JP2000228999A

JP2000228999A - 個体の集団の多重遺伝子型

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Publication number: JP2000228999A
Application number: JP2000028401A
Authority: JP
Inventors: Robert J Lipschutz; ジェイ．リップシュツロバート
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-04
Publication date: 2000-08-22
Also published as: EP1026258A2; CA2297352A1; EP1026258A3

Abstract

(57)【要約】【課題】ある集団中の多くの個体において、多くの多
型性マーカーについての多型性プロフィールを生成する
こと。【解決手段】複数の個体において、多型性マーカーの
多型性形態を検出する方法であって、ａ）複数の個体の
各々からの核酸サンプルに対して多重増幅を実施するこ
とによって、複数の増幅産物を生成する工程であって、
該多重増幅が各々、複数の核酸セグメントを増幅し、該
セグメントの各々が少なくとも２の多型性形態によって
特徴付けられる多型性マーカーを含む、工程；ｂ）基板
の個別の領域に対して該増幅産物の各々を適用する工
程；およびｃ）該増幅産物の各々において、少なくとも
１つの多型性マーカーの、少なくとも１つの多型性形態
の存在または非存在を検出する工程、を包含する、方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝学、生化学お
よび医療診断の分野に関し、そして特に、多くの個体の
遺伝子型を迅速に決定するための物質および方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子型決定は、個体によって保有され
る遺伝子または多型性マーカーについて対立遺伝子の同
一性を決定することを含む。個体および集団の遺伝子型
決定は、多くの用途を有する。個体についての遺伝子情
報は、遺伝的要因が寄与する状態に対してその存在また
は素因を診断するために使用され得る。多くの状態は、
単一の対立遺伝子の影響から生じるのではなく、多くの
遺伝子の寄与を含む。従って、いくつかの遺伝子につい
ての遺伝子型の決定は、複雑な遺伝的状態を診断するの
に有用であり得る。単一の個体からの多くの遺伝子座の
遺伝子型決定もまた、法医学的用途において使用して、
例えば、ある個体からの生物学的サンプルに基づいてそ
の個体を同定し得る。

【０００３】集団の遺伝子型決定は、集団遺伝学におい
て有用である。例えば、集団における種々の対立遺伝子
の頻度の追跡は、集団の履歴またはその遺伝子の経時的
変遷についての重要な情報を提供し得る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ヒトゲノムにおいて数
千もの多型性がすでに同定されている。多型性の同定
は、ヒトゲノムが完全に配列決定されると加速化され
る。これは、１つの個体における多くの遺伝子について
の遺伝子型を含む多型性プロフィールの生成を可能にす
る。しかし、現在、何千もの個体において何千ものマー
カーについての多型性プロフィールを迅速に作製するた
めのツールは存在しない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、多くの個体に
対して多くの遺伝マーカーについての遺伝子型分析を迅
速かつ同時に行うための物質および方法を提供する。こ
の方法を実施するにおいて、核酸サンプルは、遺伝子型
決定される個体から入手される。各サンプルは、試験さ
れる遺伝子マーカーを含むセグメントを増幅するために
多重増幅に供される。必要ならば、各サンプルを、画分
に分割し得、そして異なる多重増幅が各画分に対して実
施され得る。各多重増幅の産物を、固体基板に、問い合
わせについて個別の位置（特徴）において適用する。各
特長を、増幅された遺伝子マーカーの対立遺伝子を検出
するために問い合わせる。１つの実施態様において、各
特徴は、この特徴を、標識された、対立遺伝子特異的な
核酸プローブと接触させること、およびそのプローブが
その特徴において増幅産物に対してハイブリダイズした
か否かを決定することによって問い合わせられる。この
プロセスを多数の遺伝子マーカーについて反復すること
によって、その個体の集団における多くのマーカーにつ
いての遺伝子プロフィールが展開される。多くの増幅産
物を迅速および小さな面積において固定する技術を用い
て、このプロトコルは、少なくとも２５，０００の個体
について、少なくとも５０，０００の多型性マーカーを
遺伝子型決定し得る。

【０００６】１つの局面において、本発明は、複数の個
体において、１つの、および好ましくは１を超える多型
性マーカーの多型性形態を検出する方法を提供する。こ
の方法は、ａ）複数の個体の各々から核酸サンプルに対
して複数の増幅を実施することによって、複数の増幅産
物を生成する工程であって、この多重増幅が各々、複数
の核酸セグメントを増幅し、このセグメントの各々が少
なくとも２の多型性形態によって特徴付けられる多型性
マーカーを含む、工程；ｂ）基板の異なる領域に対して
この増幅産物の各々を適用する工程；およびｃ）この増
幅産物の各々において、少なくとも１つの多型性マーカ
ーの、少なくとも１つの多型性形態の存在または非存在
を検出する工程、を包含する。

【０００７】別の実施態様において、検出する工程は、
複数の連続する検出工程においてこの基板上のこの増幅
産物の各々において、複数の異なる多型性マーカーの多
型性形態の存在または非存在を検出することを含む。こ
の方法の１つの実施態様において、この工程ａ）は、複
数の画分へとこのサンプルの各々を分割すること、およ
びこの画分の各々において異なる多型性マーカーに対し
て多重の増幅を実施することを含む。別の実施態様にお
いて、この検出する工程は、この多型性マーカーを含む
セグメントに対してハイブリダイズした核酸プローブを
検出することを含む。別の実施態様において、この方法
は、ｄ）この複数の個体に対して、この多型性形態の存
在または非存在を示す値セットを生成し、それによりこ
の値セットがこの個体についての多型性プロフィールを
決定する工程、をさらに包含する。本発明の別の実施
態様において、この複数の核酸フラグメントは少なくと
も１００セグメントである。さらに別の実施態様におい
て、この複数の個体は少なくとも１０００個体である。
さらに別の実施態様において、本方法は、この増幅産物
を、直行性アレイにおいてこの基板に適用する工程を包
含する。さらに別の実施態様において、本方法は、この
増幅産物が、スポットまたはスプレーすることによりこ
の基板に適用される。さらに別の実施態様において、本
方法の検出する工程は、前記増幅産物に対してハイブリ
ダイズした、標識したオリゴヌクレオチドを検出するこ
とを含む。

【０００８】本発明のさらなる実施態様において、この
少なくとも１つの個体はヒトである。さらなる実施態様
において、この複数の工程は少なくとも１０である。さ
らなる実施態様において、本発明の方法は、少なくとも
１００の多型性マーカーの存在を検出する工程を包含す
る。さらなる実施態様において、このプローブは対立遺
伝子特異的プローブである。さらなる実施態様におい
て、このプローブは対立遺伝子特異的連結から生じる。
さらなる実施態様において、このプローブは、連鎖伸長
終結から生じる。さらなる実施態様において、この標識
は蛍光標識である。さらなる実施態様において、この少
なくとも１つの多型性マーカーは複数の多型性マーカー
である。さらなる実施態様において、本発明は、この増
幅産物の各々に対して、少なくとも１対の対立遺伝子特
異的核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、
ここでこの対のプローブの各々が別の、排他的な識別可
能な多型性形態の選択された多型性マーカーに対して特
異的にハイブリダイズする、工程、を包含する方法。さ
らなる実施態様において、本発明は、この増幅産物に対
して、少なくとも２つの対立遺伝子特異的核酸プローブ
をハイブリダイズする工程であって、ここでこのプロー
ブの各々が、異なる多型性マーカーを含むセグメントに
対して特異的にハイブリダイズする、工程、を包含す
る。さらなる実施態様において、このプローブの対の各
々は、異なる波長の光を放出する蛍光標識を含む。さら
なる実施態様において、本発明は、複数の対をハイブリ
ダイズする工程であって、ここで、この対の各々が、異
なる多型性マーカーを含むセグメントに対して特異的に
ハイブリダイズする、工程、を包含する。

【０００９】別の局面において、本発明は、ａ）複数の
プライマー対であって、この対の各々が核酸セグメント
を増幅するための配列を有し、ここでこのセグメントの
各々が、少なくとも２つの多型性形態によって特徴付け
られた異なる多型性マーカーを含む、プライマー対；お
よび対立遺伝子特異的核酸プローブのセットであって、
ここでこのセットが、この多型性マーカーの各々につい
て、この多型性マーカーの多型性形態に対して特異的に
ハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む、
セットを包含するキットを提供する。１つの実施態様に
おいて、このキットは、１つのアレイ中にこの核酸セグ
メントを固定するために適切な表面を有する基板をさら
に含む。キットの別の実施態様において、このプローブ
のセットは、この多型性マーカーの各々について、１対
の対立遺伝子特異的プローブを含み、ここで、この対の
プローブの各々が、別の、排他的に識別可能な多型性形
態の多型性マーカーに対して特異的にハイブリダイズす
る。別の実施態様において、この対のプローブの各々
は、異なる波長の光を放出する蛍光標識を含む。さらな
る実施態様において、この複数のプライマー対は少なく
とも１，０００である。さらなる実施態様において、こ
の複数のプライマー対は少なくとも１０，０００であ
る。

【００１０】別の局面において、本発明は、ａ）増幅産
物のアレイであって、ここでこの増幅産物の各々が、複
数の個体の各々のからの核酸サンプルに対する多重増幅
の産物であり、この増幅産物の各々が複数の増幅された
核酸セグメントを含み、そしてこのセグメントの各々が
少なくとも２つの多型性形態によって特徴付けられる多
型性マーカーを含む、アレイ；およびｂ）対立遺伝子特
異的な核酸プローブのセットであって、ここでこのセッ
トが、この増幅産物の各々について、増幅されたセグメ
ントの少なくとも１つの多型性マーカーの多型性形態に
対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプ
ローブを含む、セットを含む、キットを提供する。

【００１１】さらなる実施態様において、この増幅産物
の各々は少なくとも１０個の異なる増幅されたセグメン
トを含む。さらなる実施態様において、上記セットは、
前記増幅産物の各々の少なくとも１つの増幅されたセグ
メントについて、対立遺伝子特異的なプローブの対を含
み、ここで、該対の各々のプローブは、前記多型性マー
カーの別の、排他的に識別可能な多型性形態に特異的に
ハイブリダイズする。さらなる実施態様において、上記
対の各々のプローブは、異なる波長の光を放出する蛍光
標識を含む。さらなる実施態様において、上記アレイは
少なくとも１０００の個体について増幅産物を含む。

【００１２】

【発明の実施の形態】（Ｉ．定義）他に定義しない限
り、本明細書において使用されるすべての技術および科
学の用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常
理解される意味を有する。以下の参照は、本発明におい
て使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供
する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ
ＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＡＮＤＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）；ＴＨ
ＥＣＡＭＢＲＩＤＧＥＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦ
ＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗ
ａｌｋｅｒ編、１９８８）；ＴＨＥＧＬＯＳＳＡＲＹ
ＯＦＧＥＮＥＴＩＣＳ，第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ
ら（編）、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ（１９９
１）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ
ＨＡＲＰＥＲＣＯＬＬＩＮＳＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ
ＯＦＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。本明細書におい
て使用される場合、他に特定しない限り、以下の用語
は、それらに割り当てられた意味を有する。

