JP2001500741A - 分子配列サインの同定およびそれに関する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的核酸と別々に配列決定されたポリヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーションアッセイ由来のハイブリダイゼーションデータを分析するための新規の手段および方法は、配列サインについての参照配列を規定するプローブセットを選択する工程、およびプローブへのそのハイブリダイゼーションに基づく標的核酸分子の性質についての有用なデータを引き出す工程を包含する。本方法は、標的が核酸もしくはポリペプチドもしくは配列サインを含むか否か、標的が遺伝子ファミリーメンバーをコードするか否か、または標的が任意の遺伝子数の１つに由来するか否かを決定するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 分子配列サインの同定およびそれに関する方法 本出願は、1996年9月19日に出願された米国特許仮出願60/025,740の出願日の 利益を請求する。これはその全体が、本明細書中に援用される。 発明の背景 本発明は、配列サインの存在についての標的核酸分子の迅速なスクリーニング の方法および手段に関する。好ましい実施態様において、ハイブリダイセーショ ンデータは、プログラム可能なデジタルコンピュータによりプロセスされる。 ta Clara，CA，USA））は、１cm²当たり500,000より多くの特徴部分（feature） 密度で、何千もの別々に配列決定されたポリヌクレオチドプローブを含み得る。 このようなアレイは、標的核酸分子からヌクレオチド配列情報を得ることを可能 にする。情報は、標的核酸分子とポリヌクレオチドアレイ上のポリヌクレオチド プローブとの間のハイブリダイゼーション反応を行うことにより得られる。標的 がハイブリダイズするプローブの位置および同定、ならびにハイブリダイゼーシ ョンの程度が決定される。核酸間のハイブリダイゼーションがそれらの配列の機 能であるので、標的がハイブリダイズするプローブの配列の分析、ならびにハイ ブリダイゼーションの程度は、標的分子の配列についての情報を提供する。 ポリヌクレオチドアレイが何千ものプローブを有し得るので、ハイブリダイゼ ーション反応は分析のための多数の生データを作製する。すでに、このようなデ ータをプロセスする幾つかの方法が開発されている。１つの適用において、標的 分子と参照ヌクレオチド配列に基づく１セットのプローブとの間の、ハイブリダ イゼーションを試験する。標的がハイブリダイズしないかまたは弱くハイブリダ イズするプローブのセットは、標的が参照配列とは異なる配列を示す。核酸アレ イは、参照と標的核酸配列との間の単一のヌクレオチド差異を検索するために使 用されている。実施例は、感染性疾患（例えば、HIV）、または遺伝病（嚢胞性 線維症）の遺伝子変異体の同定を含む。 ハイブリダイゼーションデータからの有用の情報を入手する他の方法は、科学 的および医学的共同体に恩恵を与える。 発明の要旨 本発明は、アレイに基づく分析の階層制の方法を包含する。ここで、１ヌクレ オチド塩基決定は、１つの工程であっても、１つの工程でなくてもよい。本発明 は幾つかの実施態様を有し、これらの多くは配列サインの決定を包含する。有用 な配列サインは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列サイン（例えば、タ ンパク質ドメイン、遺伝子ファミリー、ゲノム中の異なった遺伝子、反復配列、 または遺伝子多型を規定するサイン）を含む。方法は、スクリーニングされる標 的核酸分子と、配列サインを含む標的を同定するために設計されたポリヌクレオ チドアレイとの間のハイブリダイゼーションアッセイを行う工程を包含する。ア レイはプローブセットを含む。１セットのプローブは、一緒になって、配列サイ ンの配列、またはその配列上の変異を有する。それにより、プローブは参照配列 サインおよび配列サインに関する配列を規定する。標的分子とアレイ中のプロー ブとの間のハイブリダイセーションアッセイは、データが非常に望まれる場合、 標的がハイブリダイズするプローブならびにハイブリダイゼーションの程度につ いてのデータを生成する。次いでコンピュータープログラムを使用して、データ をプロセスする。１つ以上の参照配列を規定する標的がプローブに、または参照 配列から逸脱する配列を規定するプローブに、標的がハイブリダイズするか否か を決定することにより、標的が１つ以上の参照配列と同じ配列または類似した配 列を有するか否かを決定し得る。プローブとしてアレイ上に配置するための適切 な参照配列を選択することにより、標的が特に密接に関連したポリペプチド配列 サインをコードするか否か、または遺伝子ファミリーのメンバーであるか否か、 またはゲノム中に特にもしくは密接に関連した遺伝子の配列を有するか否かを決 定し得る。また、標的と、新規の遺伝子ファミリーおよび遺伝子ファミリーの新 規のメンバーなどを同定するための参照配列との間の差異のパターンを見ること が出来る。参照と標的配列との間の類似性および/または差異を同定することに よってまた、標的核酸分子の染色体上の位置を決定し得る。 標的核酸分子が配列サインを有するか否かを決定するために、以下の工程を使 用し得る：配列サインを規定する１セットのポリヌクレオチドプローブを含むポ リヌクレオチドアレイを提供する工程；標的核酸分子とセット中のプローブとの 間のハィブリダイゼーションを行うことによってハイブリダイゼーションデータ を生成し、そして標的核酸分子とセット中の各プローブとの間のハイブリダイゼ ーションを検出する工程；ならびにハイブリダイゼーションデータをプロセスし 、標的核酸分子が配列サインを有するか否かを決定する工程。特定の実施態様に おいて、配列サインはポリペプチド配列サインであり；配列サインは、可変位置 を含むか、またはプロセシングの工程は、プログラム可能なデジタルコンピュー ターによって行われる。別の実施態様において、配列サインがアミノ酸配列サイ ンである場合、アレイは、ポリペプチド配列サインをコードする縮重セットのヌ クレオチド配列サインを規定するプローブのセットを含む。さらに、または縮重 プローブセットに対する代替物として、有用なプローブセットは、イノシン（in sosine）、他の一般的な塩基、またはコドン部位の3d位でのＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇの混 合物を含み得る。プローブセットはまた、配列サインの多型変異体の存在を照合 する配列を含み得る。 本発明の１つの局面は、核酸試料の分析方法（少なくとも第１および第２のア ッセイを含むアッセイ技術の階層制（hierarchy）を選択する工程を包含する） を提供する。第１のアッセイは、第１配列サインの存在または非存在または変異 体の決定を提供するために、そして選択される第２のアッセイは、第２の配列サ インの存在または非存在または変異体の決定を提供するために選択される。少な くとも１つのアッセイは、高密度核酸アレイを使用する。第１のアッセイを用い る核酸試料が分析される。核酸試料は、第１のアッセイの結果に基づいて、第２ のアッセイで必要に応じて分析される。 さらなる実施態様において、第１または第２の配列サインは、遺伝子ファミリ ーの保存領域である。特定の実施態様において、第１および第２の配列サインは 、遺伝子ファミリーの非保存領域である。この方法は、上記核酸試料の全長配列 を決定する工程をさらに含み得る。 本発明はまた、分析のためのクローンを選択する方法を提供する。本発明のこ の局面は、それに結合する多様なクローンを有する支持体を提供する。支持体は 、クローンとポリヌクレオチドとの間の少なくとも幾つかのハイブリダイゼーシ ョンを許容するために、低い、中程度、または高いストリンジェンシーの条件下 で１つ以上のポリヌクレオチドに暴露される。このポリヌクレオチドとハイブリ ダイズするクローンが同定される。分析のために選択されるクローンは、クロー ンにハイブリダイズすることが同定されないものである。 この方法の１つの実施態様において、支持体は高密度核酸アレイである。 分析のための核酸試料を狭める方法もまた提供される。この工程は、核酸を含 有する試料を提供し；試料が配列サインを含有するか否かを、高密度核酸アレイ を用いて分析し；そして配列サインが存在しない場合のみ、核酸試料をさらに分 析する。 本発明はまた、標的分子が遺伝子ファミリーメンバー由来の配列を有するか否 かを決定するための方法を提供する。この方法は、遺伝子ファミリーメンバー由 来の参照ヌクレオチド配列を規定する１セットのポリヌクレオチドプローブを（ 少なくとも２つの異なる遺伝子ファミリーメンバーの各々について）含むポリヌ クレオチドアレイを提供する工程；標的核酸分子とセット中のプローブとの間の ハイブリダイゼーション反応を行う工程、および標的核酸分子とセット中の各プ ローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程により、ハイブリダイゼ ーションデータを作製する工程；ならびに標的核酸が、遺伝子ファミリーメンバ ーの１つに由来する参照配列を有するか否かを決定するためにハイブリダイゼー ションデータをプロセシングする工程を包含する。１つの実施態様において、標 的が、遺伝子ファミリーメンバーをコードする遺伝子にハイブリダイズする核酸 プローブにハイブリダイズするか否かを決定することにより核酸分子を標的化す る工程。他の実施態様において、プロセシングの工程はプログラム可能なデジタ ルコンピューターにより行われ；ポリヌクレオチドアレイは、遺伝子の高度な保 存領域を規定するプローブセットおよび遺伝子の高度な可変領域を規定するプロ ーブセットを（各遺伝子ファミリーメンバーについて）さらに含み；ポリヌクレ オチドアレイは、遺伝子の少なくとも２つの高度な保存領域を規定するプロー ブセットおよび遺伝子の少なくとも２つの高度な可変領域を規定するプローブセ ットを（各遺伝子ファミリーメンバーについて）さらに含み；領域はアミノ酸配 列をコードし、そしてアレイはアミノ酸配列をコードする異なったヌクレオチド 配列を規定し得るプローブセットをさらに含む。１つの実施態様において、方法 は、標的が遺伝子ファミリーメンバーの領域の配列を有さない場合、標的核酸分 子のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに包含する。 別の局面において、本発明は、ポリヌクレオチドアレイの各特徴部分において ポリヌクレオチドプローブの配列を入力として受けるコード；多数のメンバーの 遺伝子ファミリー由来の参照ヌクレオチド配列を入力として受けるコード；ヌク レオチド配列配列を規定するプローブを有するポリヌクレオチドアレイにおいて １セットの特徴部分を同定するコード；標的核酸分子と、ポリヌクレオチドアレ イ中のポリヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーション反応からのハ イブリダイゼーションデータを入力として受けるコード；標的核酸分子が任意の 参照配列由来の配列を有するか否かを決定するためのハイブリダイセーションデ ータをプロセスするコード；およびコードを保存するコンピューター読み取り可 能な媒体、を含むハイブリダイゼーションデータを分析するためのコンピュータ ープログラム製品を提供する。 別の局面において、本発明は、標的核酸分子が遺伝子セットの１つ由来の配列 を含むか否かを決定する工程を包含する方法を提供する。この方法は、ゲノムDN A由来のヌクレオチド配列を含む標的核酸分子を提供する工程；遺伝子の特有な 領域由来の少なくとも１つの配列サインを規定するヌクレオチドプローブを（セ ット中の各遺伝子について）含むポリヌクレオチドアレイを提供する工程；標的 核酸分子とセット中のプローブとの間のハイブリダイゼーション反応を行う工程 、および標的核酸分子とセット中の各プローブとの間のハイブリダイゼーション を検出する工程によりハイブリダイゼーションデータを作製する工程；ならびに 標的核酸が遺伝子の１つの特有の領域由来の配列を含むか否かを決定するための ハイブリダイゼーションデータをプロセスする工程を包含する。１つの実施態様 において、プロセシング工程は、プログラム可能なデジタルコンピューターによ り行われる。別の実施態様において、遺伝子の特有な領域はアミノ酸配列をコー ド する。さらなる実施熊様において、ポリヌクレオチドアレイは、１セットのポリ ヌクレオチドプローブ（この配列は、アミノ酸配列をコードする縮重したヌクレ オチド配列のセットを規定する）を（各特有の領域について）さらに含む。この ような実施態様におけるプローブは、さらにまたは代替物として、イノシンのよ うな一般的な塩基を、特に第３のコドン位置に含む配列を含む。なおさらなる付 加物または代替物として、ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドアレ イの単一の特徴部分内の第３のコドン位置に、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧの混合物を 有し得る。 