JP2011101623A - マイクロアレイ - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、凹凸構造をもった担体からなるマイクロアレイにおいて、凸部の数を増やすことなく、担体に固定化できる選択結合性物質の種類を増やすことができるマイクロアレイを提供する。
【解決手段】複数の選択結合性物質を単一の凸部上部の異なる領域に固定することで、担体に固定化できる選択結合性物質数を増大させることが可能となった。
【選択図】図３

Description

本発明は、被検物質と選択的に結合する物質を担体上に固定化したマイクロアレイに関する。

各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティングに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。

近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法または方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間、糖鎖／糖鎖間または糖鎖／蛋白質間のハイブリダイゼーションに基づく蛋白質や糖鎖の検出・定量にも応用が可能である。これらの技術は、マイクロアレイ又はマイクロチップと呼ばれるガラス等の平面基板（担体）上に、多数のＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。ＤＮＡマイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。

核酸を基板（担体）上に固定化するための技術として、特許文献１には、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法が開示されている。そして、特許文献２には、ガラス以外の基板の材料として飽和環状ポリオレフィンなどのプラスチックを用いた方法が開示されている。

これらのマイクロアレイでは、ハイブリダイゼーションを行う際に、核酸を固定化したスポット以外の部分に非特異的に検体試料が吸着してしまうという課題があった。そのため、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光検出を行う際、この非特異的に吸着した検体をも検出し、ノイズが大きくなり、結果的にＳ／Ｎが悪くなるといった問題があった。

また、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン処理を行ったスライドガラス等の平坦な固体表面にスポッターを用いて核酸をスポットする際に、各スポットの大きさがばらつき、後の解析に支障をきたす問題点があった。

このような問題を解決するため、特許文献３には、担体表面に凹凸構造をもったマイクロアレイ担体（基板）が開示されている。そして、この凹凸構造の凸部に選択結合性物質を固定化することにより従来と比べて分析感度が大幅に改善されたマイクロアレイが開示されている。

特表平１０−５０３８４１号公報 特開２００３−１６１７３１号公報 特開２００４−２６４２８９号公報

近年、マイクロアレイを用いた核酸検出において、被験物質の検出・解析の効率化等のため、マイクロアレイ担体上に固定化される選択結合性物質（プローブＤＮＡ等）の数を増やすことが求められているが、凹凸構造を有する担体を用いる場合、固定化できる選択結合性物質の数（種類）は凸部の数に影響される。そのため、固定化される選択結合性物質（プローブＤＮＡ等）の数を増やすためには、限られた担体サイズにおいて凸部の数を増やすことが必要であるという点で困難さがあった。

上記のように、凹凸構造を有する担体を用いた高感度マイクロアレイにおいて、担体上に固定化される選択結合性物質の数を増やすために、本発明では、複数の選択結合性物質（プローブＤＮＡ等）を単一の凸部上部の異なる領域に固定することで、凸部の数を増やさずに、マイクロアレイ担体に固定化できる選択結合性物質（プローブＤＮＡ等）の数を増大させることを可能とした。

すなわち、本発明は、担体上に凹部及び凸部からなる凹凸構造（凹凸部）を有し、該凸部の上面に選択結合性物質が固定化された担体を有するマイクロアレイであって、複数種類の選択結合性物質が単一の凸部上面の異なる領域に固定化されていることを特徴とするマイクロアレイを提供する。

本発明により、凹凸構造を有する担体を用いた高感度マイクロアレイにおいて、担体上の凸部の数を増やすことなくマイクロアレイ担体に固定化できる選択結合性物質の数を増やすことができ、従来よりも多くの種類の選択結合性物質を１つの担体上に搭載することが可能となる。これにより、担体に凹凸構造を有するマイクロアレイの高感度の分析が可能という特徴を兼ね備えたまま、高密度に選択結合性物質が固定化されたマイクロアレイを作製することができる。

図１は、本発明のマイクロアレイの担体の一例を示す概略図である。Ａは担体の一部を拡大した断面図、Ｂは担体全体の斜視図、Ｃは担体全体の断面図である。 図２は、選択結合性物質の固定化工程を説明する概略図である。 図３は、本発明のマイクロアレイにおける選択結合性物質の固定化パターンの一例を示す概略図である。Ａは凸部の一部を拡大した斜視図、Ｂは凸部上面の概略図である。 図４のＡ〜Ｄは、本発明のマイクロアレイにおける選択結合性物質の固定化パターンの一例を示す担体凸部上面の概略図である。 図５のＡ〜Ｄは、本発明のマイクロアレイにおける選択結合性物質の固定化パターンの一例を示す担体凸部上面の概略図である。

