JP4122317B2 - 遺伝子検査方法 - Google Patents
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Description
好ましくは、前記支持体上において、前記プローブは各プローブ固定領域ごとに仕切りを設けて固定される。例えば、各プローブ固定領域ごとに、高さ1mm、幅2mm程度の仕切りを設けることにより、最後の相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸の拡散による広がりが防止できるため、ピロリン酸からの発光が局在化し、検査精度の向上が実現できる。
図1は、本発明を利用したSNP検出のプロセスを模式的に示したものである。まず、ヒトの血液試料などから抽出したゲノムDNA1を出発物質として、SNP計測の対象となる複数の遺伝子部位に対応したPCRプライマーセット2、3を用いて、複数の遺伝子部位を同時にPCR増幅5する。
次に、検出すべき配列に相補的な配列を含むDNAプローブを表面に固定した支持体(ここでは、チップ)を用意する。前記支持体上に固定されるDNAプローブは、検出すべき配列(SNP等の変異)に相補的な塩基配列を有し、かつ、その3’末端が標的SNP位置に一致するように設計されたオリゴヌクレオチドである。前記DNAプローブには、必要に応じてその3’末端から2〜4塩基目にミスマッチを導入してもよい。なお、ミスマッチの導入とは、鋳型配列とは非相補な塩基あるいは塩基相当物(スペーサー等)を当該プローブ中に挿入することを意味する。本発明において、前記DNAプローブの長さは特に限定されないが、約10〜約50塩基長、特に約20〜約30塩基長が好ましい。
PCR増幅産物を、DNA相補鎖伸長用の耐熱酵素と基質を含む反応溶液7とともに前記チップ8上に滴下し、反応溶液がチップのDNAプローブ領域を覆った状態12でサーマルサイクル反応13にかける。このとき、PCR増幅産物14のSNP位置の配列と相補な3’末端を有するDNAプローブ15のみが伸長16する。反応終了後、固体表面を洗浄17し、アルカリなどの変性剤18を加えることにより、チップ表面に固定されたDNAプローブ伸長産物と未反応DNAプローブを、それぞれ一本鎖DNA19の状態にする。この際、DNAプローブ伸長産物の3’末端にはすべて共通のアンカー配列20に相補的な配列が導入されている。
次に、前記アンカー配列と同一の塩基配列を有するプライマー、DNA相補鎖伸長用の耐熱酵素、基質、及び発光試薬を含む反応溶液21でチップのDNA固定領域を覆う。こうして、チップ上の伸長反応生成物を鋳型とした相補鎖伸長反応22と、それにより生成するピロリン酸を基質とする発光反応を同時に行う。なお、反応溶液21中には、拡散したピロリン酸の検出を避けるためにアピラーゼを添加しておいてもよい。
ヒトゲノムDNAを出発物質とする複数遺伝子部位の同時PCRは、Multiplex PCR Kit (QIAGEN社製品)のプロトコルをベースに以下の手順で進めた。まず、TE Buffer (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0)に、図2に示す9組の遺伝子特異的配列を有するプライマーセット計18種類のプライマー(配列番号1〜18)を最終濃度2 μMになるよう希釈した。アンカー配列については任意の配列を用いることができるが、検出対象であるゲノム配列に対して非特異的な配列を選択する必要がある。本実施例においては、20塩基からなるポリA配列をアンカー配列として図2に示されるプライマー2の5’末端に導入した。
本発明の第二の実施例を図5を用いて説明する。本実施例は、本発明の実用化に適した発光計測装置に関するものである。ここでは、実施例1で示した10個のSNP部位を計測するために、各3箇所からなる30箇所の検出サイト26からなるチップ27を作製した。チップはガラス基板で、各サイトは直径1mmの円形で、個々にそれぞれDNAプローブ28が固定化されている。各スポット間の距離は1.5mmで、これが5行6列に配置されている。30箇所の発光サイトからの発光をチップ底面から検出する。計測のための検出器としては、複数のフォトダイオードアレイをシリコン基板上に形成したものを用いた。各フォトダイオード29の配置は、上記チップの検出サイトの配置と同じにした。
本発明の第三の実施例を図6を用いて説明する。本実施例は、本発明の実用化に適したチップデバイスに関するものである。実施例2で示したディメンジョンで配置したチップ領域を覆うようなチップデバイス34を構成し、試薬類を注入、排出するポート35、36を設けた。このチップデバイス34にゲノムDNAからの同時増幅産物と相補鎖伸長反応溶液を導入し、実施例1と同様の温度サイクルをかけ、チップ上のDNAプローブの選択的伸長反応を行った。伸長反応終了後、排出ポートから反応溶液を排出し、さらに注入口から洗浄液、アルカリ溶液を順次、注入、排出し、チップ上の伸長DNA産物を一本鎖化した。
配列番号19〜38−人工配列の説明:合成DNA(プローブ)
2,3:PCRプライマーセット
4:アンカー配列
5:PCR増幅
6:PCR増幅産物
7:反応溶液
8:チップ
9:メジャーアレル用プローブ