別の局面において、本発明は、ポリヌクレオチドアレイの各特徴部分において ポリヌクレオチドプローブの配列を入力として受けるコード；多数の遺伝子の特 有の領域由来の配列サインを入力として受けるコード；その配列を規定するプロ ーブを有するポリヌクレオチドアレイにおける１セットの特徴部分を同定するコ ード；標的核酸分子と、ポリヌクレオチドアレイ中のポリヌクレオチドプローブ との間のハイブリダイゼーション反応からのハイブリダイゼーションデータを入 力として受けるコード；標的核酸分子が任意の配列サイン由来の配列を含むか否 かを決定するためのハイブリダイゼーションデータをプロセスするコード；なら びにコードを保存するコンピューター読み取り可能な媒体、を含むハイブリダイ ゼーションデータを分析するためのコンピュータープログラム製品を提供する。 図面の簡単な説明 図1Aは、本発明によって生じるデータを分析するために使用され得るソフトウ ェアを実行するために使用されるコンピューターシステムの例を図示する。図1A は、モニター３、スクリーン５、キャビネット７、キーボード９、およびマウス 11を含むコンピューターシステム１を示す。マウス11は、マウスボタン13のよう な１つ以上のボタンを備え得る。キャビネット７は、CD-ROMドライブ15、および 本発明を組み込むコードを含むコンピュータープログラムを記憶し、そしてそれ を読み出すために利用され得るハードドライブ（示さず）を収容する。CD-ROM17 がコンピューター読み取り可能記憶媒体として示されるが、他のコンピューター 読み取り可能記憶媒体（フロッピーディスク、DRAM、ハードドライブ、フラッシ ュテープメモリ、テープなどを含む）が利用され得る。キャビネット７はまた、 よく知られたコンピューター構成要素（例えば、プロセッサー、メモリなど）（ 示さず）を収容する。 図1Bは、本発明によって生じるデータを分析するために使用され得るソフトウ ェアを実行するために使用されるコンピューターシステム１のシステムブロック 図を示す。図1Aにおけるように、コンピューターシステム１は、モニター３およ びキーボード９を備える。コンピューターシステム１は、サブシステム（例えば 、セントラルプロセッサー102、システムメモリ104、I/Oコントローラー106、デ ィスプレーアダプター108、出し入れ可能なディスク112、固定ディスク116、ネ ットワークインターフェイス118、およびスピーカー120）をさらに含む。出し入 れ可能なディスク112は、フロッピー、テープ、CD-ROM、出し入れ可能なハード ドライブ、フラッシュメモリなどのような出し入れ可能な読み取り可能記憶媒体 の代表である。固定ディスク116は、内部ハードドライブ、DRAMなどの代表であ る。本発明に関する使用のために適切な他のコンピューターシステムは、さらな るサブシステムまたはより少ないサブシステムを含み得る。例えば、別のコンピ ューターシステムは、１つより多いプロセッサー102（すなわち、マルチプロセ ッサーシステム）またはメモリキャッシュを含み得る。 図２は、サイン配列を検出するためのタイル方式(tiling)を図示する。サイン 配列Asn-Gly-Lys-Ala-Met（配列番号２）は、それをコードする64のヌクレオチ ド配列の縮重セットを含む。これらのうちの１つは、ATTGGCAAAG CTATG（配列番 号１）である。この参照配列を規定する一増分タイル方式に基づいた６マーのプ ローブセットは、セットATTGGC（配列番号１の１〜６）、TTGGCA（配列番号１の ２〜７）、TGGCAA（配列番号１の３〜８）、GGCAAA（配列番号１の４〜９）、GC AAAG（配列番号１の５〜10）、CAAAGC（配列番号１の６〜11）、AAAGCT（配列番 号１の７〜12）、AAGCTA（配列番号１の８〜13）、AGCTAT（配列番号１の９〜14 ）、およびGCTATG（配列番号１の10〜15）である。縮重内の別の参照配列は、AA CGGAAAGG CAATG（配列番号＿）である。この配列を規定する一増分タイル方式に 基づいた６マーのプローブセットは、AACGGA（配列番号＿の１〜６）、ACGGAA（ 配列番号＿の２〜７）、CGGAAA（配列番号＿の３〜８）、GGAAAG（配列番号＿ の４〜９）、GAAAGG（配列番号＿の５〜10）、AAAGGC（配列番号＿の６〜11）、 AAGGCA（配列番号＿の７〜12）、AAGGCAA（配列番号＿の８〜13）、GGCAAT（配 列番号＿の９〜14）、およびGCAATG（配列番号＿の10〜15）である。 図３は、遺伝子ファミリーのメンバーを検出するためのストラテジーの例を図 示する。ファミリーにおける３つの遺伝子の４つの領域は、サイン配列（角括弧 内）として選択される。遺伝子１、２、および３の各々のヌクレオチド配列サイ ンは、プローブＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（可変領域Ｖ₁）；Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ（可変領域Ｖ₂ ）、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ（定常領域Ｃ₁）、およびＭ、Ｎ、Ｏ、Ｐ（定常領域Ｃ₂）を 含むプローブのセットによって規定される。 図４は、種々の遺伝由来の配列サインを検出するためのストラテジーの例を図 示する。この例において、すべての可能性のある９マー配列を有するプローブを 含む525×525特徴部分を有するポリヌクレオチドアレイが提供される。２つのポ リペプチドサイン配列は、Asn-Gly-Lys-Ala-Met（配列番号＿）およびArg-Arg-G ly-Ser-Phe（プロテインキナーゼＡによって認識される部位）と確認される。特 定のヌクレオチド参照配列ATTGGCAAAG CTATG（配列番号１）およびCGCCGCGGAA G TTTT（配列番号＿）は、それぞれプローブセットa〜gおよびh〜nによって規定さ れる。プログラム可能なデジタルコンピューターは、アレイ上の文字として示さ れるように、規定プローブを有する特徴部分のアレイ上の位置を同定するコード を備える。ハイブリダイゼーション情報を処理する際に、それは、規定セットに ついての特徴部分からのデータを使用する。 図５は、遺伝子のTGF-βファミリーの32メンバーの各々の４つの領域のヌクレ オチド配列を図示する。（配列番号＿〜＿）。30のヌクレオチドの第１の領域は 、RXXR（配列番号＿）切断部位の成熟領域のちようど5'の可変領域から選択され る。24ヌクレオチドの第２の領域は、成熟TGF-βポリペプチドの最初の８つのア ミノ酸をコードするヌクレオチドから選択される可変領域である。27のヌクレオ チドの第３の領域は、CXGXC（配列番号＿）配列サインをコードする領域から選 択される。18のヌクレオチドの第４の領域は、TGF-βの成熟コード領域の末端で CXC保存モチーフをコードする領域から選択される。最も右の欄は、配列が選択 されたクローンからのクローン名を示す。 図６は、TGF-βクローンhBMP-4およびhBMP-5由来のDNAの間のハイブリダイゼ ーションアッセイの結果、ならびに32のTGF-βクローンの各々のすべての99塩基 について一増分タイル方式およびトレリス(trellis)タイル方式を用いての、図 ５に記載の配列でタイル化したアレイを示す。 発明の詳細な説明 Ｉ．定義 本明細書中で使用される以下の用語は、以下の意味を有する。 用語「相補的」は、プローブ分子およびその標的の相互作用表面の、トポロジ ー適合性または整合性をいう。従って、標的およびそのプローブは、相補的とし て記載され得、さらに接触表面特性は互いに相補的である。相補性は、遺伝子コ ードにおいて、ＧはＣに相補的であり、ＡはＴまたはＵに相補的であるように塩 基相補性を含む。相補性はまた、他の形態のリガンド-レセプター（リガンド-抗 リガンドとしてもまた公知）相互作用（例えば、他の形態のレセプターと、それ らのアゴニスト、アンタゴニスト、およびそれらに結合するか、またはそれらに 対するいくらかの親和性を示す他の分子との間）を含む。 用語「プローブ」は、表面固定化ポリヌクレオチド、または特定の標的によっ て認識され得る他のポリマーを含む。文脈に依存して、用語「プローブ」は、個 々のポリヌクレオチド分子に対する、および分散した位置に表面固定化された同 じ配列のポリヌクレオチド分子の集団の両方をいう。プローブおよび標的は、し ばしば、文脈に依存して交換可能に使用され：プローブは、リガンド-抗リガン ド対の一部として標的と結合し得るか、または結合するようになり得る。本発明 のプローブおよび標的は、天然において見出されるような塩基、またはそのアナ ログを含み得る。 用語「標的」は、目的の分子をいう。プローブは、標的についての情報：標的 が所定のプローブについて親和性を有するか否かを得る際に有用である。標的は 、天然に存在するかまたは人工の核酸分子であり得る。また、それらは、それら の改変されない状態で、または他の種との凝集体として使用され得る。標的は、 共有結合的または共有結合的に、直接的または特定の結合物質を介してかのいず れ かで、結合メンバーに結合し得る。標的は、時に、当該分野において抗プローブ としていわれる。「プローブ-標的対」は、２つの巨大分子が分子認識により結 合し、複合体を形成する場合、形成される。 標的分子は、配列が標的の配列に少なくとも部分的に相補的である参照を規定 するプローブセットにハイブリダイズし得る。しかし、標的と参照配列との比較 をより容易にするために、標的あるいは逆に参照の配列、およびそれを検索する プローブは、それらの相補体として本明細書中で与えられ得る。 用語「特徴部分(feature)」は、実質的に同じ配列、表面固定化ポリヌクレオ チドプローブの集団を有する基板の領域をいう。一般に、１つの特徴部分は、異 なる特徴部分のプローブが実質的に異なるヌクレオチド配列を有する場合、別の 特徴部分とは異なる。しかし、特定の特徴部分は、例えばコドン配列の３位を照 合するために配列の混合物を有するように設計され得る。例えば、光指向ポリヌ クレオチド合成の文脈において、特徴部分は、部分的にアドレシング可能な合成 部分である。米国特許第5,384,261号；同第5,143,854号；同第5,510,270号；同 第5,593,139号；同第5,634,734号；およびWO/95/11995を参照のこと。 用語「ポリヌクレオチドアレイ」は、その表面と結合する不連続的な既知の場 所に、異なる既知の配列を有するポリヌクレオチドプローブを有する基板をいう 。ポリヌクレオチドアレイは、少なくとも２つの異なる特徴部分、および１平方 cm当たり少なくとも500の特徴部分もの密度を有する。特定の実施態様において 、アレイは、１平方cm当たり、約625、少なくとも100、少なくとも１万、少なく とも10万、少なくとも100万、または少なくとも１億もの密度を有する。基板は 、単に例として、シリコンまたはガラスであり得、そしてガラス顕微鏡スライド またはガラスカバー片の厚さを有し得る。光に対して透明である基板は、チップ 上でアッセイを実行する方法が光学的検出を含む場合、有用である。この用語は また、プローブアレイ、およびそれが結合してウェハの一部を形成する基板をい う。 「高密度ポリヌクレオチドアレイ」は、１cm²当たり少なくとも400の異なるポ リヌクレオチド配列を含む。 「スクリーニング」をすることは、特定の特性について試料を分析することを 意味する。さらなる分析に供される物質のプールを狭くするために、試料は頻繁 にスクリーニングされる。スクリーニングに利用されるアッセイは、同定を望む 特性の機能である。例えば、以下の例示的な方法のいずれかを用いてスクリーニ ングされ得る：免疫学的方法（例えば、抗体アッセイ）、開始物質が、酵素活性 または特定の細胞型と関連する活性のような生物学的特性を示すか否かを研究す るための機能的アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、化学アッセイ、NM R、質量分析、クロマトグラフィー、電子スピン共鳴、等電点分離法、電気泳動 など。有用なスクリーニングアッセイは、経時的または同時に実施されるこれら の方法の組み合わせを含む。ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、 およびウェスタンブロッティング、および種々の他の方法が使用され得ることは 、当業者に明白である。用語「プレスクリーニング」は、別の工程の前に実施す るスクリーニング工程を意味する。本明細書中で使用される用語スクリーニング またはプレスクリーニングは、時に、交換可能に使用され得る。 用語「配列」は、文脈に依存して、核酸のヌクレオチド（塩基）配列、または ポリペプチドのアミノ酸配列をいう。 用語「核酸配列サイン」は、選択されたヌクレオチド配列または参照ヌクレオ チド配列をいう。配列サインは、多くとも300、250、200、150、100、75、50、3 0、25、または多くとも15のヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含む。配 列サインは、10、15、25、30、35、45、50、60、70、80、90、100、120、135、1 50、175、200、250、および300未満のヌクレオチド長の配列を含む。