本発明のマイクロアレイは、その担体上に凹部及び凸部からなる凹凸構造を有し、担体の凸部の上面に選択結合性物質が固定化されているが、複数種類、すなわち少なくとも２種類以上の選択結合性物質が凸部の上面に固定される。

凹凸構造を有する担体としては、例えば、特許文献１に開示されているポリメチルメタクリレート製マイクロアレイ担体を用いることができる。

本発明において、選択結合性物質とは、被検物質と選択的に結合する物質のことをいう。担体の表面に固定化する選択結合性物質としては、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を用いることができる。代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもよく、ＰＮＡ、ＬＮＡなどの核酸誘導体でもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ'）_２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、および種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、選択結合性物質に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸、抗体及び抗原である。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。

凹凸構造を有する担体の単一の凸部上面の異なる領域に複数種類の選択結合性物質を固定化する方法としては、主に、凸部上面部において直接オリゴＤＮＡ（選択結合性物質）を合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴＤＮＡを凸部上面へ滴下して固定する方法が知られている。

前者の方法としては、Ronaldらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Michelらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）が挙げられる。これらの方法では、ＤＮＡ合成反応時に有機溶媒を用いるため、担体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。例えば、特許文献１に記載の方法を用いて作製した凹凸構造を有したガラス担体を用いることができる。特にFrancescoらの方法においては、担体の裏面から光を照射し、ＤＮＡ合成を制御するため、担体は透光性を有する材質であることが好ましい。

後者の方法としては、廣田ら（特許第３９２２４５４号）の方法やガラスキャピラリーを用いる方法を適用することができる。ガラスキャピラリーを用いる方法の一例としては、自作したガラスキャピラリーやマイクロピペット（（株）マイクロサポート社製；ＭＰ−００５）などの市販製品を用いる方法が挙げられる。

本発明のマイクロアレイにおいて選択結合性物質を凸部上面に固定化する方法としては以上のような方法が挙げられるが、凹凸構造の凸部上面の異なる領域を区別して複数種類のＤＮＡプロープ等が互いに重複または混在しないように固定化できる方法であればよく、これらに限られない。

単一の凸部上面の異なる領域とは、選択結合性物質を固定化するための領域であって、凸部上面を任意の形状で区分した時のそれぞれの区画を意味する。単一の凸部上面の異なる領域に複数種類の選択結合性物質を固定化するパターンの例として、図４および図５のような固定化パターンがあげられる。図４および図５では、一例として２種類の選択結合性物質（プローブＡとプローブＢ）を複数の異なる領域（斜線および塗りつぶし）に固定する場合を示している。図４は凸部上面が円形の場合、図５は凸部上面が矩形の場合を示す。本発明のマイクロアレイにおいて選択結合性物質の固定化パターンは、複数の選択結合性物質が固定化された各領域が互いに重複または混在しないように区画されていればよく、これらの例に限定されない。

本発明のマイクロアレイにおいて、担体に固定化される選択結合性物質の種類は複数であればよく、選択結合性物質の種類は３種類以上でも構わない。図４および図５は、２種類の選択結合性物質（プローブＡとプローブＢ）が固定化された例を示すが、互いに識別できるように領域が区画されていれば、より多数の種類の選択結合性物質を固定化することができる。

生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３： ２３０３ （１９７６））等により、またＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（ Favaloro et.al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。

本発明のマイクロアレイに供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、該抗原又は抗体に結合した標識を測定することもできる。

選択結合性物質と被検物質を相互作用（ハイブリダイズ）させる工程は、従来知られている方法をそのまま適用して、またはこれら方法と同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。

本発明のマイクロアレイを用いて、上記方法により、固定化された選択結合性物質と選択的に結合する核酸や抗体、抗原等の被検物質を測定することができる。すなわち、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう測定は、検出と定量の両者を含むものである。

本発明のＤＮＡマイクロアレイについて、以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

（ＤＮＡ固定化担体の作製）
平均分子量５万のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）９９質量部及びカーボンブラック（三菱化学製 商品名 ＃３０５０Ｂ）１質量部を混合し樹脂組成物を調製した。

