JPH02299598A - 微視的サイズの別個の粒子と結合している核酸試料中のごく短い配列の全部または一部のオリゴヌクレチドプローブとのハイブリダイゼーションによる決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は分子生物学の分野に関する。

［従来の技術］ ゲノムの大きさは、細菌（大腸菌）中の４×１０６個の
ヌクレオチドからヒトを含む哺乳動物の３×１０９個の
ヌクレオチドまで多様である。フォーミュラすなわちゲ
ノムのＤＮＡ中のヌクレオチド配列の決定は二十世紀末
の科学にとって第一級の技術的課題である。ゲノム中の
ヌクレオチド配列が解明されれば、医学、生物工学、さ
らに基礎生物学それ自体においても質的な向上をもたら
し、これら全ての科学分野に有益な影響を及ぼすであろ
うと思われる。この作業を達成するために充分に有効で
はない既存の方法に対し、本発明者らはこの問題の複雑
さに適応するハイブリダイセージコンによる配列決定法
を特許出願した（ユーゴスラビア特許出願Ｎｏ、５７０
／８７、補正　Ｎｏ、４５２１．１９８８年３月１６日
付）。【ノかしながらその方法は工場や巨額の投資を必
要とする。本発明の解決法は先に出願した基本的原理の
技術的向上に関するものであって、小型化、投資コスト
の軽減、この方法のより広範な応用、およびゲノムの配
列を決定するためのオリゴヌクレチドハイプリダイゼー
ションの他のあらゆる応用を可能にする。

一次構造レベルの部分的または全体的ゲノムに関する知
識は、この情報の利用による遺伝的性質の追求の可能性
とともに、生物学的プロセスに関する効果的でより迅速
な研究の条件として広く認められつつある。実験的研究
の一部は、得られた配列に関するコンピューターリサー
チによって代用されるであろう。いくつかの生物学的現
象（進化的過程）の研究は、ゲノム配列の分析を通じて
のみ可能だということが明かになるであろう。

−次遺転子情報の決定を可能にする方法論的な解決法を
見出すための努力がますます組織的に行われている二つ
の分野が認められる。一つは、個体・科（ｆａｍｉ　ｌ
ｙ）または個体群のゲノムＤＮＡにおける遺伝子地図が
作成された多数の多形性部位（ｐｏｌｙｍｏｒρ旧ｃ　
５ｉｔｅ）を検出することに関するものである。事実、
このプロジェクトは、本発明者らがゲノグラム（ＧＥＮ
ＯＧＲＡＭ）という名を提案している特異的ゲノムの副
次的属性（ｓｕｂ−ｅｎｔｉｔｙ）を表すゲノム配列特
定部分の決定を意味する。もう一方のプロジェクトは、
ヒトおよびその他のゲノムの全配列の決定に関する。最
終的には、目的とする大部分の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）お
よびそれぞれの種の充分な数の個体についてのゲノム配
列の決定を意味しよう。第一のプロジェクトには、二つ
の基本的なアプローチがある。すなわち制限酵素の有す
る特異性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ
　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＲＦ　Ｌ
　Ｐ　）を利用するか、または、オリゴヌクレオチドプ
ローブとのハイブリダイゼーションという特異性を利用
して・多形配列（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ）を検出する。二番目の方法においては、ＤＮＡ
のフラグメントの長さを決定する必要がなく、増幅ター
ゲット（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃ
ｔｉｏ＋］；　ＰＣＲ）または増幅連結ハイブリダイゼ
ーション（ａｍｐｌｉｆｉｅｄＩ　ｉｇａｔｉｏｎ−ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応で容易乙こ行なわれる
ので、多数の多形性部位を調べる際に有利である。

１ｃｍの解析（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）の個々の遺伝子
配列地図を作成するには、５０００〜１００００個の多
形性部位を調べる必要がある。

第二のプロジェクトは多面性物理的地図を作成すること
であると考えられ、その最終目標はヌクレオチド配列を
決定することである。物理的地図の作成にもまた配列識
別を利用するが、その識別はＲＥおよびＤＮＡフラグメ
ントの長さの測定またはオリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションによるオリゴヌクレオチド配
列の内容の決定によって行う。そして配列決定そのもの
は、既存の方法に従って、フラグメント長の測定を利用
して、間接的ではあるが実験によって決定する。

ヌクレオチドの序列（ｏｒｄｅｒ）を実験的に決定する
ために、さらに二つのアプローチが考慮されている。第
一のアプローチは間接的であって、ＤＮＡフラグメント
の一端から屯−のヌクレオチドを継続的に除去していく
ことに基づいている。第二の方法は、ある特殊な電子顕
微鏡を用いて配列を直接実験的に読み取ることを想定し
ている。最終的に、あるアプローチのための理論が開発
された。すなわち、配列はヌクレオチドの序列の実験的
決定乙とよって直接帯られるのではなく、代わりＬこオ
リゴヌクレオチド配列の内容を見出して、次いで、これ
らのデータをコンピュータ一作業で配列情報に変換する
（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ；　５ＢＩ（）というものである。現在のところ
、オリゴヌクレオチド配列内容を決定する唯一現実的な
方法は、上記の方法に用いたものと同じ種類のオリゴヌ
クレオチドプローブとのハイブリダイゼーションである
。

両プロジェクトおよび全ての方法（結果的に顕微鏡は除
く）においては、処理されるゲノムの大きざと数に応じ
て、１０６から１０７個の膨大な数の試料を操作しなけ
ればならない。各試料は一つまたはそれ以−ヒの同一ま
たは同様の一回以上の反応に供されるので、多数の反復
操作を実行する方法と速度の問題、さらに、実験情報を
集めてコンピューター記憶装置に記憶させる方法と速度
に関する問題がある。明かに第一の問題の解決法は、プ
ロセスのロボット化であり、データ収集の最も効果的な
方法は実験画像の画像分析（ｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉ
ｓ）である。画像分析のスピードはすでに秒速１００万
から１０００万画素（ｐｉｘｅｌｓ）／秒であり、これ
によってその１０倍少々い数の点状対象物を区別するこ
とができる。

［発明が解決しようとする課題］ ここで本発明者らは、ゲノムの一次構造を研究するため
の「情報アプローチ（ｉｎｆｏｍｒａｔｉｏｎａｌａｐ
ｐｒｏａｃｈ）」を定義し、その性質と情報技術の必要
条件とを分析し、アドレスされた（ａｄｄｒｅｓｓｅｄ
）試料を用いて、大量のロボット化されたプロセスを小
型化したプロセスに代用することを可能にする主要な技
術に必要な手段を提供した。それは、基本的に試料混合
物を個別の識別可能な粒子の形で用いるというものであ
る。

［課題を解決するための手段］ ロー　　　　　７ 異なる目標を達成するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブによる誤った紺合せを含まないミスマツチフリーハイ
ブリダイゼーション（ｍ　ｉ　５ｎａｔｃｈｆｒｅｅ　
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を利用する三つの方法に
共通する特徴は、ゲノムＤＮＡの特異的フラグメントに
おける単一のオリゴヌクレオチド配列、あるいは多数の
オリゴヌクレオチド配列のうちいくつかまたはほとんど
全ての内容（ｃｏｎｔｅｎｔ）を実験的に決定すること
である。これらは、多形性部位検出法、組織的ゲノムラ
イブラリー（連結）形成法およびハイブリダイゼーショ
ンによる配列決定を行うＳＢＨ法である。同一のターゲ
ットに対し、情報的観点では、個々のヌクレオチド配列
または特定のオリゴヌクレオチドプローブの配列に基づ
く実験的位置決定による方法がある。これらの方法とは
、ＲＦＬＰ分析、制限地図作成ならびに制限パターンお
よびアクリルアミドゲルによる配列決定を基礎にした組
織的ライブラリーの形成である。本発明者らは、オリゴ
ヌクレオチド配列の内容の決定を利用する方法を「情報
アプローチ」と定義する。このアプローチでは、同一の
原理が全配列とゲノムの選択部分（ゲノグラム（ＧＥＮ
ＯＧＲＡＭ））との両方の決定に用いられるので、一般
に、このアプローチは「ゲノムの一次構造の研究および
探索のための情報アプローチ」と定義することができる
。これはいくつかの本質的特徴を有する。

このアプローチの最も本質的な特徴は、位置づけされて
いない（ｕｎｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ）試料において実験
データ（オリゴヌクレオチド配列の内容）を得る可能性
があることである。要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）の配列自体
は測定の目的ではないし、要素の物理的距離も対象では
ないので、試料の序列化された空間的配置を必要とせず
、明確な開始位置などを有する必要もない。

第二の特徴は、オリゴヌクレオチド配列の内容は、原則
的に最終的実験処理において最適なサイズのミクロな（
ｍｉｃｒｏ）容量または領域面積を占める試料において
決定されるということである。物理的分離を必要としな
いために、拡散等の輸送効果は避けられる。これらの効
果は通常マクロな（ｍａｃｒｏ）容量を必要とする。

第三の（上記の特徴から導かれる）特徴は、実験容量ま
たは領域の単位当りのデータビット密度が相当大きいこ
とである。それは高度のデータの平行獲得を達成する可
能性があると定義づけられる。