配列サイン はまた、これらの変数の任意の組み合わせを含む。天然に存在する核酸配列サイ ンの非限定的な例は、例えば、Hogness BoX，TATAボックス、ホメオボックス、C AATボックス、およびAlu反復配列を含む。 用語「ポリペプチド配列サイン」は、アミノ酸配列をいう。配列サインにおけ るアミノ酸は、20の一般的なアミノ酸の群から選択され、そしてまた、より一般 的ではないアミノ酸を含む。配列サインによって規定されるすべてのアミノ酸配 列の集団は、ポリペプチド「サインセット」という。 ポリペプチド配列サインは、すべて、大多数、または少なくとも２つのアミノ 酸（一般的なアミノ酸、非一般的アミノ酸、またはそれらのアナログ）が固定さ れるアミノ酸配列を含む。配列サインは、固定性または可変性について選択され 得る。配列サインはまた、可変性の位置を占め得るアミノ酸のセットが、多くと も15、多くとも10、多くとも５、または多くとも２の20個の一般的なアミノ酸か ら選択される、アミノ酸配列を含む。他のアミノ酸（より一般的ではないアミノ 酸として、生化学の当業者に公知のものを含む）もまた含まれる。ポリペプチド 配列サインはまた、多くとも300、250、200、175、150、100、多くとも50、多く とも10、または多くとも５のアミノ酸の長さのアミノ酸配列を含む。ポリペプチ ド配列サインはまた、長さが275、225、180、140、120、100、90、800、70、50 、40、30、20、10、または５未満のアミノ酸の長さの配列を含む。ポリペプチド 配列サインはまた、これらの変数の任意の組み合わせを含む。ポリペプチド配列 サインの例は、いくつか例を挙げると、ジンクフィンガーモチーフ、および他の 構造的モチーフ（コイル、ループ、ヘリックス、ターン、ロイシンジッパー、対 称二量体特徴部分、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない ）；プロテインキナーゼＡ、βグロビン、免疫グロブリン、TGFβスーパーファ ミリー、DNA結合タンパク質、ステロイドホルモンレセプタースーパーファミリ ーなどについてのコンセンサス認識配列を含む。 用語「遺伝子」は、そのエキソンがポリペプチドをコードする特定の遺伝子座 のゲノム核酸配列をいう。 遺伝子について言及する場合、用語「領域」は、遺伝子のヌクレオチド配列内 の少なくとも15個の連続するヌクレオチドのサブ配列、または遺伝子によりコー ドされるポリペプチドのアミノ酸配列内の少なくとも５アミノ酸のサブ配列を意 味する。 用語「特有な領域」は、２つの遺伝子により共有されないサブ配列をいう。 用語「遺伝子ファミリー」は、アミノ酸配列が少なくとも20アミノ酸の比較領 域にわたって少なくとも25％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチ ドドメインをコードする遺伝子のコレクションをいう。このようなドメインは、 遺伝子重複およびその後の進化の結果として共通の祖先を通して関連がある。多 くのポリペプチドドメインが、当該分野で公知である。ポリペプチドドメインは 、２、３例を挙げると、例えば、EGFドメイン、免疫グロブリンドメイン、フィ ブロネクチンIII型ドメイン、カドヘリン様ドメイン、死エフェクタードメイン （D ED）を含む。Vaux，D.L.，Cell，第90巻，389-390頁(1997)およびその全体；Mol ecular Biology of the Cell，第３版，Albertsら，(1994)を参照のこと。タン パク質ドメインはまた、R.F．Doolittle，Annu．Rev．Biochem.，（1995）64:28 7-314より詳細に議論される。 遺伝子ファミリーは、頻繁に、少なくとも１つの高度な保存領域を共有するポ リペプチドをコードする。２つのポリペプチドが５アミノ酸の比較域にわたって 少なくとも60％の配列同一性を有する場合、またはこれらのポリペプチドが10ア ミノ酸の比較域にわたって少なくとも80％の配列同一性を共有する場合、２つの ポリペプチドは、「高度な保存領域」を共有する。 遺伝子ファミリーによりコードされるポリペプチドメンバー（タンパク質ファ ミリー）は、高度な可変領域を有し得る。遺伝子ファミリーのメンバーによりコ ードされるポリペプチドの「高度な可変領域」は、別の遺伝子ファミリーのメン バーのポリペプチドの同じ領域と50％未満の配列同一性を有する10アミノ酸の領 域である。本発明を用いて検索され得るタンパク質ファミリーは、TNFファミリ ー、BCL-2ファミリー、アクチン、熱ショックタンパク質、ケラチン、ミオシン 、プロテインキナーゼ、転写因子、チューブリン、卵殻タンパク質、αグロビン 、β様グロビン、免疫グロブリン（immunoglobin）、オボアルブミン、移植抗原 、視覚色素タンパク質、およびビテロゲニンを、制限されない例として含む。Va ux，D.L.，Cell，第90巻，389-390頁(1997)およびその全体；Molecular Biology of the Cell，第３版，Albertsら，（1994）；Avise，J.C.,Molecular Markers ，Naturnal History and Evolution，Chpman and Hall publishers(1994);Strye r，L.，Biochemistry，第３版（1988）；およびAtassi，M.Z.，Molecular Immun ology，Marcel Dekker，Inc．（1984）を参照のこと。 「偽遺伝子」は、それを含む生物にタンパク質産物を生じないゲノム領域であ る。偽遺伝子は、それらの真の遺伝子対応物に配列類似性を有する。偽遺伝子は 、偽遺伝子に含まれる変異が、転写または翻訳を妨害すること以外は、祖先遺伝 子の重複から生じ得る。Lodishら，Molecular Cell Biology，第３版，Scientif ic American，Inc.，New York，New York(1995)。本明細書中で使用される偽遺 伝子は、それらの機能的対応物を含む遺伝子およびタンパク質のファミリーのメ ン バーであり得る。 「縦列反復遺伝子」または「縦列に反復した遺伝子」は、同一またはほぼ同一 のタンパク質または機能的RNAをコードする。コピーは、個体内で変化し得るス ペーサー領域により隔てられて次々と出現し得る。Lodishら，Molecular Cell B iology，第３版，Scientific American，Inc.，New York，New York(1995)。本 明細書中に用いられる縦列反復遺伝子は、遺伝子ファミリーのメンバーのサブセ ットである。 「縦列反復」は、縦列反復遺伝子とは異なり、反復されるが必ずしもタンパク 質または機能的RNAをコードしない単純な核酸セグメントであり得る。これらも また、この用語が本明細書中で用いられる場合は、遺伝子ファミリーのサブセッ トである。 「単純配列DNA」は、主に、長い縦列反復において反復される５〜10塩基対の 配列から構成される。当業者は、単純配列DNAは、染色体の特定の領域にしばし ば濃縮されることを認識する。例えば、多量のマウス単純配列DNAが、セントロ メアの付近に位置する。従って、このような配列は、マーカーとして用いられて 特定の染色体部位を局在化し得る。Lodishら，Molecular Cell Biology，第３版 ，Scientific American，Inc.，New York，New York(1995)。 「中間反復DNA」または中程度に反復されたDNAは、種々のゲノム全体に分散さ れる：例えば、哺乳動物、drosophila、および酵母のゲノム。特定の中間反復配 列は、転移性DNAエレメントである。Lodishら，Molecular Cell Biology，第３ 版，Scientific American，Inc.，New York，New York(1995)。 「スペーサーDNA」は、機能的DNA配列を隔てること以外に現在公知の機能はな い。Lodishら，Molecular Cell Biology，第３版，Scientific American，Inc. ，New York，New York(1995)。 ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドプローブの配列が参照配列の サブ配列である場合、参照配列「から選択された」配列を有する。例えば、プロ ーブATTGGC（配列番号１の１〜６）は、参照配列ATTGGCAAAGCTATG（配列番号１ ）から選択された配列を有する。 ポリヌクレオチドプローブのセットは、ポリヌクレオチドプローブの配列が参 照配列から選択される場合に参照配列を「規定」し、そしてまとめられる場合、 ポリヌクレオチドプローブの配列は、参照配列の配列全体を含む。プローブセッ トはまた、その中にサブ配列を規定する。例えば、プローブATTGGC（配列番号３ ）およびGGCAAA（配列番号４）はまた、サブ配列TTGGCA（配列番号＿）を規定す る。 用語「タイル方式ストラテジー」は、参照配列または参照配列のセットを規定 するプローブセットを選択するために用いられる基準をいう。 「ブロックタイル方式（block tillng）」は、一般に、参照配列を規定する１ セットのプローブを含むタイル方式ストラテジーをいう。ここで、セットのうち のプローブはいずれも配列が重複しない。例えば、参照配列ATTGGCAAAG CTATG（ 配列番号１）は、ATTGG（配列番号１の１〜５）、CAAAG（配列番号１の６〜10） 、およびCTATG（配列番号１の11〜15）のセットによりブロックタイル方式され 得る。 「一増分タイル方式（Single-increment tiling）」は、セット中の各プロー ブが、末端の１ヌクレオチド以外はセット中の別のプローブと配列が重複する参 照配列を規定する１セットのプローブを含むタイル方式ストラテジーをいう。例 えば、参照配列ATTGGCAAAG CTATG（配列番号１）は、ATTGGC（配列番号１の１〜 ６）、TTGGCA（配列番号１の２〜７）、TGGCAA（配列番号１の３〜８）、GGCAAA （配列番号１の４〜９）、GCAAAG（配列番号１の５〜10）、CAAAGC（配列番号１ の６〜11）、AAAGCT（配列番号１の７〜12）、AAGCTA（配列番号１の８〜13）、 AGCTAT（配列番号１の９〜14）、およびGCTATG（配列番号１の10〜15）のセット により一増分タイル方式が行われ得る。 「二増分タイル方式」は、セット中の各プローブが、２つの連続する末端ヌク レオチド以外はセット中の別のプローブと配列が重複する参照配列を規定する１ セットのプローブを含むタイル方式ストラテジーをいう。例えば、参照配列ATTG GCAAAG CTATG（配列番号１）は、ATTGGC（配列番号１の１〜６）、TGGCAA（配列 番号１の３〜８）、GCAAAG（配列番号１の５〜10）、AAAGCT（配列番号１の７〜 12）、AGCTAT（配列番号１の９〜14）、およびCTATG（配列番号１の11〜15）の セットにより二増分タイル方式が行われ得る。 「標準タイル方式」は、参照配列のサブ配列のタイル方式ストラテジーをいう 。標準タイル方式は、以下のとおりに１セットのプローブを含む。サブ配列中の 全てのヌクレオチド位置は、可変と称される１つの位置以外は固定と称される。 セット中の１プローブは、参照サブ配列の配列を有する（かまたは相補する）。 セット中の他のプローブは、固定位置では参照サブ配列と同じヌクレオチドを有 するが、可変位置では異なるヌクレオチドを有し、そしてセット中で２つのプロ ーブが同じ配列を有することはない。従って、例えば、参照配列ATTGGCA（配列 番号１の１〜７）は、ATTGGCA（配列番号１の１〜７）、ATTaGCA（配列番号＿） 、ATTtGCA（配列番号＿）、およびATTcGCA（配列番号＿）のセットで標準タイル 方式が行われ得る。 「標準一増分タイル方式」は、一増分タイル方式ストラテジーに、一増分セッ ト中の各プローブについての標準タイル方式ストラテジーを組み合わせるタイル 方式ストラテジーをいう。例えば、参照配列ATTGGCAAA（配列番号１の１〜９） は、標準一増分ストラテジーで以下のプローブセットを用いてタイル方式が行わ れ得る： 参照配列についての標準一増分タイル方式を含むアレイ由来のハイブリダイゼ ーションデータは塩基呼び出し（標的における塩基が、参照配列における塩基と 異なることの決定、およびその異なる塩基の同定）に有用である。 タイル方式ストラテジーは、プローブを、アレイ上の特徴部分と隣接して配置 することにより実施され得る。例えば、一増分タイル方式における配列を規定す るプローブは、アレイ上の特徴部分と隣接して平行な列に配置され得；そして一 増分セット中のプローブの各々についての標準タイル方式のプローブセットは、 参照配列の下に縦の列に配置され得る。 しかし、プログラム可能なデジタルコンピューターの力により、タイル方式を カスタマイズする必要性を低減または排除し得る。例えば、プローブアレイは、 全ての可能なポリヌクレオチド９マーを規定するプローブを含み得る。コンピュ ーターは、そのメモリーに、任意の所定の９マー配列を有するプローブを含む特 徴部分の位置を保有し得る。