WO2003093502A2 - Multiplex-nachweis von nukleinsäure-polymorphismen - Google Patents

Multiplex-nachweis von nukleinsäure-polymorphismen Download PDF

Info

Publication number
WO2003093502A2
WO2003093502A2 PCT/EP2003/004579 EP0304579W WO03093502A2 WO 2003093502 A2 WO2003093502 A2 WO 2003093502A2 EP 0304579 W EP0304579 W EP 0304579W WO 03093502 A2 WO03093502 A2 WO 03093502A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
primer
fluorescence
block
molecules
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/004579
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2003093502A3 (de
Inventor
Lars Edman
Rudolf Rigler
Original Assignee
Gnothis Holding Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gnothis Holding Sa filed Critical Gnothis Holding Sa
Priority to AU2003224141A priority Critical patent/AU2003224141A1/en
Publication of WO2003093502A2 publication Critical patent/WO2003093502A2/de
Publication of WO2003093502A3 publication Critical patent/WO2003093502A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the present invention relates to a method for the multiplex detection of nucleic acid polymorphisms by detection of fluorescence-labeled nucleic acid molecules.
  • sequence deviations between the genomes of the individuals of a species due to nucleic acid insertions and deletions differences in the number of repetitions of short, recurring sequence motifs (so-called microsatellites and minisatellites) and deviations in single base pairs, which are called single nucleotide polymorphisms (SNPs, English Single nucleotide rjolymorphisms ) are referred to and occur most frequently in humans with about one base pair per 1000 base pairs (see WO 00/18960).
  • Such variations in the genome can in many cases be linked to the occurrence of hereditary diseases.
  • Classic examples are HD, cystic fibrosis, Duchenne muscular dystrophy and certain forms of breast cancer (see WO 00/18960). More recently, diseases such as Alzheimer's and Parkinson's have also been linked to individual mutations at the molecular level.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a disadvantage of known methods is that the detection of nucleic acid polymorphisms from a large number of patient samples is very time-consuming and labor-intensive. On the other hand, there is a great need to carry out such studies in order to determine a correlation of certain nucleic acid polymorphisms with diseases on a statistical basis.
  • the object underlying the present invention was to provide a method for determining nucleic acid polymorphisms, in which the above-mentioned. Disadvantages are at least partially eliminated.
  • the method should enable the rapid acquisition of the data required for determining statistical correlations between nucleic acid polymorphisms and diseases.
  • Nucleic acid polymorphisms are performed by determining a variety of different samples in a single reaction.
  • the determination preferably comprises carrying out nucleic acid single-molecule determination reactions in parallel.
  • the invention thus relates to a method for characterizing nucleic acid polymorphisms, comprising the steps: (a) providing nucleic acid matrices to be examined from a large number of samples, (b) attaching at least one start primer to a nucleic acid template, the 3 'end of the start primer being upstream of a nucleic acid polymorphism to be investigated, (c) extending the at least one start primer with at least one fluorescence-labeled nucleotide, whereby at a nucleotide one outer polymorph his must be built with a base-specific fluorescent label, and
  • the nucleic acid polymorphism is preferably a single nucleotide polymorphism (Single Nucleotide Polymorphism, SNP). However, the polymorphism can also contain several nucleotides, e.g. up to 20 consecutive nucleotides.
  • DNA or RNA of any origin for example from prokaryotes, in particular pathogenic prokaryotes, archaea or eukaryotes, in particular mammals, such as humans, can be used as the nucleic acid template.
  • the nucleic acid template particularly preferably originates from a human sample.
  • the method according to the invention comprises the joint examination of a large number of samples.
  • the aim of such an investigation is to determine the statistical correlation of nucleic acid polymorphisms, in particular SNPs, that is to say a genotype, with a phenotype, for example the occurrence or / and the predisposition of diseases or / and the resistance to medicaments, for example antibiotics, in a test population .
  • the method according to the invention preferably comprises determining the proportions of nucleic acid polymorphisms in a subpopulation based on the frequency of the Occurrence of respective base-specific fluorescent labels. These portions of base-specific fluorescent labels are directly proportional to the frequency of certain mutations in the individuals of the test population.
  • the number of samples examined together in one batch is preferably at least 10, particularly preferably at least 50 and most preferably at least 100.
  • the samples are advantageously first obtained individually from individuals in the test population and then completely or partially transferred to a common reaction batch.
  • the common reaction approach then contains a large number of nucleic acid matrices from different sources, which have potential differences with regard to a nucleic acid polymorphism to be characterized.
  • the nucleic acid matrices in the sample are preferably provided in a single-stranded form and then brought into contact with at least one start primer under conditions such that the start primer can be hybridized to a nucleic acid matrix. Since the start primer specifically hybridizes with the nucleic acid template to be examined, it is not necessary to purify the template from the sample.
  • the start primer preferably consists of single-stranded DNA.
  • the start primer can also be a nucleic acid analog, for example a peptide nucleic acid, wherein the phosphate sugar backbone of the nucleic acids can be replaced by a peptide-like backbone, for example consisting of 2-aminoethylene glycine (Nielsen et al., Science, 254: 1497-1500) as a carrier of the individual bases A, T, G, C.
  • a such peptide nucleic acid primers must have a 3 'end that allows elongation.
  • the start primer preferably binds to the template immediately upstream of the SNP to be characterized.
  • the extension reaction preferably comprises adding a single fluorescence-labeled nucleotide to a start primer. If there are several polymorphisms to be examined on a single nucleic acid matrix, several start primers can be used for one reaction. Otherwise, only one start primer is usually used per reaction.
  • the fluorescence-labeled nucleotide can be a deoxynucleotide, a ribonucleotide or also a chain termination molecule, e.g. be a dideoxynucleotide.
  • the fluorescent labeling groups can be selected from the known ones for labeling biopolymers, e.g. Nucleic acids, fluorescent labeling groups used, such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3, Cy5 or derivatives thereof, etc. can be selected.
  • the differentiation of dyes can be made using optically detectable parameters, e.g. the wavelength, over the life of the excited states, or a combination thereof.
  • distinguishable fluorescent labels are used in each case in order to enable a base-specific fluorescent label and thus a differentiation of different bases at the positions of a nucleic acid polymorphism.