このアプローチにおける第四の明白な特徴は、試料位置
、配列中の構成要素序列、開始および終止ＤＮＡフラグ
メントまたは操作順序のようなデータ部分を実験的に決
定する必要はなく、代わりに、より単純で迅速な方法で
実験的に得られるデータを情報コンピューター処理して
代用され得るということである。

第五の特徴は、実験データビット数（マトリックスの大
きさ）が、より高性能でより小さいマド＝１５− リックスの獲得に必要な仕事量を減少させることによっ
て、増加することである。これはプロセスの負担が、デ
ータ読み取り工程、すなわち、より多くのデータビット
のコンピューター記憶装置への入力にかかることを意味
する。

これらの特徴によって、必要な実験データをもたらす小
型化された迅速で簡素なプロセスの提供が可能になる。

ゲノグラムおよび全ゲノムの配列決定に対して、科学的
および実用的な面における同一の情報技術的必要条件が
要求される。

本発明者らはデータピッ）　（ＢＩＴＳ）を、個別の実
験によって得られる有意なデータと定義づける。

例えば、一つのデータビットは、１００万番目のヌクレ
オチドはヒト染色体第５番のＡ部分である、ということ
を示す。あるいは、ヒトゲノムのＤＮＡのＸフラグメン
トはＹオリゴヌクレオチド配列を含むということを示す
。

一つの哺乳動物ゲノムの全配列決定に要する最小のデー
タビット数は３０億、すなわちこれは塩基１６一 対（ｂｐ）数に等しい。最終目標は、全てのデータビッ
トをコンピューター記憶装置に入れることであるから、
処理スピードを決定するために実験的に収集して記憶装
置に記憶させる単位時間当りのデータビットの必要数の
割合（％）を知ることが重要である。将来、複雑なゲノ
ムの配列を決定する時間は好ましくは一年を越えないと
想定される。

秒を単位時間とすると（１年は３．１５３６Ｘ　１０７
秒）、全データビットを１０６から１０７秒で得られる
と考えることができる。非常に好ましい期間として１０
６秒（中断せずに１２日）を選択すれば、必要データの
１００万分の１を毎秒得なければならない。

この時間のかなりの部分は、配列決定操作を行うために
用いられるのではなく、試料調製や管理調整などに用い
られることから、上記の分析で定義された１２日は実際
に要する期間の少なくとも５〜ＩＯ倍は長い期間を表す
。

オリゴヌクレオチド配列の内容の決定によってゲノグラ
ムまたは一つの哺乳動物ゲノム配列のどちらか一方の決
定を行うためには、何個のデータビットが必要であろう
か。配列決定には、約１０７個の個別のゲノムフラグメ
ント（試料）と約１０５個のオリゴヌクレオチドプロー
ブが必要であって、これらの数値は１０１２個のデータ
ビ・ソトを必要とする。ゲノグラムには１ｃＭの地図に
対し少なくとも１０４個のゲノム部位またはフラグメン
トが必要である。１ゲノム中１０５ト・ントと（Ａう数
値が遺伝子の概数であるから、これを調へなければなら
ないと言える。その場合、ゲノグラムは、一つまたはそ
れ以上のオリゴヌクレオチド配列の内容を決定せねばな
らない比較的多数のフラグメントな必要とするであろう
し、このような広範囲にわたるゲノグラムでは、同一の
オリゴヌクレオチド配列の重複使用にもかかわらず、必
要なオリゴヌクレオチド配列数は１０数万に達する。実
際には、７または８塩基長を有するオリゴヌクレオチド
プローブをそれぞれ有肱１６０００または６５０００個
のオリゴヌクレオチドプローブによって、いかなる配列
の変化をも検出するシステムを持つことがより適切であ
る。最も有効な方法は、プローブとターゲットの特定の
対を決定することてはなく、代わりに、各プローブと各
ターゲットとの単純な組合せによってより多くの情報を
得ようとすることである。この種の分析に基づいてゲノ
グラムには約１０９個のデータビットが必要であるとい
える。

本発明者らは１０６秒（１２日）て１００ないし１００
０のゲノグラムの情報を集めることを合理的と考える。

おおよそ、それは１日当り数人の患者を分析すること、
またはある集団の１０００個体の試料を２ケ月の期間内
でテストすることになる。将来の分子遺伝学の必要条件
に関するこのようなアプローチｔこよって、本発明者ら
は、また、単一ゲノムの配列決定におけるのと同数のデ
ータビット数（約１０１１〜１０１２）に達成できる。

したがって、大規模な集団的および診断的研究における
主要な仕事は、全ゲノムの配列決定に必要な仕事となる
。

本発明者らは全データビットの１００万分の１を１秒で
記憶装置に入れなければならないという事実を確立した
ので、このアプローチにとって決定的に重要なパラメー
ターに到達できた。すなわち、いかにして毎秒１００万
のデータビットを産出し記憶させるかということである
。

ゲノム構造に関する知識を得るためのこれらの膨大な技
術的必要条件は、必要なデータビットを迅速に得るシス
テムの開発によって達成される。

以下の各章では、情報アプローチの特徴を利用するその
ような一つのシステムについて説明する。

憧艮ヱチ旦二ｌ オリゴヌクレオチド配列の内容がオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いたハイブリダイゼーションによって決定さ
れる時、このアプローチの実験的部分において四つのフ
ェーズ（過程；　ｐｈａｓｅ）が定義される。ゲノムＤ
ＮＡに特異的なフラグメントのオリゴヌクレオチド配列
の内容に関する情報を記憶させた後に、全配列またはそ
の一部分をもたらす情報化フェーズが行われる。これら
のフェーズは以下の通りである。

フェース１．　　試料調製（単離、印付け（Ｍａｒｋｉ
ｎ８）、フェーズ３のための各種調製） フェーズ２．プローブ調製（合成、オリゴヌクレオチド
プローブバンク、プローブの標識（１ａｂｅｌ　ｉｎｇ
）） フェーズ３．ハイブリダイゼーション フェーズ４．読み取りおよびデータビットの蓄積各フェ
ーズにおいて別々にまたはプロセス全体としてのいずれ
かにおいて達成されなければならない三つの目標が定義
付けられる。すなわち、試料とプローブは、最小限の範
囲内での位置（座標、アドレス）によって、できるだけ
多くの固有な情報的特徴によって、識別されなければな
らない。

また、できるだけ少ない独立したハイブリダイゼーショ
ン反応数および毎秒１００万前後のオリゴヌクレオチド
プローブＸターゲットデータビットの「読み取り」能力
が必要である。

Ｉ　　　：　　　１０　ノ・ヒｔ−３とＬΣ／−一゛試
料は、試料調製とハイブリダイゼーションの二つのフェ
ーズとの関連で考察される。明確な解決法は、マイクロ
タイタープレート中にアドレスされた試料と、序列化さ
れたドツトプロット（ｄａｔ−ｐｌｏｔ）としてアドレ
スされたハイブリダイゼ−ションドットをそれぞれ調製
することである。

アドレスされた試料は必要に応じて使用できる。

アドレスされていない試料を用いることは、試料を恒久
的に保存する必要がない場合、または必要時に容易に得
られるため保存しないほうかより容易である場合に、と
く乙こ重要である。しかしながら、アドレスされていな
い試料を用いた場合は、検出システムが一つ以上のター
ゲット分子、すなわちゲノムフラグメントの増幅を必要
とする場合に、とくに難しい作業が必要となる。一方、
一つのハイブリダイゼーション領域に一度だけ供給され
る試料についてはオリゴヌクレオチド配列の完全な内容
を決定すること（すなわち全オリゴヌクレオチドプロー
ブをハイブリダイズすること）はできない（または平行
性（ｐａｒａｌ　Ｉｅｌ　ｉｓｍ）を維持するために決
定しないほうが便利である）。したがって、個別のハイ
ブリダイゼーション領域における一つのハイブリダイゼ
ーションスポットおよび多くのハイブリダイゼーション
スポット中に、大きなコピー数の任意のゲノムフラグメ
ントが存在することは便利である。例え、管内で増幅さ
れた多数のゲノムフラグメントが互いに分離されないで
使用されたとしても、ハイブリダイゼーションスポット
は、既知の目印および既知の座標を序列化されたパイプ
リダイゼーションドットを用いることで識別できること
が望ましい。

ＤＮＡの化学合成のための他の多くの方法や技術におけ
ると同じく、解決策は、反応管の代用として固体担体を
用いて液体試料を互いに混ざらないように分離させてお
くことである。必要コピー数の任意のＤＮＡフラグメン
トを含む一滴の水は、その表面に必要コピー数の同ＤＮ
Ａフラグメントを付着して有している個体粒子（本明細
書では独立粒子（ｄｉｓｃｒｅｔｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ
）と称する）によって置換される。これらの粒子として
は、既に他の特許出願に用いられている一定の大きさと
形状を有する小ビーズ体が利用できる。すなわち、独立
粒子は種々の公知の材料から形成できる。そのような材
料としては、例えばガラス等の多孔質無機固体材料、テ
フロン、ラテックス等の有機固体材料［Ｋｒｅｍｓｋｙ
　ｅｔ　ａｔ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１
９８７）１５：　２８９１−２９０９１、アクリルアミ
ド、デキストラン等からなるスポンジ状有機材料［Ｇ団
ｚｅｒａｓ、　Ｔ、Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−　
（１９８７）　１５：　５３７３］およびアガロース等
を挙げることができる。説明を簡略化するため、ハイブ
リダイゼーション反応における独立粒子の使用を、調製
フェーズにおいて得られる物理的に分離されて増幅され
る試料を用いた場合を一例として説明する。

