四个不同Cy5标记寡核苷酸(即50-Cy5-[GT]x-30,x=8、13、18和23)、一个D2标记寡核苷酸(50-D2-[GT]23-30)和一个D4标记寡核苷酸(即50-D4-[GT]20-30)的混合物(表1b)。它们是由Operon Biotechnologies(德国科隆)或Sigma-ProligoFrance SAS(法国巴黎)合成和HPLC纯化的。这些寡核苷酸的浓度和纯度是按照各寡核苷酸和染料在最大吸光度下测得的光密度和染料的消光系数进行计算。GenomeLabTM DNA大小标准80试剂盒含有长度13和88bp的WellRed D1标记的片段。
染料终止物标记的寡核苷酸引物的浓度按以下方程(1)进行定量:
其中Cp表示某掺入了特定染料终止物的寡核苷酸引物的摩尔浓度;Cdi表示与标记的寡核苷酸引物相同的用染料标记的寡核苷酸内标的摩尔浓度;Ap表示该寡核苷酸引物的峰面积;Adi表示寡核苷酸内标的峰面积;Vp表示装载到样品装载溶液的HOPE反应产物的体积;Vdi表示装载到样品装载溶液的内标的体积。
某特定引物所定量的某特定靶标核酸序列与通用引物所定量的总靶标的相对数量,可按照以下方程(2)进行计算:
其中Cp代表在HOPE反应中延伸的某特定引物的摩尔浓度;C338Ia代表在HOPE反应中延伸的通用引物EUB338Ia的摩尔浓度;CFp-338Ia是用参照菌株获得的该特定引物相对于EUB338Ia的引物延伸效率校准系数。
(b)实验结果
图2显示DNA测序仪进行寡核苷酸分离和荧光测量的灵敏度。评估了在2.4-46.4pM和94-1857pM这两个不同最终浓度范围的四个不同Cy5标记合成寡核苷酸(即cy5-GT16、cy5-GT26、cy5-GT36和cy5-GT46)的混合物(图2a)。在这四个Cy5标记寡核苷酸当中获得了明显和准确的长度分离(图2b)。所观测到的荧光强度或峰面积与这些Cy5标记寡核苷酸的浓度高度相关(R2>0.9998)(图2c和2d),动态范围至少3阶。
图3显示poly dA长度对单碱基引物延伸效率的影响。在引物延伸反应中使用了七个用0-30核苷酸(nt)的不同长度poly dA尾修饰的EUB338引物(图3a和表1b)。它们分别用D2标记ddCTP进行延伸。用DNA自动测序仪分析后,以所观测到的荧光强度用方程(1)定量各个被延伸引物的浓度。那些poly-dA连接的EUB引物的相对引物延伸效率,通过设定EUB338的延伸效率为100%来计算。图3b显示,单碱基引物延伸的效率随poly dA尾长度的增加而线性下降(3.6%每dA),直到该长度达18nt(R2=0.982)。当poly dA尾的长度超过18nt时,引物延伸效率在24-34%之间波动。以后使用最多18nt的poly dA尾长度。
最初,在HOPE反应中使用四个不同的等级寡核苷酸引物。这四个引物即EUB338Ia、BAC303-5a、BTH274-15a和BTH584-16a在5′末端分别用0、5、15和16个dA修饰。这些引物的特异性在表1b和图4中显示。
这四个引物的预测的延伸核苷酸类型,是用含有28,289个几乎完全16S rRNA序列(41450nt)的ssu_jan04.arb数据库(www.arb-home.de),通过ARB中提供的Match Probes功能进行计算机分析。所延伸的核苷酸的预测类型,对于EUB338Ia来说大部分是ddTTP(91.6%),对于BAC303-5a和BTH584-16a来说是ddCTP。对于BTH274-15a,所延伸的核苷酸类型,对Bacteroides thetaiotaomlcron或Bacteroides fragilis 16S rRNA基因分别为ddTTP或ddCTP。其他HOPE引物的特异性及其延伸核苷酸类型在图4中显示。
图5显示退火温度对引物延伸效率的影响。退火温度在45-70℃之间以5℃的增幅变化。链延伸反应后,按方程(1)对这些标记引物进行定量。将各个相对引物延伸效率对各个引物所观测到的最高浓度进行归一化。BAC303-5A、BTH274-15A和BTH584-16A的最高延伸效率出现在45℃的退火温度,而EUB338Ia出现在60℃。在45-60℃之间,所有的引物显示出80%-100%之间的延伸效率。在高于65℃的温度下,EUB338Ia、BAC303-5A和BTH274-15A的引物延伸效率快速下降到12.2%以下。对于BTH584-16A,当退火温度高于70℃时,引物延伸效率降低到8.2%。为达到引物延伸的严格条件,将60℃的退火温度用于本研究的后续各实验。
研究了变性所用的持续时间(10s、30s和60s)、退火所用的持续时间(5s、30s和60s)和延伸所用的持续时间(15s、30s和60s)对引物延伸效率的影响。所获得的最佳持续时间为,96℃变性10s,60℃退火30s和72℃延伸15s。
图6显示引物延伸的一致结果(consistent result)。结果表明,被延伸引物的量随循环数的增加而线性增加,直到循环数为25,在30个循环后逐渐达到稳定。引物延伸的效率在循环数为25个循环以内保持恒定。达25个循环后,D2-ddCTP标记的BTH584-16A和BAC303-5A的增加速率相似且高于D4-ddUTP标记的BTH274-15A和EUB338Ia。BTH584-16A、BAC303-5A、BTH274-15A和EUB338Ia的引物延伸的斜率经计算分别为5.77、5.23、2.48和1.26飞摩尔(femto-mole)每循环(R2>0.99)。换言之,已与模板退火且被成功延伸的BTH584-16A、BAC303-5A和BTH274-15A的量,比被延伸的EUB338Ia的量高4.19、4.15和1.92倍。