  • the primer is preferably extended by a template-dependent enzymatic reaction, e.g. by a polymerase.
  • Polymerase is selected depending on whether RNA or DNA is used as the template. A polymerase without exonuclease activity is preferred selected. Examples of possible polymerases are T7 polymerase or thermostable polymerases such as Taq, Pfu, Pwo and the like, which are usually used for PCR reactions.
  • the extension reaction preferably involves the addition of a single fluorescence-labeled nucleotide to a start primer.
  • fluorescence-labeled chain termination molecules such as deoxynucleotides, can be used for this purpose.
  • the extension of the extension can be forced by a block primer bound downstream to the nucleic acid template, instead of being forced to terminate the chain termination molecule. If several polymorphisms to be examined are examined in the vicinity of one another, a start primer bound downstream can serve as a block primer for a start primer bound upstream.
  • Built-in nucleotides are preferably detected using techniques known from single-molecule analysis, in particular by detection in a confocal volume element. Compared to classic single-molecule analysis, however, the method according to the invention requires the determination of a significant number of molecules within a sample in order to enable a sufficient statistical correlation between genotype and phenotype.
  • Patent application DE 100 23 423.2 described, due to the different migration rates of built-in and non-built-in nucleotides in the electric field. In this way, enrichments of three powers of ten or more can typically be achieved.
  • the nucleic acid molecules to be detected are particularly preferably coupled to a carrier particle.
  • the start primers can also contain marker groups, e.g. Fluorescent labeling groups. If several start primers are used per approach, the markings can be different.
  • the carrier particle has a size that enables movement in microchannels and retention in a desired position within a sequencer.
  • the particle size is preferably in the range from 0.5-1 ⁇ m and particularly preferably from 1-3 ⁇ m.
  • suitable materials for carrier particles are plastics, such as polystyrene, glass, quartz, metals or semimetals, such as silicon, metal oxides, such as silicon dioxide, or composite materials which contain several of the aforementioned components.
  • Optically transparent carrier particles for example made of plastics, or particles with a plastic core and a silicon dioxide shell are particularly preferably used.
  • the nucleic acid molecules to be detected are preferably immobilized on the carrier particle via their 5 'ends.
  • the immobilization can take place by covalent or non-covalent interactions, for example via high-affinity interactions between the partners of a specific binding pair, for example biotin / streptavidin etc., or by adsorption, for example via adsorption of alkanethiol groups on metallic surfaces.
  • Carrier particles to which a large number of nucleic acid molecules are bound are used for the method according to the invention.
  • the number of molecules to be detected coupled to a carrier particle is preferably higher than the number of samples.
  • the number of molecules to be detected coupled to a carrier particle is higher than the number of samples by at least a factor of 2, preferably by at least a factor of 5 and particularly preferably by at least a factor of 10.
  • each carrier particle contains a statistically sufficient number of nucleic acid molecules from each individual of the test population in order to enable a sufficient statistical representation of the individual individuals of the entire test population.
  • the determination in the method according to the invention comprises the steps:
  • the detection and manipulation of loaded carrier particles can, for example, according to the in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue ⁇ TAS 96, 85-87), Eigen and Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1 994), 5740-5747) or Rigler (J. Biotech. 41 (1 995 ), 1 77-1 86) described methods that involve detection with a confocal microscope.
  • the manipulation of the loaded carrier particles in microchannel structures is preferably carried out with the aid of a capture laser, for example an infrared laser. Suitable methods are for Example from Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31) and Chu (Science 253 (1991), 861-866).
  • the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleotides is preferably carried out by an enzymatic reaction using an exonuclease, single-strand or double-strand exonucleases degrading in the 5 ' ⁇ 3' direction or in the 3 ' ⁇ 5' direction. depending on the type of immobilization of the nucleic acid molecules on the support - can be used.
  • T7 DNA polymerase, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III are particularly preferably used as exonucleases.
  • the nucleotide building blocks released by the cleavage reaction are preferably passed through a microchannel in a flow and determined during the flow through the microchannel.
  • the flow is preferably a hydrodynamic flow.
  • an electroosmotic flow can also be used.
  • the diameter of the microchannel is preferably in the range from 1-100 ⁇ m, particularly preferably from 10-50 ⁇ m.
  • the detection of the fluorescence of the released nucleotides can be done with any measurement method, e.g. done with spatially and / or time-resolved fluorescence spectroscopy, which is able to detect fluorescence signals down to single photon counting in a very small volume element, such as is present in a microchannel.
  • the detection can be carried out by means of confocal single-molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy, with a very small, preferably a confocal volume element, for example 0.1 x 10 '15 to 20 x 10 "12 I, of the sample liquid flowing through the microchannel is exposed to an excitation light of a laser which excites the fluorescent markings located in this measurement volume to emit fluorescent light, wherein the emitted fluorescent light from the measurement volume is measured by means of a photodetector, and a correlation is established between the temporal change in the measured emission and the relative flow rate of the molecules involved, so that individual molecules can be identified in the measurement volume if the dilution is correspondingly strong.
  • confocal single-molecule detection such as by fluorescence correlation spectroscopy
  • the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating, as described, for example, by Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: “Ultrafast Phenomena”, D.H. Auston, Ed., Springer 1,984.
  • the fluorescence molecules are excited within a measurement volume and then - preferably at a time interval of> 100 ps - the detection interval is opened at the photodetector. In this way, background signals generated by Raman effects can be kept sufficiently low to enable essentially interference-free detection.
  • the reaction mixture can also contain block primers in addition to one or more primers.
  • Block primers are bound to the nucleic acid matrix downstream of a polymorphism to be investigated and are preferably themselves protected against elongation at their 3 'end by suitable chemical modification.
  • the most downstream nucleotide of the block primer can be a chain termination molecule.
  • the use of block primers is particularly preferred when investigating polymorphisms which consist of more than one nucleotide.
  • the reaction mixture contains at least two different labeled nucleotides in accordance with the respective possibilities of the base sequence on the polymorphism to be examined and possibly unlabeled nucleotides.
  • Blocking of the block primers may be reversible, except for blocking the most downstream binding primer.