まず、マイクロタイタープレート上に置かれたゲノムク
ローンのライブラリーがある。独立粒子を各ウェルに加
えると結合反応が起きて、その結果、ＤＮＡがそれらに
付着する。このようにして各液体試料はいくつかの独立
粒子に分配される。各ウェルからの独立粒子の一部を混
合して、必要濃度の単層にひろげる。この後、固定（ｆ
ｉｘａｔｉｏｎ）のための各種操作を行う。このように
してフィルターを用いたドツトプロット法におけるフィ
ルターに形成されたのと同様なハイブリダイゼーション
のための領域を得ることができる。各独立粒子は一つの
ドツトに相当し、固体担体はフィルターのドツト形成領
域に相当する。例えば、各ハイブリダイゼーション領域
は、少なくとも、ライブラリーからの各クローンをそれ
ぞれ含む独立粒子の充分無作為な配列を含む。複数のハ
イブリダイゼーション領域のそれぞれは同一の独立粒子
の組合せを含み、互いに複製（ｒｅｐｌ　１ｃａ）の関
係にあるが、各ハイブリダイゼーション領域において独
立粒子の配置は異なる。すなわち、これらの複製間にお
いて、同じクローンを含む独立粒子は異なる場所に存在
する。いずれのハイブリダイゼーション領域も原則とし
てハイブリダイズされて、従来のフィルターと同様に処
理される。主要な問題は、異なるハイブリダイゼーショ
ン領域において同一クローンを有する独立粒子を識別す
ることである。全てのハイブリダイゼーションを単一（
同一）のハイブリダイゼーション領域中で行うことがで
きれは、この問題は起きない。ハイブリダイゼーション
による配列決定に必要な１０５個のオリゴヌクレオチド
プローブを用いると後者の達成はおそらくきわめて難し
いであろう。また、ハイブリダイゼーション領域を一つ
だけ用いる場合には、多くのハイブリダイゼーション反
応を平行して行う可能性は失われる。

組み合わされる独立粒子を識別する方法として三つの原
則的な方法を挙げることができる。１）読み取りフェー
ズで、例えば、画像分析において識別される大きさ、形
状および色のような独立粒子の物理的属性による標識。

２）適当なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダ
イゼーションのような方法によって識別できるオリゴヌ
クレオチドの異なる組合せを用いた標識。例えば、２０
個の異なるオリゴヌクレオチドから各１０個のオリゴヌ
クレオチドからなる３Ｘ１０”の異なる組合せが形成さ
れる。オリゴヌクレオチドの各組合せを独立粒子に付着
させることによって、３Ｘ１０５個の異なるように標識
された独立粒子が得られる。それらは、前記のオリゴヌ
クレオチドと相補的な２０個のオリゴヌクレオチドプロ
ーブとのハイブリダイゼーションにおいて任意の組合せ
を検出するこ一２７＝ とによって識別され得る。３）オリゴヌクレオチドプロ
ーブの一部分を全ハイブリダイゼーション領域に用いる
ことによる標識（より精度の高い識別）。この原理は連
結法（１ｉｎｋ−ｕｐ　ｍｅｔｈｏｄ）で用いられるも
のである。必要条件は、一部を識別に用いるやり方で多
数のオリゴヌクレオチドプローブでの試験に対して各ハ
イブリダイゼーション領域が耐え得ることである。Ｌｅ
ｈｒａｃｈは、ハイブリダイゼーションによる配列決定
のための８ｍｅｒないし９ｍｅｒのプローブと同濃度を
有する１００個のオリゴヌクレオチドプローブが全ゲノ
ムライブラリーにおいて重複するコスミドの識別に適し
ていることを見出した。この場合、重複したクローンで
はなく同一のクローンの識別が一定数の異なるクローン
の混合物において要求される。その混合物がより単純で
あれば全クローンを−っに混合する必要はないが、少数
のクローンが入った個別の混合物を調製して用いること
によって細分割されたハイブリダイゼーション領域が得
られて、その結果、必要なプローブ数が減少する。

一肩一 三つの原理全ての組合ぜおよび細分割されたハイブリダ
イゼーション領域を用いることによって、ゲノグラムお
よびハイブリダイゼーションによる配列決定に必要な１
０７個の個別の試料を識別することができる。１０区分
に分けたハイブリダイゼーション領域を用いて、それぞ
れの原理について１００の「標識」を行うことによって
、この数のそれぞれの試料の識別が可能になることが明
かである。

この組合せ法では、原理１および２を用いて個別に標識
された独立粒子を有する１００００個の試料を調製しな
ければならない。しかしながら、第三の原理を最大限に
用いれば、個別に異なる方法で目印付けされた独立粒子
を調製する必要性は減少するが、必要なハイブリダイゼ
ーション数が増加することは明らかである。

・　　ヘ　　　　　　　　　　−　゛　　　官　　・＝
。リハイブリダイゼーションによるオリゴヌクレオチド
配列の検出を、任意のフラグメントの一つまたは多数の
分子においておよびフラグメントの増幅モードにおいて
行い得るかどうかによって、独ヴ粒子の直接混合物とし
て試料を作成する三つの可能な方法を限定できる。この
ようなアプローチによって、おおまかに分離されてアド
レスされた試料を調製して維持する必要性はなくなる。

１）原理３による識別とを組合せた原理１および２によ
って標識された独立粒子を用いる、個々の分子における
検出。

標識された独立粒子は、染色体、人工酵母染色体（Ｙｅ
ａｓｔ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
；　ＹＡＣ）等のゲノム部分または多数のゲノグラムの
平行調製における個体の識別に有用である。ゲノムＤＮ
Ａまたは個体ＤＮＡの特定の部分のフラグメントは個別
の反応で特異的に目印付けされた独立粒子に単位分子と
して付着されよう。独立粒子は後で混合されて、一つの
ハイブリダイゼーション領域を形成するために用いられ
る。同一のまたはより頻繁には最大限に重複したフラグ
メントを有している独立粒子は、上記の原理３を用いて
識別されよう。クローニングにより単離されたフラグメ
ントの使用とは対照的に、フラグメントはここでは同一
であることばまれであって、そのために、密に重複した
フラグメント群が識別される。この状況では、完全な配
列の内容は任意のフラグメント群によって共有される配
列部分として得られる。連結（ハイブリダイゼーション
による配列決定においてライブラリーを序列化すること
）により得られる無作為なフラグメント群を使用するた
めに、各クローンを分離することなく　ＰＣＲまたはそ
れらのクローニングを行うことが必要である。ゲノグラ
ムここ必要なフラグメントの、残りのゲノムＤＮＡから
の「分離ｊは、ＰＣＲ反応によって最も有利に達成され
る。

２）ＰＣＲによる増幅。

ＰＣＲは、増幅の結果生じる連続長を有するフラグメン
トとしてのゲノムライブラリーの調製に用い得る。５ｋ
ｂの長さが立証された。その工程では、ゲノムフラグメ
ント混合物の末端へ単一分子を連結すること、連結産生
物を容量当り一分子に希釈すること、次いで個別のＰＣ
Ｒ反応において、例えば、マイクロタイターウェルにお
いて、それらを用いることが要求される。このようにす
れば、出発フラグメントのクローンをインビトロで得る
ことができる。

アドレスされた液体試料において個々のフラグメントを
分離することなく　ＰＣＲの進行を認めることは可能で
ある。必要条件は、それぞれ単一フラグメントを含むま
たは全く含まない増幅混合物の微細小滴が、適当な皮膜
（おそらく半透過性皮膜）から成る小球体（丸い小粒（
ｐｅａｒｌ））中に独立粒子の集合体（ｃｏｎｇｌｏｍ
ｅｒａｔｅ）とともに囲み込まれることである。独立粒
子の集合体は類似の特徴をもつ独立粒子で構成され、緩
やかな条件下で個々の独立粒子が互いに容易に分離され
る。集合体の利用によって、多数の複製ハイブリダイゼ
ーション領域の調製に必要とされる同一のＤＮＡフラグ
メントを有するより多くの独立粒子を調製することが可
能になる。微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）形成は、
高精度にロボット化されたプロセスというよりもむしろ
脂肪小滴の形成プロセス、すなわち、ある程度の成功度
を有する統計的プロセスと見なされるへきである。