图7显示引物-模板比的影响。对于这个研究,将各引物固定浓度,EUB338Ia为5pmol,BAC303-5A、BTH584-16A和BTH274-15A为10pmol。使用了在250-16000范围的引物-模板比(基于EUB338Ia),这个比例是通过将模板数量(即B.thetaiotaomicron PCR扩增子)在20fmol-0.3125fmol之间变动得到的。设定被延伸的EUB338Ia的量为1,对以各个引物-模板比从这四个引物延伸得到的引物的量进行归一化。EUB338Ia和D2-ddCTP延伸引物(BAC303-5A和BTH584-16A)之间的归一化比普遍高于EUB338Ia和D4-ddUTP延伸引物(BTH274-15A)之间的归一化比。在1000-16000范围的引物-模板比,对于BTH274-15a和BAC303-5a来说,归一化比大体上分别保持在1.73和4.0的恒定数值。对于BTH584-16a,归一化比从3.49稍降到2.69。基于这些观测结果,当寡核苷酸引物的初始浓度超过模板浓度时(>1000倍),可用归一化比来进一步计算HOPE反应内的这些被延伸引物的浓度,以确保一致的引物延伸效率。
图8显示HOPE方法的特异性。HOPE的特异性首先是在单一反应中,用四个不同的拟杆菌属菌种(即B.thetaiotaomicron、B.fragllis、B.vulgatus和B.distasonis)和四种不同的引物EUB338、BAC303-5A、BTH584-16A和BTH274-15A进行验证。图8a表明,使用EUB338或BAC303-5A,所有四个拟杆菌属菌种用D4-ddUTP或D2-ddCTP都分别被正确地延伸。使用BTH274-15A,B.thetaiotaomicron和B.fragilis用D4-ddUTP和D2-ddCTP分别被延伸。D4-ddUTP延伸引物和D2-ddCTP延伸引物虽然显示类似的电泳大小,但根据染料的颜色可容易地被DNA测序仪所区分。对引物BTH274-15A来说,B.vulgatus和B.distasonis不产生荧光信号,因为它们分别在接近引物3′末端处含有一个错配核苷酸“T”和两个错配核苷酸“AG”。用BTH584-16A只有B.thetaiotaomicron得到D2-ddCTP的成功延伸。其他三个拟杆菌属菌种没有观测到信号,因为它们对于BTH584-16A的序列含有至少两个核苷酸错配。这些观测结果与图8b所示的计算机预测相匹配。结果总体上提示,HOPE技术对错配靶标有较高的区分能力。
用16个其他的常见于粪便样品的参照菌种,进一步确证4重HOPE的特异性(表1a)。该HOPE反应显示在从这些参照菌株延伸正确类型的核苷酸方面准确率达100%,结果与计算机预测相匹配。
图9显示HOPE方法的灵敏度。HOPE反应是用不同数量(1-5ng)的DNA模板(即B.thetaiotaomicron 16S rRNA基因)在三个不同反应体积(即5μL、10μL和20μL)下进行。使用了两个特异性引物BTH274-15A和BTH584-16A。图9(a)表明D4-ddUTP延伸的BTH274-15A的量随着模板浓度的下降而线性下降。使用20μL、10μL和5μL的反应体积,发现模板的最低可检测量分别为250pg、31.3pg和7.8pg(R2分别等于0.999、0.993和0.988)。这些可检测量分别对应于227amol、28.4amol和7.1amol。引物BTH584-16a获得了类似的结果(图9b)。对于20μL、10μL和5μL的反应体积,所检测到的最低模板量也分别为250pg、31.3pg和7.8pg(R2分别等于0.999、0.991和0.994)。显然,5μL的小反应体积会提高检测灵敏度和减少试剂用量。
通过将靶标模板(即B.thetaiotaomicron)与以高浓度存在的其他靶标进行混合,对HOPE的检测灵敏度作进一步的研究。在5μL反应体积中,将100ng的L.acidophilus 16S rRNA基因扩增子与不同数量(1-250pg)的B.thetaiotaomicron 16S rRNA基因进行混合。最低检到量对于BTH274-15a为15.6pg,对于BTH584-16a为31.3pg(图9),这与前面的DNA模板中不存在L.acidophilus扩增子情况下获得的数据相当。最小可检测靶标DNA占100ng数量的总DNA模板的大约0.016-0.031%。
如表2所示,分别制备了五个不同的模型群落并通过HOPE反应进行测定。它们包含不同数量的从三个不同拟杆菌属菌种、L.acidophilus、E.faecium、P.productus、E.coli和M.barkeri扩增得到的16S rRNA基因。B.thetaiotaomicron在HOPE反应中可同时被所有四个引物(BTH274-15A、BTH584-16A、BAC303-5A和EUB338Ia)检测到。B.distasonis和B.vulgatus仅可被BAC303-5a和EUB338Ia检测到。其余四个细菌种可被EUB338Ia检测到,M.bakeri不被任何引物检测到。某特定靶标的丰度按方程(2)进行计算。在MC1、MC2和MC3中,由BAC303-5A观测到的拟杆菌属比例分别为占总扩增DNA的77.0±3.9%、49.2±3.6%和14.8±1.0%(以摩尔浓度计),分别与制备的比例72.7%、46.2%和21.5%非常接近(表2)。由BTH274-15A和BTH584-16A检测到的B.thetaiotaomicron的比例,在MC1和MC2中分别为17.6-18.5%,这也与制备的比例(21.5-22.1%)接近。但是,在MC3中观测到较低的比例(14.4-14.9%)。在MC4中,观测到拟杆菌属菌种的丰度为占总细菌16S rRNA基因的9.7%,这也与11.1%的理论值非常接近。引物BTH2840-15A和BTH584-16A所检测到的B.thetaiotaomicron的丰度为占总细菌16S rRNA基因的2.8-3.4%,接近理论比例。在MC5中,用M.barker16S rRNA基因替代E.coli16S rRNA基因,所有拟杆菌属菌种的观测比例从占总细菌16S rRNA基因的9.7%增加到53.1%。因此,B.thetaiotaomicron的丰度也从占总细菌16S rRNA基因的2.8-3.4%增加到15.3-17.4%。这些结果显示,HOPE反应能够准确地和可再现性地剖析混合的16S rRNA基因样品中的选定靶标的相对丰度。