  • a removable protective group for example a photolabile protective group, can be used for reversible blocking.
  • the block primers at the 3 'end particularly preferably carry a phosphate group at the 3' position of the sugar. This phosphate group at the 3'-end prevents the elongation by polymerase and can be easily split off with a 3'-phosphatase for deblocking.
  • Figure 1 shows a schematic representation of the measuring principle according to the invention.
  • a carrier particle (1) with immobilized on it is shown.
  • Nucleic acid fragments (2) which carry fluorescent labeling groups (2a) are in a channel, for example by means of a laser, recorded. In this channel there is preferably a laminar hydrodynamic flow in the direction of the arrow shown. In the presence of exonucleases (3), the immobilized nucleic acid fragments (2) are broken down, the split-off labeled or unlabeled nucleotides (2b) being released and passed through the flow in the channel to a downstream detection element (4), preferably a confocal detection element ,
  • the number of labeled nucleic acid molecules bound to a carrier particle can vary, for example, in the range from 10-20,000 molecules.
  • FIG. 2 shows a nucleic acid sequence and its relevant SNP positions (SEQ ID NO. 1).
  • the arrows in the nucleic acid sequence show 3 SNP positions, the correlation of which with the disease state of a larger group of patients is to be determined. Statistical information about the proportion of patients who have a mutation at SNP positions 1, 2 or / and 3 should be obtained.
  • FIG. 3 shows an example of the result of a multiplex SNP analysis of a large group of patients.
  • the areas under the respective peak (A means no mutation, B means a mutation) are directly proportional to the percentage of the analyzed patients with a certain mutation.
  • the area below peak B can be divided by the sum of the areas below peak A and peak B. example
  • Samples for example blood samples, are taken from a predetermined number of patients and mixed with one another to give a total patient sample.
  • Fluorescence-labeled DNA fragments are produced from the entire patient sample. Only the nucleotides at the SNP positions (but no other bases) are fluorescently labeled, with a different fluorescent label being used for each base type. Areas without SNP positions are filled with unlabeled nucleotides, for example as described in DE 100 65 631 .5.
  • the fluorescence-labeled DNA fragments are coupled to carrier particles.
  • the number of DNA fragments per carrier particle is selected such that the number is greater than the number of patients by a factor of, for example, 10. In this way it is ensured that each carrier particle contains a sufficient statistical average of DNA fragments with the DNA of each patient and its specific sequence in order to give a sufficient statistical representation of the DNA of the entire patient group.
  • the loaded carrier particles are introduced into a microchannel in which there is a hydrodynamic flow, and there e.g. held by an IR laser. Then exonuclease is added and the DNA fragments on the carrier particles are broken down. The fluorescence of labeled nucleotides (corresponding to the SNP positions to be examined) are detected in a detection element.
  • the time sequence of the detected fluorescence is determined when the fluorescence-labeled nucleotides are directed onto the detection element.
  • the fluorescence from each labeled nucleotide is classified according to its spectroscopic parameters, and indicates whether or not there is a mutation at an SNP position.
  • An exemplary result is shown in FIG. 3.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Multiplex-Nachweis von Nukleinsäurepolymorphismen durch Detektion fluoreszenzmarkierter Nukleinsäuremoleküle.

Description

Multiplex-Nachweis von Nukleinsäure-Polymorphismen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Multiplex-Nachweis von Nukleinsäurepolymorphismen durch Detektion fluoreszenzmarkierter Nukleinsäuremoleküle.
Zwischen den Genomen der Individuen einer Spezies gibt es Sequenzabweichungen durch Nukleinsäure-Insertionen und Deletionen, Unterschiede in der Zahl der Wiederholungen kurzer, wiederkehrender Sequenzmotive (sogenannte Mikrosatelliten und Minisatelliten) und Abweichungen bei einzelnen Basenpaaren, die als Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, engl. Single nucleotide rjolymorphisms) bezeichnet werden und mit etwa einem Basenpaar pro 1000 Basenpaaren beim Menschen (siehe WO 00/18960) am häufigsten vorkommen.
Solche Variationen im Genom können in vielen Fällen mit dem Auftreten erblicher Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Klassische Beispiele sind Huntington, cystische Fibröse, Duchenne muskuläre Dystrophie und bestimmte Formen von Brustkrebs (siehe WO 00/18960). In jüngerer Zeit wurden auch Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson mit einzelnen Mutationen auf molekularer Ebene in Verbindung gebracht.
In der Regel handelt es sich bei diesen Mutationen um Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs). Am Auffinden neuer Positionen im Genom, an denen SNPs auftreten, besteht daher ein erhebliches Interesse der medizinischen Forschung. An der Untersuchung von SNPs, deren Position im Genom auf das Nukleotid genau bekannt ist, besteht dagegen vor allem ein Interesse für die Diagnostik von molekular bedingten Krankheiten.
Eine Reihe von Verfahren zur routinemäßigen Untersuchung solcher SNPs an bekannter Position im Genom sind daher in den vergangenen Jahren entwickelt worden.
Ein Nachteil bekannter Verfahren besteht jedoch darin, dass der Nachweis von Nukleinsäure-Polymorphismen aus einer großen Anzahl von Patientenproben sehr zeit- und arbeitsaufwändig ist. Andererseits besteht ein großer Bedarf, derartige Untersuchungen durchzuführen, um eine Korrelation bestimmter Nukleinsäure-Polymorphismen mit Krankheiten auf statistischer Basis zu ermitteln.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäure-Polymorphismen bereitzustellen, bei dem die o.g. Nachteile mindestens teilweise beseitigt sind. Insbesondere soll das Verfahren die schnelle Gewinnung der zur Bestimmung statistischer Korrelationen zwischen Nukleinsäure- Polymorphismen und Krankheiten benötigten Daten ermöglichen.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Charakterisierung von
Nukleinsäure-Polymorphismen durch Bestimmung einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben in einer einzigen Reaktion erfolgt. Die Bestimmung umfasst vorzugsweise eine parallele Durchführung von Nukleinsäure-Einzelmolekülbestimmungsreaktionen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäure-Polymorphismen, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen von zu untersuchenden Nukleinsäurematrizen aus einer Vielzahl von Proben, (b) Anlagern von mindestens einem Startprimer an eine Nukleinsäurematrize, wobei das 3'-Ende des Startprimers stromaufwärts eines zu untersuchenden Nukleinsäure- Polymorphismus liegt, (c) Verlängern des mindestens einen Startprimers mit jeweils mindestens einem fluoreszenzmarkierten Nukleotid, wobei an einem N u kl e i n s ä u re- Po l y m o rp h i s mu s N u k l eoti d e mit e i n e r basenspezifischen Fluoreszenzmarkierung eingebaut werden, und
(d) gemeinsames Nachweisen von in den Startprimer eingebauten fluoreszenzmarkierten Nukleotiden aus einer Vielzahl von Proben.
