JP2008298785A - 固体支持体に核酸を固定化するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】固体支持体に結合したビーズから形成された得られた表面は、「平坦」な表面と比べて増加した、生物学的粒子または巨大分子(特に核酸)の固定化のための表面積を有利に与える。さらに、所望の官能性を有するビーズを選択することにより、選択した巨大分子または生物学的支持体を固定化するための、固体支持体の化学的性質とは異なる適当な官能基化の化学的性質を得ることができる。
【選択図】なし
Description
分子生物学および生化学の分野ならびに疾患の診断においては、核酸ハイブリダイゼーションが、特異的オリゴヌタレオチド配列の検出、単離および分析のための有効な手段となっている。典型的には、そのようなハイブリダイゼーションアッセイ、例えば逆ドットブロット法(Saikiら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86:6230)では、固体支持体上に固定化されたオリゴデオキシヌクレオチドプローブを使用する。最近、ハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)用に、固体表面に結合した固定化DNAプローブのアレー(配列)が開発された(Drmanacら(1989)Genomics 4:114-128)、(Strezoskaら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10089-10093)。SBHでは、固体支持体に固定化されたオリゴデオキシヌタレオチドの、規則正しいアレーを用いる。未知DNAのサンプルを該アレーに適用し、該ハイブリダイゼーションパターンを観察し、分析して、多数の短い部分配列情報を同時に得る。一本鎖の3'-または5'-突出部を含有する二重プローブを使用する、SBHの拡張形態(ポジショナルSBH(PSBH)と称される)が、開発されている(Broudeら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91:3072-3076)。現在では、例えばゲル電気泳動により検出可能な配列決定用ラダーを生成させるために、PSBH捕捉アプローチと通常のサンガー配列決定法とを組合せることが可能である(Fuら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:10162-10166)。
「平坦」な表面と比べて、固体支持体に結合したビーズは、核酸の固定化のための表面積の増加をもたらす。さらに、所望の官能性を有するビーズを選択することにより、実施者は、固体支持体の化学的性質とは異なる、核酸を固定化するための官能化の化学的性質を選択することができる。
図1は、固体支持体に対するビーズの共有結合、および該ビーズに対するDNAの共有結合を示す図である。
A.定義
特に示さない限り、本明細書中で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同意義を有する。本明細書中に引用するすべての特許および刊行物は、特に示さない限り、それらの全体を参考として本明細書に組入れるものとする。本節の定義が他の定義と一致しない場合は、本節に記載の定義が優先する。
本発明は、ビーズを介して固体支持体に結合した結合巨大分子または生物学的粒子を有する固体支持体を提供する。該ビーズは、そのような結合に関して適切に官能化されており、適当な任意の形状を有する。本明細書においては、例示として核酸を記載する。しかしながら、該方法および結合ビーズを有する固体支持体は、他の巨大分子の固定化に関して、また、生物学的粒子およびそのような支持体に対する固定化に適した他の任意の分子に関して使用することができると理解される。
また、例えば、N7またはN9デアザプリンヌクレオシドを使用することにより、あるいはリンカーアームによるdTのC5の修飾により(例えば、Eckstein編,"Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach",IRLPress(1991)を参照されたい)、核酸塩基を修飾することができる。あるいは、バックボーンが修飾された核酸(例えば、ホスホロアミダートDNA)を使用して、修飾リン酸バックボーンにより付与された窒素中心に反応性基を結合させることができる。
支持体は、ビーズ〔シリカゲル、制御多孔質(controlled pore)ガラス、磁性ビーズ、Dynabeads、Wang樹脂;Merrifield樹脂、セファデックス/セファロースビーズ、セルロースビーズなど〕、毛細管、平坦な支持体、例えばガラス繊維フイルター、ガラス表面、金属表面(鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素および銅)、プラスチック物質、例えば多ウェルプレートまたは膜(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリドからなるもの)、薄延物、櫛状物、ピンまたは針(例えば、コンビナトリアル(combinatorial)合成または分析に適したピンのアレー)、または薄延物(例えば、シリコンウェーハ)、濾過底(filter bottom)を有するまたは有さない有孔薄延物などの平坦な表面のナノリットルウェルまたは小孔のアレー中のビーズを含む任意の形態であることが可能である。