在图10中显示了可在HOPE反应中分析的靶标核酸的类型。除了经PCR扩增的产物外,基因组DNA和天然RNA也可用于分析。对用基因组DNA作为靶标,使用较长的引物(例如25~50nt)来提高引物延伸效率,如图10a所示。对于天然RNA靶标,使用了RNA依赖性DNA聚合酶或反转录酶,如图10b所示。证实使用HOPE反应来分析RNA靶标能够直接定量出样品中的靶标的绝对拷贝数。
为实现多重能力大于4重,设计并试验了6重反应和7重反应。图4显示含有一个域细菌特异性引物和四个群特异性引物(BTT1250、BAC303-5a、BTH274-15a、EUB338Ia-23a和BFRG602-19a)的6重HOPE反应中的引物组合。取决于靶标而定,BTH274-15a可用ddCTP或ddTTP延伸。7重反应包括两个群特异性引物(BFRG602-19a和BTH274-15a)和四个种特异性引物(BUFM1018-18a、BADF1037-9a、BFG1024和BITT141)。
图11a和11b分别显示用不同参照菌株进行的6重反应和7重反应的电泳图。各个引物基于长度和所延伸的染料终止物类型得到明显的分离和鉴定。给定引物和参照引物之间获得的校准系数与从图6和7获得的相当。
还将6重和7重HOPE反应一起使用(总共10重),以同时测定生活废水处理厂的流入物和流出物中的拟杆菌属不同种的相对丰度,在该流入物和流出物中经T-RFLP测定观测到超过25-34个可检测细菌群(数据未显示)。图11c图解了用7重HOPE反应获得的流入物样品的电泳图。那些明显的可检测峰正确地对应于群特异性引物(BFRG602_19a和BTH274-15a)、两个种特异性引物(BUFM1018-18a和BFG1024)及两个大小和浓度标准品。表3表明,拟杆菌群和BFRG602相关群的相对丰度分别占流入物样品中的经扩增16S rRNA基因的10-11.1%和3.6-4.5%。在流出物样品中这些百分数降低到1.1-1.6%和50.1%,即相对丰度下降7-45倍。BTH274相关群占流入物样品中的总扩增细菌16S rRNA基因的大约0.3-1.1%,在流出物中没有检测到。在BTH274相关群当中,B.fragilis和Bacteroides uniformis分别占BFRG602相关群的4.9-5.1%和19.7-21.6%,或者分别占EUB338Ia检测的细菌的0.2%和0.8-0.9%,这提示流入物中存在着其他不被所用的种特异性引物靶向的拟杆菌属菌种。
实施例2
用等级寡核苷酸引物延伸(HOPE)反应
定量分析粪便和废水中的人特有拟杆菌属菌种
本实施例证明HOPE作为执行对粪便和废水中存在的17个不同的人特有拟杆菌属菌种的定量分析的新方法的用途。通过将23个不同长度和/或用不同ddNTPs延伸的引物安排到七个HOPE反应管中,在90分钟内实现了高通量和快速分析。
(a)材料和方法
细菌菌株和环境样品
使用了从“日本微生物保藏中心”(Japan Collection ofMicroorganisms)(日本和光)或“生物资源保存及研究中心”(BioresourcesCollection and Research Centre)(台湾新竹)获得的19个参照细菌菌株。它们包括B.distasonis(JCM5825)、B.uniformis(JCM5828)、B.pyogenes(JCM6294)、B.helcogenes(JCM6297)、B.stercoris(JCM9496)、B.merdae(JCM9497)、B.caccae(JCM9498)、B.tectus(JCM10003)、B.acidifaciens(JCM10556)、B.fragilis(BCRC10619)、B.thetaiotaomicron(BCRC10624)、B.vulgatus(BCRC12903)、B.coprocola(JCM12979)、B.massiliensis(JCM12892)、B.eggerthii(JCM12986)、B.nordii(JCM12987)、B.salyersiae(JCM12988)、B.intestinalis(JCM13266)和B.goldsteini(JCM13446)。粪便样品收集自(i)三个年龄26-32岁的健康供体,(ii)三头健康猪和(iii)三头健康牛。环境样品收集自位于新加坡的城市处理厂和位于台湾台南的猪废水处理厂的流入物。样品收集保藏于-20℃以备进行DNA提取。
DNA提取
纯培养物和流入物样品的总DNA按之前描述的方案稍作改动来进行提取(Schmidt,T.M.,E.F.DeLong,and N.R.Pace.1991.Analysis of amarine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing(通过16S rRNA基因克隆和测序分析海洋超微型浮游生物群落).J Bacterid173:4371-8)。粪便样品的总DNA用QIAamp DNA stool mini kit(Qiagen)来提取,因为这个市售试剂盒据报道最适合于粪便样品的DNA提取。
16S rRNA基因的PCR扩增
每个PCR反应含有50-100ng的基因组DNA(于1X Takara Ex-Taq缓冲液中)、200nM的正向引物[11F,5′-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′]和反向引物[1492R,GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′]、200mM的dNTP和0.5U的Ex-Taq DNA聚合酶(Takara)。