Bei dem Nukleinsäurepolymorphismus handelt es sich vorzugsweise um einen Einzelnukleotidpolymorphismus (Single Nucleotide Polymorphism, SNP). Der Polymorphismus kann aber auch mehrere Nukleotide, z.B. bis zu 20 aufeinander folgende Nukleotide, betreffen.
Als Nukleinsäurematrize kann DNA oder RNA beliebiger Herkunft, beispielsweise aus Prokaryonten, insbesondere pathogenen Prokaryonten, Archaea oder Eukaryonten, insbesondere Säugetieren, wie etwa dem Menschen, verwendet werden. Besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäurematrize aus einer humanen Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die gemeinsame Untersuchung einer Vielzahl von Proben. Ziel einer solchen Untersuchung ist die Bestimmung der statistischen Korrelation von Nukleinsäure- Polymorphismen, insbesondere SNPs, d.h. einem Genotyp, mit einem Phänotyp, z.B. dem Auftreten oder/und der Prädisposition von Krankheiten oder/und der Resistenz gegenüber Medikamenten, z.B. Antibiotika, in einer Testpopulation. Somit umfasst das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise die Bestimmung der Anteile von Nukleinsäure- Polymorphismen in einer Teilpopulation aufgrund der Häufigkeit des Auftretens jeweiliger basenspezifischer Fluoreszenzmarkierungen. Diese Anteile basenspezifischer Fluoreszenzmarkierungen sind direkt proportional zur Häufigkeit bestimmter Mutationen in den Individuen der Testpopulation. Auf diese Weise können in einem einzigen oder in einer geringen Anzahl von Reaktionsansätzen statistische Korrelationen zwischen dem Genotyp und einem Phänotyp in der Testpopulation ermittelt werden. Die Anzahl der gemeinsam in einem Ansatz untersuchten Proben beträgt vorzugsweise mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 100. Die Proben werden günstigerweise zunächst einzeln aus Individuen der Testpopulation gewonenn und dann vollständig oder teilweise in einen gemeinsamen Reaktionsansatz überführt. Der gemeinsame Reaktionsansatz enthält dann eine Vielzahl von Nukleinsäurematrizen aus unterschiedlichen Quellen, die potenzielle Unterschiede bezüglich eines zu charakterisierenden Nukleinsäurepolymorphismus aufweisen.
Die Nukleinsäurematrizen in der Probe werden vorzugsweise in einer einzelsträngigen Form bereitgestellt und dann mit mindestens einem Startprimer unter solchen Bedingungen Inkontakt gebracht, dass eine Hybridisierung des Startprimers an eine Nukleinsäurematrize erfolgen kann. Da der Startprimer spezfizisch mit der zu untersuchenden Nukleinsäurematrize hybridisiert, ist eine Aufreinigung der Matrize aus der Probe nicht erforderlich.
Der Startprimer besteht bevorzugt aus einzelsträngiger DNA. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, mit RNA-Molekülen zu arbeiten. Der Startprimer kann auch ein Nukleinsäureanalog, zum Beispiel eine Peptidnukleinsäure sein, wobei das Phosphat-Zucker-Rückgrat der Nukleinsäuren ersetzt werden kann durch ein peptidartiges Rückgrat, beispielsweise bestehend aus 2-Aminoethylenglycin (Nielsen et al., Science, 254:1497-1500) als Träger der einzelnen Basen A, T, G, C. Ein solcher Peptidnukleinsäureprimer muss ein 3'-Ende besitzen, das eine Elongation zulässt.
Bevorzugt bindet der Startprimer unmittelbar stromaufwärts des zu charakterisierenden SNPs an die Matrize. In diesem Fall umfasst die Verlängerungsreaktion vorzugsweise das Anfügen von jeweils einem einzigen fluoreszenzmarkierten Nukleotid an einen Startprimer. Falls sich auf einer einzigen Nukleinsäurematrize mehrere zu untersuchende Polymorphismen befinden, können für eine Reaktion mehrere Startprimer eingesetzt werden. Ansonsten wird üblicherweise nur ein Startprimer pro Reaktion verwendet.
Das fluoreszenzmarkierte Nukleotid kann ein Desoxynukleotid, ein Ribonukleotid oder auch ein Kettenabbruchmolekül, z.B. ein Didesoxynukleotid sein. Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus den bekannten zur Markierung von Biopolymeren, z.B. Nukleinsäuren, verwendeten Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. , ausgewählt werden. Die Unterscheidung von Farbstoffen kann über optisch nachweisbare Parameter, z.B. die Wellenlänge, über die Lebensdauer der angeregten Zustände oder über eine Kombination davon erfolgen.
Für unterschiedliche Basen werden jeweils unterscheidbare Fluoreszenzmarkierungen verwendet, um eine basenspezifische Fluoreszenzmarkierung und somit eine Unterscheidung unterschiedlicher Basen an den Positionen eines Nukleinsäure-Polymorphismus zu ermöglichen.
Die Verlängerung des Primers erfolgt vorzugsweise durch eine matrizenabhängige enzymatische Reaktion, z.B. durch eine Polymerase. Die
Polymerase wird abhängig davon gewählt, ob als Matrize RNA oder DNA verwendet wird. Bevorzugt wird eine Polymerase ohne Exonukleaseaktivität ausgewählt. Beispiele für mögliche Polymerasen sind T7-Polymerase oder thermostabile Polymerasen wie Taq, Pfu, Pwo und Ähnliche, die üblicherweise für PCR-Reaktionen Verwendung finden.