次いで、参照配列を頼りにして、コンピューターは 、例えば、参照配列についての一増分タイル方式セットを構成する全てのプロー ブの位置を同定し得る。同様に、コンピューターは、参照配列を規定するプロー ブの各々についての標準タイル方式セットを構成する全てのプローブの位置を同 定し得る。次いで、ハイブリダイゼーションデータの処理において、コンピュー ターは、標的とプローブとの間のハイブリダイゼーションを、一増分標準タイル 方式セットを規定する特徴部分の位置の各々で調べるようにプログラミングされ 得る。 用語「縮重セット」は、特定のポリペプチド配列サインをコードする全てのヌ クレオチド配列のセットをいう。 用語「高度な識別ハイブリダイゼーション条件」は、１塩基ミスマッチが決定 され得るハイブリダイゼーション条件をいう。 本発明の実施に有用なストリンジェンシー条件は、Sambrookら，Molecular Cl oning:A Laboratory Manual，第２版（1989）に記載される。 「塩基呼び出し」は、標的分子のヌクレオチド配列を、参照ヌクレオチド配列 と比較する工程、および標的分子中のヌクレオチドが、参照配列中のヌクレオチ ドとは異なる位置を同定する工程を含むプロセスをいう。「ID塩基呼び出し」と は、参照配列の同じ位置のヌクレオチドとは異なる、標的分子中のヌクレオチド の正体を決定する工程をさらに含む塩基呼び出しのプロセスをいう。 標的核酸配列は、公知の遺伝子座から由来することが同定されていない場合、 「遺伝子起源未知」の配列である。 II．説明 核酸アレイは、参照核酸配列と標的核酸配列との間の一ヌクレオチド相違を検 索するために用いられている。対照的に、本発明は、アレイベース分析の階層方 法を含む。この方法において、１ヌクレオチド塩基決定は、１工程であってもよ いし、そうでなくともよい。例えば、本発明は、第１工程（または一連の工程） として、標的核酸が配列サインを含むか否かの決定を提供する。配列サインは、 例えば、１セットの反復配列、遺伝子ファミリーメンバー間での保存領域、また は目的のものである他の複数のヌクレオチドグループ分けを含み得る。可能な結 果は、標的が、その全体として正確な配列サインを含むこと、その全体として配 列サインを欠くこと、または配列サインの１つ以上の改変物を含むことである。 これらの結果は、種々の目的に用いられ得る：目的の核酸の分類系を配列サイン に基づいて構成するため、存在する分類系の公知のグループ分けに核酸を割り当 てるため、任意のさらなる分析が所望されることを決定するため、核酸試料の全 てまたは位置を保持するか廃棄するか、および特別な保存または処分方法が必要 とされるか否かを判断するため。 当業者は、このような結果が患者の診断に疾患の同定において特に関連するこ とを理解する。例えば、可能な病原体または病原体のセットに存在する配列サイ ンが、診断を限定する最初の工程として患者の体液または組織から得られた核酸 中に存在するか否かを最初に決定し得る。例えば、ミコバクテリアの配列サイン が存在するか否かかを決定し得る。PCT出願番号PCT/US92/02102（1997年８月14 日の公開、公開番号WO97/29212を参照のこと。PCT/US92/02102に教示される方法 を使用して、例えば、配列サインに基づいて、種々のミコバクテリア種の存在を 同定し得る。本発明の階層的方法を使用して、ミコバクテリアが存在しなければ 、別の疑わしい病原体の存在が調べられる。 プロセスは、標的核酸の配列に関する所望のレベルの詳細が得られるまで、 種々のセットの配列サインを有する種々のアレイを利用して繰り返され得る。あ るいは、この多段階プロセスは、複数の配列サインに指向するプローブを有する １つのアレイ上での単一の実験において行われ得る。本明細書中に開示される方 法はまた、連続様式または平行様式で１つ以上のアレイを使用して用いられ得る 。 本発明は、決定した最初の判定または所望のレベルの情報が判定されるまでの さらなる判定の結果に依存する。本発明はまた、二進法の様式または三進法の様 式で配列サインおよびそれらの改変の存在または非存在についてプローブする方 法を提供する。二進法分析は、特異的配列サインが同定されるか否かを尋ねる； 二進法の判定は、肯定／否定判定である。三進法分析は、特異的配列サインが存 在するか、存在しないか、またはその配列サインの改変が存在するか否かを尋ね る；三進法判定は、肯定／否定／改変判定である。四進法分析もまた変異が存在 しないか否かなどを尋ね得ることが理解され得る。本発明によって意図される階 層はポリマーアレイへの標的の結合に基づく最初の判定、続いて少なくとも１つ の目的の他のアレイベースの判定を含む。 目的が新規な遺伝子発見である二進法分析および三進法分析において、しばし ば、最も有用な情報は、特定の配列を含まない（二進法分析および三進法分析の 両方において否定）それらの試料および特定の配列の改変を含む（三進法分析に において改変）それらに含まれる。遺伝子発見を行う場合、既に同定された配列 を含む（二進法分析または三進法分析において肯定）それらについて核酸を予め スクリーニングすることは大きな利点である。例えば、公知の配列サインを含む 全ての試料を捨て、その配列サインを含まないそれらの核酸のみにさらなる研究 の焦点を合わせられ得る。新しい遺伝子を探索する場合、本発明のこの実施態様 を使用して、分析のための試料のプールを限定することによって、多くの時間、 労働力、および金銭が省かれる。 本発明の実施の例は、試料のセットが遺伝子ファミリーのメンバーである核酸 を含むか否かを決定する工程を含む。最初の工程または工程の最初のシリーズと して、それらの試料中に含まれる核酸と目的の遺伝子ファミリーと関連する保存 領域の少なくとも１部をコードするDNAのいずれかの鎖の配列を検索するアレイ されたプローブとの間のハイブリダイゼーションのレベルを決定し得る。次いで 、 試料は、結果に従って、分割される。例示の目的のために、３つの患者試料のセ ットの例を想定して、それらの試料由来の核酸は、プローブされた保存配列の全 体部分の存在、プローブされた保存配列の全体の部分の非存在、およびプローブ された保存配列の部分少なくとも１つの改変を示した。患者の試料および／また はそれら由来の核酸は分離されるか、または新しいセット（１、２、および３） 中へ、然るべく、分類される。分離されたセットの１つ以上に関してより高いの レベルの詳細が所望される場合、さらなる分析が行われる。さらなる分析は、３ （この場合）セットの各々について異なり得る。 セット１のさらなる問い合わせは、最初の工程（単数または複数）において検 索されなかった保存配列の任意の残りの部分を探索する工程を含み得る。このよ うなさらなる問い合わせの結果に基づいて、セットは、３つのサブセット：Ａ、 Ｂ、およびＣにさらに分割され得る。それらのサブセットは他の保存配列または それらの改変の存在を決定するために分析され得る。サブセットは、例えば、３ つのサブーサブセットにさらに分割される。サブーサブセットは別の配列サイン の存在などについて分析され得る。 このような問い合わせは、遺伝子ファミリーの新たなメンバーを同定するため に特に有用である。例えば、遺伝子ファミリーのメンバーとしてそれらの核酸を ともに同定する配列サインを含む核酸を含む任意の試料またはセットは、既知の 遺伝子ファミリーメンバーの非保存領域を照合するプローブを含むアレイを使用 してさらにスクリーニングされ得る。アレイは、新しいファミリーメンバーの新 規な配列が得られるように、単一ヌクレオチドレベルの配列差異の同定を可能に するようにタイル化され得る。 本方法がまたポリマーの大規模製造を含む産業にも有利であることもまた理解 される。生物工学の分野において、例えば、大規模組換えタンパク質合成は、組 換え産生されたポリペプチドの混合物を生じ得る。特定の場合において、例えば 、E．coliは、特定の発酵条件下で、全てではないがいくつかのポリペプチド産 物中へいわゆる「好ましい（friendly）」コドンを挿入し得る。最初の工程また は決定樹における工程のシリーズとして配列サイン改変の存在について組換えタ ンパク質を試験し得る。その決定樹は、変異を含まないロットから変異を含むロ ッ トの分離を含み得る。変異ロットは捨てられ得るか、または所望のレベルの詳細 までさらに分析され得る。 本発明は、本明細書に教示される任意の方法の少なくとも１つの工程における アレイ、好ましくは高密度アレイの使用を含む。他の工程は、当業者に公知の技 術を使用して行われ得る。他の工程は、当業者に公知の技術を使用して行われ得 る。さらに、本適用は、核酸アレイおよび核酸分析に関して発明を頻繁に検討す る。他の物質の分析および他のポリマーアレイ（限定を伴うことなく、ポリペプ チドおよびポリサッカライドアレイを含む）の使用が、本発明によって意図され る。本明細書中で教示される分析の階層は、いくつかの利点を与える。１つのこ のような利点は、任意のさらなる分析が所望されればどうするかを決定するため に、例えば、配列データの小さなセグメント−全長配列の代わりにサインまたは サインのセットの配列−を考察することによって与えられる。この階層的アプロ ーチを利用することによって、時間、労働力、費用、および分析のための試料の 取扱いおよび操作に関与する物質の量が低減され得る。 本発明はこの新規な分析の階層を提供するだけではなく、それは、以前に特徴 づけらられなかった分子の発見のために、最も有用な情報が、含まないことを示 されたか、以前に特徴づけられた配列サインまたはそれらの一部を含む可能性を 低減させるスクリーニング工程の後分離されたそれらの試料の分析から得られ得 ることをさらに教示する。例えば、遺伝子ファミリーの保存領域由来の配列サイ ンを含むが、その遺伝子ファミリーの異なるメンバーを特徴づける特有の配列サ インを含まない試料は、その遺伝子ファミリーの新規なメンバーを含む可能性が 高い。このような場合において、その試料のさらなる分析が特に望ましい。例え ば、このような場合および分析の階層におけるその工程において、推定遺伝子フ ァミリーの特異の領域または他のメンバーとは異なる領域の全長配列またはその 領域の少なくとも一部の決定は適切である。単一ヌクレオチドレベルでの全長配 列の決定の前にまたは同時に、フットプリントまたはバーコードハイブリダイゼ ーションパターンが得られ得る。WO97/29212および1995年10月20日に出願され、 1996年６月19日にEP0717113A2として公開されたEP出願第95307476.2号を参照の こと。少なくとも特定の状況において、単一のヌクレオチド決定が、フットプリ ントまたは他のハイブリダイゼーションパターンから推測され得ると理解される 。 本発明の階層的方法は、遺伝子ファミリーメンバーの同定；新しい遺伝子ファ ミリーメンバーまたは他の分子の発見；ゲノム（ヒトまたはそれ以外）の特定の 領域から由来するかまたは含む核酸フラグメントの同定；潜在的に有害な物質（ 限定を伴わないが、プリオン、レトロウイルスのような核酸物質を含む物質を含 む）の取扱いまたは処分：種々の生物災害分類中への物質の分離；疫学的特徴づ けおよび分析；組換えでまたは酵素的に作製された生物学的物質（例えば、核酸 （限定を伴わないが、アンチセンス因子、リボザイム、プロモーター配列、制御 配列、制限部位配列、キャップ化配列、テイル化配列、分枝配列、メチル化配列 、ベクター配列、ペプチド核酸を含むアナログ、および他の配列または変種を含 む）、タンパク質またはペプチド（限定を伴わないが、インスリン、増殖因子、 抗体、エンドルフィン、エンケファリン、およびタンパク質アナログもしくはペ プチドアナログ）、全ての形態の炭水化物またはそれらのアナログ、プロテオグ リカン、および繊維状物質（限定を伴わないが、フィブリン、アクチン、ミオシ ン、トロポミオシン、トロポニン、およびメロミオシンを含む物質）；製造され た生物物質、天然のポリマーもしくは合成ポリマー、または他の化学物質につい ての品質管理および保証；クローンプールなどの限定において特に有用である。 本明細書中で議論される方法の全ては、目的の遺伝子配列とRNAレベルを相関 づけること、発現パターンの同定および使用、ならびに特定の発現プロフィール のサブセットの階層的様式または選択（これは、実験的設計によるを含む）での 発現パターン情報を限定することを含み得る。例えば、特定の代謝経路に関与す る酵素の配列サインを探索し得る。１つ以上の配列サインが失われている場合、 第２のアッセイが、第１のアッセイにおいてスクリーニングされた酵素欠損から 生じる生体生成物の過剰な蓄積を代謝し得るか、または代謝すると考えられる他 の酵素の配列サインに向かい得る。 Ａ．スクリーニング方法 １．配列サインの分析 一つの局面において、本発明は、配列サインの存在について核酸分子を分析す ることを含む方法を提供する。このような分析は、配列サインを規定するプロー ブのセットを含むポリヌクレオチドアレイを用いて開始する工程；標的とアレイ との間でハイブリダイゼーションアッセイを行うことによってハイブリダイゼー ションデータを作製し、そしてアレイにおける標的とプローブとの間のハイブリ ダイゼーションを検出する工程、およびハイブリダイゼーションデータを処理し 、標的が配列サインを有するか否かを決定する工程を包含する。 ポリヌクレオチドアレイに必要とされるプローブは、分析されるべき配列サイ ンに依存する。