为获得成比例扩增微生物群落所需的最佳热循环数,通过将热程序(变性,95℃ 30s;退火,55℃ 45s;延伸,72℃ 60s)以5个循环的增幅从10个循环变动到35个循环来进行研究确定。每个循环获得的扩增子用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行浓缩纯化,浓度用DU730分光光度计(Beckman Coulter)通过紫外吸收测量进行定量。
克隆和测序
为保证培养物纯度,用TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)将那些参照菌株的16S rRNA基因单独地克隆到pCRII载体中。对于每个克隆文库,选出20个克隆,用M13R引物和M13F引物进行直接PCR扩增,来确证DNA插入物的存在。然后用ABI PRISM 3.130遗传分析仪(Applied Biosystems)和Bigdye测序试剂盒(Applied Biosystems)对插入的DNA片段进行测序。用BLAST软件将这些序列与16S rRNA基因数据库进行比较。
种特异性引物设计
用ARB软件的探针设计功能,共设计了17个特异性靶向不同的人特有拟杆菌属菌种的引物。将最新版的ssu_jan04.arb数据库(www.arb-home.de,含有28,289个几乎完全的16S rRNA序列(长度>1450nt))与培养的拟杆菌属菌种的189个比对序列(获自Ribosomal DatabaseProject II(RDP))和19个参照细菌菌株的几乎完全16S rRNA序列一起使用。为提高HOPE引物的特异性,每个引物设计成非靶标的错配位置位于3′末端。首先将所设计的引物的特异性对RDP数据库进行计算机验证,随后在HOPE反应中验证,以确保当非靶标细菌菌株用作DNA模板时引物不会发生延伸。
内标寡核苷酸混合物
混合物含有四种不同长度的寡核苷酸[5′-(GT)x-3′;其中x=18、20、22和24],它们是合成的,并用四种不同的荧光团(即dR110、dR6G、dTAMRA和dROX)(Applied Biosystems)在5′末端进行末端标记。在260nm处测量各个寡核苷酸的浓度,随后进行稀释,5′-dR110-(GT)20-3′稀释至3nM,5′-dTAMRA-(GT)22-3′稀释至15nM,5′-dROX-(GT)24-3′稀释至18nM,5′-dR6G-(GT)18-3′稀释至3nM。
HOPE反应
除非另有规定,否则每个HOPE反应(共5μl)含有2.5μl的SnaPshot预混合物、5-30fmol的DNA模板、10pmole的寡核苷酸引物(新加坡Sigma-Proligo和台湾Mission Biotech)和不同数量的去离子水。SnaPshot预混合物由DNA聚合酶、离子缓冲液和荧光标记的双脱氧核苷酸(dROXTM-ddTTP、dTAMRATM-ddCTP、dR110-ddGTP和dRβG-ddATP)组成。HOPE热程序由20个循环的变性(96℃,10s)、退火(64℃,30s)和延伸(72℃,15s)所组成。引物延伸反应后,加入1U的虾碱性磷酸酶(RocheApplied Science,Penzberg,德国)以除去未掺入的染料终止物,在37℃下温育60min。然后在75℃下将酶灭活10min。
毛细管电泳
将0.5-1μl的HOPE产物与0.125μl的GeneScan Liz 120标准品(Applied Biosystems)、0.25μl的标准寡核苷酸混合物和12μl的Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems)混合。电泳程序包括变性步骤(60℃)、施加1.0-2.1kV进行12-40s的注射步骤、分离步骤。随后通过片段分析软件GeneMapper分析荧光数据,在该软件中记录着经延伸引物和内标寡核苷酸的片段大小和峰面积。
HOPE产物的相对丰度的计算
经延伸引物的浓度如下进行定量:
其中Cp代表样品的HOPE反应中所延伸的某特定引物的摩尔浓度;Cstd代表相关的标准寡核苷酸的摩尔浓度。
每个特定引物相对于更高级别引物的校准系数可用相关的参照菌株作为模板来获得,计算如下:
其中引物B以高于引物A的等级水平进行靶向。
然后可如下计算出引物A所靶向的16S rRNA基因扩增子相比于引物B所靶向的扩增子的相对丰度:
(b)结果
PCR扩增
在进行15-20循环的PCR时,实现了微生物靶标的成比例扩增。在20个循环后出现指数式扩增,在35个循环后达到稳定(图15)。因此,对于粪便样品和废水样品中的微生物靶标的所有PCR扩增,选择20个循环的PCR来产生DNA模板供随后的HOPE分析。这可使当进行种丰度(speciesrichness)的定量分析时由PCR引入的偏差减至最低。
等级引物的设计
表4列出了以种水平、群水平或域水平涉及拟杆菌属的23个不同引物的序列和特异性。基于这些细菌菌株的系统发生关系(phylogeneticaffiliation),将引物分配到七个不同的多重HOPE反应中(图13)。反应l-6含有三个较高级别的引物(Bth274、Bdts_gp980或Bfrg602)以及17个种特异性引物。因此,可定量出每个种特异性引物所靶向的各个微生物靶标相对于较高级别引物所靶向的那些靶标的丰度。在反应7中,可计算出Bth274、Bdts_gp980、Bfrg602和Bac303所代表的微生物靶标相比于总细菌(U1390相关)的相对丰度。为清楚地区分同一HOPE反应中的各个经延伸引物,将以相同ddNTP延伸的引物在5′末端用从5-24个核苷酸的不同长度poly-A尾进行修饰(表4)。