Im einfachsten Fall wird nur ein einziger Startprimer auf einer Matrize eingesetzt. Es ist aber auch möglich, mehrere an verschiedenen Stellen an die Matrize bindende Startprimer einzusetzen und zu verlängern. Die Verlängerungsreaktion umfasst vorzugsweise das Anfügen eines einzigen fluoreszenzmarkierten Nukleotids an eine Startprimer. Hierzu kann man beispielsweise fluoreszenzmarkierte Kettenabbruchmoleküle, wie etwa Desoxynukleotide, einsetzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Beendigung der Ve rl än g e r u n g s re a kti o n n i c ht d u rc h d e n E i n b a u e i n e s Kettenabbruchmoleküls, sondern durch einen stromabwärts an die Nukleinsäurematrize gebundenen Blockprimer erzwungen werden. Falls mehrere zu untersuchende Polymorphismen in Nachbarschaft zueinander untersucht werden, kann ein stromabwärts gebundener Startprimer als Blockprimer für einen stromaufwärts gebundenen Startprimer dienen.
Der Nachweis von eingebauten Nukleotiden erfolgt bevorzugt nach Techniken, die aus der Einzelmolekülanalyse bekannt sind, insbesondere durch Detektion in einem konfokalen Volumenelement. Gegenüber der klassischen Einzelmolekülanalyse erfordert das erfindungsgemäße Verfahren jedoch die Bestimmung einer signifikanten Anzahl von Molekülen innerhalb einer Probe, um eine ausreichende statistische Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp zu ermöglichen.
Vorzugsweise wird vor dem Nachweis von in den Startprimer eingebauten Fluoreszenzmarkierungen zunächst eine Separation von nicht eingebauten
Nukleotiden durchgeführt. Diese Trennung kann beispielsweise, wie in der
Patentanmeldung DE 100 23 423.2 beschrieben, aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit eingebauter und nicht eingebauter Nukleotide im elektrischen Feld erfolgen. Auf diese Weise können typischerweise Anreicherungen um drei Zehnerpotenzen oder mehr erreicht werden.
Besonders bevorzugt werden die nachzuweisenden Nukleinsäuremoleküle, insbesondere die verlängerten Startprimer, an ein Trägerpartikel gekoppelt. Gegebenenfalls können die Startprimer auch Markierungsgruppen, z.B. Fluoreszenz-Markierungsgruppen, tragen. Bei Verwendung mehrerer Startprimer pro Ansatz können die Markierungen unterschiedlich sein.
Entgegen üblicher Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung, wie etwa in WO 02/02225 beschrieben, wird dabei eine Vielzahl von nachzuweisenden Molekülen aus unterschiedlichen Proben an ein einziges Trägerpartikel gekoppelt. Das Trägerpartikel hat eine Größe, die eine Bewegung in Mikrokanälen und das Festhalten an einer gewünschten Position innerhalb einer Sequenziervorrichtung ermöglicht. Die Partikelgröße liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5-1 O μm und besonders bevorzugt von 1 -3 μm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe, wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle, wie Silicium, Metalloxide, wie Siliciumdioxid oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen, oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt.
Die nachzuweisenden Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihre 5'-Enden auf dem Trägerpartikel immobilisiert. Die Immobilisierung kann durch kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen, z.B. über hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z.B. Biotin/Streptavidin etc., oder durch Adsorption, z.B. über Adsorption von Alkanthiolgruppen an metallische Oberflächen, erfolgen. Für das erfindungsgemäße Verfahren werden Trägerpartikel verwendet, an die eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen gebunden ist. Vorzugsweise ist die Anzahl der an ein Trägerpartikel gekoppelten nachzuweisenden Moleküle höher als die Anzahl der Proben. Beispielsweise ist die Anzahl von an ein Trägerpartikel gekoppelten nachzuweisenden Molekülen um mindestens den Faktor 2, vorzugsweise um mindestens den Faktor 5 und besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10, höher als die Anzahl der Proben. Auf diese Weise ist garantiert, dass jedes Trägerpartikel eine statistisch ausreichende Anzahl von Nukleinsäuremolekülen aus jeweils einem Individuum der Testpopulation enthält, um eine ausreichende statistische Repräsentation der einzelnen Individuen der gesamten Testpopulation zu ermöglichen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung im erfindungsgemäßen Verfahren die Schritte:
(i) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal, (ii) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung, (iii) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen,
(iv) Bestimmen derdurch Abspaltung freigesetzten fluoreszenzmarkierten Nukleotide.
Die Detektion und Manipulation beladener Trägerpartikel kann beispielsweise nach den in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue μTAS 96, 85-87), Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 ( 1 994), 5740-5747) oder Rigler (J. Biotech. 41 ( 1 995), 1 77-1 86) beschriebenen Methoden erfolgen, die eine Detektion mit einem konfokalen Mikroskop beinhalten. Die Manipulation der beladenen Trägerpartikel in Mikrokanalstrukturen erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines Einfanglasers, z.B. eines Infrarotlasers. Geeignete Methoden sind zum Beispiel von Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31) und Chu (Science 253 (1991), 861-866) beschrieben.
Das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleotiden erfolgt vorzugsweise durch eine enzymatische Reaktion unter Verwendung einer Exonuklease, wobei Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-Exonukleasen, die in 5'→ 3'-Richtung oder in 3'→ 5'-Richtung abbauen, - je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle auf dem Träger - eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt werden als Exonukleasen T7-DNA-Polymerase, E.coli-Exonuklease I oder E.coli- Exonuklease III verwendet.
Die durch die Abspaltungsreaktion freigesetzten Nukleotidbausteine werden vorzugsweise in einem Fluss durch einen Mikrokanal geleitet und während des Flusses durch den Mikrokanal bestimmt. Der Fluss ist vorzugsweise ein hydrodynamischer Fluss. Es kann jedoch auch ein elektroosmotischer Fluss verwendet werden. Der Durchmesser des Mikrokanals ist vorzugsweise im Bereich von 1-100 μm, besonders bevorzugt von 10-50μm.