本発明での使用に適した「ビーズ」には、固体支持体と対合することが可能であり生物学的粒子および巨大分子(例えば、DNAおよびRNA)の固定化のための表面積の増加をもたらす任意の三次元構造体が含まれる。好ましくは、該ビーズは、直径約1〜約100μmの大きさである。本発明の目的には、ビーズは、実質的に不溶性または固体の任意の物質から調製することが可能である。例えば、該ビーズは、シリカゲル、ガラス(例えば、制御多孔性ガラス(CPG))、ナイロン、Wang樹脂、Merrifield樹脂、セファデックス、セファロース、セルロース、磁性ビーズ、Dynabeads、金属表面(鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素および銅)、プラスチック物質(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF))などから調製することが可能である。ビーズは、膨潤性(例えば、Wang樹脂などの重合性ビーズ)または非膨潤性(例えば、CPG)であることが可能である。
生物学的粒子および巨大分子(例えば、核酸分子)は、リンカーを介してビーズに直接結合させることができる。対合は、適当な任意の手段、特に、共有結合または非共有結合によるものであることが可能である。例えば、ビーズに核酸を対合させるための1つの実施態様においては、該対合手段は、ビーズと核酸との間に可変性スペーサーを導入する。もう1つの実施態様においては、該対合は、例えば光切断性結合の場合のように直接切断したり(例えば、ストレプトアビジン−またはアビジン−ビオチン相互作用は、例えば質量分析用にレーザーにより切断することが可能である)、あるいは光切断性リンカー(例えば、来国特許第5,643,722号参照されたい)または酸不安定性リンカー、熱感受性リンカー、酵素切断性リンカーまたはそのような他のリンカーを介して間接的に切断することが可能である。
分子を支持体およびビーズに対合させるため及び/又はビーズを支持体に対合させるために使用するのに適した架橋剤には、それぞれビーズ、不溶性支持体および/または分子(例えば、核酸)の表面上に存在する官能基と反応しうる種々の物質、またはそれぞれ分子、例えば核酸および/またはビーズ中に存在する官能基と反応しうる種々の物質が含まれる。そのような反応性を有する試薬には、ホモおよびヘテロ二官能性試薬が含まれ、それらの多くは、当該技術分野で公知である。ヘテロ二官能性試薬が好ましい。好ましい二官能性架橋剤は、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾアート(SIAB)である。また、他の架橋剤、例えば、ジマレイミド、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸(DTNB)、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセタート(SATA)、N−スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、6-ヒドラジノニコチミド(HYNIC)など(これらに限定されるものではない)を本発明で使用することも可能である。
また、二官能性トリチルリンカーを、アミノ基を介して樹脂(例えば、Wang樹脂)上の4-ニトロフェニル活性エステルに結合させたり、アミノ樹脂を介してカルボキシル基から結合させることができる。該二官能性トリチルアプローチにおいては、該核酸が切断され取り出し可能となるのを保証するために、該ビーズを揮発性酸(例えば、ギ酸、トリフルオロ酢酸など)で処理することが必要かもしれない。その場合、該核酸が固体支持体中のウェルの底に又は固体支持体の平坦な表面上に無ビーズパッチ(beadless patch)として沈殿する可能性がある。マトリックス溶液を加えた後、該核酸を脱着させ、例えば質量分析計にかけることができる。
前記のとおり、ビーズを、非共有的相互作用により固体支持体に同伴させることも可能である。例えば、磁性ビーズ(例えば、磁化されうるビーズ、例えば、強磁性ビーズ)を磁性固体支持体に誘引することが可能であり、磁界の除去により支持体から引き離すことが可能である。あるいは、ビーズに、イオン性または疎水性部分を設けることが可能であり、それらは、それぞれ、固体支持体のイオン性または疎水性部分と同伴しうる。また、ビーズに特異的結合ペアのメンバーを設けて、相補的結合部分を備えた固体支持体に固定化させることも可能である。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆されたビーズを、ビオチンまたはビオチン誘導体(例えば、イミノ−ビオチン)で被覆された表面に結合させることができる。
ビーズは、前記の方法および結合および対合手段により固体支持体に結合させることができる。また、ビーズは、固体支持体に対するビーズの高密度結合および/またはビーズに対する核酸の高密度結合が促進されるような長さと化学的性質とを有するように選択されうる連結基を介して固体支持体に結合させることができる。ポリリシン、ポリグルタミン酸、ペンタエリトロール、トリス−ヒドロキシ−アミノメタンなどのように固体支持体上の結合部位1個当たりに多数の官能基を付与する場合には、そのような連結基は「樹木様」構造を有するであろう。