独立粒子の集合体を有してなる微小球の形成は、例えは
、合成あるいは増幅したオリゴヌクレオチドと独立粒子
とを独立粒子の集合体を膜中に形成するための反応に供
することにより行うことができる。微小球の形成に好適
なビーズ体としては、アゾラクトンアクリルアミド（ス
リーエム、米国特許第４，７３７，５６０号）等が挙げ
られる。なお独立粒子としてのガラスピーズ上でオリゴ
ヌクレオチドの合成や増幅を行う場合は、合成の最終段
階（デブロテクションステップ、ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉ
ｏｎ　５ｔｅｐ）でガラスピーズからオリゴヌクレオチ
ドが離脱し易いので、独立粒子への合成オリゴヌクレオ
チドの結合形態を変えることにより、このような離脱を
防ぐことができる。この離脱を生じにくい担体としては
市販の種々の担体、例えばテフロン誘導体ファイバー［
Ｄｕｎｃａｎ、　Ｃ，Ｈａｎｄ　Ｃａｖａｌｉｅｒ、　
Ｓ、Ｌ、。

Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８９
）　１６９：　１０４−１０８］等が利用できる。

それぞれの微小球はマイクロタイターウェルと同様に個
別の増幅反応を表す。増幅後、増幅され＝３２− たフラグメントの球体内への導入は、膜に透過性を付与
する適当な試薬を用いる反応によって行われる。膜およ
び集合体の分裂の結果、十分なコピー数の各ＤＮＡフラ
グメントが適当な数の独立粒子に結合した独立粒子混合
物が形成される。

３）単一フラグメントの増幅に代えて行われる、選択可
能な独立粒子上に密に重複しているフラグメント群の分
離。

ハイブリダイゼーションに基づいた選択による分離が行
われる。各々特異的なオリゴヌクレオチドを有している
１ｏｏｏ万の独立粒子が必要である。

各オリゴヌクレオチドは、通常、ゲノム配列において一
度の出現を確実にする長さを有するであろう。この独立
粒子数を得る方法は以下に説明されよう。大量のゲノム
ロＮＡ配列から得られる（最終的に必要とされるものよ
り長い）任意のフラグメントを５′または３′エキソヌ
クレアーゼの作用に供する。次いでこれらのフラグメン
トを無作為に切断して、再度大きさを選択する。選択的
ハイブリダイゼーションの後、クローニングおよび連結
による共有結合とを行わせる。このようにして、各独立
粒子はそれ自身、任意のオリゴヌクレオチドを含む一本
鎖の末端で内部置換されたオリゴヌクレオチドとのみ結
合されていよう。「同一の」フラグメントを有する独立
粒子の識別は、１および／または２によるの原理のいず
れか一つまたは組合せによって独立粒子を標識すること
によって、および／または原理３によって独立粒子を標
識しない識別法を用いることによって、行うことができ
る。

この選択的工程は、個々のゲノム当りの試料数が１００
〜１０００分の１と小さいゲノグラムにより一層適当で
ある。独立粒子は、調べようとするフラグメント配列に
相補的である選択された配列のオリゴヌクレオチドを有
している。

個別の試料の調製と同様にゲノムＤＮＡの特定のフラグ
メントの調製における問題が独立粒子混合物の使用によ
り解決できる。

淵Δ　　＝α 多数の個別のオリゴヌクレオチドの合成は、標準的「遺
伝子機器（ｇｅｎｅ　ｍａｃｈｉｎｅ）Ｊを用いた場合
、相当な作業になる。しかし、オリゴヌクレオチドの合
成は、組合せ原理を用いることによってかなり高速化す
ることができる。このアプローチによって、少量の個々
のオリゴヌクレオチドの合理的でかつ安価な合成が保証
される。多様に利用される多数の異なるオリゴヌクレオ
チドを充分量に合成すれば、異なる研究室で使用できて
、さらに高度な合理化が達成される。この原理は、既に
リンカ−、アダプターおよびブライマーの合成において
用いられている。このようにしてオリゴヌクレオチドバ
ンクが得られる（Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ、　Ｄｒｍａ
ｎａｃおよびＢｅａｔｔｉｅによる発案）。どのバンク
が最も有用かという問題が起きる。答えは主要な応用分
野に最も適するオリゴヌクレオチドの特徴の識別にある
。すなわち、ハイブリダイゼーションによる配列検出、
既存のＤＮＡ配列の変換および所望の配列のＤＮＡの合
成である。分離された短いＤＮＡフラグメント（増幅フ
ラグメント、サブクローン、ハイブリダイゼーションに
よる配列決定に適するクローン）における配列の検出は
、８．７さらには６個のヌクレオチド長というきわめて
短いオリゴヌクレオチドプローブを用いても行うことが
できる。約２０塩基の長さのオリゴヌクレオチドプロー
ブは、全ゲノム配列とのハイブリダイゼーションに適し
ている。部位特異性突然変異およびＰＣＲのためのプラ
イマーは、通常１５〜２０ｍｅｒである。ＰＣＲにおい
ては、８ｍｅｒでさえも活性ブライマーである。短いブ
ロックの連続的連結に基づ＜　ＤＮＡ合成工程が開発さ
れつつある。全ての可能な３ｍｅｒ〜８ｍｅｒを含むバ
ンクは、次の理由からきわめて有用である。（１）上記
の応用分野、（ＩＩ）バンクが包含する技術的に認容で
きる試料数、（ｉｉｉ）より短いオリゴヌクレオチドか
らより長いオリゴヌクレオチドを産生させる可能性（連
結、ジデオキシヌクレオチドおよび末端転移酵素の使用
）。それらの総数は約９万である。

Ｂｅａｔｔｉｅの計算によれば、８ｍｅｒのバンク（６
５，５３６個のオリゴヌクレオチド）は６力月以内で総
額３００万ドルの投資で合成できるという。１〜２ｍｇ
の各オリゴヌクレオチドのストックを有するこのような
バンクに要する原料および労働コストは２００万ドルで
ある。全オリゴヌクレオチドの各々ｌＯμｇのストック
に要する費用は総額約１万〜２万ドルになろう。これは
現在の市場価格の数十分の−である。

固体担体上へのオリゴヌクレオチドバンクンク（独立粒
子に結合されていても良い）の形成は、それを更に機械
的にまたは手動によって処理して、特異的に修飾された
またはより長いオリゴヌクレオチドを得るという点から
有効であると考えられている（　Ｂｅａｔｅｅ）。ハイ
ブリダイゼーションによる配列決定でまたは他の方法の
いずれかで異なるマークを有するオリゴヌクレオチドプ
ローブの混合物の使用は、個別に合成したオリゴヌクレ
オチドを混合によって形成する代わりに、オリゴヌクレ
オチド混合物の直接合成を可能性とする。例えば、６４
個の３　ｍｅｒは、それぞれを多数の独立粒子への付着
に際して、例えば、ヌクレオチドの独立粒子への付着を
媒介する分子の特徴（蛍光性等）によって、それぞれ異
なる目印イ」けなして合成される。

全６４個の３　ｍｅｒからなる等モル量の混合物が調製
され、１０２４試料に分配される。次いで、ある５　ｍ
ｅｒの合成が各部分で続けられる。このようにして、１
０８８の合成反応で全ての８ｍｅｒが各６４個の混合物
において合成される。

同様の原理は、異なるより長いオリゴヌクレオチド（例
えば、１６ｍｅｒ）をそれぞれ有している１０７個の独
立粒子合成に適用される。これらは選択的ハイブリダイ
ゼーションの原理（上記の３）を参照されたい）によっ
て混合物において試料を調製するために必要である。例
えば、各々１００個の独立粒子を有する３群を用いて（
可能ならば１００個の独立粒子が異なる物理的特徴を有
する）、各群において１００個の異なるオリゴヌクレオ
ナトを独立粒子ｔこ連結させる。１６ｍａｒのオリゴヌ
クしオチドを合成したい場合には、５　ｍｅｒからなる
二つの群と、６ｍｅｒからなる一つの群を用意する。更
に、同様のオリゴヌクレオチドの組合せを有するが、独
立粒子に結合させていない三つの群を用意する。独立数
子群と付着されていないオリゴヌクレオチド群との全て
の組合せに必要な六つの個別の反応において、各々１６
ｍｅｒの異なるオリゴヌクレオチドを有する６００万個
（独立粒子の限界数）の独立粒子が得られる。このよう
にして、３００個の異なる出発オリゴヌクレオチドなら
びにいくつかの置換および連結反応を用いて、混合物（
この場合は独立粒子混合物）において多様な必要な数の
オリゴヌクレオチドを調製することができる。

組合せ合成、バンク形成および混合物における合成の可
能性を考慮すると、合成および操作数は必ずしも多くは
なく、結果的に、オリゴヌクレオチド価格は量すなわち
原料のコストに直接関連すると結論づけられる。独立粒
子をドツトプロットの代用として使用すればオリゴヌク
レオチドプローブの必要量は減少するので、この意味で
は相当有利である。面積当り同一のターゲット密度を得
るために、独立粒子当りのターゲット量はドツト当りの
量よりきわめて小さいものが要求される。

ハイブリダイゼーション領域の全面積もきわめて＝３９
− より小さく、このためハイブリダイゼーション緩衝液の
必要量すなわちオリゴヌクレオチドプローブ量が減少す
る。独立粒子の直径が４μ■の場合、したがってその最
大切断面積は約１０μｍ２である。