引物延伸的特异性
引物延伸的特异性是针对参照菌株进行验证。结果显示,所有的种特异性引物当其被靶向的细菌种在反应中用作DNA模板时,都如计算机预测那样正确地被相同核苷酸延伸。同样,所有的种特异性引物当在非靶标存在时都不延伸。群特异性引物Bth274在B.uniformis和B.fragilis的存在下被核苷酸“C”延伸,或者在B.tectus、B.pyogenes、B.nordii、B.salyersiae和B.thetaiotaomicron的存在下被核苷酸“T”延伸。Bfrg602被设计成靶向B.fragilis簇中的拟杆菌属菌种并被“C”延伸。被设计成分别在目水平和域水平上靶向所有19个参照细菌菌株的Bac303和U1390,分别被“C”和“A”延伸了(表4)。
HOPE反应的电泳图的阐释
图14显示代表人粪便中不同的人特有拟杆菌属菌种的经延伸引物的电泳图。由于较高级别的引物具有更多的靶标可引发,它们的峰高和峰面积比代表种特异性引物的那些峰高和峰面积要大的多。因此,在用种特异性引物进行的HOPE反应的优选实施方案中,相关的更高级别引物可能在科水平以外不靶向。这有助于峰高较低的经延伸种特异性引物的检测。另外,由于经延伸的引物会以一致的片段大小出现,所有其他与经延伸的引物不相符的峰都可认为是背景噪音而从后面的分析中除去。
经延伸引物和内标寡核苷酸的峰面积得到了记录并用于计算相对丰度。
粪便样品中的人特有拟杆菌属菌种的相对丰度
表5描述了人特有拟杆菌属菌种在不同分类学水平的相对丰度。在所有的人粪便样品中,观测到B.vulgatus为Bfrg602相关群当中的优势种(14.5-51.2%),但拟杆菌属多样性的个体间差异明显。B.fragilis、B.eggerthii、B.intestinalis和B.massiliensis在志愿者H2和H3中检测到在0.6-6.8%之间,但在志愿者H1中低得没有检测到。B.caccae和B.uniformis也以不同的相对丰度(1.3-9.1%)存在。在较高的分类学水平上,Bth274[C]相关群(包括B.uniformis和B.fragilis)占粪便菌群中存在的细菌的0.4-0.8%。同样,Bth274[T]相关群(包括B.thetaiotaomicron、B.tectus、B.caccae、B.pyogenes、B.nordii和B.salyersiae)占细菌的0.1-0.6%,其中B.thetaiotaomicron为这个群的优势种(44.8-96.4%)。Bfrg602相关簇(B.fragilis簇)随宿主而异,占细菌的3.0-6.6%。还观测到,在三个人志愿者中Bac303引物所靶向的拟杆菌(Bacteroidales)群的相对丰度为14.3-21.8%之间,这提示人粪便菌群具有相对稳定的优势微生物谱型。但是,种丰度随个体明显不同,推测是因为生活习惯、年龄和饮食的差异所致。相比之下,猪和牛粪便菌群中的人特有拟杆菌属菌种的比例明显较低。在HOPE反应7中没有检测到代表经延伸的Bth274_15dA和Bfrg602_19dA的片段。Bac303_5dA所靶向的拟杆菌,在猪粪便菌群中占总细菌的2.4-5.1%,在牛粪便中占总细菌的1.8-2.9%。这一拟杆菌相对丰度比人粪便菌群低五倍以上。
废水中人特有拟杆菌属菌种的相对丰度
将HOPE进一步应用来研究猪和城市废水处理厂流入物中的拟杆菌属菌种的相对丰度(表5)。之前在人粪便中检测到的拟杆菌属菌种在城市废水中也存在,其中B.fragilis、B.caccae、B.uniformis、B.vulgatus和B.massiliensis分别占Bfrg602相关群的11.8%、3.1%、21.5%、32.5%和6.1%。B.thetaiotaomicron仍是Bth274[T]相关群中的优势种,占了大约93.6%。虽然城市废水中存在的Bth274相关群和Bfrg602相关群相对丰度与人粪便菌群中所见的接近,但拟杆菌目的经扩增16S rRNA基因的相对丰度似乎已降低了超过两倍。这可提示拟杆菌属菌种在环境中的持久力低。在猪废水处理厂的流入物中,在种水平上靶向拟杆菌属菌种的引物没有一个可被检测到。拟杆菌目的靶标的相对丰度比城市废水低大约三倍。这再次证实了前面的观测结果,即人特有拟杆菌属菌种在动物排泄物中以较低的丰度存在。
(c)讨论
为研究拟杆菌在肠道中的功能重要性,诸如FISH和16S rRNA克隆文库构建之类的基于分子的方法已得到使用,尽管它们在进行定量方面有局限。基于16S rRNA克隆文库,发现拟杆菌门(Bacteroidetes)占总细菌的27.7-48%。在它们当中,B.fragilis和B.distasonis亚群占总细菌最多达13.3%,这表明了它们在人肠道的良好机能中的优势和重要性。
在种水平上,Suau等人(Direct analysis of genes encoding 16S rRNAfrom complex communities reveals many novel molecular species within thehuman gut(对来自复杂群落的编码16S rRNA的基因的直接分析发现了人肠道中的许多新分子种).Appl Environ Microbiol 65:4799-807v)已测定到B.thetaiotaomicron、B.vulgatus、B.uniformis和B.caccae分别占细菌的2.1%、1.4%、4.9%和1.1%。但是,这个报道的丰度比Eckburg及其同事(2005;Diversity of the human intestinal microbial flora(人肠道微生物菌群的多样性).Science 308:1635-8)报道的低三倍以上,Eckburg及其同事发现B.vulgatus和B.thetaiotaomicron分别占细菌的15%和6.2%(表6)。