配列サインは、例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列で あり得る。配列サインは、例えば、ポリペプチドドメインを規定し得る。配列サ インは、固定された配列、または特定の位置が固定されていないコンセンサス配 列であり得る。例えば、プロテインキナーゼＡについてのコンセンサス認識配列 ：RRX(S/T)Z（ここでＸは任意のアミノ酸であり、そしてＺはバリン、ロイシン 、またはイソロイシンから選択される疎水性アミノ酸である）（配列番号３）を 考慮する。このアミノ酸配列についてのサインセットは１×１×20×２×３、す なわち240の異なるアミノ酸配列を含む。このサインセットをコードするヌクレ オチド配列の数は、各位置で可能性のあるアミノ酸をコードするコドンの数の産 物に等しい。この場合において、サインセットにおける全てのアミノ酸配列につ いての完全な縮重セットは、６×６×61×（６＋４）×（４＋６＋３）＝285,48 0の異なる参照ヌクレオチド配列を含む。対照的に、単一の認識配列RRGSV（配列 番号＿）をコードする可能な全てのヌクレオチド配列の縮重セットは、６×６× ４×６×４＝3456の配列である。特定の配列サインの認識のために、例えば、全 ての可能な８マーの一般的なアレイが、特に有用であり得る。1997年１月22日に 出願された、PCT出願第97US/01603号、PCT公開第WO97/17317号を参照のこと。 １つの実施態様では、アミノ酸サイン配列における全ての可能なアミノ酸をコ ードするヌクレオチド配列の完全な縮重セットを規定するプローブセットを含む ポリヌクレオチドアレイが選択される。しかし、代替アプローチは、着手する分 析の特定の種類に依存して、可能である。例えば、ポリペプチドサイン配列セッ トにおけるアミノ酸配列のサブセットのみを分析することを望み得る。この場合 、そのプローブセットがそれらのアミノ酸配列をのみをコードする縮重セットを 規 定するポリペプチドアレイを選択し得る。あるいは、ポリペプチドサインセット におけるアミノ酸の全てまたはいくつかをコードする選択されたコドンを有する 標的について分析することを望み得る。この場合、いずれの特定のアミノ酸配列 についても縮重セット未満（例えば、ポリペプチド配列サインをコードする配列 の縮重セットの少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％、または少な くとも95％）を規定するプローブセットを有するポリヌクレオチドアレイを選択 し得る。（図２を参照のこと。）２つのアプローチの組み合わせもまた可能であ る。有用なプローブセットはまた、一般的な塩基（例えば、イノシンまたは配列 において第三のコドン位置の等価な位置でのＡ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵの混合物） を含み得る。 次いで、標的核酸配列をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドプ ローブと接触させるハイブリダイゼーション反応を実施し得る。標的核酸分子が 非常に長い場合、必要に応じて標的をフラグメントに切断し、アレイをフラグメ ントと接触させ得る。通常、標的またはそれらのフラグメントを、それらがハイ ブリダイズした位置が決定され得るように検出可能に標識化する。 ハイブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイゼーションは、選択さ れたプローブと標的との間で検出され、ハイブリダイゼーションデータを作成す る。このデータは、通常、特定の特徴部分での標識とプローブとの間の、検出可 能なシグナルの強度（例えば、蛍光）により決定されるように、ハイブリダイゼ ーションの量を反映する。所望のように、高度、中間、または低い識別ハイブリ ダイゼーション条件を使用し得る。 次いで、ハイブリダイゼーションデータを、好ましくは、プログラム可能なデ ジタルコンピューターによってプロセシングし、標的が任意のプローブセットに より規定されたヌクレオチド参照配列を含むか否かを決定する。ハイブリダイゼ ーション情報のプロセシングは、標的核酸分子とセット中の各プローブとの間の ハイブリダイゼーションの忠実度を決定する工程を含み、これにより、セット中 のプローブの全てに対して高い忠実度を有するハイブリダイゼーションは、標的 核酸分子が配列サインを有することを示し、そしてセット中のプローブのサブセ ットに対して高い忠実度を有するハイブリダイゼーションは、標的核酸分子が配 列サインの一部を有することを示す。 例えば、標的ポリヌクレオチドがアミノ酸配列RRGSV（配列番号＿）をコード するか否かを決定することを望んだと仮定する。上述のように、3456ヌクレオチ ド配列がこのアミノ酸配列をコードする。RRGSV（配列番号＿）をコードするヌ クレオチド配列の縮重セットを規定する一増分タイル方式ストラテジーを用いて プローブセットを含むアレイが選択され得る。さらに、標的核酸が配列CGACGAGG GTCTGTC（配列番号 ）（これは、RRGSV（配列番号＿）をコードする）を有する と仮定する。高度な識別ハイブリダイゼーション条件下では、この標的配列は、 アスタリスクにより示されるような一増分プローブセットにハイブリダイズする ： 標的と上記各プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することにより、 標的分子が参照配列の配列を有することを決定し得る。また、配列サインを同定 するためのハイブリダイゼーションパターンを決定し得る。 RRGSV（配列番号＿）をコードする全ての縮重配列を規定するプローブセット を含むアレイはまた、CGCCGAGGGTCCGGG（配列番号＿）を規定するプローブセッ トを含む。これは、アスタリスクにより示されるような標的分子にハイブリダイ ズする： 従って、標的とこのプローブセットとの間のハイブリダイゼーションを検出す る際に、標的は、この完全な参照配列を有さないか、またはそれが配列RSをコー ドするが、配列サインに関連することを決定し得る。 標的は、参照ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズし得るが、これは特定 のコドンを表す位置でハイブリダイズしないこともあり得る。この場合、標的は 、ポリペプチド配列サインをコードしないが、可変アミノ酸位置の結果として元 の配列とは異なる関連の配列サインをコードし得る。アレイが、このような可変 位置を含む配列サインを定義するプローブを含む場合、コンピューターシステム は、これらの他の配列サインを規定するプローブセットからのハイブリダイゼー ションデータをプロセシングして、標的がこれらの１つをコードするか否かを決 定し得る。標的が配列サインを規定するプローブにハイブリダイズし得ない場合 、標的はこの配列サインをコードしない。 アレイは、ポリペプチド配列サインをコードするヌクレオチド配列の縮重セッ トを規定するプローブを含む必要はない。ヌクレオチド配列に対する縮重セット の代替として、一般的な塩基（例えば、イノシンまたは配列において第三のコド ン位置に相当する位置でのＡ、Ｃ、Ｔ、ＧおよびＵの混合物）を提供し得る。さ らに、参照配列サインの存在、不在、または変動を決定するために、フットプリ ント、分子バーコード化、または他のハイブリダイゼーションパターンを使用し 得る。 本方法の別の実施態様では、アレイは、参照配列の標準的なタイル方式につい て選択されたプローブセットをさらに含む。例えば、変異の結果として、標的核 酸が配列CGA CGA tGG TCT GTC（配列番号＿）（これは、RRWSV（配列番号＿）を コードする）を有すると仮定する。参照配列全体が標準タイル化されたプローブ セットは、以下のように、標的にハイブリダイズするプローブセットを含み得る ：この情報から、標的がサイン配列をコードしないが、以下の配列を有することを 決定し得る： ソフトウェア（例えば、Affymatrix，Inc．(Santa Clara，CA，USA)製のGeneられ得る。国際公開第WO 97/28212、欧州特許出願公開第EP 07171l3A2号（欧州 特許出願第95307476.2号）もまた参照のこと。 ２．遺伝子ファミリーのメンバーについてのスクリーニング 別の局面では、本発明は、標的核酸分子が遺伝子ファミリーのメンバーをコー ドするか否かを決定するための方法を提供する。本方法は、標的分子がファミリ ーの既知のメンバーであるか、または新規な未だ知られていないメンバーである か否かを決定するために有用である。このスクリーニングタイプについてアレイ を選択することにおいて、いくつかのパラメーターが変化し得る。 １つのパラメーターは、その配列がアレイ上で用いられている遺伝子ファミリ ーメンバーの数である。ファミリーの少なくとも１つ以上、好ましくは少なくと も２つのメンバーからの配列を規定するプローブセットが、アレイ上で用いられ る。しかし、新規なファミリーメンバーの同定については、好ましくは、ファミ リーの全ての既知のメンバー由来の配列を規定するプローブセットを含むアレイ を作製する。 変化され得る別のパラメーターは、アレイ上でプローブセットにより規定され る遺伝子ファミリーの各メンバーからの配列サインの数である。遺伝子ファミリ ーの既知のメンバーのアミノ酸およびヌクレオチド配列の比較は、高度な保存領 域および高度な可変領域の両方を明らかにする。保存領域は、メンバー間でより 高い同一性を共有するので、標的がファミリーのメンバーをコードするか否かを 決定するため、により有用である。可変領域は、それらが最も異なるので、ファ ミリーのメンバー間を識別するため、および標的がファミリーの新規なメンバー をコードするか否かを示すために、より有用である。従って、ファミリーのメン バーをスクリーニングするために用いられるアレイは、遺伝子ファミリーの各メ ンバー由来の少なくとも１つの配列サインを規定するプローブセットを含む。 変化され得る別のパラメーターは、第二のパラメーターに関連し、プローブセ ットが選択される１つ以上の遺伝子ファミリーメンバー由来のアミノ酸サイン配 列をコードする縮重セット内のヌクレオチド配列の数である。例えば、遺伝子フ ァミリーのメンバー由来の核酸サイン配列は、それが遺伝子のコード領域内にあ る場合、アミノ酸配列をコードする。参照ヌクレオチド配列だけでなく、参照ヌ クレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードする縮重セットのメンバーも規定す るプローブセットが選択され得る。このようなプローブセットは、任意の遺伝子 ファミリーメンバーの多型およびファミリーの新規なメンバーを同定することに おいて有用である。特定のコドン位置（例えば、第三のコドン位置）の塩基の混 合物を有する一般的な塩基およびプローブもまた、用いられ得る。 別のパラメーターは、配列サインの長さである。特にサイズに制限はないが、 一般に、配列サインは、好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長である。約４つ のサインの間にわたる合計75〜125ヌクレオチドの配列サインのコレクションは 、特に有用である。 任意の核酸分子は、この方法において標的分子として使用され得る。しかし、 しばしば、標的は、標的が遺伝子ファミリーのメンバーであり得ると考える理由 が存在するように、本発明の教示に従って予めスクリーニングされた分子である 。例えば、遺伝子ファミリーの１つ以上のメンバーから選択された配列を有する プローブ（縮重セット、一般の塩基、および特定の位置でのヌクレオチドの混合 物を含み得る）でDNAライブラリーをスクリーニングし得る。使用されるハイブ リダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブは、より密接 に、またはより隔絶してそのプローブに関連する配列にハイブリダイズし得る。 従って、標的配列は、選択されたセットのハイブリダイゼーション条件下で、参 照配 列を有するプローブにハイブリダイズする配列であり得る。 アレイ上での標的とプローブとの間のハイブリダイゼーション反応から生成さ れたハイブリダイゼーションデータは、そのデータが、遺伝子ファミリーのメン バーである標的核酸と一致するか否かを決定するためにプロセッシングされる。 これは、例えば、遺伝子の保存された領域についての少なくとも１つの配列サイ ンにわたって標的配列を塩基呼び出しすること、またはその配列サインに予想さ れる全体のパターンが存在するか否か決定することを含み得る。 ハイブリダイゼーションデータは、遺伝子ファミリーの公知のメンバーの配列 と同一である標的分子が配列を有することを示し得る。しかし、ハイブリダイゼ ーションデータが、標的配列と参照配列との間に差異があることを示す場合、差 異の程度は、標的配列の同一性についてのさらなる情報を提供する。 例えば、差異が十分少ないのであれば、その位置および同一性は、特定の実施 態様において、例えば、一増分標準タイル方式を使用するアレイを使用して、ID 塩基呼び出しによって決定され得る。この場合、情報は、公知の遺伝子ファミリ ーメンバー（おそらく、その遺伝子の対立遺伝子形態を含む）の１つである標的 と一致する。 