ドツト面積が１　ｍｍ２の場合、その割合は１：１０５
である。無作為の単層の形成において、各独立粒子が少
なくとも一度ハイブリダイゼーション領域に含まれるた
めには１０倍の独立粒子が必要であって、かつ、この場
合の利用可能な空間は僅かに１０％であるという計算に
基づくと、上述の割合は１　：　１０００になろう。絶
対数についていえば、一つのハイブリダイゼーション領
域中の独立粒子の面積はｌＯｌｏＸｌｏであって、一方
ドットでは１　ｘ　ｉ　ｃｍである。一つのハイブリダ
イゼーション領域が１０００個のオリゴヌクレオチドプ
ローブ（１０〜１０００個のオリゴヌクレオチド混合物
×１００〜１０回洗浄）の試験に用いられる場合、全面
積は１ｍ２対１０００ｍ２になる。最初のケースでは、
ハイブリダイゼーションによる配列決定における各オリ
ゴヌクレオチドプローブの必要量は次の方法で計算でき
る。−個のオリゴヌクレオチドプローブはクローン各１
０個ごとに１ターゲツトを有し、無作為の試料採取のた
めに１０倍の独立粒子を必要とするため、１０個のオリ
ゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズされる独立粒
子の総数は、クローン数（ｔｏｏｏ万）に等しい。ＣＣ
Ｄ　（Ｃｈａｒｇｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ）
カメラを用いて１個の独立粒子上のシグナルを検出する
には、１０００個以下の蛍光性分子による標識を行えば
充分である。ハイブリダイゼーションにおいてオリゴヌ
クレオチドプローブの僅か０．１％が利用されると推定
した場合、全クローンとのハイブリダイゼーションには
１０１３個のオリゴヌクレオチド分子が必要である。ｌ
ｌ１ｇの８　ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブは約
３Ｘ１０”分子を含むので、個々のオリゴヌクレオチド
のこのような量は充分すぎるほどである。ドツトシステ
ムにはおそらく１ｍｇのオーダーからなるより大きな量
が必要とされよう。ライブラリーのＢｅａｔｅｅの価格
によれば、１ゲノム（または１００ゲノグラム）当りの
ドルの節約は、ドツトから独立粒子システムへの移行で
、約１００万米ドルになるという。

ハイブリダイゼーションをオリゴヌクレオチドの内容の
決定工程とみなすように限定した場合、単一ターゲット
分子の検出の問題には二つの要素がある。第一は単一タ
ーゲット分子とのハイブリダイゼーションが起きる可能
性（成功度、有効性、確率）であり（オリゴヌクレオチ
ドプローブが過剰になる可能性がある）、第二は得られ
るバイブリドの検出である。これまでのところ単一分子
ハイブリダイゼーションを検出するための効率的または
簡単な工程は開発されていないので、この反応について
も知られていない。単一分子ハイブリダイゼーションは
、ある確率（試験の一定の％で）で起きると仮定できる
。このような事象の検出には二種類ある。第一の検出は
、後に多様に増幅されるとしても、シグナルの検出はハ
イブリダイズするプローブ上のマーカー（例えば、蛍光
性分子、酵素活性）によって行われる。第二の検出では
、ハイブリダイゼーションがそれ自身で増幅される。

その理論は、天然およびインビトロの増幅反応における
、全ての指数級数的倍加（細胞分裂、ＤＮＡ複製、ＰＣ
Ｒ，連結増幅反応（ＬＡＲ；　ｌｉｂａｔｉｏｎａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ））に用いら
れる理論と同じである。産生物の全量はｋＸｎ’であっ
て、ｎは通常２で増幅因子を表し、Ｃは周期数、ｋは効
率因子である。ゲノグラム決定のためには、方法の基本
的必要条件がかなうことおよびそれが配列または少数の
その変異体に関する予めの知識であることから、ＬＡＲ
を用いることができる。１．ＡＲを未知の配列のハイブ
リダイゼーションによる配列決定に適用するのはより難
しい。ハイブリダイゼーションのレポーター（通常ビオ
チンを有している）であるオリゴヌクレオチドは、混合
物（おそらく４〜５　ｍｅｒ）において理論的に可能な
全配列を用いるためになるべく短くされる。さらに、Ｌ
ＡＲには、連結産生物をそれが形成されるドツトまたは
独立粒子とにいかに位置決めするかという問題がある。

位置固定の問題が解決すれば、連結反応とレボ−ター分
子の特異性に関する必要条件を回避することができる。

簡便な増幅ハイブリダイゼーションの概要は以下の通り
である。

端部に結合のための特異的な基を有するオリゴヌクレオ
チドプローブとの結合能を有している独立粒子および単
一のターゲットを調製する。次いで、これらの両者との
相補性を有しかつ同様に特異的な基を有しているオリゴ
ヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションさせる
。・識別的ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、変
性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）およびオリゴヌクレオ
チドプローブの独立粒子への結合反応が行われる。この
結合反応は任意の独立粒子上でターゲットにハイブリダ
イズされるオリゴヌクレオチドについてのみ可能である
ことに注意しなければならない。このようにして、陽性
のハイブリダイゼーションを有する独立粒Ｙ竹二つのタ
ーゲット分子が得られる。出発オリゴヌクレオチドプロ
ーブおよび相補的オリゴヌクレオチドプローブの両方を
用いるハイブリダイゼーション反応を繰り返す（合一４
４＝ 成ターゲット）。変性およびハイブリダイズされたオリ
ゴヌクレオチドの結合との新サイクルにおいて、ターゲ
ット数が倍加される。検出できる数のオリゴヌクレオチ
ドが独立粒子に結合されるまで、このサイクルが繰り返
される。短いオリゴヌクレオチドプローブ（ハイブリダ
イゼーションによる配列決定用の８　ｍｅｒ）との最初
のサイクルの後、より長いプローブや最初のターゲット
から全く独立したターゲットとのハイブリダイゼーショ
ンへの転換ができるということは興味深い。識別はこの
ようにして高いサイクル数において容易に達成される。

これは、−次オリゴヌクレオチドブローブよりも長い、
合成ターゲットの使用によっておよび合成ターゲットに
相補的な一つの追加オリゴヌクレオチドプローブの使用
によって、達成される。

いずれにしろ、陽性の結果を得る確率の小さいプロセス
である単一分子レベルでのハイブリダイゼーション検出
を（または一般的に）、同一ターゲットを有する多数の
独立粒子上での実験または同−独立粒子で同一オリゴヌ
クレオチドプローブを用いたより多数の実験の結果とし
て、統計的に処理することができる。１個の独立粒子に
ついて行われるこのより多数の実験は、多くのサイクル
のハイブリダイゼーションに統合される。この場合、陽
性のハイブリダイゼーションは、ある臨界値以上のシグ
ナル強度の広い範囲内で識別される。

これはドツトまたは独立粒子において増幅されたターゲ
ットのモル濃度に大きな差異があるという状況に類似し
ている。

ゲノム配列決定のための望ましい効率の情報アプローチ
において、コンピューター記憶装置に毎秒１０５ないし
１０６ビツトの二進法情報を記憶させる必要があること
が確立されている。情報ゲノムアブａ−チのマトリック
スは１０７ターゲツト×１０５個オリゴヌクレオチＦプ
ローブからなるのでこのスピードは理論的に両極値で、
すなわち毎秒］　　（１０）ターゲット×全オリゴヌク
レオチドプローブまたａ、ｔ１０６〜１０６ターゲツト
×１オリゴヌクレオチドプローブのサブマトリックスを
読み取ることによって得られる。もちろん、他の小さい
または大きい平方サブマトリックスも全て同様に可能で
ある。実用面からいえば、一つまたは他の構成要素の極
値に基づくこれらマトリックスは調製しないほうがより
簡単である。例えば、単一オリゴヌクレオチドプローブ
についてマトリックスを一つだけ用いる場合、１０万の
個別のハイブリダイゼーションを行わなけれはならない
。一方、同時的ハイブリダイゼーションを行って、続い
て１０万個のオリゴヌクレオチドプローブを識別するこ
とは難しい。したがって、１０’ないし１０５ターゲツ
ト×１０〜１００個オリゴヌクレオチドプローブのよう
な型の多くのサブマトリックスの平行形成が、今後推進
すべき最も合理的な方法だと思われる。この平行形成に
は、単一ハイブリダイゼーション領域上における同一オ
リゴヌクレオチドプローブ群を有する１００〜１０００
個の全サブマトリックスの形成と、多くの異なるオリゴ
ヌクレオチド群を有する複製ハイブリダイゼーション領
域上の個別の容器（ｖｅｓｓｅｌｓ）での同時的ハイブ
リダイゼーションとの二種類がある。個別のハイブリダ
イゼーション数の観点から、僅か１０００個の個別のハ
イブリダイゼーション反応とおそらく同数の個別のオリ
ゴヌクレオチドプローブの合成操作（混合物におけるオ
リゴヌクレオチドプローブの合成に関する項を参照され
たい）とを必要とする１００個のオリゴヌクレオチドプ
ローブ群を用いることがより望ましい。一方、１０４〜
１０５ターゲツトは、効率的な画像分析を達成するため
の電子カメラにおいて約ｌＯＯ万個の画素（ｐｉｘｅｌ
）を必要とする。ＣＣＤカメラは、約１０Ｘ　１０μｍ
の画素を６５万から１３０万個有することができる。し
たがって、示唆されたマトリックスは単一の絵とみなす
ことができる。画像および独立粒子の大きさは、光学顕
微鏡を用いる可能性があるため、直接に互いに依存する
ものではない。画像分析には、０．１７ｚｍの大きさの
独立粒子を用いることができる。既存のＣＣＤカメラの
有−４８＝ する画素分析の速度は毎秒５万画素で、これは毎秒１０
０万画素という必要条件の約２０分の１の遅さである。