【００１３】「多型性」とは、ある集団のゲノムにおけ
る特定の遺伝子座における２以上の代替のヌクレオチド
配列の発生をいう。

【００１４】「多型性形態」または「対立遺伝子」と
は、あるアッセイにおいて排他的に識別可能である多型
性の別の形態をいう。

【００１５】「多型性マーカー」または「多型性部位」
とは、多型性が生じる遺伝子座をいう。好ましいマーカ
ーは、少なくとも２つの多型性形態を有し、それら各々
は、選択された集団の、１％を超える頻度で、そしてよ
り好ましくは、１０％を超えるまたは２０％を超える頻
度で生じる。遺伝子座は、その多型性が１ヌクレオチド
置換または欠失の場合１塩基対でさえあり得、またはそ
の多型性が、例えば、染色体の部分の欠失、転換、また
は重複である場合、複数の塩基対であり得る。多型性マ
ーカーは、例えば、制限フラグメント長多型性、可変数
の縦列反復（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライ
ト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テト
ラヌクレオチド反復、単純配列反復、および挿入エレメ
ント（例えば、Ａｌｕ）を含む。１つの指定された対立
遺伝子形態は、任意に、参照形態と命名され、そして他
の対立遺伝子形態は、代替（オルタナティブ）のまたは
改変体（変異体）対立遺伝子と命名される。選択された
集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子形態を、時
折、野生型形態と呼ぶ。二倍体生物は、対立遺伝子形態
についてホモ接合型またはヘテロ接合型であり得る。ジ
対立遺伝子多型性は、２つの形態を有する。トリ対立遺
伝子多型性は、３つの形態を有する。

【００１６】単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）は、単
一のヌクレオチドによって占有される多型性部位におい
て生じる。これは、対立遺伝子配列間の変動の部位であ
る。この部位は通常、対立遺伝子の高度に保存された配
列（例えば、その集団の１／１００または１／１０００
未満のメンバーにおいて変動する配列）に先行および後
続される。単一ヌクレオチド多型性は通常、その多型性
部位において、あるヌクレオチドが別のヌクレオチドに
置換されることによって生じる。トランジション（転
位）は、あるプリンの別のプリンによる置換またはある
ピリミジンの別のピリミジンによる置換である。トラン
スバージョン（転換）は、プリンのピリミジンによる置
換またはその逆である。単一ヌクレオチド多型性はま
た、参照対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失または
ヌクレオチドの挿入から生じ得る。

【００１７】「多型性プロフィール」とは、個体におけ
る少なくとも１つの多型性マーカーについて、その多型
性マーカーの１つの形態の存在または非存在を示す値の
セットをいう。例えば、多型性プロフィールは、複数の
遺伝子についての個体の遺伝子型を提供し得る（例え
ば、Ａ₁Ａ₁、Ｂ₂Ｂ₂、Ｃ₁Ｃ₂）。多型性プロフィールは
また、複数のマーカーの１つの多型性形態についての情
報を提供し得る（例えば、Ａ₁＋、Ｂ₁−、Ｃ₂＋）。

【００１８】「多重増幅」とは、単一の増幅反応におけ
る少なくとも２つの異なる核酸セグメントの増幅をい
う。好ましい実施態様において、多重増幅は、少なくと
も１０の異なる核酸セグメント、少なくとも１００の異
なる核酸セグメント、または少なくとも２５０の異なる
核酸セグメントの増幅を含む。

【００１９】「増幅産物」とは、増幅反応において産生
された、増幅された核酸セグメントの収集物をいう。

【００２０】「増幅」とは、親の分子のヌクレオチド配
列をコピーさせ、従って多数の核酸分子へと増加させる
任意の手段（例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、
およびリガーゼ連鎖反応による）をいう。

【００２１】「核酸」とは、ヌクレオチド単位から構成
されるポリマーをいう。核酸は、天然に存在する核酸
（例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ
核酸（「ＲＮＡ」））ならびに核酸アナログを含む。核
酸アナログは、天然に存在しない塩基を含むヌクレオチ
ドのポリマーを含む。核酸アナログはまた、ヌクレオチ
ドがホスホジエステル結合以外の結合を介して結合して
いるヌクレオチドポリマーを含む。従って、ヌクレオチ
ドアナログは、例えばそして限定することなく、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエ
ステル、ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、メ
チルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−
Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）
などを含む。このような核酸は、例えば、自動化ＤＮＡ
合成機を用いて合成され得る。「オリゴヌクレオチド」
とは、代表的に、短い核酸をいい、一般的には、約１０
０ヌクレオチド以下を有する。ヌクレオチド配列がＤＮ
Ａ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合
は、これはまた、「Ｕ」が「Ｔ」で置換された、ＲＮＡ
配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含むことが理解さ
れる。「核酸セグメント」とは、例えば、フラグメント
化または増幅によって作製された大きな核酸のセグメン
トをいう。

【００２２】「基板」とは、複数の特徴に分割され得る
固体支持体をいう。この固体支持体上では増幅産物が固
定され得る。基板は、限定することなく、紙、ガラス、
ニトロセルロース、シリコンウエハおよびポリマー材料
（例えば、プラスチック）またはゲルを含む。

【００２３】「特徴」とは、標的が適用された基板のア
ドレス可能な位置をいう。

【００２４】「プライマー」とは、指定された核酸テン
プレートに対して特異的にハイブリダイズし、そして相
補的な核酸の合成のための開始点を提供し得る核酸をい
う。このような合成は、その核酸プライマーが合成が誘
発される条件（すなわち、ヌクレオチド、相補的核酸テ
ンプレート、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合化
のための因子の存在下）下におかれる場合に、生じる。
プライマーは、代表的に、一本鎖であるが、二本鎖でも
あり得る。プライマーは代表的に、デオキシリボ核酸で
あるが、広汎な種々の合成プライマーおよび天然に存在
するプライマーも多くの適用に有用である。プライマー
は、テンプレートと相補的であり、このテンプレートに
対して、そのプライマーはハイブリダイズして合成開始
のための部位として作用するように設計されているが、
そのテンプレートの正確な配列を反映する必要はない。
このような場合、そのテンプレートに対するそのプライ
マーの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダ
イゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プ
ライマーは、例えば、色素原性、放射性または蛍光性の
部分を用いて標識され得、そして検出可能な部分として
使用され得る。プライマーは、一般的に少なくとも７ヌ
クレオチド長、そして好ましくは約１０〜２５ヌクレオ
チド長である。

【００２５】「プローブ」とは、核酸に関して使用され
る場合、別の核酸の指定された配列に対して特異的にハ
イブリダイズし得る核酸をいう。プローブは、標的相補
的核酸に対して特異的にハイブリダイズするが、そのテ
ンプレートの正確な相補的配列を反映する必要はない。
このような場合、その標的に対するそのプローブの特異
的なハイブリダイゼーションは、そのハイブリダイゼー
ション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブ
は、例えば、色素原性、放射性または蛍光性の部分を用
いて標識され得、そして検出可能な部分として使用され
得る。プローブは、一般的に少なくとも８ヌクレオチド
長、そして一般的に１０〜２５ヌクレオチド長である。

【００２６】第一の核酸は、選択されたハイブリダイゼ
ーション条件下で、第一の核酸が核酸混合物中の第二の
核酸に対してハイブリダイズし、その結果第二の核酸配
列の検出およびその混合物中の第二の核酸と他の核酸と
の間の識別が可能である場合、第二の核酸に対して「特
異的にハイブリダイズ」するという。従って、例えば、
完全に相補的なプローブは、高度にストリンジェントで
ないハイブリダイゼーション条件下でさえも標的配列に
特異的にハイブリダイズするが、ミスマッチプローブ
（すなわち、その配列が、その標的配列と完全に相補的
でないプローブ）は、一般的に、識別可能な様式で、そ
の標的配列とハイブリダイズするためによりストリンジ
ェントな条件を必要とする。

【００２７】選択されたハイブリダイゼーション条件の
ストリンジェンシーは、多くの因子（例えば、温度、イ
オン強度、ｐＨを含む）に依存する。核酸のハイブリダ
イゼーションに対する広汎なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅ
ｎ、ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳＩＮＢＩＯＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ
−− ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮＷＩＴＨＮＵＣ
ＬＥＩＣＰＲＯＢＥＳ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕ
ｃｌｅｉｃａｃｉｄａｓｓａｙｓ」（１９９３）に
見い出される。一般的に、「ストリンジェント条件」と
は、規定されたイオン強度ｐＨにおける特定の配列につ
いての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃〜約１０℃低く選択
される。このＴｍは、（規定されたイオン強度、ｐＨお
よび核酸濃度において）標的に相補的なプローブの５０
％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度であ
る（Ｔｍにおいてその標的配列が過剰に存在するので、
そのプローブの５０％が平衡状態で占有される）。スト
リンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイ
オン未満である条件であり、代表的には、約０．０１〜
１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または別の塩）で、ｐ
Ｈ７．０〜８．３であり、そして温度は、短いプローブ
（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なく
とも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５
０ヌクレオチドを超える）については、少なくとも約６
０℃である。ストリンジェント条件はまた、脱安定化薬
剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得
る。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的なハイ
ブリダイゼーションについては、陽性シグナルは、バッ
クグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラ
ウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例え
ば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＮａＰＯ₄、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）であり、そ
して２５〜３０℃の温度の条件が対立遺伝子特異的なプ
ローブハイブリダイゼーションについて適切である。

【００２８】「中程度にストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件」とは、４０％ホルムアミド、１Ｍ
ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中での３７℃でのハイブ
リダイゼーション、および１×ＳＳＣで４５℃での洗浄
を含む。陽性ハイブリダイゼーションは、少なくともバ
ックグラウンドの２倍である。当業者は、別のハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、類似のスト
リンジェンシーの条件を提供し得ることを容易に認識す
る。

【００２９】「対立遺伝子特異的プローブ」とは、多型
性マーカーの対立遺伝子形態を含む核酸セグメントに特
異的にハイブリダイズする核酸プローブをいう。例え
ば、多型性マーカーが多型性形態Ａ₁およびＡ₂により特
徴付けられる場合、対立遺伝子特異的プローブは、Ａ₁
を含む核酸セグメントまたはＡ₂を含む核酸セグメント
のいずれかに対して特異的にハイブリダイズするプロー
ブである。

【００３０】「検出（する）」とは、サンプル中におけ
る分析物の存在、非存在または量を決定することをい
い、そしてサンプル中における分析物の量を定量するこ
とを含み得る。