標的とプローブセットとの間に有意な差異が存在する場合、ハイブリダイゼー ションは、異なる領域において一般に非常に弱い。この場合、標的は、ファミリ ーの以前に公知のメンバーではない挿入物を含むとして同定される。次いで、実 施者は、クローンが、実際にファミリーのメンバーであるか否か、そしてもしそ うならば、いかに他のメンバーと異なるかを決定するために、配列決定するに値 するか否かを決定し得る。 ３．遺伝子配列についてのスクリーニング ヒトおよび他のゲノムの全ての遺伝子が同定され、そして配列決定される世界 に我々が移行するにつれ、多くの核酸分析の焦点は、特定の試料中にどの遺伝子 が存在するかの同定である。このような同定は、本発明の階層的な方法において 特に有用である。従って、本発明はまた、標的核酸分子が、遺伝子の任意のセッ トからのヌクレオチド配列を有するか否かを決定する方法を提供する。方法は、 遺伝子のセットからの配列サインを規定するプローブセットを有するアレイを提 供する工程を包含する。ハイブリダイゼーションデータは、アレイ上の標的とプ ローブとの間のハイブリダイゼーション反応から回収される。データは、標的が 、セットのなかの遺伝子の１つからの配列サインを含むか否かを決定するために 分析される。 ハイブリダイゼーションデータは、以下の様式でプロセスされ得る。各配列サ インおよび標的を規定するプローブ間のハイブリダイゼーションの程度が決定さ れ得る。標的が、配列サインの１つに密接に関連する配列を有する場合、その遺 伝子の配列サインを規定する標的とプローブセットとの間のハイブリダイゼーシ ョンの程度は、アレイにおいて規定される他の配列サインとのハイブリダイゼー ションシグナルに比較して強力である。これは、標的における配列サインの同定 を補助する。核酸アレイからのハイブリダイゼーションデータを分析するために コンピューター化された方法は、WO97/29212;EP公開第95307476.2によって教示 される。 好ましくは、配列サインは、セットの中の遺伝子に特有である。約20ヌクレオ チドの配列サインは、ほとんどの場合、遺伝子を特有に同定するのに十分である 。サイン配列は、遺伝子の転写された領域またはコード領域由来であり得る。こ のようなアレイは、例えば、標的cDNA分子、ゲノムクローンの改変体の同一性を 決定するために有用である。 配列サインの各々における、各ヌクレオチドについて、一増分標準タイル方式 系でプローブセットとともにアレイを提供することによって、標的配列について のさらなる情報を得ることができる。この場合において、標的が、配列サインと 完全に整合しない場合、２つの配列間の差異が、塩基呼び出しによって決定され 得る。あるいは、ハイブリダイゼーションパターンの認識が利用される。 Ｂ．ハイブリダイゼーションアッセイの実施 基板結合ポリヌクレオチドアレイにおけるハイブリダイセーションアッセイは 、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を包含する。ハイブリダイゼーシ ョン工程において、標的、および好ましくは、ハイブリダイゼーション最適化薬 剤 （例えば、イソ安定化（isostabilizing）薬剤）、変性剤、または再生促進剤） を含むハイブリダイゼーション混合物は、アレイのプローブと接触され、そして 標的と任意の相補プローブとの間のハイブリダイゼーションを可能にするに適切 な温度および時間でインキュベートされる。次いで、通常、未結合標的分子は、 ハイブリダイゼーション緩衝液のような標的を含まない洗浄混合物で洗浄するこ とによってアレイから除去される。これにより、結合した分子のみが残る。検出 工程において、標的がハイブリダイズしたプローブは、同定される。各特徴部分 のプローブのヌクレオチド配列が公知であるので、標的が結合した位置を同定す ることは、これらのプローブの特定の配列についての情報を提供する。 ハイブリダイゼーション混合物は、適切な溶液（すなわち、ハイブリダイゼー ション緩衝液）中に、標的核酸分子およびハイブリダイゼーション最適化薬剤を 含む。標的核酸分子は、約0.005nMと約50nMとの間、好ましくは約0.5nMと５nMと の間、またはより好ましくは約１nMと２nMとの間の濃度で混合物中に存在する。 標的核酸分子は、好ましくは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含む。 ベタインおよび低級テトラアルキルアンモニウム塩は、イソ安定化薬剤の例で ある。変性薬剤は、二本鎖核酸中の塩基間の水素結合を妨害すること、または核 酸分子の水和によって、二重標準核酸分子の融点を低下させる組成物である。変 性薬剤には、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、DMSO（「ジメチルスルホキシド 」、テトラエチルアセテート、尿素、GuSCN、グリセロール、およびカオトロピ ック塩が含まれる。ハィブリダイゼーション促進剤には、異種の核リボヌクレオ タンパク質（「hnRP」）A1、ならびにカチオン性界面活性剤（例えば、好ましく はCTAB（「セチルトリメチルアンモニウムブロミド」）およびDTAB（「ドデシル トリメチルアンモニウムブロミド」））、そしてまたポリリジン、スペルミン、 スペルミジン、一本鎖結合タンパク質（「SSB」）、ファージT4遺伝子32タンパ ク質、および酢酸アンモニウムとエタノールの混合物が含まれる。 ハイブリダイゼーション混合物は、アレイと接触して置かれ、そしてインキュ ベートされる。接触は、任意の適切な容器（例えば、ディッシュ、またはアレイ を保持して、液体のセルへの導入およびセルからの除去を可能にして、アレイに 接触するように特別に設計されたセル）中で起こり得る。一般には、インキュベ ーションは、核酸のハイブリダイゼーションのために通常使用される温度（例え ば、約20℃と約75℃との間、例えば、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃ 、約50℃、約55℃、約60℃、または約65℃）でである。約14ヌクレオチドより長 いプローブについては、20℃〜50℃が好ましい。より短いプローブについては、 より低い温度が好ましい。標的は、アレイ中で標的と任意の相補プローブとの間 の所望のレベルのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な時間、プロー ブアレイとインキュベートされる。25℃のハイブリダイゼーション温度を使用し て、通常少なくとも30分間から２時間で、非常に明確なシグナルを生じ得る。し かし、より長く（すなわち、約15時間）ハイブリダイズすることが望ましくあり 得る。 ハイブリダイゼーション混合物とのインキュベーションの後、アレイは、通常 、ハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄される。ハイブリダイゼーション緩衝液 はまた、ハイブリダイゼーション最適化薬剤を含み得る。これらの薬剤は、ハイ ブリダイゼーション工程についてと同じ範囲の量で含められ得る。または、これ らは、すべて排除され得る。次いで、アレイは、標的がハイブリダイズしたプロ ーブを同定するために試験され得る。 Ｃ．標的試料の調製 配列が決定されるべき標的ポリヌクレオチドは、クローン、cDNA、ゲノムDNA 、RNA、培養された細胞、または組織試料から単離され得る。標的がゲノムであ る場合、試料は、任意の組織（赤血球のみ除く）由来であり得る。例えば、全血 、末梢血リンパ球すなわちPBMC、皮膚、髪、または精液は、臨床試料の便利な供 給源である。これらの供給源はまた、標的がRNAである場合には、適切である。 血液および他の体液はまた、ウイルス核酸を単離するための便利な供給源である 。標的がmRNAである場合、試料は、mRNAが発現される組織から得られる。試料中 のポリヌクレオチドがRNAである場合、通常、DNAに逆転写される。逆転写から生 じるDNA試料またはcDNAは、通常、例えば、PCRによって増幅される。プライマー および増幅酵素の選択に依存して、増幅産物は、RNAまたはDNAであり得る。対合 したプライマーは、目的の標的ポリヌクレオチドのボーダーに隣接するように選 択される。１つより多くの標的が、多数の対合したプライマーが使用される多重 PC Rによって同時に増幅され得る。標的が長いポリヌクレオチドである場合、ハイ ブリダイゼーション反応を行う前に、標的をより小さな小片にフラグメント化す ることは適切であり得る。本明細書中で使用される場合、アレイ上での標的とプ ローブとの間のハイブリダイゼーションの検出には、標的の全てまたは一部との ハイブリダイゼーション反応を行うことが含まれる。 標的は、増幅の間または後に、一つ以上のヌクレオチドで標識され得る。いく つかの標的ポリヌクレオチド（試料のサイズに依存して）(例えば、エピソームD NA)について、増幅工程を不要にするのに十分なDNAが組織中に存在する。好まし い標識は、とりわけ蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および熱量測定標 識を含む。最も好ましくは、標識は、フルオレセイン、ローダミン、ポリメチン （polumethine）色素誘導体、リン光などのような蛍光標識である。商業的に利 用可能な蛍光色素には、とりわけ、Fluoreprime(Pharmacia，Piscataway，NJ)、 Fluoredite（Millipore，Bedford，MA）、およびFAM（ABI，Forster City，CA） のようなフルオレセインホスホルアミダイトを含む。 有用な光散乱標識には、大きなコロイド、特に金属コロイド（例えば、金、セ レン、銀、スズ、および酸化チタニウム）が含まれる。 放射性標識には、例えば、³²Pが含まれる。この標識は、ホスホイメージャー （phosphoimager）によって検出され得る。検出は、もちろん、イメージャーの 解像度に依存する。50ミクロンの解像度を有するホスホイメージャーが利用可能 である。従って、この標識は、現在、少なくともそのサイズの特徴部分を有する チップとともに有用である。 １つの実施態様において、ビオチン化塩基は、標的核酸に組み込まれる。ハイ ブリダイゼーションは、ストレプトアビジン-フィコエリトリンで染色すること によって検出される。 標的鎖が、標的RNAの調製において一本鎖形態で調製される場合には、鎖のセ ンスは、もちろんチップ上のプローブのそれに相補的であるべきである。これは 、標的の任意の増幅に使用されるプライマーの適切な選択による例として達成さ れる。また、アレイは、両方の鎖のプローブを含有し得る。 標的は、好ましくは、標的における二次構造の形成を低減するか、または排除 するために、チップに適用する前にフラグメント化され、そして任意のオーバー ハング相互作用を低減する。ハイブリダイゼーションの後の標的セグメントの平 均のサイズは、通常、チップ上のプローブのサイズよりも大きい。 Ｄ．基板に結合したポリヌクレオチドアレイ 本発明のアッセイで用いられる基板に結合したポリヌクレオチドアレイは、代 表的には、１平方ｃｍあたり、約５×10²個と約10⁸個との間、または約10⁴個と 約10⁷個との間、または約10⁵個と10⁶個との間の特徴部分を含む。 好ましくは、これらのアレイは、空間定方向ポリヌクレオチド合成により生成 される。本明細書で用いられる「空間定方向ポリヌクレオチド合成」は、ポリヌ クレオチドの合成を基板上の特定の位置に向ける任意の方法をいう。空間定方向 ポリヌクレオチド合成のための方法は、限定されずに、光特異的ポリヌクレオチ ド合成、マイクロリソグラフィー、インクジエットによる付与、特定位置へのマ イクロチャンネル沈着および物理的バリアを用いた封鎖を含む。一般に、これら の方法は、通常、保護基を除去することによる活性部位生成；およびこの活性部 位へのヌクレオチド(これは、さらなるヌクレオチドカップリングが所望される 場合、これ自身、必要に応じて保護された活性部位を有する)のカップリングを 包含する。 １つの実施態様では、基板に結合したポリヌクレオチドアレイが、光特異的ポ リヌクレオチド合成により特定の位置で合成される。このパイオニア的技術の方 法は、米国特許第5,143,854号；PCT WO 92/10092;PCT WO 90/15070；および1994 年５月24日に出願された米国特許出願第08/249,188号、1990年12月６日に出願さ れた第07/624,120号、および1993年６月25日に出願された第08/082,937号に開示 されている。このプロセスの基礎的ストラテジーでは、リンカーおよび光に不安 定な保護基で修飾された固体支持体の表面を、フォトリソグラフィーマスクを通 じて照射し、照射された領域に反応性ヒドロキシル基を生じる。次いで、３'-O- ホスホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシド(光に不安定な基で５'ヒドロキ シルを保護された)を表面に存在させ、そして光に曝された部位でカップリリグ が起こる。未反応の活性部位および酸化物を必要に応じてキャッピングした後、 基板をすすぎ、そして表面を第２のマスクを通じて照射し、リンカーへのカップ リングのためにさらなるヒドロキシル基をむき出す。