公知の方法であるＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製した。この型を用い、上記樹脂組成物を射出成型し、後述する通りの形状を有する黒色の担体を得た。

担体の形状は、概ね図１に示す通りの形状であり、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分の凹凸構造Ｒ１を除き表面は平坦であった。担体の中央部分には、凹凸構造Ｒ１として、縦横１０ｍｍ、深さ１５０μｍの矩形の凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径１３０μｍ、高さ１５０μｍ、上面の径１３０μｍの凸部１を６４箇所（８×８）設けた（図１は概略図であるため、図中に示される凸部の数は、実際のものより少ない。）。凹凸構造部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分８との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）を測定したところ、３μｍ以下であった。さらに、凸部のピッチＬ１（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は５６０μｍであり、最外側の凸部から凹部周縁部までの距離は７９０μｍであった。

この黒色担体の分光反射率と、分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、厚み方向の透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。

（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（Ｐｒｏｂｅ Ａ）、配列番号２（Ｐｒｏｂｅ Ｂ）に示される配列を有し、５’末端がアミノ化されたＤＮＡを合成した。Ｐｒｏｂｅ ＢはＰｒｏｂｅ Ａの配列にミスマッチを３箇所導入した配列である。Ｐｒｏｂｅ ＡとＰｒｏｂｅ Ｂの蛍光強度を比較することにより、試作したマイクロアレイがミスマッチ配列を正確に識別し検出しているか観測することができる。このＤＮＡを、図２に示すスキームにしたがって固定化した。上記の担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。

ＤＮＡを純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２ｇ純水に溶かし１ＬにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、この混合溶液をマイクロピペット（（株）マイクロサポート社製；ＭＰ−００５）を用いて吸引し、図３のＡ、Ｂに示すように担体凸部上面に点着した。次いで、担体を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄し、担体凸部上面上に固定化プローブＤＮＡを得た。

（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な、配列番号３の塩基配列を持つＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。このＤＮＡの調製方法を以下に示す。

配列番号４と配列番号５の塩基配列を持つＤＮＡを合成した。これらをそれぞれ純水に溶解して濃度１００μＭの水溶液とした。次いで、ｐＫＦ３ プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号６：２２４６塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。

ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ ４０μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製 製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２のＤＮＡ溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡ溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号６）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号３（９６８塩基）に示す配列を有するＤＮＡが増幅されていることを確認した。

次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにKlenow Fragment（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケア製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのKlenow Fragmentを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号３（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。

この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈したもの。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。

以下の実施例において、ハイブリダイゼーションの際の検体溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡの濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった。

（ハイブリダイゼーション）
上記で得られた分析チップに上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液５０μｌをマイクロアレイ上に滴下し、カバーがラスをかぶせた。その後、マイクロアレイを４２℃の条件で１６時間インキュベートした。インキュベート後、担体からカバーガラスを脱離後に担体を洗浄、乾燥した。

マイクロアレイのプローブＤＮＡを固定化した凸部の４箇所の各領域（スポット１〜４）の蛍光強度を測定して、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション結果を評価した。マイクロアレイ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000B）に上記処理後のマイクロアレイをセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。その結果を表１に示す。ここで示す４つの蛍光強度は、異なる凸部４箇所のハイブリダイゼーション後の蛍光強度の値である。

測定の結果、スポット１、スポット２において十分な蛍光強度が得られた。一方で、検体ＤＮＡとミスマッチ配列を有するプローブＤＮＡが固定されているスポット３、スポット４では十分な蛍光強度が得られなかった。以上の結果のとおり、試作したマイクロアレイによって、ミスマッチ配列を正確に識別し検出することができた。担体上の凹凸構造の凸部上面部に複数のプローブＤＮＡを固定した本発明のマイクロアレイは、高い精度で検体ＤＮＡを検出できることが示された。

１ 凸部
２ 担体
３ 平坦部
４ スポット１
５ スポット２
６ スポット３
７ スポット４
Ｒ１ 凹凸構造（凹凸部）
Ｌ１ 凸部ピッチ

Claims (1)

1. 担体上に凹部及び凸部からなる凹凸構造を有し、該凸部の上面に選択結合性物質が固定化された担体を有するマイクロアレイであって、複数種類の選択結合性物質が単一の凸部上面の異なる領域に固定化されていることを特徴とするマイクロアレイ。
   

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