【００３１】「標識」または「検出可能な部分」とは、
分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学
的な手段によって検出可能な成分をいう。有用な標識
は、例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、
酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される
ような）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲ
ニン、ハプテンおよび抗血清もしくはモノクローナル抗
体が利用可能なタンパク質、または標的に対して相補的
な配列を有する核酸分子を含む。標識は、しばしば、測
定可能なシグナル（例えば、放射性、色素原性または蛍
光性のシグナル）を生成し、これを使用して、サンプル
中で結合された検出可能な部分の量を定量し得る。標識
は、共有結合的にまたはイオン結合、ファンデルワール
ス結合または水素結合を介して、プライマーもしくはプ
ローブ中に取り込まれるかまたはプライマーもしくはプ
ローブに付着され得る（例えば、放射性核種の取り込
み、またはストレプトアビジンによって認識されるビオ
チン化ヌクレオチド）。標識は、直接または間接的に検
出可能であり得る。間接的な検出は、その標識に対する
直接または間接的に検出可能な第二の部分の結合を含み
得る。例えば、その標識は、結合パートナーのリガンド
（例えば、ビオチン（これは、ストレプトアビジンにつ
いての結合パートナーである））または相補性配列（そ
れに対してそのヌクレオチドが特異的にハイブリダイズ
し得る）についての結合パートナーであるヌクレオチド
配列であり得る。その結合パートナーは、それ自身が直
接検出可能であり得、例えば、抗体はそれ自身が蛍光分
子を用いて標識され得る。その結合パートナーはまた、
間接的に検出可能であり得、例えば、分岐ＤＮＡ分子の
一部であり得る相補的なヌクレオチド配列を有する核酸
であり、この核酸は次いで、他の標識された核酸分子と
のハイブリダイゼーションを通して検出可能である。
（例えば、ＰＤ．ＦａｒｈｌａｎｄｅｒおよびＡ．Ｋｌ
ａｕｓｎｅｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８
８）６：１１６５を参照のこと。シグナルの定量は、例
えば、シンチレーション計数、密度測定またはフローサ
イトメトリにより達成される。

【００３２】「複数」とは、少なくとも２を意味する。

【００３３】（ＩＩ．多重多型性プロフィールを迅速に
決定する方法）（Ａ．集団メンバーからの核酸サンプルの多重増幅）（１．緒言）複数の個体における多型性形態を検出する
方法の最初の工程は、遺伝型を決定される各々の個体か
らの核酸サンプルにおいて多重増幅を行うことである。
遺伝的マーカーの個数が、好都合にも単回の多重増幅反
応の容量内にある場合、全体の増幅は各々の個体からの
単一のサンプルにおいて実行され得る。しかし、何百ま
たは何千ものマーカーが試験される場合、その核酸サン
プルは代表的には画分に分けられ、そして各々の画分は
多重増幅に供される。増幅は、共に、すべての試験され
る遺伝的マーカーを含むセグメントを増幅する。例え
ば、１００の画分の各々の１００重の増幅を行うこと
は、１０，０００マーカーを増幅する。多重増幅の結果
は、各々の遺伝的マーカーに対する増幅された核酸セグ
メントを含む一連の増幅産物の作製である。特定のセグ
メントの増幅産物は、個体の遺伝子型に依存して（例え
ば、ホモ接合性またはヘテロ接合性）、一倍体の個体に
おける１つの形態の多型性マーカー、二倍体の個体にお
ける２つの異なる形態の多型性マーカー、または三倍体
の個体についての３つの異なる形態の多型性マーカーを
含み得る。個体由来のサンプルが、多重増幅について画
分に分けられた場合、画分からの増幅産物は、所望の場
合には、試験の前にプールされ得、単一のサンプル（ま
たは少数のサンプル）を形成する。

【００３４】（２．個体）個体は、一般的に生物の集団
由来の個体である。これは、ウイルス、単細胞生物（例
えば、原核生物または真核生物）、動物または植物を含
む。動物集団は、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、および
ヒトを含む。植物は、穀物（例えば、コムギ、イネ、お
よびトウモロコシ）、野菜、および果実のような農業的
に重要な植物を含む。

【００３５】その集団はまた、細胞培養由来の細胞の集
団であり得る。これは、例えば、転移性細胞または突然
変異誘発に供せられた細胞を含む。

【００３６】プロフィールされる集団における個体の数
は、複数であり、一般的には、少なくとも１００、少な
くとも１０００、少なくとも１０，０００、または少な
くとも２５，０００である。

【００３７】（３．核酸サンプル）多型性は、分析され
る個体由来の核酸を含むサンプル中で検出される。ゲノ
ムＤＮＡのアッセイについては、実質的にいかなる生物
学的サンプルも適切である。例えば、哺乳動物由来の好
都合な組織サンプルは、全血、精液、唾液、涙液、尿、
糞便、汗、頬（口腔）、皮膚、および毛髪を含む。ｃＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡのアッセイについては、組織サンプ
ルは、標的核酸が発現される器官から得られなければな
らない。例えば、標的核酸がシトクロムＰ４５０である
場合には、肝臓が適切な供給源である。

【００３８】（４．多重増幅）本発明の方法は、標的サ
ンプルからの核酸の増幅を含む。核酸セグメントを増幅
するためのいくつかの方法が当該分野で公知である。

【００３９】好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応、
ＰＣＲである。一般的には、ＰＣＲＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
Ｙ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳＡＮＤＡＰＰＬＩＣＡＴ
ＩＯＮＳＦＯＲＤＮＡＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯ
Ｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓ
ｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）；ＰＣＲＰＲＯＴＯＣＯ
ＬＳ：ＡＧＵＩＤＥＴＯＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤ
ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，
１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋ
ｅｒｔら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ１，１７（１９９１）；ＰＣＲ（Ｍｃ
Ｐｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌ
ｌｉｓ）。増幅のためのプライマーは、標的サンプルに
おける目的の領域に隣接されるように選択される。例え
ば、プライマーは、既知の変動の部位および両側のいく
つかの塩基に隣接するように、またはエキソンに隣接す
るように、または全コード配列もしくは遺伝子に隣接す
るように設計され得る。

【００４０】他の適切な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応
（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉ
ｃｓ４，５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，１０７７（１９８
８））、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３（１９８
９））および自己維持的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
７，１８７４（１９９０）を参照のこと）および核酸に
基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。後の２つの増幅
方法は、等温転写に基づく等温反応を含み、これは増幅
産物としてそれぞれ約３０または１００対１の比で、一
本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤ
ＮＡ）の両方を生成する。

【００４１】多重増幅の１つのバージョンは、Ｗａｎｇ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１００７７（１９９
８）、脚注２６において記載される。この方法に従っ
て、多重ＰＣＲが、単回の反応において複数のＰＣＲプ
ライマー対を使用することによって行われる。具体的に
は、多重ＰＣＲ反応は、１００ｎｇの被験体のＤＮＡ、
０．１〜０．２μＭの各プライマー、１単位のＡｍｐｌ
ｉＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１
ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、
１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍ
ＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、および０．００１％
ゼラチンを含む５０μｌ容量中で行われる。温度サイク
リングは、Ｔｅｔｒａｄ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ）上
で、最初の変性を９６℃で１０分間、続いて、９６℃で
３０秒間の変性、５５℃で２分間のプライマーアニーリ
ング、および６５℃で２分間のプライマー伸長の３０サ
イクルで行った。３０サイクル後、最終の伸長反応を６
５℃で５分間行った。生じたＰＣＲ産物が小さい場合、
それらをフラグメント化する必要はない。次いで、ＰＣ
Ｒ産物は、標準的なＰＣＲ反応において、それらの５’
末端にビオチン標識を有するＴ７およびＴ３プライマー
を用いてビオチン標識される。その反応は、１μｌの鋳
型ＤＮＡ、０．１〜０．２μＭの標識プライマー、１単
位のＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ）、１００μＭｄＮＴＰｓ、１０ｍＭｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．
５ｍＭＭｇＣｌ₂、および０．００１％ゼラチンを
用いて行われる。温度サイクリングは、最初の変性を９
６℃で１０分間、続いて、９６℃で３０秒間の変性、５
２℃で１分間のプライマーアニーリング、および７２℃
で１分間のプライマー伸長の２５サイクルで行った。２
５サイクル後、最終の伸長反応を７２℃で５分間行っ
た。個体についての種々の多重反応からのＰＣＲ産物が
共存し得る。

【００４２】（Ｂ．増幅産物の基板結合アレイの調製）（１．緒言）本方法の第２の工程は、個別のアドレス可
能な位置の固体基板上において増幅産物を固定する工程
を含む。これらの位置は、「特徴」といわれる。従っ
て、その増幅産物の固定は、特徴のアレイを産生する。
多型性マーカーが各々の個体について単回の多重増幅反
応において増幅された場合、または個体についてのいく
つかの多重増幅反応の産物が、単一のサンプルにプール
される場合、すべての個体由来のサンプルは、単一の基
板上に整列され得るか、またはすべての個体を収容する
ために同じ多さの基板が必要である。そのアレイは、任
意の所望の形をとり得る。しかし、直交性のアレイの行
および列は、しばしば操作することおよびきちんと整理
することが容易である。

【００４３】個体についての増幅されたマーカーは、い
くつかの画分に分けられ、次いでサンプルを整列させる
いくつかの方法が存在する。好ましくは、多重増幅反応
は、各々の個体からの画分からの同一の多型性マーカー
を増幅するために設定される。好ましい方法において、
すべての個体についての同一の増幅された遺伝的マーカ
ーを含む産物のセットは、１つ以上の基板上に固定さ
れ、その結果各々の基板は同一の増幅されたマーカーを
含む画分のみを含む。この整列は、基板に対する検出プ
ローブの適用を単純化し得る。アレイ上にスポットされ
た個体の数は、基板および特徴技術の能力に依存する。
従って、サンプルが１ｍｍ離れてスポットされ得る場
合、次いで１０，０００の個体の増幅産物は１０ｃｍ×
１０ｃｍのアレイ中に配置され得る。また、任意の特徴
に固定された増幅されたマーカーの数は、多重反応の能
力および／または異なる増幅産物を単一サンプルへプー
ルする能力の関数である。

【００４４】（２．核酸アレイ）増幅産物を固体支持体
上に固定するためのいくつかのストラテジーが利用可能
である。核酸は、直接的に核酸を結合する基板（例え
ば、紙、ガラス、またはニトロセルロース）に結合され
得る。あるいは、それらはリンカー（例えば、基板に結
合したオリゴヌクレオチドリンカー）を通して結合され
得る。

【００４５】（ａ．スポットの方法）１つのバージョン
において、個別の反応領域のアレイを有する基板が提供
され、通常は不活性な領域によって互いに分離されてい
る。１つの実施態様において、第１の核酸溶液は、適切
に誘導体化された基板の第１の領域上にスポットされ
る。その後、第２の核酸サンプルが第２の領域上にスポ
ットされ、第３の核酸サンプルが第３の領域上にスポッ
トされるなど、それぞれがそこに位置する増幅産物を有
する領域の数まで続く。

【００４６】別のストラテジーにおいて、増幅産物は、
サンプルウェルのアレイ（例えば、９６ウェルプレー
ト）中で調製される。ピンのアレイがウェルの中に浸漬
され、オリゴヌクレオチドを含む液体を拾い上げる。次
いでピンは核酸を結合する基板（例えば、紙、ガラス、
またはニトロセルロース）に押しつけられる。従って、
サンプル中の核酸はアレイ中に固定される。従って、例
えば、９６ウェルプレートの各々のウェルは、集団中の
９６の異なる個体の各々についての同じ多重増幅反応の
産物を含み得る。次いで、各々のウェルからの増幅産物
は、基板上の異なる位置にスポットされる。