第２の５'保護３'-O-ホス ホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシドを表面に存在させる。選択的光脱保 護およびカップリングサイクルを所望の産物が得られるまで繰り返す。次いで、 光に不安定な基を必要に応じて除去し、そしてその後、必要に応じて配列をキャ ップする。側鎖保護基が存在すれば、それもまた除去される。フォトリソグラフ ィーが用いられるので、このプロセスは、縮小され、ポリヌクレオチドプローブ の高密度アレイを生成し得る。 この一般的プロセスは改変され得る。例えば、ヌクレオチドは、それらが、連 結化学と適合する活性化されたヒドロキシル基を有する限り、天然ヌクレオチド 、化学的に改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり得る。保 護基は、それら自身光分解性であり得る。あるいは、保護基は、例えば、酸のよ うな特定の化学的条件下で不安定であり得る。この例では、固体支持体の表面は 、光に曝されたとき酸を生成する組成物を含み得る。従って、基板の領域を光に 曝すと、その領域内に酸を生成し、曝された領域中の保護基を除去する。また、 合成法は、３'-保護５'-O-ホスホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシドを用 い得る。この場合、ポリヌクレオチドは、５'から３'の方向に合成され、これは 遊離の５'末端を生じる。 光に曝すことにより保護基を取り除くこと、曝された活性部位にヌクレオチド をカップリングすること、および必要に応じて未反応部位をキャッピングするこ とにより保護基を取り除く一般的プロセスは、本明細書では、「光特異的ヌクレ オチドカップリング」と呼ばれる。 再配列決定のような種々の課題に適合されたプローブアレイを作成するための タイル方式(Tiling)ストラテジーは、1995年８月２日に出願された米国特許出願 第08/510,521号、および1994年10月26日に出願された国際出願PCT/US94/12305に 記載されている。 所望であれば、基板に結合したポリヌクレオチドアレイは、チップリーダーに おいて使用するために適切にパッケージされ得る。１つのこのような装置は、国 際公開番号WO 95/33846に開示されている。 プローブは、ポリヌクレオチドアレイ上に、特異的に規定された位置関係で広 げられ得る。例えば、セット中のプローブは、アレイ上で隣接する特徴部分に位 置決めされ得る。しかし、ポリヌクレオチドアレイからのハイブリダイゼーショ ンデータは、通常、プログラム可能なデジタルコンピュータにより処理される。 コンピュータメモリは、アレイ上に各特徴部分で各ブローブの配列を記憶するよ うにプログラムされ得る。結果として、ポリヌクレオチドアレイを提供するか、 または所定長さのプローブのすべての可能な配列を含むポリヌクレオチドアレイ をセット得る。例えば、525×525個の、すなわち275,625個の特徴部分のチップ は、９ヌクレオチドのすべての可能なヌクレオチド配列を有するすべての９マー プローブ(４⁹＝262,144)を含み得る。任意の選択されたタイル方式ストラテジー を用いて、プログラム可能なコンピュータは、任意の所定の参照配列を規定する プローブを含む１セットの特徴部分を同定し得る。次いで、コンピュータは、参 照配列を規定するプローブセットからのハイブリダイゼーションデータを処理す るためにプログムされ得る。 Ｅ．蛍光により標識されたプローブの検出 アレイ上の検出可能な標識から生成されるシグナルの測定には、ポリヌクレオ チドアレイまたはチップリーダーを必要とする。ポリヌクレオチドアレイリーダ ーの性質は、標的分子に付着した標識の特定の型に依存する。 １つの実施態様では、チップリーダーは、ポリヌクレオチドアレイを固定化か るための本体を備える。第１の波長を有する励起源からの励起放射は、アレイの 下から励起光学系を通過する。励起光学系は、励起放射を引き起こし、基板上の ポリヌクレオチドアレイの領域を励起する。応答では、試料上の標識物質は照射 を発出し、これは、励起波長とは異なる波長を有する。収集光学系もまた、アレ イの下にあり、次いで試料からの放射を収集し、そしてそれを検出器上に造影す る。検出器は、その上に感知された照射の量に比例するシグナルを生成する。シ グナルはアセンブルされて放射が生じる複数の領域にともなう画像を表す。 １つの実施熊様によれば、走査されるべき異なる領域に配置し、そして応答さ れるべきアレイの異なる位置を可能にするために、ポリヌクレオチドアレイ複数 軸の並進ステージが、ポリヌクレオチドアレイを移動させる。結果として、ポリ ヌクレオチドの２次元画像が得られる。 ポリヌクレオチドアレイリーダーは、走査プロセスの間中、励起光の焦点平面 中に試料を維持するための自動焦点合わせ特徴部分を備え得る。さらに、温度コ ントローラー制御器を利用して、試料を、それが走査されている間特定温度に維 持し得る。複数軸並進ステージ、温度コントローラー、自動焦点あわせ特徴部分 、ならびに造影およびデーター収集に関連する電子機器は、適切にプログラム可 能なデジタルコンピュータにより管理される。 １つの実施態様では、ビームは、例えば、顕微鏡の対物レンズまたはビーム直 径を制御するための他の光学的手段を用いて、アレイの表面上で直径約２μｍの スポットに集められる。(例えば、1994年２月10日に出願された米国特許出願第0 8/195,889号を参照のこと)。 別の実施形態では、蛍光プローブが、CCD造影システムと組み合わせて利用さ れる。この方法の詳細は、1994年９月２日に出願された米国特許出願番号第08/3 01,051号に記載されている。多くの市販のマイクロプレートリーダーでは、代表 的には、光源は、アレイの上に配置され、そして光ダイオード検出器がアレイの 下にある。本発明の方法には、光源は、より高い出力のランプまたはレーザーで 置換され得る。１つの実施態様では、標準的な吸収の幾何学的構造が用いられる が、光ダイオード検出器は、CCDカメラで置換され、そして造影光学機器が、ア レイの迅速造影を可能にする。一連のラマンホログラフィー(Raman holographic )フィルターまたはノッチフィルターを、光学機器の光路に用いて、放射を検出 器に通過させながら、励起光を除去し得る。この方法の改変例では、フィルター ファイバ光学造影束を利用して、光をCCD検出器にもたらす。別の実施態様では 、レーザーは、ポリヌクレオチドアレイの下に置かれ、そして光は、ポリヌクレ オチドアレイの底部を形成する透明ウェーハーまたはベースをに向けらける。別 の実施熊様では、CCDアレイは、ポリヌクレオチドアレイのフェーハー中に構築 される。 CCDアレイの選択は、各アレイ中のポリヌクレオチドの数に依存する。矩形(50 ×50)中に名目上ならべられた2500個の特徴部分の配列特異的ポリヌクレオチド が調査され、そして各特徴部分において６ラインがサンプリングされ、良好な画 像を得、次いで、この領域では、300×300画素のCDアレイが望ましい。しかし、 個々のアレイが、48,400の特徴部分(220×220)を有する場合、そのときは、1320 ×1320画素を備えたCCDアレイが望ましい。CCD検出器は、例えば、Princeton In strumentsから市販されており、これらの要求のいずれとも合致し得る。 検出デバイスはまた、1994年９月２日に出願された米国特許出願第08/301,051 号に記載のように、ラインスキャナーを備え得る。励起光学機器は、励起光を、 試料でラインに集め、同時に、試料の細片を走査または造影する。アレイからの 表面に結合した蛍光標識は、光に反応して蛍光を発する。収集光学機器は、放射 を、光検出器の直線状アレイ上に造影する。共焦点技術を利用することにより、 実質的に、光の焦点平面からの放射のみが造影される。一旦細片が走査されたな ら、１次元画像を表すデータがコンピュータのメモリー中に記憶される。１つの 実施態様によれば、複数軸並進ステージが、デバイスを一定速度で移動させ、デ ータを連続的に統合かつ処理する。あいるは、検流計スキャナーまたは回転する 多面体鏡を用いて試料を横切る励起光を走査し得る。結果として、試料の２次元 画像が得られる。 別の実施態様では、収集光学機器は、放射を分光器に向け、分光器は、放射ス ペクトルを、光検出器の２次元アレイ上に造影する。分光器を用いることにより 、スペクトル的に完全に解像されたアレイの画像が得られる。 ポリヌクレオチドアレイに対する読みとり時間は、蛍光の光物理学(即ち、蛍 光量子収率および光分解収率)および検出器の感度に依存する。フルオレセイン については、CCD検出器でチップ画像を読むに十分なシグナル対ノイズが、Ａｒ イオンレーザーまたはランプからの3mW/cm²および488nm励起を用いて約30秒で得 られ得る。レーザー出力を増加すること、およびより低い光分解収率を有しかつ その放射がCCD検出器の感度最大により緊密に一致するCY3またはCY5のような色 素にスイッチすることにより、５秒未満で各アレイを読み取り得る。 Ｆ．データ分析 ハイブリダイゼーションアッセイにおいて生成されたデータは、プログラム可 能なデジタルコンピュータの使用で最も容易に分析される。一般に、コンピュー タプログラムは、コードを記憶する読み出し可能な媒体を含む。特定のファイル が、各特徴部分の位置およびその特徴部分におけるポリヌクレオチドプローブの 配列を含むメモリーに充てられる。分析は、しばしば参照配列に対して標的の配 列を比較することを含むので、プログラムはまた、そのメモリー中に参照配列を 含み得る。この情報を用い、次いでプログラムは、アレイ上の特徴部分のセット を同定し、そのプローブが選択されたタイル方式ストラテジーにおける参照配列 を規定し得る。コンピュータはまた、ポリヌクレオチドアレイにおいて、標的核 酸分子とポリヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーション反応からの 入力ハイブリダイゼーションデータとして受けるコードを含む。コンピュータは また、ハイブリダイゼーションデータを処理するコードを含む。コンピュータプ ログラムはまた、入力としてプログラマーからの命令を受けるコードを含み得る 。 コンピュータは、プレセンテーション用に、データを別のフォーマットに変形 し得る。データ分析は、収集されたデータから、基板位置の関数として、例えば 、蛍光強度を測定する工程、「異常値」(所定の統計的分布から逸れるデータ)を 除去する工程、および残りのデータから標的の相対的結合親和性を計算する工程 を包含し得る。得られるデータは、各領域における光放射または標的とプローブ との間の結合親和性に従って変動するその色で画像として表示され得る。 検出工程が、標識された標的ポリヌクレオチドの、アレイ中のポリヌクレオチ ドとのハイブリダイゼーションを含む場合、性能を早めるCCD造影システムとカ ップルする場合、このシステムの１つの適用は、ハイブリダイゼーションのオン またはオフ速度を調査することによりアッセイの結果を得ることである。この方 法の１つのやり方では、各アドレスにおける結合量は、標的がアレイと接触した 後いくつかの時点で測定される。総ハイブリダイゼーション量は、各時点におけ る結合量に基づく結合動力学の機能として測定され得る。従って、達成されるべ き平衡を待つ必要は必ずしもない。温度、試料撹拌、洗浄条件(例えば、pH、溶 媒特性、温度)について異なるポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーショ ン速度の依存性は、速度およびシグナル対ノイズに対する条件を最大にするため に、容易に決定され得る。別の方法が、本明細書に参考として援用される、Fodo rらによる米国特許第5,324,633号に記載されている。 速度およびシグナル対ノイズについての条件を最大化するために、異なるポリ ヌクレオチドについてのハイブリダイゼーション速度の、温度、試料撹拌、洗浄 条件（例えば、pH、溶媒特性、温度）への依存性は容易に決定され得る。 Ｇ．アッセイの機構 ポリヌクレオチドアレイでのアッセイは、一般に、選択された反応条件下で標 識試料ポリヌクレオチドアレイを接触させることを含み、必要に応じて、未反応 分子を除去するためにアレイを洗浄すること、および標的分子とプローブとの間 の反応の証拠について生物学的なアレイを分析することを含む。これらの工程は 、液体を取り扱うことを含む。これらの工程は、アレイ上での検出工程を同時に 実施するための自動液体取扱システムを用いて自動化され得る。液体取扱は、ウ ェル中の試料の均一な処置を可能にする。マイクロタイターロボット工学および 液体取扱デバイスは、例えば、Tecan AGから市販されている。 チップは、液体取扱デバイスにより操作され得る。このロボット工学デバイス をプログラムして、適切な反応条件（例えば、温度）を設定し、チップに試薬を 添加し、チップを適切な時間インキュベートし、未反応物質を除去し、チップ基 板を洗浄し、適切な反応基質を添加し、そして検出アッセイを実施する。反応条 件の詳細は、アッセイの目的（例えば、ポリヌクレオチドに対するプローブのハ イブリダイゼーションまたは標識の結合）に依存して選択される。 所望であれば、チップ読み取り機における使用のためにチップを適切に包装し 得る。