这两个研究中所报道的拟杆菌属菌种丰度的差异,可能是由克隆前的扩增循环数以及挑选进行分析的克隆总数的差异所致。同样,FISH也显示出拟杆菌属在亚群水平和目水平上的相似丰度。但是,没有进行过对拟杆菌属中每个种进行定量的详细研究(表6)。这可能是因为拟杆菌属16SrRNA基因在粪便中的缺乏活性,而导致检测灵敏度低。
与上述方法相比,HOPE的检测灵敏度达总PCR扩增微生物靶标的0.05-0.1%,因此能够在种水平上检测微生物靶标。使用HOPE,发现拟杆菌的相对丰度占总细菌的14.3-21.8%,与16S rRNA克隆文库所报道的相似。但是,每个拟杆菌属菌种的丰度低三倍以上(表6)。这一相对丰度差异很可能是由于两种方法的差异所致。与检测整个PCR扩增微生物群落的HOPE不同的是,通过克隆文库进行的定量分析取决于所挑选的克隆的最终数量。因此,HOPE分析能比克隆文库更准确地反映实际种丰度。另外,整个HOPE程序可在不到90分钟内完成,从而提供了快速且灵敏的对任何样品类型进行定量分析的方法。
由于HOPE能快速定量粪便和受污染水中的拟杆菌属菌种,它可用于不同的环境微生物研究中。由于Kreader等人(1995;Design and evaluation ofBacteroides DNA probes for the specific detection of human fecal pollution(用于人粪便污染的特异性检测的拟杆菌属DNA探针的设计和评估).ApplEnviron Microbiol 61:1171-9)发现,人特有拟杆菌属菌种的丰度可区分人粪便与非人粪便,因此HOPE可用来定量这些微生物靶标,从而可作为粪便源跟踪(fecal source tracking,FST)的方法。这个研究显示的是HOPE在定量具有很高比例的拟杆菌属菌种的样品中这些菌种的相对比例方面的应用,可能不能准确反映它在这样的大片水体中执行FST的能力,在该大片水体中拟杆菌属16S rRNA基因的量可能占总细菌的0.1%以下。在这种情况下,为提高HOPE的检测灵敏度,可扩增拟杆菌属-普氏菌属(Prevotella)而不是细菌来充当HOPE反应的DNA模板。通过将该替代的基于HOPE的FST策略补充以常规的粪便指示剂试验,可更好地理解粪便污染。
HOPE除了用于FST外,这个方法还能应用来鉴定肠道或粪便中存在的疾病相关生物标记。这可这样来实现,首先将这些生物标记在健康人和病人中的相对丰度进行比较。结合对这些生物标记所起到的功能作用的认识,由此可制定出另选的治疗策略,该策略涉及到对微生物多样性进行操控。到目前为止,只有基于培养物的和常规的分子方法如变性梯度凝胶电泳(DGGE)被应用于这个领域。HOPE相对于这些常规方法具有比较优势,因为它能提供定量分析,从而能在所鉴定的生物标记和人疾病之间建立更好统计学相关性。
总之,这个研究证明了HOPE作为能够在各种分类学水平上定量微生物靶标的快速高通量检测方法的用途。这个方法的通用性还会意味着,一旦有适当的等级引物设计可供利用,可将它扩展到PCR扩增群落中的任何微生物靶标,从而促进对不同生态环境中的微生物多样性的进一步认识。
应用
有利的是,本发明公开的方法使得能够在单个分析中快速、高通量、灵敏和准确地检测、鉴定和/或定量样品中的多个靶标核酸。本发明方法在开发商品化的或定制的环境和临床用途的诊断试剂盒方面具有潜在的应用,所述用途包括监测以下场合中的指示微生物:饮用水(例如病原菌、粪便细菌和产毒素微生物)、水和废水生物处理工艺(生物膜、丝状细菌和发泡细菌(foam-forming bacteria))、受污染土壤和地下水的生物除污(指示细菌)及人和动物肠道(与健康和疾病相关的细菌),在这些场合中特定群体的丰度或者多个靶标的检测和/或定量是重要的或者必需的。
显而易见,本发明技术人员在阅读了前述公开内容后,可不偏离本发明精神和范围对本发明作出各种其他的修改方案和改编方案,且认为所有这些修改方案和改编方案都落入所附权利要求书的范围内。
表1a.20个细菌菌株的等级寡核苷酸引物延伸分析
a各细菌菌株获自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)、生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Ceater,BCRC)、日本微生物保存中心(JapanCollection of Microorganisms,JCM)、德国国家生物材料资源中心(German National Resource Centre for Biological Material,DSMZ)和英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collection of Industrial Marine and Food Bacteria,NCIMB)。
b错配碱基配对(MM)的数目。
c指邻近所形成的引物-模板双链体的模板核苷酸。
d指所观测到的染料终止物。
ND,末检测到。
表1b.本研究中所用寡核苷酸的序列和特异性
a参考图4。
表3.用多重HOPE方法定量污水处理厂流入物和流出物中特定靶标的相对丰度
a由BTH274-15a的ddCTP延伸引物检测的群。
b由BTH274-15a的ddTTP延伸引物检测的群。
6重反应所获得的校准系数:EUB338Ia-23a:BAC303-5a:BFRG602-19a:BTH274-15a(C):BTH274-15a(T):BTT1250=1:6.1:11.2:14.4:3.1:2.4,7重反应所获得的校准系数:BFRG602-19a:BUFM1018-18a:BTH274-15a(C):BTH274-15a(T):BFG1024:BITT141=1:0.8:1.2:0.4:17:0.1。