10:マイナーアレル用プローブ
11:参照用プローブ
12:反応溶液がチップのDNAプローブ領域を覆ったもの
13:サーマルサイクル反応
14:ゲノムDNA増幅産物
15:DNAプローブ
16:伸長
17:洗浄
18:変性剤
19:一本鎖DNA
20:アンカー配列
21:反応溶液
22:相補鎖伸長反応
23:生物化学発光
24:結像レンズ
25:CCDカメラ
26:検出サイト
27:チップ
28:DNAプローブ
29:フォトダイオード
30:フォトダイオードアレイセンサ
31:シート
32:ロッドレンズ
33:ロッドレンズアレイ
34:チップデバイス
35:注入ポート
36:排出ポート
Claims (16)
- 検出すべき配列に相補的な配列を含むプローブを表面に固定した支持体に対し、5’末端にアンカー配列を有する試料核酸をハイブリダイズさせる工程と、
前記試料核酸を鋳型として前記プローブの相補鎖伸長反応を行う工程と、
前記相補鎖伸長反応で合成された前記プローブ伸長鎖から前記試料核酸を解離し、除去する工程と、
解離した前記プローブ伸長鎖を鋳型として、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いて、相補鎖伸長反応を行う工程と、
前記プライマーの伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程とを含む、遺伝子検査方法。 - 前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いた相補鎖伸長を行う工程と、伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程を同時に行うことを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子検査方法。
- 前記5’末端にアンカー配列を有する試料核酸が、前記アンカー配列を5’末端に含むプライマーを用いた核酸増幅反応によって得られることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子検査方法。
- 前記試料核酸が二本鎖核酸であって、前記プローブ伸長反応を温度サイクル下で行うことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 前記核酸増幅反応に用いるプライマーの一方がビオチン標識されていて、ビオチン、アビジン反応によってアビジンが表面に固定された担体に増幅産物を固定化する工程と、上記増幅産物を一本鎖核酸に変性する工程により、一本鎖核酸からなる試料核酸を得ることを特徴とする、請求項3に記載の遺伝子検査方法。
- 検出すべき配列が変異部位であって、当該変異部位に予測される配列に対応した各プローブをそれぞれ前記支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸の変異のタイピングを行うことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 検出すべき複数の変異部位について、当該複数の変異部位に予測される配列に対応した各プローブをそれぞれ同一の支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸に含まれる複数の変異のタイピングを同時に行うことを特徴とする、請求項6に記載の遺伝子検査方法。
- 前記プローブの3’末端が変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする、請求項6又は7に記載の遺伝子検査方法。
- 前記プローブが、さらに3’末端から2〜4番目にミスマッチを含むことを特徴とする、請求項8に記載の遺伝子検査方法。
- 前記変異が一塩基多型であることを特徴とする、請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記支持体上において、前記プローブが各プローブ固定領域ごとに仕切りを設けて固定されていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 前記アンカー配列がポリA配列であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 前記支持体が前記試料核酸あるいは反応試薬の注入及び排出のための部位を有する容器中に存在することを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 生物化学発光を検出する光検出素子が、前記支持体のプローブ固定領域ごとに配置されていることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 前記光検出素子と前記支持体の間に、導光路が配置されていることを特徴とする、請求項14に記載の遺伝子検査方法。
- 前記導光路がロッドレンズ、球形レンズ、光ファイバーロッドのいずれかであることを特徴とする、請求項14又は15に記載の遺伝子検査方法。
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