【００４７】（ｂ．噴霧法）別のストラテジーは、液体
サンプルを含む毛細管のアレイの使用を含む。毛細管が
基板の表面に接触される場合、サンプルの一滴がそこに
蓄積する。この方法の１つのバージョンは、ＷＯ９５
／３５５０５（Ｓｈａｌｏｎら）に記載される。

【００４８】別のストラテジーは、インクジェット技術
をうまく利用する。このようなインクジェットは、プリ
ンターで一般に使用されており、ここでは微小なインク
滴が、基板（例えば、紙）上の特定の位置に噴霧され
る。このストラテジーに従って、毛細管がノズル端から
核酸サンプルを含むウェルに連結される。この技術は、
固定された核酸サンプルの非常に高密度なアレイを作製
し得る。

【００４９】（ｃ．オリゴヌクレオチドアンカーへのハ
イブリダイジング）別のストラテジーにおいて、増幅プ
ロセスは、核酸配列タグを有する増幅産物を提供する工
程を含む。このことは、例えば、標的にハイブリダイズ
する相補的部分とともにタグを含むプライマーを使用し
て達成され得る。タグは、個体に特異的であり得るか、
または特定の多重増幅に特異的であり得る。例えば、個
体１は第１の配列タグを含むように増幅され得る。個体
２は第２の配列タグを含むように増幅され得る。個体３
は第３の配列タグを含むように増幅され得る。

【００５０】次いで、タグの相補物を有する配列特異的
オリゴヌクレオチドのアレイは、基板上の個別の、アド
レス可能な位置上で構築される。画分からの増幅セグメ
ントがアレイに付加される場合、配列タグは特定の位置
における相補的アンカーとハイブリダイズする。このよ
うにして、フラグメントは、特定の位置に対するアレイ
上でのそれ自体を分類する。

【００５１】アンカーは、空間的に指向されるオリゴヌ
クレオチド合成のバージョンによって局在化され得る。

【００５２】（ｉ．空間的に指向されるオリゴヌクレオ
チド合成−バージョン１）１つの実施態様において、基
板結合核酸は光指向性オリゴヌクレオチド合成によって
特異的な位置において固定される。この方法の先駆的な
技術は、米国特許第５，１４３，８５４号（Ｐｉｒｒｕ
ｎｇら）、米国特許第５，５７１，６３９号（Ｈｕｂｂ
ｅｌｌら）、米国特許第５，７４４，１０１号（Ｆｏｄ
ｏｒら）、および米国特許第５，４８９，６７８号（Ｆ
ｏｄｏｒら）に開示される。このプロセスの基本的なス
トラテジーにおいて、リンカーおよび光感受性の保護基
で改変された固体支持体の表面は、写真平板マスクを通
して照射され、照射領域における反応性のヒドロキシル
基を産生する。次いで、３’−Ｏ−ホスホルアミダイト
活性化デオキシヌクレオシド（５’−ヒドロキシルが光
感受性基で保護されている）が、表面に提示され、そし
て光に曝露される部位においてカップリングが起こる。
未反応の活性部位の任意のキャッピングおよび酸化の
後、その基板はすすがれ、そして表面は第２のマスクを
通して照射されて、リンカーに対するカップリングのた
めにさらなるヒドロキシル基を曝露する。第２の５’−
保護された３’−Ｏ−ホスホルアミダイト活性化デオキ
シヌクレオシド（Ｃ−Ｘ）が、表面に提示される。選択
的光脱保護およびカップリングサイクルは、所望の一連
の産物が得られるまで反復される。次いで、光感受性基
は、必要に応じて除去され、そして配列は、その後、必
要に応じてキャップされる。側鎖保護基もまた、存在す
る場合には、除去される。写真平板が使用されるので、
そのプロセスは縮小化されて、オリゴヌクレオチドプロ
ーブの高密度アレイを生成し得る。

【００５３】本発明において、リンカーが基板の表面上
に構築され得、そしてサンプルは種々の位置において、
今述べた写真平板の技術を用いてその位置において基を
活性化することによってカップリングされ得る。

【００５４】この一般的なプロセスは改変され得る。例
えば、ヌクレオチドは、それらが結合化学と適合性の活
性化されたヒドロキシル基を有する限りは、天然のヌク
レオチド、化学的に改変したヌクレオチド、またはヌク
レオチドアナログであり得る。保護基はそれ自体、光感
受性であり得る。あるいは、保護基は、特定の化学的条
件下（例えば、酸）で不安定であり得る。この実施例に
おいて、固体支持体の表面は、光に対する曝露に際して
酸を生成する組成物を含み得る。従って、基板の領域の
光に対する曝露は、この領域において酸を生成し、曝露
された領域中における保護基を除去する。また、その合
成方法は、３’−保護５’−Ｏ−ホスホルアミダイト活
性化デオキシヌクレオシドを使用し得る。この場合、そ
のオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向で合成さ
れ、遊離の５’末端を生じる。

【００５５】光に対する曝露によって保護基を除去する
こと、曝露された活性部位へのヌクレオチドのカップリ
ング（必要に応じて、さらなるカップリングに適合性で
ある）、および必要に応じての未反応部位のキャッピン
グの一般的プロセスは、本明細書中では「光指向型ヌク
レオチドカップリング」といわれる。

【００５６】（ｉｉ．空間的に指向されるオリゴヌクレ
オチド合成−バージョン２）別のストラテジーは、米国
特許第５，６６７，１９５号（Ｗｉｎｋｌｅｒら）に記
載される。この方法に従って、一連のチャンネル、溝、
またはスポットが、基板の上にまたは基板に隣接して形
成される。試薬は、選択的にチャンネル、溝、もしくは
スポットを素通りするか、または沈着して、基板上の選
択された位置において異なる化合物（そしていくつかの
実施態様では、異なる化合物のクラス）を有するアレイ
を形成する。本方法の２つの主要なバージョンが存在す
る。

【００５７】１つのバージョンにおいて、その表面上に
一連のチャンネル（例えば、溝）を有するブロックが利
用される。そのブロックは、誘導体化されたガラスまた
は他の基板と接触して配置される。第１の工程におい
て、ピペッターまたは他の送達システムが、選択された
試薬を、チャンネルに接続された１つ以上の一連の開口
部に流すために使用されるか、またはチャンネル中に直
接的に配置して、チャンネルを満たして、そして基板を
第１の試薬で「裸にして」、それに核酸をカップリング
させる。次いでブロックを平行移動または回転させ、再
び基板の上に置き、そしてプロセスが第２の試薬を用い
て反復され、モノマーの第２の基を基板の異なる領域に
カップリングさせる。そのプロセスは、所望の配列およ
び長さの多様なポリマーのセットが基板上で形成される
まで反復される。このプロセスによって、ペプチドまた
はオリゴヌクレオチドのような多様なモノマー配列を有
する多くのポリマーが、既知の位置において基板上で形
成される。

【００５８】別のバージョンにおいて、適切な微小バル
ブのアレイとともに一連の微小チャンネルまたは微小溝
が基板上に形成される。チャンネルおよびバルブは、誘
導体化された表面を越えて選択された試薬を流すために
使用され得る。微小バルブは、どのチャンネルが任意の
カップリング工程について開口されるかを決定するため
に使用される。

【００５９】同様に、種々の位置が、これらの産物を固
定するために活性化されて、増幅産物中の核酸セグメン
トとカップリングされ得る。

【００６０】（Ｃ．集団中の各々の個体についてのマー
カーの多型性形態の存在の検出）（１．緒言）個体の集団についてのマーカーの多型性形
態を決定するためのプロセスにおける第３の工程は、そ
の集団における各々の個体についての少なくとも１つの
マーカーの多型性形態の存在または非存在の検出を含
む。この工程は、その集団のすべてのメンバーについて
の固定された増幅産物を含む基板の提供によって、本発
明において単純化される。その基板は、基板の限定され
た空間内で、同時にすべての個体における任意の増幅さ
れたマーカーについてプローブすることを可能にする。

【００６１】一般的なバージョンにおいて、その方法
は、集団中の複数の個体についての１つ以上のマーカー
の単一の多型性形態の存在または非存在を検出する工程
を包含する。例えば、多重増幅反応は、個体の核酸サン
プルにおけるマーカーＡ、ＢおよびＣを増幅し得る。こ
れらのマーカーは、２つの多型性形態（各々、例えば、
Ａ₁およびＡ₂、Ｂ₁およびＢ₂、ならびにＣ₁およびＣ₂）
を有し得る。各々の個体についての増幅産物は、マーカ
ーを含む増幅セグメントを含む。増幅されたセグメント
中の特定の多型性形態は、当然ながら、各々の個々の遺
伝子型に依存する。当業者は、対立遺伝子Ａ₁の存在ま
たは非存在を検出するために各々の個体の増幅産物をプ
ローブし得る。次いで、このプロセスは、同じまたは異
なるマーカーの別の対立遺伝子について反復され得る。
例えば、対立遺伝子Ａ₁の存在または非存在について増
幅産物をプロービング後、当業者は、同じ基板（また
は、同じ増幅産物が固定された別の基板）を、対立遺伝
子Ｂ₁についてプローブし得る。

【００６２】しばしば、プローブされるマーカーについ
て、各々の個体の完全な遺伝子型（すなわち、個体によ
って保有されるすべての対立遺伝子の同一性）を決定す
ることがより有用である。例えば、当業者は、対立遺伝
子Ａ₁およびＡ₂の両方についてすべての個体の増幅産物
をプローブし得る。二倍体の個体においては、これらの
対立遺伝子の存在または非存在は、その個体がホモ接合
性（Ａ₁Ａ₁またはＡ₂Ａ₂）か、またはヘテロ接合性（Ａ
₁Ａ₂）かを示す。再度、第１のマーカーについて遺伝子
型を決定した後、第２のマーカー（例えば、Ｂまたは
Ｃ）について遺伝子型を決定するために、同一の基板上
で、または同一の増幅産物でブロットした異なる基板上
のいずれかでアレイをプローブし得る。

【００６３】（２．参照配列）多型性マーカーについて
の参照配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ｔｈｅＳｔａｎｆｏ
ｒｄＧｅｎｏｍｅＣｅｎｔｅｒ、ＴｈｅＩｎｓｔ
ｉｔｕｔｅｆｏｒＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈお
よびｔｈｅＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
のようなコンピューターデータベースから入手可能であ
る。後者のデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇ
ｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ／／ｓｈ
ｇｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ．およびｈｔｔｐ／／
ｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．において入手可能である。参
照配列は、代表的には、十分に特徴付けられた生物（例
えば、ヒト、マウス、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、酵母、Ｅ．ｃｏ
ｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来
である。参照配列は、一般的には多型性マーカーを特定
するために十分に長く、そして多型性形態を含む。従っ
て、参照配列は、任意の検出アッセイにおける特異的な
検出を可能にするのに十分に長いべきである。例えば、
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、参照配列
は、一般的に、少なくとも８ヌクレオチド長から５０ヌ
クレオチド長である。参照配列は、ゲノムの発現された
領域または発現されない領域由来であり得る。ＲＮＡサ
ンプルが使用されるいくつかの方法において、高度に発
現された参照配列は、時々、ＲＮＡ増幅の必要を避ける
ことが好ましい。参照配列の機能は、知られていてもよ
いし、知られていなくともよい。参照配列はまた、ミト
コンドリアＤＮＡのようなエピソーム由来であり得る。
当然ながら、複数の参照配列は独立して分析され得る。