所用的细菌菌株包括B.thetaiotaomicron、B.fragilis、B.acidifaciens(JCM10556)、B.intestinalis(JCM13266)、B.uniformis(JCM5828)、Bacteroides tectus(JCM10003)和Bacteroides pyogenes(JCM6294)。ND,未检测到。
表4.本研究所包括的引物足设计来在不同的等级水平(种、属、目和域水平)靶向人特有拟杆菌属菌种
引物 | 靶标 | 序列(5’-3’) | Poly-A尾(nt) | 所加入ddNTP类型 | 参考文献 |
Pg_dtc 732 | B.pyogenes | GTT CCG GCC CGG TGA GCT | 20 | G | 本研究 |
Bhcg 171 | B.helcogenes | TTT CAG TGC CAT CGG GCAT | 8 | T | 本研究 |
Bcc 1066 | B.caccae | CGT ATG GGT TTC CCC ATA A | 15 | T | 本研究 |
Badf 1009 | B.acidifaciens | CGG CTA ACA TGT TTC CAC | 0 | A | 本研究 |
Bvg 1016 | B.vulgatus | ATG CCT TGC GGC TTA CGG C | 0 | T | 本研究 |
Bcpc 1015 | B.coprocola | CGC CTT GCG GCT TAC AAG T | 24 | T | 本研究 |
Bmsl 1000 | B.massiliensis | GCG TTT CCG CCA TAT TCG G | 19 | T | 本研究 |
Begt 999 | B.eggerthii | GTT TCC ACT ACA TTC CGC | 0 | T | 本研究 |
Bnd 136 | B.nordii | AGC CTA TCC CCG AGT AAA A | 0 | G | 本研究 |
Bsls 1016 | B.salyersiae | GCC TTG CGG CTA TGC CG | 10 | T | 本研究 |
Bmde 657 | B.merdae | TCC GCC TAC CTC AAA CAC | 0 | A | 本研究 |
Bgld 277 | B.goldsteinii | GAA CCC CTA TCC ATC GTG | 8 | G | 本研究 |
Bdts 1278 | B.distasonis | AGA CGT GGT TTG GGG ATT | 0 | C | 本研究 |
Bufm 1018 | B.uniformis | CTG CCT TGC GGC TGA CA | 20 | T | (32) |
Bfrg 1026 | B.fragilis | TCAC AGC GGT GAT TGC TC | 20 | A | (32) |
Bth 584 | B.thetaiotaomicron | CAA CTG ACT TAA CTG TCC AC | 16 | C | (32) |
Bitt 141 | B.intestinalis | CGA AAG GCT ATC CCG GAA | 0 | T | (32) |
Bdts_gp980 | B.distasonis亚群 | CGT TCA AAC CCG GGT AA | 12 | G | 本研究 |
Bth 274 | B.fragilis亚群 | CCC CTA TCC ATC GAA GG | 15 | C/T | (32) |
Bfrg 602 | B.fragilis群 | GAG CCG CAA ACT TTC ACA A | 19 | C | (14) |
Bac 303 | 拟杆菌 | CCA ATG TGG GGG ACC TT | 5 | C | (26) |
U1390 | 细菌 | YGA CGG GCG CTG TGT | 17 | A | (38) |
(14)Harmsen,et al.2002.Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces(用于检测人粪便细菌的一大套基于16S rRNA的探针).Appl Environ Microbiol 68:2982-90.
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Claims (42)
1.一种鉴定靶标核酸的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使含有多个靶标核酸的样品与至少一个系列的核苷酸引物在这样的条件下进行接触,该条件能使得所述引物可以与至少一个所述靶标核酸发生结合,并使得所述结合引物可以用可检测信号进行标记,其中每个系列当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和
(b)测量每个标记引物的所述可检测信号,以确定所述靶标核酸的身份。
2.权利要求1的方法,其中所述样品包含经扩增的所述多个靶标核酸。
3.权利要求1的方法,其中所述多个靶标核酸包含16S核糖体RNA。
4.权利要求1的方法,所述方法还包括在步骤(b)之前对所述标记引物进行纯化的步骤。
5.权利要求4的方法,其中所述纯化步骤选自由色谱分离、基于酶的消化、离心纯化管柱纯化、化学沉淀或电泳分离构成的组。
6.权利要求1的方法,其中所述至少一个系列的每一个包含3-20个核苷酸引物。
7.权利要求1的方法,其中一个系列当中至少一个所述核苷酸引物其长度与所述系列的其他成员不同。
8.权利要求1的方法,其中一个系列当中的每一个所述核苷酸引物其长度与所述系列的其他成员不同。
9.权利要求7或8的方法,其中所述不同的长度包括2-70个核苷酸的差异.