表示されたスピードには、「写真記録（ｐｈｏｔｏｇｒ
ａｐｈｉｃ　ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）　Ｊ、計数化、コン
ピューター記憶装置への記憶が含まれる。おそらく技術
的特徴は、理論的限界よりもむしろ限定因子であろう。

より強力な装置を用いれば、特に大きな計数解析が必要
とされない場合に、より迅速な計数化が得られる。コダ
ック社は毎秒１０シフト（１０個の異なる画素）で８ビ
ツト（シグナル強度２５６レベルの識別）の１００万画
素を読み取るカメラを発表した。一方、ハイブリダイゼ
ーション画像を映像画面で見たり再構築したりする必要
がない、ということを指摘しなければならない。このこ
とは、時間の節約を意味する。

最も適当なサブマトリックスには、難しい問題がある。

それは１０〜１００個のオリゴヌクレオチドプローブと
の同時ハイブリダイゼーションであり、これを達成する
ためには多くの標識が混合物中で識別される必要がある
。また、ハイブリダイゼージョンによる配列決定におけ
る数学的期待では、各プローブはクローンの１０％（ゲ
ノグラムではさらに少ない）とハイブリダイズするたろ
うということに留意する必要がある。これは、１００個
のオリゴヌクレオチドプローブ゛の混合物を用いると、
各ドツトまたは独立粒子毎に約１０個のオリゴヌクレオ
チドプローブをハイブリダイズすることを意味する。こ
の問題の解決に影響を及ぼす二つの実験的に確認された
アプローチがある。一つは異なる蛍光性分子の使用であ
り、他方はマス分光分析と合わせたガスクロマトグラフ
ィーである。前者においては、１０個以上の異なる蛍光
性分子の使用を想定することは難しく、それらを（単一
独立粒子について）検出するためには、波長またはフィ
ルターの異なる励起光が必要となる。波長またはフィル
ターのあらゆる変化が新たな物理的操作になり、ハイブ
リダイゼーションにおいてのみ最適にできるが、画像分
析においてはそうではない。しかし、ＣＣＯカメラは精
度と感度がきわめて高く（毎秒２フオトンまで）、この
アプローチの可能性を一５１＝ 大にする。この画像分析には、ハイブリダイゼーション
反応後の独立粒子を適当な基体上に単層として固定して
画像分析する方法が利用できる。この単層の形成は、例
えば独立粒子を共有結合により固定可能な表面を有する
基体が利用できる。該基体としては、例えは付着性スラ
イド（ａｄｈｅｓｉｏｎｓｌｉｄｅｓ、タイプＩ、バウ
ルマリエンフィールドにＧ、パート　メルゲントハイム
、西独）等のシアン化した表面を有するガラス等からな
る基板、独立粒子に結合させたビオチンとの結合が可能
なアビジン、ストレプトアビジンをコートした表面を有
する基板、独立粒子の表面にある反応性基と特異的な共
有結合を形成し得る反応基をその表面に有する基板等を
挙げることができる。後者のガスクロマトグラフィーを
用いる方法は、ハイブリダイゼーションの結果を独立粒
子の序列化された流れによって検出する方法であり、こ
の方法を用いることで可能性としては１０００標識でさ
えも識別できるが、単一または少数の試料でのみ適当（
または可能）である。この方法論が効果的に働くために
は、毎秒１００〜１００個の試料から全データを平行的
に獲得する技術を開発する必要がある。これを、序列化
されていない微小試料を独立粒子の形で用いることと調
和させることは難しい。

画像分析のための最も単純な方法は、大きさ、形状、色
等の物理的特徴に基づいて、多数の対象を識別すること
である。これらの特徴は、蛍光性分子によって放出され
る特定の光量子（ｐｈｏｔｏｎ）とは対照的に、種々の
光量子パターンに変形される。これによって、「無限の
」数の重複しない対象を識別することができる。したが
って、画像分析において、物理的に異なる数百の独立粒
子を識別することが容易となる。このターゲット標識原
理をオリゴヌクレオチドプローブの識別（標識）にも同
様に用いることができるかどうかが問題になる。これは
二つの原理の適用により解決できる。

すなわち、１）オリゴヌクレオチドプローブは光学顕微
鏡によって識別され、画像分析において有用な物理的属
性（ｅｎｔｉｔｙ）を有している。また、２）オリゴヌ
クレオチドプローブは、特異的物理的属性の局限的形成
のためのイニシエーターとしてハイブリダイゼーション
後乙こ利用される化学的属性を有している。

第一原理の最も単純な適用は、物理的特徴に従って相互
に識別できる独立粒子にオリゴヌクレオチドプローブを
結合させる、二重独立粒子システムである。陽性ハイブ
リダイゼーションによりロゼッ）　（ｒｏｓｅｔｔｅ）
形成か導かれる。すなわち、ターゲットを有する独立粒
子は、該ターゲット中の配列と相補的配列を含むオリゴ
ヌクレオチドプローブを有している独立粒子によって取
り囲まれる。

二分子識別反応を可視化するこの原理は、適当な細胞に
よるロゼツト形成によって陽性抗体抗原反応が識別され
る免疫学において用いられている。

この方法における基本的な要件は、オリゴヌクレオチド
プローブによるハイブリダイゼーションによって二つの
独立粒子を結合させておくのに充分な強力なエネルギー
を有する充分な数の化学的結合の形成を導くことができ
るかどうかということである。適用されるシステムは、
−塩基対が対になっていないレベルにおける同時的個別
のハイブリダイゼーション（ミスマツチハイプリダイセ
ーション）を可能にしなければならないということを忘
れてはならない。

第二のアプローチは、ハイブリダイゼーションにおいて
形成される化学結合による独立粒子の連鎖を必要としな
い。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブで開始さ
れる反応等が局所的に識別可能な物理的特徴変換される
方法である。おそらくある試薬（例えば、ある金属イオ
ン）の局所的濃度を利用する必要があろう。問題は次の
ように言い替えることができる。すなわち、一つまたは
いくつかの反応において、局所的に分配された１０個の
異なるイオンをいかにして局所化されて物理的に異なる
属性に変換できるかということである。

システムにおいて加えられる特異的独立粒子とターゲッ
トを有する独立粒子の、ターゲットを有する独立粒子表
面における化学的相互作用をイオンによって開始きせる
方法が利用できる。また、特異的で識別可能な微小結晶
の局所的形成を開始させる方法が利用できる。

以上説明した本発明のモデルケースとして、配列決定用
の情報を作成するための種々のオリゴヌクレオチドやＤ
ＮＡを試料としてナイロン膜［ニューイングランドヌク
レアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、デ
ュポン（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）　］に固定し、これら試料の
配列決定のための直接及び間接（ｒｅｖｅｒｓｅ）ハイ
ブリダイザ−ジョンを行い、各試料の配列情報とそれに
対応するプローブをメモリーした。次に、分析対象とし
ての試料としてテフロン誘導体ファイバー上で８〜１０
ｍｅｒの各種オリゴヌクレオチドを合成し、それらをモ
デルオリゴヌクレオチド’　（２５ｍａｒ）をプローブ
としたハイブリダイゼーションにかけた。その結果、良
好なハイブリダイゼーション反応とその識別が行えた。

なお、Ｌｉｃｈｔｅｒ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ−（１９８８）：　８５Ｌ、９８
６４−９６６８には固定化した種々の細胞染色体の蛍光
分析法が開示されている。これら固定化された細胞染色
体は本発明における独立粒子と類似の粒径（例えは１〜
ｌＯμｍ）を有し、１種のプローブとハイブリダイズさ
れて蛍光により検出される。各細胞染色体は、共通のプ
ローブとハイブリダイズする遺伝子のコピーを有する。

標識検出のための蛍光分析の感度を考慮すると、ハイブ
リダイズした試料における蛍光発色団の数は約ｌＯＯ程
度とみなすことができる。そこで、本発明において標識
として蛍光発色団を使用した場合、良好な標識の検出が
可能であったことから、独立粒子に少なくとも１００個
のＤＮＡ等のプローブとハイブリダイズする分析対象と
しての核酸分子を吸着させることができたことになる。

したがって、蛍光分析を用いる場合には、独立粒子に少
なくとも１００個のプローブとハイブリダイズする核酸
分子が吸着しているように必要に応じて増幅を行うこと
が好ましい。