【００６４】ヒトおよび他の種における多型性部位の実
質的な数は、公開された文献に記載され、そしてヒトゲ
ノムＤＮＡにおける多数の多型性部位が、共有に係る同
時係属の特許出願（例えば、１９９８年３月５日に出願
された、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４５７１）に記載され
る。これらの部位のゲノム部位は、その部位にある多型
性形態の性質として公知である。多くの公知の多型性部
位は、いわゆる発現配列タグ内にあり、それゆえにゲノ
ムＤＮＡの転写物、ならびにゲノムＤＮＡそれ自体にお
いて示される。しばしば、多型性は遺伝子のコード配列
の外側で見出される；例えば、プロモーター、他の調節
配列、またはイントロン性配列に見出される。

【００６５】（３．特異的な参照配列での核酸検出の方
法）支持体に固定された特異的なヌクレオチド配列を検
出するための任意の方法が、本明細書中で意図される。
好ましい方法は、標的配列へプローブを特異的にハイブ
リダイズさせる工程、およびハイブリダイズさせたプロ
ーブを検出する工程を包含する。ハイブリダイズさせた
プローブは、例えば、質量スペクトルによって直接的に
検出され得るか、プローブまたはハイブリダイゼーショ
ンと関連する標識を検出することによって、間接的に検
出され得る。

【００６６】直接的検出の方法は、質量スペクトルであ
り、ハイブリダイズさせたプローブは、基板から脱離さ
れ、その分子量に基づいて同定される（例えば、ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ）。標識方法（ここで、対立遺伝子の存在
または非存在が、検出可能な標識の存在または非存在に
よって示される）は、特異的な配列を有する固定分子と
関連するようになる検出可能標識を含む。

【００６７】１つの標識に基づく検出システムは、配列
に対して特異的なプローブをハイブリダイズさせること
によって特異的な配列を検出する工程、およびハイブリ
ダイズさせたプローブを検出する工程を包含する。ハイ
ブリダイズさせたプローブは、例えば、質量スペクトル
を通して直接的に、または標識の使用を通して間接的に
検出され得る。以下に記載されるこの方法の３つの特定
の有用なバージョンは：（１）対立遺伝子特異的ハイブ
リダイゼーション、（２）対立遺伝子特異的伸長および
（３）対立遺伝子特異的連結である。

【００６８】別のバージョンの標識に基づく検出におい
て、標識は、この配列を有する分子によって放出され
る。例えば、固定分子は、標識され得る。次いで、標的
へ対立遺伝子特異的プローブをハイブリダイズさせ得
る。対立遺伝子が存在する場合、二本鎖分子が作製され
る。次いで、この基板は、二本鎖ＤＮＡを切断する、特
異的または非特異的エンドヌクレアーゼによる切断に供
される。これは、標識を放出する。従って、標識の存在
の減少は、対立遺伝子の存在を示す。

【００６９】当業者が、任意の単一なアッセイを決定し
得る対立遺伝子の数は、アッセイの性質に依存する。例
えば、区別し得るいくつかの異なる波長で蛍光を発する
蛍光標識が存在する。例えば、使用されるこのアッセイ
システムが、４つの異なる蛍光標識を区別し得る場合、
次いで、４つの異なる多型性形態の存在または非存在を
検出し得る。当業者は、いくつかの方法でこれを使用し
得る。例えば、単一の多型性マーカーは、複数の対立遺
伝子を有し得る。４つの対立遺伝子Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およ
びＡ₄が存在するこの例について仮定する。４つの異な
る標識を使用して、４つの対立遺伝子のどれが単回のア
ッセイに存在するかを決定し得る。あるいは、４つの標
識を使用して、２つの異なるマーカーについて、各々、
２つの対立遺伝子を検出し得る。例えば、対立遺伝子Ａ
₁、Ａ₂、Ｂ₁およびＢ₂をプローブし得る。さらに、同じ
増幅産物を用いる同じ基板または異なる基板についての
第２のアッセイにおいて、当業者はさらに２つの増幅さ
れたセグメントをプローブし得る。

【００７０】最終的に、上記で議論したように、このプ
ロセスは、各個体からのＤＮＡのアリコートについて、
多くの種々の多重増幅反応を実施することを包含し得
る。従って、アッセイは、第１の基板上でプローブされ
ている１つのセットのマーカーおよび、第２の基板上で
プローブされている第２のセットのマーカーと共に、並
行して実行され得る。

【００７１】（ａ．対立遺伝子特異的ハイブリダイゼー
ション）基板上で特定の配列を有する固定核酸を検出す
る１つの方法は、この配列を有する核酸と特異的にハイ
ブリダイズする標識化核酸プローブと、この基板を接触
させることである。この配列の存在は、その特徴におけ
るこの標識の存在を検出することによって検出される。

【００７２】従って、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼ
ーションは、各固定増幅産物に、少なくとも１つの対立
遺伝子特異的核酸プローブをハイブリダイズする工程を
含み、ここで各対立遺伝子特異的プローブは、増幅産物
において増幅されたセグメントの多型性マーカーの特定
の多型性形態に特異的にハイブリダイズする。特定の実
施態様において、各基板は、一対の相互に区別可能な核
酸プローブでプローブされ（二倍体の個体の場合）、そ
の各々は、多型性マーカーの別の形態に特異的である。
この場合、このプローブ対は、一般的に、２つの区別可
能な標識を有する。例えば、この標識は、２つの異なる
波長で蛍光を発する蛍光標識であり得る。両方の標識が
存在する場合、両方の波長が検出され得る。各波長の光
量比を測定することによって、各波長の光量比の関数と
して、ハイブリダイズしたプローブの量の比を決定し得
る。

【００７３】プローブは、単一のマーカーのための対に
おいて使用されなくてもよい。例えば、実施者は、選択
された対立遺伝子の存在または非存在を示す単一のプロ
ーブの使用を選択し得る。また、実施者は、第１のマー
カーの１つの対立遺伝子を検出する第１のプローブおよ
び第２のマーカーの１つの対立遺伝子を検出する第２の
プローブの使用を選択し得る。さらに、特徴にハイブリ
ダイズした２を超えるプローブが区別され得るので、実
施者は、１つを超える対のプローブを使用し得、各対
は、増幅産物における異なるマーカーの多型性形態に指
向され、そして各プローブは、他方から区別可能であ
る。

【００７４】（ｂ．対立遺伝子特異的ライゲーション）
特異的ヌクレオチド配列を決定する別の方法は、対立遺
伝子特異的ライゲーションによるものである。この方法
は、米国特許第５，８３０，７１１号（Ｂａｒａｎｙ
ら）にいくらか詳細に記載される。この方法において、
固定分子は、ハイブリダイゼーション条件下で位置特異
的プローブと接触される。位置特異的プローブは、多型
性マーカーに特異的であり、それゆえ特定の対立遺伝子
に関わらず、全ての増幅したフラグメントによって保有
される配列にハイブリダイズする。基板はまた、１つ以
上の標識化対立遺伝子特異的プローブと接触される。す
なわち、これらのプローブは、その位置で特異的対立遺
伝子を有するフラグメントのみにハイブリダイズする。
位置特異的および対立遺伝子特異的プローブが選択さ
れ、その結果、それらは互いに直接隣接する標的にハイ
ブリダイズし、その結果それらの末端は連続する。次い
で、基板はリガーゼと接触される。このリガーゼは、互
いに隣接する、ハイブリダイズされた核酸を連結する。
しかし、このリガーゼは、１つ以上のヌクレオチドによ
って分離されるか、またはその末端ヌクレオチドが標的
に相補的でなく、それゆえそれにハイブリダイズしない
フラグメントを連結しない。従って、特定の対立遺伝子
が存在する場合はいつも、標識化プローブは、その位置
でハイブリダイズされる位置特異的プローブに連結され
る。基板は、対立遺伝子特異的プローブが位置特異的プ
ローブに連結されない限りは、その標的にハイブリダイ
ズしないままであるような洗浄条件下で洗浄される。

【００７５】この検出方法は、対立遺伝子特異的ハイブ
リダイゼーションを超える特定の利点を有する。より長
いプローブは、より短いプローブより、標的分子により
高い感受性を提供する。なぜなら、それは、よりストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするからである。
しかし、同様のストリンジェンシー条件下で、より短い
プローブは、より長いプローブより、標的により特異的
である。なぜなら、より短いプローブは、より長いプロ
ーブより、ハイブリダイズにおいて、より少ないミスマ
ッチを許容するからである。対立遺伝子特異的ライゲー
ションは、これらの事実の両方を利用する。これは、特
異性を提供する２つのより短いプローブに依存する。し
かし、完全にハイブリダイズした末端を連結するのみな
ので、そのリガーゼは、より長いプローブの標的感受性
を提供する。

【００７６】（ｃ．対立遺伝子特異的プライマー伸長）
特定のヌクレオチド配列を決定する別の方法は、対立遺
伝子特異的プライマー伸張によるものである。この方法
において、各対立遺伝子形態は、この対立遺伝子に特徴
的な、特異的に標識されたヌクレオチドのプライマーへ
の取り込みを通じて検出される。例えば、マーカーの２
つ（または３つ、または４つ）の多型性形態は、配列に
おける特定の位置で異なるヌクレオチドを有し得る。こ
の方法において、実施者は、異なる点にちょうど隣接す
る配列に相補的なプライマーを調製する。次いで、差異
の方向において、このプライマー上でのプライマー伸長
反応を実施する。しかし、鎖伸張ヌクレオチドを用いる
よりはむしろ、実施者は、別々に標識された鎖終結ヌク
レオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）を使用す
る。例えば、４つのヌクレオチドの各々は、別々に着色
された蛍光マーカーで標識され得る。この場合、１つの
ヌクレオチドのみが、任意の増幅鎖においてプライマー
に付加され得る。それゆえ、このヌクレオチドの同一性
は、特定の多形成形態に依存する。したがって、任意の
特定の標識化ヌクレオチドの検出は、特徴で特定の多型
形態を示す。個体がヘテロ接合体である場合、２つの形
態のシグナルが検出可能である。この方法の利点は、単
一のマーカーの４つの異なる対立遺伝子改変体が検出可
能であることである。

【００７７】（Ｄ．ハイブリダイゼーションアッセイの
実施）本発明の１つの実施態様において、多型性形態
は、この多型性形態を含む多型性マーカーを含む核酸セ
グメントにハイブリダイズされるプローブを検出するこ
とによって検出される。それゆえ、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを実施する方法が本明細書に示される。

【００７８】（１．プローブ）固定分子とのハイブリダ
イゼーションのためのプローブは、一般的に、８ヌクレ
オチド〜約１００ヌクレオチド長である。好ましくは、
プローブは、約１０〜５０または１５〜３０ヌクレオチ
ドの間を有する。プローブは、代表的には、蛍光標識で
標識される。なぜなら、このような標識は区別可能であ
り得、そしてその特徴が達成し得る小領域において検出
され得るからである。しかし、任意の検出可能な標識が
使用され得る。