１つのそのような器械は、米国特許出願08/255,682（1994年６月８日出願 ）に開示されている。 Ｈ．基板に連結したポリヌクレオチドアレイの製造 チップを作製する際に、基板およびその表面は、好ましくは、強固な支持体を 形成し、ここで試料が形成され得る。基板およびその表面はまた、適切な光吸収 の特性を提供するように選択される。例えば、基板は、官能化ガラス、Si，Ge、 GaAs、GaP、SiO₂、SiN₄、修飾シリコーン、または広範な種々のゲルまたはポ リマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフル オリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組合せ）のいずれか であり得る。他の基板材料は、本開示を鑑みて、当業者には容易に明らかである 。好ましい実施態様において、基板は板ガラスまたはシリカである。 固体基板上の表面は、通常（ただし、常にとは限らない）、基板と同一の材料 からなる。従って、表面は、任意の広範な種々の材料（例えば、ポリマー、プラ スチック、樹脂、ポリサッカライド、シリカもしくはシリカベースの材料、炭素 、金属、無機ガラス、メンブレン、または任意の上記に列挙した基板材料）から なり得る。１つの実施態様において、表面は光学的に透明であり、そしてシリカ 表面上に見い出される官能基のような表面Si-OH官能基を有する。 好ましくは、ポリヌクレオチドは、チップ上で、アドレス付が可能な行および 列において整列される（array）。このようなアレイから情報を読む技術は、す でに開発されている。各チップ上に保存され得る情報量は、リソグラフィー密度 に依存し、これは、ウェハを合成するために使用される。例えば、各特徴部分の サイズは、側面が約100ミクロンである場合、各チップは、１ｃｍ²の面積中、約 10,000プローブのアドレス（特徴部分）を有し得る。 以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためではない。 実施例 本発明の方法を使用して、タンパク質のTGF-βのスーパーファミリーの新しい メンバーについてスクリーニングした。現在、32の公知のこのファミリーのメン バーが存在する。クローンライブラリーを、この遺伝子ファミリーのメンバーの 指標となる配列モチーフに相補的な配列を含む溶液中の核酸プローブに対するハ イブリダイゼーションに基づくゲノム材料から作製した。ゲノム挿入物は、約15 kbのサイズである。ほとんどの挿入物は、このファミリーの以前から既知のメン バー由来の配列を含む。 従来のアプローチは、従来のアプローチは、これらの15kb挿入物を幾重にも配 列決定することを含み、ほとんどの時間は、挿入物がすでに同定されているファ ミリーメンバーを含むこと見出すのみである。本発明の方法は、これらの労力の かかりかつ時間を浪費する工程を、より迅速で、より容易なスクリーニング方法 で置き換えた。この方法は、どのクローンが、ファミリーの既知のメンバーを含 むか、そして大きなライブラリーのどのほんの少しのクローンが、より詳細に調 査するに値するかを同定し得る。TGF- βクローンスクリーニングポリヌクレオチドアレイ： アレイは、TGF-βファミリーの32の公知のメンバーの各々のための99塩基につ いての単調増加の４塩基格子タイル方式を伴う異なるプローブを有する12,000個 を超える特徴部分を含んでいた（図５を参照のこと）。99塩基は、遺伝子の４つ の異なる領域由来であった。そして連続する領域は18〜30塩基のサイズに及ぶ。 検索（interrogate）領域は、いくつかの基準に基づいて選択した：これらは、 （a）合理的に良好に保存され（アミノ酸レベルで高度に保存されるが、DNAレベ ルではそれほどではない）、そしてタンパク質ファミリーの識別子として役立つ 、（b）高度に可変性で、そしてファミリーの個々のメンバーの特有の識別子と して役立ち、そして（c）推定イントロン／エキソン境の近くにない、という領 域を含む。ハイブリダイゼーションのためのTGF-βクローン試料： DNAまたはRNAのいずれかが、標準的な方法（例えば、核酸抽出に続いて重合化 工程の間に取り込まれる標識塩基を用いるPCRまたはインビトロ転写）を用いて クローンから生成され得る。断片化した一本鎖DNAまたはRNA、ならびに断片化二 本鎖DNAをハイブリダイゼーションに使用し得る。ハイブリダイゼーションは、 ６×SSPE-Tまたは3M TMAC1-T（Trisで緩衝化させハイブリダイゼーション溶液中 のNaイオンを何らかの形で有することを避ける）のいずれかにおいて、および差 別化を改善しそして交叉ハイブリダイゼーションを低減するために一般に30℃を 超える温度（これは、試料が約15,000塩基を含むので、この適用においては、い くつかの再配列決定適用についてよりも重要である。）で行う。標識RNAを使用 する場合、試料を、熱でMg²⁺の存在下で断片化する。DNAを使用する場合、試料 をハイブリダイゼーションの前にDNAse Iでの処理により断片化する。これは、 二 本鎖DNAまたはPCRに続いてλエキソヌクレアーゼを用いる鎖の一方の分解による 一本鎖にされたDNAの両方でうまくいく。実施例およびデータ分析： ハイブリダイゼーションおよびアレイの読み取りに続き、イメージをTGFレポ ートGeneChipソフトウェア（Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA，USA）を用い て分析する。塩基呼び出し（call）を、32の異なる領域の各々について99塩基の 全てにわたって行った。この呼び出しを、32の既知の野生型配列（図５および６ を参照のこと）の各々について予測される配列と比較した。各々について、塩基 呼び出しの結果を列挙し、そしてその領域での推定配列に適合する出力を呼び出 しの数（正解数）に基づいて並べた。現在までのすべての場合において、既知配 列がハイブリダイズされている場合、正しい配列は、リストの最上位に存在した 。さらに、ソフトウェアは、リスト中の最上の５つの配列について４つの異なる 領域の各々における塩基呼び出しの詳細な評価を与える。これは、どこに類似性 および差異が生じるかのより明らかな像を与える。アレイとhBMP-4およびhBMP-5 由来のDNAとの間のハイブリダイゼーションの結果を図６に示す。 疾患の診断を、体液の試料、組織、または他の核酸を含む材料を得ることによ り行い、潜在的な病原体または病原体のセットに存在する配列サイン（signatur e）が存在するか否かを決定する。例えば、PCT公表番号WO97/29212に教示される 方法を用いてミコバクテリウムの配列サインが存在するか否かを決定する。ミコ バクテリウムが存在しない場合、別の疑われる病原の存在を探求する。 本発明は、ポリヌクレオチドアレイ上でアッセイを実施するための新規の方法 を提供する。特定の実施例が提供されているが、上記の説明は、例示的であり、 そして限定的ではない。本発明の多くの改変は、本明細書を鑑みれば当業者には 明らかになる。従って、本発明の範囲は、上記の説明を鑑みて決定されるべきで はないが、代わりに、等価物のそれらのすべての範囲とともに添付の請求の範囲 を鑑みて決定されるべきである。 本願において引用されるすべての刊行物および特許文献は、その全体が、それ ぞれ各々の刊行物または特許文献が、個別に表示されているかと同程度に全ての 目的で参考として援用される。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１０月２５日（１９９９．１０．２５） 【補正内容】 （１）Fig.２およびFig.４を別紙の通りに訂正いたします。 【図２】【図４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウォン，ゴードン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02146，ブルックリン，クラーク ロード 239 (72)発明者 セイファー，ペニーナ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02159，ニュートン，ケンウッド アベニ ュー 31

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的分子が、遺伝子ファミリーメンバー由来の配列を有するか否かを決定 するための方法であって、以下の工程： 少なくとも２つの異なる遺伝子ファミリーメンバーの各々について、該遺伝子 ファミリーメンバー由来の参照ヌクレオチド配列を規定する１セットのポリヌク レオチドプローブを含むポリヌクレオチドアレイを提供する工程； 該標的核酸分子と該セット中の該プローブとの間のハイブリダイゼーション反 応を行うこと、および該標的核酸分子と該セット中の各該プローブとの間のハイ ブリダイゼーションを検出することにより、ハイブリダイゼーションデータを作 製する工程；ならびに 該標的核酸が、該遺伝子ファミリーメンバーの１つに由来する該参照配列を有 するか否かを決定するためにハイブリダイゼーションデータをプロセスする工程 、を包含する、方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、前記標的が、前記遺伝子ファミリーメンバ ーをコードする遺伝子にハイブリダイズする核酸プローブにハイブリダイズする か否かを決定することにより、前記標的核酸分子を選択する工程をさらに包含す る、方法。 ３．請求項１に記載の方法であって、前記プロセシング工程がプログラム可能な デジタルコンピューターによって行われる、方法。 ４．請求項１に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドアレイが、前記遺伝 子ファミリーメンバーの各々について、前記遺伝子の高度な保存領域を規定する プローブセットおよび該遺伝子の高度な可変領域を規定するプローブセットをさ らに含む、方法。 ５．請求項１に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドアレイが、前記遺伝 子ファミリーメンバーの各々について、前記遺伝子の少なくとも２つの高度な保 存領域を規定するプローブセットおよび該遺伝子の少なくとも２つの高度な可変 領域を規定するプローブセットをさらに含む、方法。 ６．請求項１に記載の方法であって、前記領域がアミノ酸配列をコードし、そし て前記アレイが該アミノ酸配列をコードする縮重セットのヌクレオチド配列を規 定するプローブセットをさらに含む、方法。 ７．請求項１に記載の方法であって、前記標的が遺伝子ファミリーメンバーの前 記領域の配列を有さない場合、前記標的核酸分子の前記ヌクレオチド配列を決定 する工程をさらに包含する、方法。 ８．試料中の核酸が遺伝子ファミリーのメンバーであるか否かを決定する方法で あって、以下の工程： 少なくとも第１および第２のアッセイを包含する階層制のアッセイ技術を選択 する工程であって、選択される該第１のアッセイは第１の配列サインの存在、非 存在、または変異体の決定を提供し、そして選択される該第２のアッセイは第２ の配列サインの存在、非存在、または変異体の決定を提供し、ここで、該アッセ イの少なくとも１つが高密度核酸アレイを使用する工程； 該第１のアッセイを用いて該核酸試料を分析する工程；および 該核酸が該第１および第２のアッセイの結果に基づく該遺伝子ファミリーメン バーであるか否かを決定する工程、 を包含する、方法。 ９．請求項８に記載の方法であって、前記第１の配列サインが遺伝子ファミリー の高度な保存領域である、方法。 １０．請求項８に記載の方法であって、前記第２の配列サインが遺伝子ファミリ ーの非保存領域である、方法。 １１．請求項８に記載の方法であって、前記核酸試料の全長配列を決定する工程 をさらに包含する、方法。 １２．請求項８に記載の方法であって、前記遺伝子ファミリーがTGF-βファミリ ーである、方法。 １３．請求項８に記載の方法であって、前記第１または第２の配列サインが10と 100との間のヌクレオチド長である、方法。 １４．請求項１３に記載の方法であって、前記第１または第２の配列サインが18 と30との間のヌクレオチド長である、方法。 １５．分析のためのクローンを選択するための方法であって、以下の工程： 支持体に結合した多様なクローンを有する該支持体を提供する工程； 該支持体を、低い、中程度な、または高いストリンジェンシーの条件下で１つ 以上のポリヌクレオチドに曝し、該クローンと該ポリヌクレオチドとの間の少な くとも幾つかのハイブリダイゼーションを可能にする、工程； 該ポリヌクレオチドとハイブリダイズする該クローンを同定する工程；および 分析のための該同定工程において同定されない、少なくとも１つの該クローン を選択する工程、 を包含する、方法。 １６．請求項１５に記載の方法であって、前記支持体が高密度核酸アレイである 、方法。 １７．分析のための試料を狭める方法であって、以下の工程： 核酸を含む試料を提供する工程； 高密度核酸アレイを用いて該試料が配列サインを含むか否かを分析する工程； および 該配列サインが存在しない場合のみ該核酸試料をさらに分析する工程、 を包含する、方法。 １８．TGF-β遺伝子ファミリー由来の配列サインを含む、高密度核酸アレイ。