10.权利要求7-9中任一项的方法,其中所述不同的长度是用不同长度的核酸尾来获得。
11.权利要求10的方法,其中所述核酸尾选自poly dA尾和poly dT尾。
12.权利要求10的方法,其中一个系列的各个成员的所述核酸尾在2-50个核苷酸之间。
13.权利要求1的方法,其中在所述核苷酸引物与所述靶标核酸结合后,所述方法包括用标记有可检测信号的单核苷酸延伸所述引物的步骤。
14.权利要求13的方法,其中所述单核苷酸选自双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP。
15.权利要求1的方法,其中所述可检测信号选自荧光信号、化学发光信号、发光信号、放射性信号或生物素酰化信号。
16.权利要求15的方法,其中所述荧光信号选自荧光素、罗丹明、香豆素、花青、荧光纳米颗粒和荧光量子染料。
17.权利要求1的方法,其中标记引物的所述可检测信号是通过应用一个或多个靶标核酸的校准系数来定量。
18.权利要求17的方法,其中所述校准系数是通过确定特异性水平较高的结合引物的可检测信号强度与特异性水平较低的结合引物的可检测信号强度之比来获得。
19.权利要求1的方法,所述方法包括在步骤(b)之前对所述标记引物进行分离以使得能够确定所述靶标核酸的身份的步骤。
20.权利要求19的方法,其中所述分离步骤选自电泳、色谱或质谱。
21.权利要求1的方法,其中所述能使得所述引物与至少一个所述靶标核酸发生结合并使得所述结合引物用可检测信号进行标记的条件,包括使所述引物与所述靶标核酸发生退火和使所述引物用至少一个标记有可检测信号的单核苷酸进行延伸的条件,及这种条件的多个循环。
22.权利要求1的方法,其中步骤(a)包括使所述样品的第一等分试样与第一系列的核苷酸引物进行接触和另外地使所述样品的第二等分试样与第二系列的核苷酸引物进行接触,其中所述第一系列和第二系列包括至少一个共同的核苷酸引物。
23.权利要求1的方法,其中所述方法是测定异质样品中的组成生物的方法。
24.权利要求23的方法,其中所述组成生物选自原核生物和真核生物。
25.权利要求24的方法,其中所述原核生物选自细菌和古细菌。
26.权利要求24的方法,其中所述真核生物选自真菌和酵母。
27.权利要求1的方法,其中所述系列的核苷酸引物包括多个特异性水平等级的核苷酸引物。
28.权利要求1或27的方法,其中所述系列包括一个等级水平较高的引物和多个等级水平较低的引物。
29.权利要求1或27的方法,其中所述系列的核苷酸引物包括多个种特异性引物和一个非种特异性引物。
30.权利要求27-29中任一项的方法,其中所述系列包括一个域特异性引物和多个选自门特异性引物、纲特异性引物、目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的引物。
31.权利要求27-29中任一项的方法,其中所述系列包括一个门特异性引物和多个选自纲特异性引物、目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的引物。
32.权利要求27-29中任一项的方法,其中所述系列包括一个纲特异性引物和多个选自目特异性引物、科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的引物。
33.权利要求27-29中任一项的方法,其中所述系列包括一个目特异性引物和多个选自科特异性引物、属特异性引物和种特异性引物的引物。
34.权利要求27-29中任一项的方法,其中所述系列包括一个科特异性引物和多个选自属特异性引物和种特异性引物的引物。
35.权利要求27-29中任一项的方法,其中所述系列包括属特异性引物和多个种特异性引物。
36.权利要求1的方法,其中一个系列除了所述特异性水平较低的一个成员外每个成员都对一个靶标核酸有特异性。
37.权利要求1的方法,其中一个系列当中有至少一个核苷酸引物能够结合多个靶标核酸。
38.一种在鉴定靶标核酸的方法中使用的试剂盒,所述试剂盒包含:
(i)至少一个系列的能够结合多个靶标核酸的核苷酸引物,其中每个系列当中有一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和
(ii)说明书,说明使含有多个核酸的样品与所述核苷酸引物在这样的条件下进行接触,该条件能使得所述引物与至少一个所述靶标核酸发生结合,并使得所述结合引物用可检测信号进行标记,以使得可以测量每个标记引物的所述可检测信号,从而确定出所述靶标核酸的身份。
39.权利要求38的试剂盒,所述试剂盒还包含一套能够结合所述核苷酸引物的具有可检测信号的标记。
40.权利要求38的试剂盒,其中一个系列当中有至少一个所述核苷酸引物其长度与所述系列的其他成员不同。
41.权利要求38的试剂盒,其中一个系列当中的每一个所述核苷酸引物其长度与所述系列的其他成员不同。
42.一种诊断受治疗者中的肠道疾病的方法,其中所述疾病与肠道菌群的异常分布有关,所述方法包括鉴定来自所述受治疗者的样品中的靶标核酸,该鉴定包括以下步骤:
(a)使含有靶标核酸的所述样品与至少一个系列的核苷酸引物在这样的条件下进行接触,该条件能使得所述引物与至少一个所述靶标核酸发生结合,并使得所述结合引物用可检测信号进行标记,其中每个系列当中一个成员其特异性水平低于该系列的其他成员;和
(b)测量每个标记引物的所述可检测信号以鉴定所述靶标核酸的身份,其中所述鉴定确定出肠道菌群分布。
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