会　ゝボ　　　　　、：：＋ 本発明は、ゲノム−次構造決定、生態系の調整および自
己調整の決定、癌の治療、その他の分子生物学の中心問
題の解決己こ必要な方法を開発するための、より合理的
なアプローチを定義付ける試みである。問題の理論的処
理および理論的に可能な全てのアプローチの特徴の比較
は、いくつかの方法および工程を非効率的または不可能
なものであるとして除去して、より効率的な工程の開発
を開始して促進するという目標を有する。ここで、ＰＣ
Ｒ反応は材料となる構成要素がすべて明らかになる以前
になぜ「発見」されなかったかという疑問が起きる。単
一のＤＮＡフラグメントまたはフラグメントライブラリ
ー増幅方法の徹底的な理論的分析によって、ＰＣＲと現
在きわめて明白なその利点とを予測し得たということを
仮定して思い返すことは、魅力的である。そのような理
論概念の存在は、ＰＣＲのより早い適用をもたらしたで
あろうか。その複雑さと大きさから、ヒトゲノムプロジ
ェクトは、方法論的要求の理論的処理およびそれらを満
たす方法を、必然的に必要とする。ゲノムを副次的実験
に供することはできないので、より効率的なアプローチ
の経験的発見は不可能である。

ここで定義される情報原理（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａ
ｌｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）は、配列比較のために有効な互
除法（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いる場合のように、オ
リゴヌクレオチド配列言語の使用に基づく。今のところ
、オリゴヌクレオチド配列の内容を決定するには二つの
（実験確認を伴う）天然分子工程がある。すなわち、ハ
イブリダイゼーションによる相補性に基づく識別および
いくつかのタンパク質に用いられる特異的識別である。

第一の工程は、いかなる配列をも識別できることおよび
ハイブリダイゼーションの安定性によっておそらくより
容易であるために、より一般的である。これにかんがみ
て、本発明者らは、オリゴヌクレオチドプローブハイブ
リダイゼーションはゲノム配列の編集に中心的役割を果
たすであろうと考える。オリゴヌクレオチドプローブハ
イブリダイゼーションの基本的情報の特徴はオリゴヌク
レオチドプローブの内容の決定であり、これはおそらく
オリゴヌクレオチドの識別に最良の方法である。

基本的原理によって、破壊されない平行性（試料は一斉
にゲノムＤＮＡから画像分析へ進む）および増幅カスケ
ード（１００ハイブリダイゼーシヨン領域×１０ゲノム
部分×１０５−６個の独立粒子ＸＩＯ回洗浄×１００個
のオリゴヌクレオチドプローブ／ハイブリダイゼーショ
ン×１０日＝１０１３ユニット情報データ）の技術的利
点が得られる。これを平行工程の平行性、すなわち二次
平行性（ｑｕａｄｒａｔｉｃ）と称することができる。

各段階で少数の操作が行われるが、段階当りのユニット
情報ビットの増加は加法ではなく乗法で増加するため、
情報ビットの総収量は膨大である。異なる試料について
同一である予め調製された資源や原料の使用の最大化お
よび試料の特異的処理の最小化によって確実になる技術
的利点を利用することもできる。この機能的カセット調
製は、任意の種の個々の対象、すなわち個々のゲノムに
依存しない（かつとのゲノムにも用い得る）。その結果
、どのＤＮＡにも用い得る、型−基本的要素塩基性元素
Ｘ位置（ｔｙｐｅ−ｂａｓｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｘρ
ｏｓｉｔｉｏｎ）の統合的な情報を含むオリゴヌクレオ
チドプローブが調製される。この結果、また、アドレス
された情報を統合している独立粒子が調製されるので、
ロボットによる位置操作による決定を必要としない。一
度作られた配列を作出するためのコンピューターパッケ
ージソフトウェア−は、化学者−実験室の介在なしで、
新しいデータセットで再使用することができる。

最終分析では、情報アプローチは、情報コンピュータ一
作業を犠牲にして実験必要条件の減少をもたらす。上記
のいくつかの概念的解決法および可能な、または結果的
に可能な、実用的工程とに基づいて、実験必要条件を減
少させる可能性を推定することができる。このようにし
て、実験的表面積とオリゴヌクレオチドプローブの量を
約千分の−に減少することができる。古典的な配列決定
およびクローン培養のための容器を用いるドツトプロッ
トシステムにおける、おそらく必要となる試料の必要量
、クローン当り各々少なくとも１００μｍに対応する減
少が、予期される。１０００万個の試料のための総容量
は、数トンになろうが、本発明のマイクロハイブリダイ
ゼーションでは数リットルである。空間的および物質的
節約よりも重要なことは、ロボット操作数を減少させる
ことて一６〇− ある。ｔｏｏｏｏのピペット指（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ　
ｆｉｎｇｅｒ）を有するロボットでは、１０００万ドツ
トを有する１枚のフィルターを作るためには、１０００
回の操作が必要である。独立粒子システムを用いると、
数個（１０〜１０００）のピペット単位（ｐｉｐｅｔｔ
ｉｎｇ　ｕｎｉｔ）を有するロボットの手は単一の操作
で同程度の作業を行うことができる。このようにして、
「ゲノム設備（ｇｅｎｏｍｉｃ　１ｎｓｔａｌｌａｔｉ
ｏｎ）Ｊは、今日の大型実験室装置の規模へと小型化さ
れる。

独立粒子システムは本質的に、単一細胞内で同時に起き
る多数の生化学反応の模倣を表している。

細胞反応の特異性と分離性（ｄ　１ｓｃｒｅｔｅｎｅｓ
ｓ）は、その情報特質が独立粒子によってここで模倣さ
れる酵素作用に基づいている。独立粒子の使用は単位情
報ビット数の少なくとも１０倍の増加を必要とするが、
完全なデータセットを得るための時間および労働投資（
調製およびロボット操作）は数分の１に減少される。次
の数例は、操作の中心をいかにして画像分析へ移すこと
ができるかを示すものであって、それによって、最も効
率的な工程をつくることを意図するものである。ロボッ
ト化されたドツトシステムでは、あらゆるＤＮＡフラグ
メントが各ハイブリダイゼーション領域で一度だけ表さ
れる。独立粒子システムでは、この確実性は、各クロー
ンは少なくとも一度ハイブリダイセーション領域で表さ
れる、という確立に置き換えられる。

これは独立粒子の総数を１０倍に増加させる。一方、１
０倍およびそれ以上の増加は、個々の独立粒子の不完全
なハイブリダイゼーションの許容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
）、すなわち陽性ハイブリダイゼーションの統計的決定
、を可能にする。これは最終的に、目的の実験実行レヘ
ルの低下を意味する。したがって、独立粒子に基づくハ
イブリダイゼーションおよびシグナル読み取り工程は、
より多数のフラグメントからなるライブラリーを許容し
なければならない。それは代わって、より少数のより短
いオリゴヌクレオチドプローブの使用を可能にする。こ
れはゲノグラムの適用において特に明かである。１００
０対のブライマーとオリゴヌクレオチドプローブとを特
異的に選択する代わりに、全増幅フラグメントについて
全オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを行うほうがより効率的である。この利点は、情報
の次の余剰および多形性決定におけるより高い精度およ
び新しい突然変異の検出の可能性を意味することを認識
することによって、さらに強化される。これは双方とも
にかなりの診断的価値を有する。重点を画像分析に移す
ことによって、または、換言すれば、実験作業量を減少
することによって、全ゲノム配列の決定と同一の原理に
従って多数の詳細なゲノグラムを得ることが可能である
。

情報アプローチのこれらの特徴の使用によって、最終結
果として、小型化の他に、多様かつより複雑なデータビ
ットの実験的に収集を必要とする工程と比較してより速
い速度がもたらされる。

比較分析において、ゲノム配列決定のための情報アプロ
ーチの利点と欠点とを、位置決定法からなる実験的アプ
ローチを用いる三つの工程に対して略述する試みは興味
深い。ＤＮＡフラグメントの長さの測定による位置決定
に基づく、今日まで用いられてきた標準法には、選択法
として、はぼ確実にそれを排除する二つの必要条件があ
る。これらは、小型化が実際的には不可能なことおよび
ゲノムＤＮＡの増幅フラグメントを用いる必要性がある
こと、である。その他の二つの方法は情報アプローチを
用いるハイブリダイゼーションによる配列決定または他
の工程のようにこれまでのところ実験的に証明されてい
ないが、これらの必要条件を要しない。直接解読の道具
として用いられるトンネル電子顕微鏡は、ＤＮＡフラグ
メントの増幅を必要としない固有に小型化された工程で
ある。一方、ＤＮＡフラグメントの一端からの塩基によ
る塩基の連続的除去に続いて、フローによる連続的分離
および検出装置による通過における効率的な登録が行わ
れるが、実際的な理由からほぼ確実に一分子レベルでの
使用と検出とを必要とする。おそらく、同一ヌクレオチ
ドの除去をフラグメントのモルレベルで同時に行うこと
は、きわめて難しい、または不可能でさえあるかもしれ
ない。このアプローチは、アドレスされた反応の代わり
に複数の微小管によって確実に分離された領域を用いる
ので、小型化および平行化されると想像することができ
る。

さらに、除去されるヌクレオチドの水流による分離は、
ＤＮＡフラグメントの分離の場合のように、アクリルア
ミドゲル上の一塩基レベルまでの正確さを有するマクロ
な分離を必要としない。このアプローチの主な必要条件
は、単一事象の検出、特に多数の微小管における平行検
出、の精度と速度である。問題は、レーザーおよび画像
分析に基づいた画素と組合せた蛍光性標識の使用におい
て複雑な装置を用いて満足なデータ獲得速度が得られる
かということである。

いずれにしても、両工程は、情報アプローチがもっばら
生化学的分子工程に基づいているのに対して、物理学的
成就に依存している。それは、ハイブリダイゼーション
による配列決定においては、ここで指摘するように、実
験的画像および最小限の技術を要する画像分析に達する
ことができるためである。分子反応の間接的な検出であ
るので、ハイブリダイゼーションによる配列決定は原子
を要しない。また、ハイブリダイゼーションによる配列
決定は位置情報を用いないので反応のいかなる物理的序
列化をも必要とせず、増幅フラグメントの使用を可能に
する。

全ての方法は、「実験画像」の画像分析を含む共通な最
終工程を有する。問題は、この分析にいかに容易に到達
するかである。本発明者らには、ハイブリダイゼーショ
ンによる配列決定は多数の複雑なゲノムの配列決定によ
り適応して効率的であると思われる。オリゴヌクレオチ
ドプローブおよび独立粒子調製のその必要条件のために
、ハイブリダイゼーションによる配列決定は、他の方法
と比較して大規模な配列決定に有用であり、おそらくよ
り効率的であろう。個々のゲノムを公分母（ｃｏｍｍｏ
ｎ　ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ）−オリゴヌクレオチド配
列における約分によって、配列産出のための画像分析後
の情報作業を用いることを可能にする。非情報アプロー
チにおける全作業は実験的特徴を有する。

−Ｉｊ’／−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、個別の反応において増幅、合成または分離されたデ
   オキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分
   子を物理的または化学的特徴に従って識別可能な微視的
   サイズの独立粒子のそれぞれに結合させる過程と、次い
   でこれら粒子を混合してから単一プローブまたはプロー
   ブ群とハイブリダイズさせる過程と、個々の試料におけ
   るハイブリダイゼーションの結果を、検出装置による通
   過時に次々と粒子の序列化された流れによって検出する
   、あるいは画像解析によって染色した粒子の検出を可能
   にする単層の形成によって検出する過程とを有する、混
   合物中でのサンプルハイブリダイゼーション法。 ２、個別の反応で増幅、合成または分離されたＤＮＡま
   たはＲＮＡ分子を、必要に応じて物理的または生化学的
   特徴に従って識別可能な独立粒子のそれぞれと結合する
   過程と、次いでこれら粒子を混合する過程と、この混合
   物から一つの大きなまたはいくつかにより小さく区画さ
   れた単層領域を調製してからこれら粒子を担体に固定す
   る過程を有する、ハイブリダイゼーション領域を形成す
   る方法。 ３、既知の配列を有する種々のオリゴヌクレオチドの調
   製物から、出発オリゴヌクレオチドの特定数を組合せる
   ことによって異なる組成の混合物を調製する過程と、次
   いで各混合物を個別の反応で独立粒子に結合させる過程
   と、同一オリゴヌクレオチド組合せを有している独立粒
   子を出発オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオ
   チドプローブとのハイブリダイゼーションによって識別
   する過程とを有する、独立分子を同一の物理的特徴で標
   識する方法。 ４、同一または異なる物理的または化学的特徴を有し、
   単一分子の形でまたはあるモル濃度で表される既知の配
   列の種々のオリゴヌクレオチドの組合せを有すること、
   およびヌクレオチドのこの組合せが請求項３に記載のハ
   イブリダイゼーションによってまたは他の方法を用いる
   ことによって独立粒子の識別に有用であることを特徴と
   する、独立粒子。 ５、集合体中の独立粒子が同一または類似の物理的また
   は化学的特徴を有し、かつ個々の独立粒子間で容易な分
   離を可能にする弱い物理的または化学的結合によって互
   いに結合していること、および種々の集合体間の独立粒
   子が大きさ、形状、色、化学的性質に従ってまたは請求
   項４に記載のオリゴヌクレオチドの組合せによって識別
   されることを特徴とする、独立粒子の集合体。 ６、混合物中の各独立粒子が単一分子の形でまたはある
   モル濃度で一つの機能的オリゴヌクレオチドを有してお
   り、一つのまたは数個の混合物に含まれ、同一オリゴヌ
   クレオチドを有する独立粒子は同一の物理的および化学
   的特徴を有すること、および異なる機能的オリゴヌクレ
   オチドを有している独立粒子は物理的および化学的特徴
   に基づいて同一または異なっており、異なるオリゴヌク
   レオチドの組合せを有していてもよいことを特徴とする
   、独立粒子の混合物。 ７、ライブラリーが、同一核酸分子を有するより多数の
   独立粒子および生物学的出発試料における配列の内容を
   表す種々の分子の充分な総数を含むこと、各配列が多数
   モル（大きな塩基数）で表される核酸の出発試料におい
   て相補的配列をほとんどの場合に一回のみ含むか全く含
   まない機能性オリゴヌクレオチドを用いて請求項６に記
   載のようにして独立粒子混合物を使用すること、および
   次いでハイブリダイゼーション工程によって核酸フラグ
   メントの分類を行った後に同一の機能性オリゴヌクレオ
   チドを有する全ての独立粒子が同一の、主として重複ま
   たは非常に相同な配列を有するフラグメントを含むよう
   に独立粒子に固定させることからなる、個々の分子もし
   くは同一または大部分重複するゲノムＤＮＡ、相補的Ｄ
   ＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを有している独立粒子
   のライブラリーを形成する方法。 ８、同一のまたは異なる短いＤＮＡフラグメントを両端
   で必要な長さのゲノムフラグメントに酵素的に結合させ
   ること、次いでフラグメントを単一ＤＮＡ分子を含む、
   またはＤＮＡ分子を含まない個別の試料を形成すること
   ができるような方法で充分に希釈すること、およびポリ
   メラーゼを媒介としたインビトロの酵素的連鎖増幅反応
   を連結されたＤＮＡフラグメントに相補的なプローブを
   用いて行うかまたは連結されたフラグメントがプロモー
   ター配列を含む場合にはＲＮＡポリメラーゼを用いて行
   うことからなる、ゲノムライブラリーをインビトロで形
   成する方法。 ９、請求項５に記載の独立粒子の集合体を単一または皆
   無のゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのフ
   ラグメントを有する増幅混合物のある量を用いる任意工
   程によってマクロ分子非透過性皮膜中に封入すること、
   請求項８に記載の増幅を行うこと、ＤＮＡを独立粒子に
   固定してからおよび皮膜と集合体とを破壊した後に個々
   の独立粒子の混合物（相当数の独立粒子は各々ゲノムＤ
   ＮＡ、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの同一フラグメントを
   多数有している）を得ることからなる、請求項８に記載
   の増幅反応を用いて独立粒子上にライブラリーを形成す
   る方法。 １０、あるモル数（塩基数）を有するオリゴヌクレオチ
   ドプローブを、プローブからプローブへ識別することが
   できる視覚的に識別可能な独立粒子に結合させてオリゴ
   ヌクレオチドプローブの混合物の使用を可能にすること
   、および対応するハイブリダイゼーション洗浄後のハイ
   ブリダイゼーシヨンを、固体担体上の相補的配列を含む
   ターゲットが配置された独立粒子またはスポットに結合
   した独立粒子のロゼットとして識別することからなる、
   ハイブリダイゼーションを視覚的に検出する方法。 １１、特定の組織、特定の細胞培養、腫瘍成長のある時
   間内の特定の培養もしくはある外的媒介因子の作用後の
   細胞培養または組織から既知の方法または他のいくつか
   の方法を用いて請求項７または８または９に記載のよう
   にして調製されるｉＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー
   を４〜１２塩基ｂｐの長さの充分な数の個々または群の
   オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイさせること
   、および検出されたオリゴヌクレオチド配列内容に基づ
   いて発現のプロフィールおよび遺伝子の類似性を決定す
   ることからなる、クローニングされない遺伝子または遺
   伝子ファミリーの同定ならびに全体の遺伝子発現の位置
   選定、速度調節および調製の平行的研究の方法。 １２、請求項１１に記載のようにして調製されたる任意
   の（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の生物学的試
   料のライブラリーを４〜２０ｂｐの長さの一部または全
   オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイさせること
   、および検出されたオリゴヌクレオチド配列内容に基づ
   いて個々のクローンのまたは任意の核酸試料の一部また
   は完全な配列をコンピューター操作で得ることからなる
   、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの一部または
   完全な配列の決定法。 １３、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡまたはｃＲ
   ＮＡ分子およびその配列を同定して単離すること、また
   はそれらの配列を請求項１１または１２に記載の方法を
   用いて決定するを特徴とする、ゲノムＤＮＡフラグメン
   ト、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ分子とそれらの配列。