【００７９】（２．ハイブリダイゼーションアッセイの
実施）核酸アレイにおけるハイブリダイゼーションアッ
セイは、選択されたハイブリダイゼーション条件下でア
レイを標識化サンプルと接触させる工程、必要に応じ
て、このアレイを洗浄して、未反応分子を除去する工
程、および標的分子とプローブとの間の反応の証拠につ
いて生物学的アレイを分析する工程を含み得る。これら
の工程は、液体を取り扱う工程を含む。これらの工程
は、このアレイにおける検出工程を現在実施するための
自動化液体取り扱いシステムを用いて自動化され得る。
液体の取り扱いは、ウェル中のサンプルの均一処理を可
能にする。マイクロタイターロボット利用装置および液
体取り扱い装置が、例えばＴｅｃａｎＡＧから市販され
ている。

【００８０】このアレイは、液体取り扱いデバイスによ
って操作され得る。このロボット利用デバイスは、適切
な反応条件（例えば、温度）を設定し、アレイに試薬を
添加し、適切な時間、アレイをインキュベートし、未反
応物質を除去し、アレイ基板を洗浄し、適切なように反
応基板を添加し、そして検出アッセイを実施するように
プログラムされ得る。この特定の反応条件は、アッセイ
の目的、例えば、プローブのハイブリダイゼーションま
たはオリゴヌクレオチドへの標識の付着に依存して選択
される。

【００８１】所望される場合、このアレイは、アレイリ
ーダーにおける使用のために適切にパッケージされ得
る。このような装置の１つは、国際公開第ＷＯ９５／３
３８４６号（Ｂｅｓｅｍｅｒら）に開示される。

【００８２】（３．特徴に結合したプローブからのシグ
ナルの検出）（ａ．導入）特定のプローブ（例えば、対立遺伝子特異
的、対立遺伝子特異的に連結した、またはプライマー伸
長した）と、特異的ハイブリダイゼーション条件下でア
レイ上の特徴における増幅産物との間の結合の検出は、
その特徴が対応する個体が、このプローブによって検出
されたマーカーの多型性形態を有することを示す。プロ
ーブと、同じ増幅反応の産物との間の結合強度は、特定
のマーカーについての遺伝子型の指標を提供し、このプ
ローブは、集団において個体を区別するために設計され
る。例えば、特定のプローブについての強力なシグナル
は、ホモ接合性を示し得、一方、弱いシグナルはヘテロ
接合性を示し得る。個体からの各画分において試験され
た各マーカーについての遺伝子型情報の収集は、その個
体についての多型性プロフィールを生じる。その集団の
各個体メンバーについての多型性プロフィールの集合
は、この集団の多型性プロフィールを生じる。

【００８３】好ましい実施態様において、ハイブリダイ
ゼーションおよび検出のプロセスは、多重増幅反応にお
いて増幅された複数の（好ましくは各々の）マーカーに
ついての情報を得るために、複数回繰り返される。この
ことは、遺伝子型である複数の個体についての複数の増
幅されたマーカーについての情報を産生する。

【００８４】（ｂ．蛍光標識化プローブの検出）アレイ
上の検出可能な標識から生成されたシグナルを検出する
工程は、アレイリーダーを必要とする。このアレイリー
ダーの性質は、標的分子に接続される特定の型の標識に
依存する。

【００８５】１つの実施態様において、このアレイリー
ダーは、核酸アレイを固定するためのボディ（ｂｏｄ
ｙ）を含む。励起放射（第１波長を有する励起光源か
ら）は、以下のアレイからの励起光学を通じて通過す
る。この励起工学は、基板上の核酸アレイの領域を励起
する励起放射を生じる。対応して、サンプル上の標識化
物質は、励起波長とは異なる波長を有する放射を発光す
る。次いで、収集光学（以下のアレイも）は、サンプル
からの励起を収集し、そして検出器上に画像化する。検
出器は、それに検出された放射量に比例してシグナルを
生成する。このシグナルは集合されて、発光が起こった
複数の領域と関連する画像を提示する。

【００８６】１つの実施態様によって、多軸平行移動ス
テージ（ｍｕｌｔｉ−ａｘｉｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏ
ｎｓｔａｇｅ）は、スキャンするために異なる領域を
位置付けするために、そして異なる位置のアレイが問い
合わせられることを可能にするために、核酸アレイを移
動させる。結果として、この核酸アレイの二次元画像が
得られる。

【００８７】核酸アレイリーダーは、スキャニングプロ
セスを通じて、励起光の焦点面においてサンプルを維持
するための自動焦点特徴を含み得る。さらに、温度コン
トローラーは、スキャンされている間、特定の温度でサ
ンプルを維持するために使用され得る。多軸平行移動ス
テージ、温度コントローラー、自動焦点特徴、ならびに
画像およびデータ収集と関連する電子工学は、適切にプ
ログラムされたデジタルコンピューターによって管理さ
れる。

【００８８】１つの実施態様において、ビームは、アレ
イの表面上の直径約２μｍのスポットに、例えば、顕微
鏡の対物レンズまたはビームの直径を制御するためのほ
かの光学手段を用いて焦点を合わせられる（例えば、米
国特許第５，６３１，７３４号（Ｓｔｅｒｎら）を参照
のこと）。

【００８９】別の実施態様において、蛍光プローブは、
ＣＣＤ画像システムと組み合わせて使用される。この方
法の詳細は、米国特許第５，５７８，８３２（Ｔｒｕｌ
ｓｏｎら）に記載される。多くの市販のマイクロプレー
トリーダーにおいて、代表的には、光源は、アレイの上
に配置され、そして光ダイオード検出器はアレイの下に
配置される。本方法のために、この光源は、より高出力
のランプまたはレーザーで置き換えられ得る。１つの実
施態様において、標準的な吸収幾何学が使用されるが、
光ダイオード検出器は、このアレイを迅速に画像化し得
るＣＣＤカメラおよび画像工学と置き換えられる。一連
のラマン立体画像またはノッチフィルターが光学通路に
おいて使用されて、発光を検出器に通過させる間、励起
光を排除し得る。この方法のバリエーションにおいて、
光学繊維画像束が利用されて、ＣＣＤ検出器に光を運
ぶ。別の実施態様において、このレーザーは、核酸アレ
イの下に配置され、そして光は、核酸アレイの下部を形
成する透過ウエハまたは基板を通して方向付けられる。
別の実施例について、このＣＣＤアレイは、核酸アレイ
のウエハに組み立てられる。

【００９０】ＣＣＤアレイの選択は、各アレイの特徴の
数に依存する。平方に名目上配列された２５００特徴
（５０×５０）が試験され、そして各特徴の６行が良好
な画像を得るためにサンプリングされる場合、次いで、
３００×３００画素のＣＣＤアレイがこの面積で所望可
能である。しかし、個々のアレイが４８，４００特徴
（２２０×２２０）を有する場合、次いで、１３２０×
１３２０画素を有するＣＣＤアレイが所望可能である。
ＣＣＤ検出器は、例えば、ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＩｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能であり、これは、これら
の要求のいずれをも満たし得る。

【００９１】検出デバイスはまた、米国特許第５，５７
８，８３２号（Ｔｒｕｌｓｏｎら）に記載されるような
ラインスキャナーを含み得る。励起光学は、励起光をサ
ンプルの行に対して焦点をあわせ、同時にサンプルのス
トリップをスキャニングまたは画像化する。アレイから
の、表面に結合した蛍光標識は、光に応じてアレイから
蛍光を発する。収集光学は、光検出器の線状アレイ上へ
発光を画像化する。共焦点技術を使用することによっ
て、実質的に、光の焦点面からの発光のみが画像化され
る。一旦ストリップがスキャンされると、一次元画像を
提示するデータが、コンピューターのメモリに保存され
る。１つの実施態様によると、多軸平行移動ステージ
は、定常速度でデバイスを動かして、データを連続的に
取り込みそして処理する。あるいは、検流計（ｇａｌｖ
ｏｍｅｔｒｉｃ）スキャナーまたは回転多面体鏡が使用
されて、サンプルを横切る励起光をスキャンし得る。結
果として、このサンプルの二次元画像が得られる。

【００９２】別の実施態様において、収集光学は、分光
器に発光を指向し、この分光器は、光検出器の二次元ア
レイ上に発光スペクトルを画像化する。分光器を用いる
ことによって、このアレイのスペクトル的に完全に分解
された画像が得られる。

【００９３】アレイの読み込み時間は、蛍光の光物理学
（すなわち、蛍光量子収率および光破壊収率）ならびに
検出器の感度に依存する。フルオレセインについて、Ｃ
ＣＤ検出器を用いてアレイ画像を読む十分なシグナル対
ノイズ比は、Ａｒイオンレーザーまたはランプからの３
ｍＷ／ｃｍ²および４８８ｎｍの励起を用いて約３０秒
で得られ得る。レーザー出力を増加させることによっ
て、そして低い光破壊収率を有し、その発光がＣＣＤ検
出器の最大感度により緊密に一致する、ＣＹ３またはＣ
Ｙ５のような色素に変更することによって、５秒未満で
各アレイを読むことが容易に可能である。

【００９４】（Ｅ．多型性プロフィールの生成）（１．導入）マーカーの多形形態の存在または非存在に
関する情報を用いて、次いで、集団における個体の各々
についての多型性プロフィールを生成し得る。このデー
タは、好ましくは、プログラム可能なデジタルコンピュ
ーターによって処理される。

【００９５】（２．データ分析）データは、プログラム
可能なデジタルコンピューターの使用で、最も容易に分
析される（図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）。コンピュ
ータープログラムは、一般的に、コードを保存する読み
込み可能な媒体を含む。特定のコードは、各特徴の位
置、および個体の同一性、およびその特徴における多型
性マーカーを含むメモリに充てられる。このプログラム
はまた、そのメモリにおいて、このマーカーの参照配列
を含み得る。このコンピューターはまた、特定のシグナ
ルの検出を特定のプローブと相関させ、そしてハイブリ
ダイゼーションの存在を特定の対立遺伝子の存在と相関
させるコードを含み得る。このコンピューターはまた、
プローブと、特定の特徴におけるセグメントとの間のハ
イブリダイゼーション反応からのハイブリダイゼーショ
ンデータをインプットとして受け取るコードを含み得
る。このコンピューターはまた、対立遺伝子の単一コピ
ーまたは二重コピーの存在とのハイブリダイゼーション
の存在または程度に関するコードを含み得る。このコン
ピュータープログラムはまた、インプットとしてプログ
ラマーからの指示を受け取るコードを含み得る。

【００９６】このコンピューターは、データを提示のた
めの別のフォーマットに変換し得る。データ分析は、例
えば、回収したデータからの基板位置の関数として蛍光
強度を決定する工程、「分離物（ｏｕｔｌｉｅｒ）」
（予め決定された静止分布から逸脱したデータ）を除去
する工程、および残存するデータからの標的の相対結合
親和性を計算する工程を含み得る。生じるデータは、そ
の中の標的とプローブとの間の光放射または結合親和性
によって変化する各領域において、色とともに画像とし
て表示され得る。あるいは、このデータは、各個体およ
び試験された各多型性マーカーについての遺伝型を示す
リストとして提示され得る。