Der Nachweis der Fluoreszenz der freigesetzten Nukleotide kann mit einer beliebigen Messmethode, z.B. mit orts- oder/und zeitaufgelöster Fluoreszenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement, wie es in einem Mikrokanal vorliegt, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmolekül- detektion, wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise ein konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 x 10'15 bis 20 x 10"12 I der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Fluoreszenzmarkierungen zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, so dass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-Opt.lnstrum.Eng. 1 921 (1 993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4 ( 1 994), 259-264) beschrieben.
Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomena", D.H. Auston, Ed., Springer 1 984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend - vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von > 100 ps - das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
Gegebenenfalls kann der Reaktionsansatz neben einem oder mehreren Startprimern auch noch Blockprimer enthalten. Blockprimer sind stromabwärts eines zu untersuchenden Polymorphismus an die Nukleinsäurematrize gebunden und vorzugsweise selbst gegen Verlängerung an ihrem 3'-Ende durch geeignete chemische Modifikation geschützt. Beispielsweise kann das am weitesten stromabwärts gelegene Nukleotid des Blockprimers ein Kettenabbruchmolekül sein. Auch bei dieser Ausführungsform ist es möglich, mehrere unterschiedlich kodierte Start/Blockprimerpaare, die an verschiedenen Stellen an die Matrize binden können, einzusetzen. Die Verwendung von Blockprimern ist insbesondere dann bevorzugt, wenn Polymorphismen untersucht werden, die aus mehr als einem Nukleotid bestehen. In diesem Fall enthält der Reaktionsansatz mindestens zwei unterschiedliche markierte Nukleotide entsprechend den jeweiligen Möglichkeiten der Basenfolge an dem zu untersuchenden Polymorphismus und gegebenenfalls unmarkierte Nukleotide. Es erfolgt eine gezielte Elongation des Startprimers bis zum Beginn des Blockprimers.
Die Blockierung der Blockprimer kann, gegebenfalls mit Ausnahme der Blockierung des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers, reversibel sein. Zur reversiblen Blockierung kann eine abspaltbare Schutzgruppe, beispielsweise eine photolabile Schutzgruppe verwendet werden. Besonders bevorzugt tragen die Blockprimer am 3'-Ende eine Phosphatgruppe an der 3'-Position des Zuckers. Diese Phosphatgruppe am 3'-Ende verhindert die Elongation durch Polymerase und kann zur Deblockierung ohne weiteres mit einer 3'-Phosphatase abgespalten werden.
Nach der Verlängerungsreaktion des Startprimers besteht noch keine kovalente Bindung zum unmittelbar stromabwärts oder/und zum unmittelbar stromaufwärts liegenden Blockprimer. Diese Bindung kann aber geknüpft werden, zum Beispiel enzymatisch mit einer Ligase. Die Ligation läuft wesentlich leichter ab, wenn die Blockprimer an ihrem 5'-Ende eine Phosphatgruppe tragen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert werden.
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Messprinzips. Ein Trägerpartikel ( 1 ) mit darauf immobilisierten
Nukleinsäurefragmenten (2), die Fluoreszenzmarkierungsgruppen (2a) tragen, wird in einem Kanal, beispielsweise mittels eines Lasers, festgehalten. In diesem Kanal herrscht vorzugsweise ein laminarer hydrodynamischer Fluss in Richtung des eingezeichneten Pfeils. In Anwesenheit von Exonukleasen (3) erfolgt ein Abbau der immobilisierten Nukleinsäurefragmente (2), wobei die abgespaltenen markierten oder unmarkierten Nukleotide (2b) freigesetzt und durch den Fluss im Kanal zu einem stromabwärts angeordneten Detektionselement (4), vorzugsweise einem konfokalen Detektionselement, geleitet werden. Die Anzahl der an ein Trägerpartikel gebundenen markierten Nukleinsäuremoleküle kann beispielsweise im Bereich von 1 0-20.000 Moleküle variieren.
Figur 2 zeigt eine Nukleinsäuresequenz und deren relevante SNP-Positionen (SEQ ID NO. 1 ) .
Die Pfeile in der Nukleinsäuresequenz zeigen 3 SNP-Positionen, deren Korrelation mit dem Krankeitszustand einer größeren Gruppe von Patienten bestimmt werden soll. Dabei sollen statistische Informationen über denjenigen Anteil von Patienten erhalten werden, die eine Mutation an den SNP-Positionen 1 , 2 oder/und 3 aufweisen.
Figur 3 zeigt eine beispielhafte Darstellung des Ergebnisses einer Multiplex- SNP-Analyse einer großen Patientengruppe. Die Flächen unter dem jeweiligen Peak (A bedeutet keine Mutation, B bedeutet eine Mutation) sind direkt proportional zum Prozentanteil der analysierten Patienten mit einer bestimmten Mutation. Um den Anteil der analysierten Patienten, die eine Mutation an der SNP-Position Nr. 1 haben, zu bestimmen, kann die Fläche unterhalb Peak B durch die Summe der Flächen unter dem Peak A und dem Peak B dividiert werden. Beispiel
Von einer vorbestimmten Anzahl Patienten werden Proben, beispielsweise Blutproben, entnommen und miteinander vermischt, um eine Gesamtpatientenprobe zu ergeben.
Aus der Gesamtpatientenprobe werden fluoreszenzmarkierte DNA- Fragmente hergestellt. Nur die Nukleotide an den SNP-Positionen (aber keine anderen Basen) werden fluoreszenzmarkiert, wobei für jeden Basentyp eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung eingesetzt wird. Bereiche ohne SNP-Positionen werden mit nichtmarkierten Nukleotiden aufgefüllt, beispielsweise wie in DE 100 65 631 .5 beschrieben.
Die fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente werden an Trägerpartikel gekoppelt. Die Anzahl von DNA-Fragmenten pro Trägerpartikel wird so ausgewählt, dass die Anzahl größer als die Anzahl von Patienten um einen Faktor von beispielsweise 1 0 ist. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass jedes Trägerpartikel einen ausreichenden statistischen Durchschnitt von DNA-Fragmenten mit der DNA von jedem Patienten und dessen spezifischer Sequenz enthält, um eine ausreichende statistische Repräsentation der DNA der gesamten Patientengruppe zu ergeben.