ビーズと固定化分子とを有する固体支持体は、固定化分子を有する固体支持体が使用される任意の用途で使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法および組成物を用いて、生物学的サンプル(反応)から標的核酸を単離(精製)することができる。例えば、該組成物および方法を用いて、クローニング(Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(C.R.NewtonおよびA.Graham,PCR,BIOSPublishers,1994)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(例えば、Wiedmannら(1994)PCR Methods Appl. 3:57-64;Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:189-93を参照されたい)、鎖置換(stranddisplacement)増幅(SDA)(例えば、Walkerら(1994)Nucl.Acids Res. 22:2670-77;欧州特許公開第0 684 315号"Strand Displacement Amplification Using Thermophilic Enzymes"を参照されたい)およびそれらの変法、例えば逆転写(RT)-PCR(Higuchiら(1993)Bio/Technology 11:1026-1030)、対立遺伝子特異的増幅(ASA)、サイクル配列決定および転写に基づく方法により産生される特定の核酸を単離することができる。
ピン手段には、当業者に公知のもの、本明細書に記載のもの、および同時係属米国特許出願第08/786,988号および第08/787,639号の主題である後記のものが含まれる。
本発明で提供する方法は、ビーズ上に固定化された核酸(これは更に固体支持体に結合する)の空間的にアドレス可能(addressable)なアレーを得るのに有用である。そのような空間的にアドレス可能または前アドレス可能(pre-addressable)なアレーは、種々の方法(例えば、SBH、品質管理、およびDNA配列決定による診断法)において有用である。同時係属米国特許出願第08/786,988号および第08/787,639号に記載の手段は、基体表面上のサンプル物質の複数要素アレーを得るために使用しうる連続的および平行分注手段である。基体表面はビーズを有し平坦であることが可能であり、収容用物質のウェル(好ましくはビーズを含有する)を含むように幾何学的に改変されていることが可能である。1つの実施態様においては、サンプルアレーの平行的な発生を可能にする手段を提供する。この目的には、該手段は、小胞要素またはピンの集合体であり、この場合、該ピンのそれぞれは、ナノリットル容量の流体を収容するのに適した狭い内側チャンバーを含む。該ピンのそれぞれは、内側チャンバーを有するハウジングの内側に嵌合する。該内側ハウジングは、該ピンの内側チャンバーを通過する流体の流動を調節するために内側ハウジングチャンバー内の圧力を制御する圧力源に接続することができる。これは、該小胞からの一定容量の流体の制御された分注を可能にする。
該装置は、複数の側面および底部(該底部の内部には、複数の開口が形成されている)を有するハウジング(該壁および底部は内部容積を定め、該開口内に取付けられた複数の流体透過性小胞は、該ハウジングの内部容積に連絡して配置された流体収容チャンバーを有する)と、複数の流体透過性小胞の一組から分注され該小胞の流体収容チャンバー内にローディングされる流体の量を種々選択するための該ハウジングの内部容積に連絡した流体選択および分注手段とを含むことが可能である。したがって、該分注手段は、該装置が該基体上に配置されそれに調節された場合に、選択された量の流体を複数ウェル基体のウェル中に分注する。
また、ビーズ(これは更に結合される)に核酸を固定化するためのキットも提供する。1つの実施態様では、該キットは、適量のi)ビーズ、および/またはii)不溶性支持体、およびiii)対合手段を含む。本明細書に記載のキットは、所望により、適当な緩衝液、該試薬を収容するための容器、および/または使用説明書を含むことが可能である。
シリコン表面に対する樹脂ビーズの結合
シリコン(ケイ素)表面(例えば、シリコンウェーハの表面)を、3-アミノプロピルトリエトキシシランでの処理によりアミノ基で誘導体化する。Wang樹脂ビーズを無水コハタ酸で処理して、カルボキシルで官能化された樹脂ビーズを得る。ついで該カルポキシ官能化樹脂ビーズを、p-ニトロフェノールの存在下、カップリング試薬(例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC))でアミノ官能化シリコン表面に結合させる。該樹脂ビーズは、該シリコン表面に共有結合するようになり、該樹脂の未反応のカルホキシル基をp-ニトロフェニルエステル(核酸とのカップリングに適した活性化エステル)に変換する。
酸不安定性共有二官能性トリチルリンカーを介した固体支持体に対する核酸の固定化
標準的な方法に従い、アミノ結合DNAを調製し、精製した。一部(10当量)をスピードバック(speedvac)上で蒸発乾固させ、無水DMF/ピリジン(9:1、0.1ml)に懸濁させた。これにクロロトリチルクロリド樹脂(1当量、1.05mol/mgローディング)を加え、該混合物を24時間振とうした。該樹脂のサンプルを採取し、80%AcOHを使用してこれを脱トリチル化し、260nmの吸光度を測定することにより、該ローディングを確認した。ローディングは、約150pmol/mg樹脂であった。
疎水性トリチルリンカーを介した固体支持体に対する核酸の固定化
該プライマーは、通常のトリチル化(torityl-on)DNA合成を使用して結合させた5'-ジメトキシトリチル基を含有していた。
シリコンチップに対するビーズの結合
シリコン表面のアミノ誘導体化 表面残渣を除去するためにシリコン薄延物をエタノールで洗浄し、該表面の酸化が保証されるように「真っ赤に焼ける」まで該シリコン薄延物をブンゼンバーナー上で燃焼した。冷却後、該薄延物をトルエン中の3-アミノプロピルトリエトキシシラン(25% v/v)の無水溶液に3時間漬けた。ついで該薄延物をトルエン(3回)、ついで無水ジメチルアセトアミド(3回)で洗浄した。
Novabiochemから入手した真空乾燥されたWang樹脂ビーズ(5g,0.84mmol/gローディング,4.2mmol,直径100〜200メッシュ)を、DMAP(0.1当量,0.42mmol,51mg)と共にピリジン(40ml)に懸濁した。これに無水コハク酸(5当量,21mmol,2.10g)を加え、該反応を室温で12時間振とうした。この時間の経過後、該ビーズをジメチルホルムアミド(3回)、ついでピリジン(3回)で洗浄し、ピリジン/ジメチルホルムアミド(1:1,20ml)に懸濁した。4-ニトロフェノール(2当量,8.4mmol,1.40g)を加え、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(2当量,8.4mmol,1.73g)を加えることにより濃縮を促進し、該反応混合物を12時間振とうした。ついで該ビーズをジメチルホルムアミド、ピリジンおよびヘキサンで洗浄し、4℃で保存した。
アミノ官能化シリコン薄延物を、4-ニトロフェノールビーズのジメチルアセトアミド(DMA)懸濁液で処理する。5分以内に、該ビーズは該表面に共有結合される。ついで、被覆された表面をDMA、エタノールおよび水で洗浄する(その条件下では、該ビーズは均一な単層のままである)。ビーズ表面を引っ掻かないように注意しなければならない。ついで該ビーズを、アミノ官能化修飾DNAと反応させることができる。
2-イミノビオチンN-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル(Sigma)を、製造業者が提案している条件に従い、3'-または5'-アミノリンカーでオリゴヌクレオチドに対合させた。反応の完了をMALDI-TOF MS分析により確認し、生成物を逆相HPLCにより精製した。
当業者には、本明細書に記載の特定の方法の多数の均等物が認められるか、ごく通常の実験により、それを確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内とみなされ、以下の請求の範囲により保護される。
Claims (19)
- 固体支持体と対合し更に巨大分子または生物学的粒子と対合しているビーズを含んでなる組成物。
- 該巨大分子が、核酸、ペプチド、タンパタ質、アミノ酸および有機分子よりなる群から選ばれる、請求項1に記載の組成物。
- 該ビーズが巨大分子と対合しており、該巨大分子が核酸である、請求項1に記載の組成物。
- 該ビーズが、シリカゲル、ガラス、磁性体、p−ベンジルオキシベンジルアルコールコポリスチレン−ジビニルベンゼン(DVB)樹脂、クロロトリチルクロリドコポリスチレン−DVB樹脂、クロロメチル化コポリスチレン−DVB樹脂、金属、プラスチック、セルロース、架橋デキストランおよびアガロースゲルよりなる群から選ばれる物質から調製されたものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 該ビーズが膨潤性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 該ビーズが非膨潤性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 該ビーズの最大寸法または直径が1から100μmの範囲である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 該固体支持体が、ビーズ、毛細管、板、膜、薄延物、櫛状物、ピン、薄延物、小孔のアレーを有する薄延物およびナノリットルウェル群よりなる群から選ばれる形態である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 該核酸がDNAである、請求項3に記載の組成物。
- 該核酸がRNAである、請求項3に記載の組成物。
- 工程(a)ビーズを巨大分子または生物学的粒子と対合させること、および工程(b)ビーズを固体支持体と対合させることを含んでなり、工程(a)および(b)を任意の順序で順次にまたは同時に行う、固体支持体と対合し更に巨大分子または生物学的粒子と対合しているビーズの製造法。
- 該巨大分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、アミノ酸および有機分子よりなる群から選ばれる、請求項11に記載の製造法。
- 該ビーズが巨大分子と対合していて、該巨大分子が核酸である、請求項11に記載の製造法。
- 該ビーズが、巨大分子と対合のために官能化されている、請求項11〜13のいずれか1項に記載の製造法。
- 該ビーズが、カルボキシ官能基で官能化されている、請求項11〜13のいずれか1項に記載の製造法。
- 該ビーズが、アミノ官能基で官能化されている、請求項11〜13のいずれか1項に記載の製造法。
- 該ビーズを該固体支持体と対合させる前に、該ビーズを該巨大分子または生物学的粒子と対合させる、請求項11〜13のいずれか1項に記載の製造法。
- 該ビーズを該固体支持体と対合させた後に、該ビーズを該巨大分子または生物学的粒子と対合させる、請求項10に記載の製造法。
- i) ビーズ、および/または ii) 不溶性支持体、および iii)分子を該ビーズに結合させるためのおよび該ビーズを該支持体に結合させるための対合手段、を含んでなるキット。
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