【００９７】検出工程が標識化標的オリゴヌクレオチド
のアレイにおけるオリゴヌクレオチドとのハイブリダイ
ゼーションを含む場合に、実施の速度を上げるＣＣＤ画
像化システムと連結される場合のこのシステムの１つの
適用は、このハイブリダイゼーションのオンまたはオフ
の割合を試験することによってアッセイの結果を得るこ
とである。この方法の１つのバージョンにおいて、各ア
ドレスで結合する量は、標的がアレイと接触された後の
いくつかの時点で決定される。全ハイブリダイゼーショ
ンの量は、各時点で結合する量に基づいて、結合の速度
論の関数として決定され得る。従って、到達する平衡を
待つことは必要ではない。温度、サンプル攪拌、洗浄条
件（例えば、ｐＨ、溶媒特性、温度）において異なるオ
リゴヌクレオチドについてのハイブリダイゼーションの
割合の依存性は、割合およびシグナル対ノイズ比につい
ての条件を最大化するために、容易に決定され得る。別
の方法は、米国特許第５，３２４，６３３号（Ｆｏｄｏ
ｒら）に記載される。

【００９８】温度、サンプル攪拌、洗浄条件（例えば、
ｐＨ、溶媒特性、温度）において異なるオリゴヌクレオ
チドについてのハイブリダイゼーションの割合の依存性
は、速度およびシグナル対ノイズ比についての条件を最
大化するために、容易に決定され得る。

【００９９】アレイ上で実施されるハイブリダイゼーシ
ョンアッセイの結果は、一般的に、プログラム可能なデ
ジタルコンピューターによって分析される。このような
コンピューターは、そのメモリに、全ての増幅産物の同
一性（個体および全ての増幅反応で増幅されたセグメン
トの同一性を含む）を保存し得る。それゆえ、行におい
て個体および列において増幅反応を有する（または、そ
の逆）直交アレイが各使用について好ましいが、増幅産
物は、任意の整列（ランダムを含む）に置き得る。

【０１００】

【実施例】以下の実施例は、例示の目的で提供され、限
定の目的では提供されない。９個の個体の集団における
９個の遺伝子マーカーＡ〜Ｉについての多重多型性プロ
フィールを調製するための方法を示す。

【０１０１】（Ｉ．多重増幅）図１を参照すると、二倍
体個体の集団の各メンバーは、９個の多型性遺伝子マー
カー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩ）の各
々について２つの対立遺伝子を有する。この対立遺伝子
の特定の強度は、この時点で、同定されない。各個体か
らのＤＮＡサンプルを、３つの画分に分割する。各個体
からの第１の画分を、３重（ｔｈｒｅｅ−ｐｌｅｘ）増
幅の場合、プライマーａおよびａ’、ｂおよびｂ’、な
らびにｃおよびｃ’を用いる第１の多重増幅反応に供し
て、四角で示したマーカーを含むセグメントを増幅す
る。これは、マーカーＡ、ＢおよびＣを含む核酸セグメ
ントの増幅したコピーを含む各個体についての第１の増
幅産物を得る。

【０１０２】各個体からの第２の画分を、プライマーｄ
およびｄ’、ｅおよびｅ’、ならびにｆおよびｆ’を用
いる、第２の多重増幅反応に供して、マーカーＤ、Ｅお
よびＦの増幅したコピーを含む第２の増幅産物を得る。

【０１０３】第３の画分を、第３の多重増幅に供して、
マーカーＧ、ＨおよびＩの増幅したコピーを含む第３の
増幅産物を得る。

【０１０４】（ＩＩ．増幅産物の基板への適用）図２を
参照すると、集団の９個の個体についての第１の増幅産
物のセットを、第１の基板上の特徴の直交アレイに固定
する。全ての個体についての増幅産物の第２のセット
を、第２の基板上の特徴の直交アレイに固定する。全て
の個体についての増幅産物の第３のセットを、第３の基
板上の特徴の直交アレイに固定する。

【０１０５】この増幅産物は、他の配列においてもま
た、基板に適用され得る。例えば、図３に示されるよう
に、各個体についての増幅産物は、単一の基板上のアレ
イに配列され得る。例えば、このアレイは、行および列
を有するグリッドの形態をとり得る。行における各特徴
は、同じ個体についての異なる多重増幅反応の産物を含
み得る。列における各特徴は、異なる個体の各々からの
画分上の同じ多重増幅反応の産物を含み得る。図３を参
照すると、複数の個体（この場合９）からの複数の増幅
産物（この場合３）を、基板上の個別のアドレシング可
能な位置（特徴）に適用して、２７（３×９）の特徴を
得る。

【０１０６】（ＩＩＩ．マーカーの対立遺伝子形態につ
いての多重基板のプロービング）増幅産物を、ここでプ
ローブして、個体の各々についての少なくとも１つのマ
ーカーの多系形態の同一性を決定する。図２に示す増幅
産物の整列を使用して、３つの基板を図４に示すように
プローブする。単純化のために、個体１〜３のみを、各
基板について示す。一対のプローブを、増幅産物の各セ
ットにおいて１つの多型性マーカーに指向されるように
選択する。この例において、プローブを、基板１におけ
るマーカーＡの多型性形態Ａ₁およびＡ₂、基板２におけ
るマーカーＤの多型性形態Ｄ₁およびＤ₂、基板３におけ
るマーカーＧの多型性形態Ｇ₁およびＧ₂に指向させる。
各特徴において、接触に際して、プローブは、増幅産物
に存在するどの多型性形態にもハイブリダイズする。

【０１０７】例えば、基板１において、プローブＡ₁の
みが個体１についての増幅産物にハイブリダイズし、こ
れは対立遺伝子Ａ₁についてのホモ接合個体を示す。プ
ローブＡ₂のみが個体２由来の増幅産物にハイブリダイ
ズし、これは対立遺伝子Ａ₂についてのホモ接合個体を
示す。プローブＡ₁およびＡ₂の両方は個体３からの増幅
産物にハイブリダイズし、これはヘテロ接合個体Ａ₁Ａ₂
を示す。

【０１０８】基板２において、プローブＤ₁およびＤ₂の
両方は個体１由来の増幅産物にハイブリダイズし、これ
はヘテロ接合個体Ｄ₁Ｄ₂を示す。プローブＤ₁のみが個
体２からの増幅産物にハイブリダイズし、これは対立遺
伝子Ｄ₁についてのホモ接合個体を示す。プローブＤ₁お
よびＤ₂の両方は個体３由来の増幅産物にハイブリダイ
ズし、これはヘテロ接合個体Ｄ₁Ｄ₂を示す。

【０１０９】基板３において、プローブＧ₂のみが個体
１および２由来の増幅産物にハイブリダイズし、これは
対立遺伝子Ｇ₂についてのホモ接合個体を示す。プロー
ブＧ₁のみが個体３由来の増幅産物にハイブリダイズ
し、これは対立遺伝子Ｇ₁についてのホモ接合個体を示
す。

【０１１０】本明細書に記載されるプロセスにおいて、
マーカーの２つの多型性形態の各々の存在または非存在
を、一対の蛍光標識したプローブを用いて検出する。一
対における各プローブは、異なる区別可能な色（例え
ば、それぞれ、青色（垂直陰影）および赤色（水平陰
影））の蛍光を発する、異なる蛍光標識（星およびダガ
ーで示す）を有する。再び図４を参照して、第１のプロ
ーブ対を、マーカーＡの形態Ａ₁およびＡ₂に指向させ
る。この実施例において、青色光のみを、基板１の特徴
１への「Ａ」プローブのハイブリダイゼーション後に検
出し、これはプローブＡ₁のみがこの特徴における増幅
産物にハイブリダイズしたことを示す。赤色光のみを、
基板１の特徴２への「Ａ」プローブのハイブリダイゼー
ション後に検出し、これはプローブＡ₂のみが基板１の
特徴２における増幅産物にハイブリダイズしたことを示
す。赤色光および青色光の両方を、基板１の特徴３への
「Ａ」プローブのハイブリダイゼーション後に検出し、
これはプローブＡ₁およびＡ₂の両方が、基板１の特徴３
における増幅産物にハイブリダイズしたことを示す。

【０１１１】従って、任意の特徴で蛍光プローブによっ
て生成されたシグナルは、個体の遺伝子型を示す。一般
的には、特定の遺伝子型を示すシグナルの解釈を、コン
ピューターによって実施する。このコンピューターを、
各マーカーについて、マーカーの特定の対立遺伝子形態
の存在を有する標識からの色に対応するようにプログラ
ムする。

【０１１２】（ＩＶ．多重マーカーについての単一の基
板の反復性基板）図５を参照すると、増幅産物における
増幅したマーカーの全ての遺伝子型を決定するために、
ハイブリダイゼーション検出プロセスを、単一の基板上
で３回反復する。毎回、プローブを、増幅産物において
異なる増幅したマーカーに指向させる。この図は、基板
１ならびに個体１、２および３のみを示す。第１の反復
において（すでに示した）、プローブをマーカーＡに指
向させる。各個体についてのプローブのハイブリダイゼ
ーションの決定の後、基板を洗浄して、任意のハイブリ
ダイズしたプローブを除去する。

【０１１３】基板を、プローブで再びプローブして、マ
ーカーＢの多型性形態を検出する。この結果は、個体１
が遺伝子型Ｂ₁Ｂ₂を有し、個体２が遺伝子型Ｂ₁Ｂ₁を有
し、そして個体３が遺伝子型Ｂ₂Ｂ₂を有することを示
す。

【０１１４】ハイブリダイゼーションの検出の後、基板
を再び洗浄し、そしてプローブでプローブして、マーカ
ーＣの多型性形態を検出する。ここでの結果は、個体１
が遺伝子型Ｃ₁Ｃ₂を有し、個体２が遺伝子型Ｃ₂Ｃ₂を有
し、そして個体３が遺伝子型Ｃ₂Ｃ₂を有することを示
す。

【０１１５】（Ｖ．多くの個体についての多型性プロフ
ィールの生成）個体についての多重多型性プロフィール
を、個体における複数のマーカーについての遺伝子型デ
ータを値のセットに集合させることによって作製する。
集団の多重多形成プロフィールを、全ての個体の多型性
プロフィールを集合させることによって作製する。図６
を参照して、各個体についてのマーカーＡ〜Ｉについて
の集合された遺伝子型は、個体についての多重多型性プ
ロフィールを提示する。多くの個体からの多重多型性プ
ロフィールの収集は、集団の多重遺伝子型を生じる。

【０１１６】本発明は、個体の集団の多重多型性プロフ
ィーリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）のための新規な物質
および方法を提供する。特定の例を提供してきたが、上
記の説明は例示であり、限定ではない。本発明の多くの
バリエーションは、本明細書の概説に基づいて、当業者
には明らかである。それゆえ、本発明の範囲は、上記の
記載を参照してではなく、添付の請求の範囲を参照し
て、それらの等価物の完全な範囲とともに、決定される
べきである。

【０１１７】本出願に引用される全ての刊行物および特
許書類を、各個々の刊行物または特許書類が個々に記さ
れたように、同じ程度まで、全ての目的のためにその全
体において参考として援用する。この書類における種々
の参考文献の引用によって、出願人らは、任意の特定の
参考文献が、本発明の「先行技術」であるとは認めな
い。

【０１１８】（発明の要旨）本発明は、集団における多
くの個体において多くの多型性マーカーについての多型
性プロフィールを生成するための方法を提供する。本発
明は、多くの個体の各々のからの多くの核酸サンプルに
おけるマーカーの多重増幅を実施して多重増幅産物を生
成することを含む。この得られた多重増幅産物を、基板
に適用してアレイを作製する。次いで、１つの実施態様
において、一連の反復通過において、マーカーの両方の
対立遺伝子を検出するプローブの対を、このアレイ中の
増幅産物の各々に対してハイブリダイズして、その個体
がそのマーカーについて有する対立遺伝子を同定する。

【０１１９】

【発明の効果】何千もの個体において何千ものマーカー
についての多型性プロフィールを迅速に作製するための
ツールが本発明によって提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の方法における第一工程を示す
図である。個体からの核酸サンプルを３画分に分割し、
これら各々を、多型性マーカーの多重増幅に供する。

【図２】図２は、本発明の方法における第二工程を示す
図である。アレイに増幅産物を適用する。この図では、
その個体に対する第一の多重増幅からの産物のセット
を、第一の基板に適用し、その個体に対する第二の多重
増幅からの産物のセットを、第二の基板に適用し、そし
てその個体に対する第三の多重増幅からの産物のセット
を、第三の基板に適用する。

【図３】図３は、本発明の方法における第二工程の別の
型を示す図である。この型では、個体からのすべての多
重増幅の産物が基板上の異なる特徴に対して適用され
る。

【図４】図４は、本発明の第三工程である、各個体につ
いてマーカーの多型性形態の存在または非存在を検出す
る工程を示す図である。この場合、３つの基板の各々の
上の１つのマーカーがプロービングされる。

【図５】図５は、単一の基板上の検出手順の３回の反復
を示す図である。

【図６】図６は、集団内の個体１〜９におけるマーカー
Ａ〜Ｉについての多重の多型性プロフィールの仮想生成
を示す図である。１つの個体についての各多重多型性プ
ロフィールは、この個体がそのマーカーの各々について
２つの多型性形態（対立遺伝子）のどちら（１または２
と称する）を有するかを示す。この例における個体は二
倍体であるので、マーカーの各形態の存在または非存在
は、そのマーカーについての遺伝子型を提供する。

【図７Ａ】図７Ａは、本発明により生成されたデータを
分析するために使用され得るソフトウェアを実行するた
めに使用されたコンピュータシステムの例を示す図であ
る。この図は、モニタ３、スクリーン５、キャビネット
７、キーボード９およびマウス１１を備えるコンピュー
タシステム１を示す。マウス１１は、マウスボタン１３
のような１以上のボタンを備え得る。キャビネット７
は、ＣＤ−ＲＯＭドライブ１５とハードドライブ（示さ
ず）を収容する。これらは、本発明を組み込むコードを
含むコンピュータプログラムを格納および取り出しする
ために利用され得る。ＣＤ−ＲＯＭ１７は、コンピュー
タ読み出し可能な格納媒体として示されているが、フロ
ッピディスク、ＤＲＡＭ、ハードドライブ、フラッシュ
メモリ、テープなどを含む他のコンピュータ読み出し可
能な格納媒体も利用され得る。キャビネット７はまた、
プロセッサ、メモリなどのような慣用のコンピュータ・
コンポーネント（示さず）を収容する。

【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明によって生成されるデータ
を分析するために使用され得るソフトウェアを実行する
ために使用されるコンピュータシステム１のシステムブ
ロック図である。上記の図のように、コンピュータシス
テム１は、モニタ３およびキーボード９を備える。コン
ピュータシステム１は、セントラルプロセッサ１０２、
システムメモリ１０４、Ｉ／Ｏコントローラ１０６、デ
ィスプレイアダプタ１０８、リムーバブルディスク１１
２、固定ディスク１１６、ネットワークインターフェー
ス１１８およびスピーカ１２０のようなサブシステムを
さらに備える。リムーバブルディスク１１２は、フロッ
ピディスク、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、リムーバブルハー
ドドライブ、フラッシュメモリなどのようなリムーバブ
ルなコンピュータ読み出し媒体の代表例である。固定デ
ィスク１１６は、内部ハードドライブ、ＤＲＡＭなどの
代表例である。本発明での使用に適切な他のコンピュー
タシステムは、さらなる、またはより少ないサブシステ
ムを備え得る。例えば、他のコンピュータシステムは、
１を超えるプロセッサ１０２（すなわち、マルチプロセ
ッサシステム）またはメモリキャッシュを備え得る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の個体において、多型性マーカーの
多型性形態を検出する方法であって、以下の工程：ａ）複数の個体の各々からの核酸サンプルに対して多重
増幅を実施することによって、複数の増幅産物を生成す
る工程であって、該多重増幅が各々、複数の核酸セグメ
ントを増幅し、該セグメントの各々が少なくとも２の多
型性形態によって特徴付けられる多型性マーカーを含
む、工程；ｂ）基板の個別の領域に対して該増幅産物の各々を適用
する工程；およびｃ）該増幅産物の各々において、少なくとも１つの多型
性マーカーの、少なくとも１つの多型性形態の存在また
は非存在を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記検出する工程が、複数の連続する検
出工程において前記基板上の前記増幅産物の各々におい
て、複数の異なる多型性マーカーの多型性形態の存在ま
たは非存在を検出することを含む、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記工程ａ）が、複数の画分へと前記サ
ンプルの各々を分割すること、および該画分の各々にお
いて異なる多型性マーカーに対して多重の増幅を実施す
ることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記複数の核酸フラグメントが少なくと
も１００セグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記複数の個体が少なくとも１０００個
体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】前記増幅産物を、直行性アレイにおいて
前記基板に適用する工程を包含する、請求項２に記載の
方法。
【請求項７】前記増幅産物が、スポットまたはスプレ
ーすることにより前記基板に適用される、請求項２に記
載の方法。
【請求項８】前記基板がオリゴヌクレオチドアンカー
を含み、前記セグメントが該アンカーに対してハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドタグを含み、そして前記
増幅産物がハイブリダイゼーションによって該基板に適
用される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】前記検出する工程が、前記多型性マーカ
ーを含むセグメントに対してハイブリダイズした核酸プ
ローブを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記検出する工程が、前記増幅産物に
対してハイブリダイズした、標識したオリゴヌクレオチ
ドを検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】以下の工程：ｄ）前記複数の個体に対して、前記多型性形態の存在ま
たは非存在を示す値セットを生成し、それにより該値セ
ットが該個体についての多型性プロフィールを決定する
工程、をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】前記少なくとも１つの個体がヒトであ
る、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】前記複数の工程が少なくとも１０であ
る、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】少なくとも１００の多型性マーカーの
存在を検出する工程を包含する、請求項５に記載の方
法。
【請求項１５】前記プローブが対立遺伝子特異的プロ
ーブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】前記プローブが対立遺伝子特異的連結
から生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】前記プローブが、連鎖伸長終結から生
じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】前記標識が蛍光標識である、請求項１
０に記載の方法。
【請求項１９】前記少なくとも１つの多型性マーカー
が複数の多型性マーカーである、請求項１１に記載の方
法。
【請求項２０】前記増幅産物の各々に対して、少なく
とも１対の対立遺伝子特異的核酸プローブをハイブリダ
イズする工程であって、ここで該対のプローブの各々が
別の、排他的な識別可能な多型性形態の選択された多型
性マーカーに対して特異的にハイブリダイズする、工
程、を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】前記増幅産物に対して、少なくとも２
つの対立遺伝子特異的核酸プローブをハイブリダイズす
る工程であって、ここで該プローブの各々が、異なる多
型性マーカーを含むセグメントに対して特異的にハイブ
リダイズする、工程、を包含する、請求項１５に記載の
方法。
【請求項２２】前記プローブの対の各々が、異なる波
長の光を放出する蛍光標識を含む、請求項２０に記載の
方法。
【請求項２３】複数の対をハイブリダイズする工程で
あって、ここで、前記対の各々が、異なる多型性マーカ
ーを含むセグメントに対して特異的にハイブリダイズす
る、工程、を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】キットであって、以下：ａ）複数のプライマー対であって、該対の各々が核酸セ
グメントを増幅するための配列を有し、ここで該セグメ
ントの各々が、少なくとも２つの多型性形態によって特
徴付けられた異なる多型性マーカーを含む、複数のプラ
イマー対；およびｂ）対立遺伝子特異的核酸プローブのセットであって、
ここで該セットが、該多型性マーカーの各々について、
該多型性マーカーの多型性形態に対して特異的にハイブ
リダイズする少なくとも１つのプローブを包含する、セ
ット、を含む、キット。
【請求項２５】前記複数のプライマー対が少なくとも
１，０００である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】前記複数のプライマー対が少なくとも
１０，０００である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】１つのアレイ中に前記核酸セグメント
を固定するために適切な表面を有する基板をさらに含
む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】前記プローブのセットが、前記多型性
マーカーの各々について、１対の対立遺伝子特異的プロ
ーブを含み、ここで、該対のプローブの各々が、別の、
排他的に識別可能な多型性形態の多型性マーカーに対し
て特異的にハイブリダイズする、請求項２４に記載のキ
ット。
【請求項２９】前記対のプローブの各々が、異なる波
長の光を放出する蛍光標識を含む、請求項２８に記載の
キット。
【請求項３０】キットであって、以下：ａ）増幅産物のアレイであって、ここで該増幅産物の各
々が、複数の個体の各々からの核酸サンプルに対する多
重増幅の産物であり、該増幅産物の各々が複数の増幅さ
れた核酸セグメントを含み、そして該セグメントの各々
が少なくとも２つの多型性形態によって特徴付けられる
多型性マーカーを含む、アレイ；およびｂ）対立遺伝子特異的な核酸プローブのセットであっ
て、ここで該セットが、該増幅産物の各々について、増
幅されたセグメントの少なくとも１つの多型性マーカー
の多型性形態に対して特異的にハイブリダイズする少な
くとも１つのプローブを含む、セットを含む、キット。
【請求項３１】前記増幅産物の各々が少なくとも１０
個の異なる増幅されたセグメントを含む、請求項３０に
記載のキット。
【請求項３２】前記セットが、前記増幅産物の各々の
少なくとも１つの増幅されたセグメントについて、対立
遺伝子特異的なプローブの対を含み、ここで、該対の各
々のプローブが、前記多型性マーカーの別の、排他的に
識別可能な多型性形態に特異的にハイブリダイズする、
請求項３０に記載のキット。
【請求項３３】前記対の各々のプローブが、異なる波
長の光を放出する蛍光標識を含む、請求項３２に記載の
キット。
【請求項３４】前記アレイが少なくとも１０００の個
体について増幅産物を含む、請求項３１のキット。