Die beladenen Trägerpartikel werden in einen Mikrokanal, in dem ein hydrodynamischer Fluss herrscht, eingebracht und dort z.B. mittels eines IR-Lasers festgehalten. Dann wird Exonuklease zugegeben und die DNA- Fragmente auf den Trägerpartikeln werden abgebaut. Die Fluoreszenz von markierten Nukleotiden (entsprechend den zu untersuchenden SNP- Positionen) werden in einem Detektionselement nachgewiesen.
Die zeitliche Abfolge der nachgewiesenen Fluoreszenz wird bestimmt, wenn die fluoreszenzmarkierten Nukleotide auf das Detektionselement geleitet werden. Die Fluoreszenz von jedem markierten Nukleotid wird entsprechend seiner spektroskopischen Parameter klassifiziert, und zeigt an, ob an einer SNP-Position eine Mutation vorliegt oder nicht. Ein beispielhaftes Ergebnis ist in Figur 3 gezeigt.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen von zu untersuchenden Nukleinsäurematrizen aus einer Vielzahl von Proben,
(b) Anlagern von mindestens einem Startprimer an eine Nukleinsäurematrize, wobei das 3'-Ende des Startprimers stromaufwärts eines zu untersuchenden Nukleinsäurepoly- morphismus liegt,
(c) Verlängern des mindestens einen Startprimers mit jeweils mindestens einem fluoreszenzmarkierten Nukleotid, wobei an einem Nukleinsäure-Polymorphismus Nukleotide mit einer basenspezifischen Fluoreszenzmarkierung eingebaut werden, und
(d) gemeinsames Nachweisen von in den Startprimer eingebauten fluoreszenzmarkierten Nukleotiden aus einer Vielzahl von Proben.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (d) die Bestimmung der Anteile von basenspezifischen Fluoreszenzmarkierungen in einem Nukleinsäure-Polymorphismus umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) einen selektiven Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden an einem Nukleinsäure-Polymorphismus umfasst.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von nachzuweisenden Molekülen aus unterschiedlichen Proben an ein Trägerpartikel gekoppelt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der an ein Trägerpartikel gekoppelten nachzuweisenden Moleküle höher als die Anzahl der Proben ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl von an ein Trägerpartikel gekoppelten nachzuweisenden Moleküle um mindestens den Faktor 2, vorzugsweise um mindestens den Faktor 5 und besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10, höher ist als die Anzahl der Proben.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der an ein Trägerpartikel gekoppelten Moleküle die Schritte umfasst: (i) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal, (ii) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung, (iii) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immbobilisierten Nukleinsäuremolekülen, (iv) Bestimmen der durch Abspaltung freigesetzten fluoreszenzmarkierten Nukleotide.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Abspaltung von an den Startprimer angehängten Nukleotiden durch eine Exonuklease, insbesondere durch T7-DNA-Polymerase, E.coli-Exonuklease I oder E.coli-
Exonuklease III, erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein einziger Startprimer pro Matrize verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Startprimer pro Matrize verwendet werden.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verlängerungsreaktion das Anfügen jeweils eines einzigen fluoreszenzmarkierten Nukleotids an einen Startprimer umfasst.
1 2. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichent, dass man ein Kettenabbruchmolekül anfügt.
1 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 0, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Paare von Start- und Blockprimern eingesetzt werden, wobei das 5'-Ende jedes Blockprimers in einem vorbestimmten Abstand stromabwärts des 3'-Endes des zugehörigen Startprimers an die Nukleinsäurematrize bindet, wobei das 3'-Ende des Blockprimers blockiert ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockierung des 3'-Endes der Blockprimer, gegebenenfalls mit Ausnahme des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers reversibel ist.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 3 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Blockprimer verwendet werden, die eine 3'-Phosphatgruppe tragen.
1 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine kovalente Bindung zwischen dem durch ein oder mehrere fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimer und dem
Blockprimer geschlossen wird.
1 7. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung enzymatisch, zum Beispiel unter
Verwendung einer Ligase, geschlossen wird.
1 8. Verfahren nach Anspruch 1 6 oder 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Blockprimer eine 5'-Phosphatgruppe trägt.
19. Verwendung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Charakterisierung von Nukleinsäure-Polymorphismen in einer Vielzahl unterschiedlicher Proben.
20. Verwendung nach Anspruch 1 9 zum Nachweis von SNPs.
21 . Verwendung nach Anspruch 1 9 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Proben aus Individuen einer Testpopulation stammen.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 9 bis 21 zur Bestimmung einer statistischen Korrelation zwischen dem Auftreten oder/und der Häufigkeit von Nukleinsäure-Polymorphismen und einem Phänotyp.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Phänotyp die Prädisposition oder/und das Auftreten einer Krankheit umfasst.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 9 bis 23 zur Bestimmung einer statistischen Korrelation zwischen dem Auftreten oder/und der Häufigkeit von Nukleinsäure-Polymorphismen und einem Krankheitsbild bei menschlichen Patienten.
PCT/EP2003/004579 2002-04-30 2003-04-30 Multiplex-nachweis von nukleinsäure-polymorphismen WO2003093502A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003224141A AU2003224141A1 (en) 2002-04-30 2003-04-30 Multiplexed determination of nucleic acid polymorphisms

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37665702P 2002-04-30 2002-04-30
US60/376,657 2002-04-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003093502A2 true WO2003093502A2 (de) 2003-11-13
WO2003093502A3 WO2003093502A3 (de) 2004-02-05

Family

ID=29401386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2003/004579 WO2003093502A2 (de) 2002-04-30 2003-04-30 Multiplex-nachweis von nukleinsäure-polymorphismen

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU2003224141A1 (de)
WO (1) WO2003093502A2 (de)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2293238A (en) * 1994-09-13 1996-03-20 Inceltec Ltd Primers for replication and/or amplification reactions
WO1998059066A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Orchid Biocomputer, Inc. Methods for the detection of multiple single nucleotide polymorphisms in a single reaction
US6013431A (en) * 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
EP1026258A2 (de) * 1999-02-05 2000-08-09 Affymetrix, Inc. (a California Corporation) Multiplex Genotypisierung von Populationen von Individuen
US6140054A (en) * 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes
WO2001032931A2 (en) * 1999-11-02 2001-05-10 Curagen Corporation Method and compositions for selectively inhibiting amplification of sequences in a population of nucleic acid molecules
WO2001071028A2 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Evotec Analytical Systems Gmbh Specific multiplex analysis of nucleic acids
WO2002002795A2 (de) * 2000-06-30 2002-01-10 Gnothis Holding Sa Multiplex-sequenzierungsverfahren
DE10065631A1 (de) * 2000-11-13 2002-05-23 Gnothis Holding Sa Ecublens Nachweis von Nukleinsäure- Polymorphismen
US20030077584A1 (en) * 2001-08-28 2003-04-24 Mark Kunkel Methods and compositons for bi-directional polymorphism detection

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6013431A (en) * 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
GB2293238A (en) * 1994-09-13 1996-03-20 Inceltec Ltd Primers for replication and/or amplification reactions
WO1998059066A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Orchid Biocomputer, Inc. Methods for the detection of multiple single nucleotide polymorphisms in a single reaction
US6140054A (en) * 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes
EP1026258A2 (de) * 1999-02-05 2000-08-09 Affymetrix, Inc. (a California Corporation) Multiplex Genotypisierung von Populationen von Individuen
WO2001032931A2 (en) * 1999-11-02 2001-05-10 Curagen Corporation Method and compositions for selectively inhibiting amplification of sequences in a population of nucleic acid molecules
WO2001071028A2 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Evotec Analytical Systems Gmbh Specific multiplex analysis of nucleic acids
WO2002002795A2 (de) * 2000-06-30 2002-01-10 Gnothis Holding Sa Multiplex-sequenzierungsverfahren
DE10065631A1 (de) * 2000-11-13 2002-05-23 Gnothis Holding Sa Ecublens Nachweis von Nukleinsäure- Polymorphismen
US20030077584A1 (en) * 2001-08-28 2003-04-24 Mark Kunkel Methods and compositons for bi-directional polymorphism detection

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARMSTRONG B. ET AL.: "SUSPENSON ARRAYS FOR HIGH THROUGHPUT, MULTIPLEXED SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM GENOTYPING" CYTOMETRY, ALAN R. LISS, Bd. 40, Nr. 2, 1. Juni 2000 (2000-06-01), Seiten 102-108, XP001106772 ISSN: 0196-4763 *
CHEN J. ET AL.: "A MICROSPHERE-BASED ASSAY FOR MULTIPLEXED SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM ANALYSIS USING SINGLE BASE CHAIN EXTENSION" GENOME RESEARCH, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, US, Bd. 10, Nr. 4, April 2000 (2000-04), Seiten 549-557, XP000927257 ISSN: 1088-9051 *
CHEN X. AND KWOK P.-Y.: "Homogenous genotyping assays for single nucleotide polymorphisms with fluorescence resonance energy transfer detection" GENETIC ANALYSIS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, Bd. 14, 1999, Seiten 157-163, XP002129269 ISSN: 1050-3862 *
KROOK A. ET AL.: "RAPID AND SIMULTANEOUS DETECTION OF MULTIPLE MUTATIONS BY POOLED AND MULTIPLEX SINGLE NUCLEOTIDE PRIMER EXTENSION: APPLICATION TO THE STUDY OF INSULIN-RESPONSIVE GLUCOSE TRANSPORTER AND INSULIN RECEPTOR MUTATIONS IN NON-INSULIN-DEPENDENT DIABETES" HUMAN MOLECULAR GENETICS, Bd. 1, Nr. 6, 1992, Seiten 391-395, XP000939000 ISSN: 0964-6906 *
SYVANEN A.-C.: "FROM GELS TO CHIPS: MINISEQUENCING PRIMER EXTENSION FOR ANALYSIS OF POINT MUTATIONS AND SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS" HUMAN MUTATION, WILEY-LISS, NEW YORK, US, Bd. 13, Nr. 1, 1999, Seiten 1-10, XP000953256 ISSN: 1059-7794 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003224141A1 (en) 2003-11-17
WO2003093502A3 (de) 2004-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2002038806A2 (de) Nachweis von nukleinsäure-polymorphismen
DE69233458T2 (de) Nukleinsäuretypisierung durch polymeraseverlängerung von oligonukleotiden unter verwendung von terminator-mischungen
DE69633974T2 (de) Nachweis von nukleinsäure-variationen
DE60208278T2 (de) System und Verfahren zum Testen von Nukleinsäuremolekülen
EP2235210B1 (de) Verfahren zur nukleinsäuresequenzierung
DE19844931C1 (de) Verfahren zur DNS- oder RNS-Sequenzierung
EP1975246A1 (de) Markierungsfreie Sequenzierung auf einer Festphase mittels Feldeffekttransistoren
DE10239504A1 (de) Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen und der Genexpression
DE10120798B4 (de) Verfahren zur Bestimmung der Genexpression
EP1186669B1 (de) Verfahren zur spezifischen Bestimmung von DNA-Sequenzen mittels paralleler Amplifikation
EP1294946B1 (de) Multiplex-sequenzierungsverfahren
EP1349649A2 (de) Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren
EP1711627B1 (de) Verfahren zur geno- und pathotypisierung von pseudomonas aeruginosa
DE10162535A1 (de) Sequenzierung über Lochmembranen
EP1280939B1 (de) Verfahren zum nachweis von polynukleotiden
EP1448798A1 (de) Nanostruktur insbesondere zur analyse von einzelmolekülen
DE102004038359A1 (de) Paralleles Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren
EP1458892B1 (de) Evaneszenz-basierendes multiplex-sequenzierungsverfahren
WO2003093502A2 (de) Multiplex-nachweis von nukleinsäure-polymorphismen
DE60223532T2 (de) Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen durch Einzelmolekülanalyse
DE102005029811B4 (de) Oligonukleotidanordnungen, Verfahren zu deren Einsatz und deren Verwendung
DE10325098B3 (de) Verfahren zur SNP-Analyse auf Biochips mit Oligonukleotid-Arealen
DE60226230T2 (de) Bestimmungsverfahren für das vorhandensein von verlängerungsprodukten
DE10065626A1 (de) Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren
DE10065631A1 (de) Nachweis von Nukleinsäure- Polymorphismen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP