WO2011142307A1 - 核酸分析デバイス、その製造法及び核酸分析装置 - Google Patents

核酸分析デバイス、その製造法及び核酸分析装置 Download PDF

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bonding pad
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孝伸 濱崎
俊郎 齋藤
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/05—Flow-through cuvettes

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analysis device, a production method thereof, and a nucleic acid analysis apparatus using the device.
  • a new technique for determining the base sequence of DNA or RNA has been developed.
  • a cDNA fragment sample synthesized in advance by reverse transcription reaction from a DNA fragment or RNA sample for sequencing is prepared, and a dideoxy reaction is performed by a well-known Sanger method. After that, electrophoresis is performed, and the molecular weight separation development pattern is measured and analyzed.
  • a DNA sequencer using this method is called a massively parallel sequencer.
  • DNA elongation reactions using fluorescently labeled bases as substrates are performed in parallel at hundreds of thousands to millions of locations on the substrate.
  • the fluorescence of the reacted base is detected, and the DNA base sequence is determined.
  • the massively parallel sequencers are classified into a cluster system and a single molecule system. Each method will be described below.
  • the cluster method analyzes a cluster which is a bundle of DNAs obtained by amplifying DNA.
  • a microparticle is used as a medium carrying a DNA fragment, and PCR is performed on the microparticle to amplify a copy of DNA. Thereafter, the microparticles carrying the PCR-amplified DNA fragment are put in a plate having a large number of holes that match the size of the microparticles with the hole diameter, and read by the pyrosequencing method.
  • Non-Patent Document 2 PCR is performed on microparticles using microparticles as a medium carrying DNA fragments. Thereafter, the fine particles are dispersed and fixed on the glass substrate, an enzyme reaction (ligation reaction) is performed on the glass substrate, a substrate with a fluorescent dye is incorporated, and fluorescence detection is performed to obtain sequence information of each fragment.
  • enzyme reaction ligation reaction
  • Non-Patent Document 3 a plate in which a large number of holes are formed is prepared in advance, and a method of arranging a nucleic acid synthase thereon is used to detect fluorescence while incorporating and extending a nucleotide with a fluorescent dye. Thus, the sequence information of each fragment is obtained.
  • the cluster method analyzes a cluster that is a bundle of DNAs obtained by amplifying DNA, whereas the single molecule method directly analyzes DNA without amplifying DNA.
  • a single molecule method that does not require an amplification process can save the process and the running cost.
  • the base length that can be deciphered is limited by a phenomenon in which the timing of the sequence reaction is shifted between a plurality of amplified DNAs.
  • dephasing does not occur in principle in the single molecule method, there is a possibility that the base length that can be deciphered can be greatly extended. To that end, hundreds of thousands of nucleic acid sample fragments are placed on the substrate one molecule at a time.
  • the technique of fixing for every group is required.
  • an object of the present invention is to solve the above problems.
  • the present invention includes a substrate, a plurality of bonding pads formed on the substrate, A thin film layer covering the substrate surface other than the bonding pad; One particulate adhered to each of the adhesive pads; Comprising one type of probe molecule fixed to the microparticle,
  • the nucleic acid analyzing device wherein the fine particles and the bonding pad are bonded through a chemical bond, and the thin film layer suppresses nonspecific adsorption of the fine particles to the substrate surface. It is to provide.
  • a metal thin film is formed on the substrate surface, Selectively etching the metal thin film to form a plurality of bonding pads; Introducing a linear molecular film that adsorbs to each bonding pad into each bonding pad, Fine particles are introduced into the linear molecular film, and bonded to each bonding pad through chemical bonds. Immobilizing probe molecules on the microparticles via chemical bonds;
  • the present invention provides a method for producing a nucleic acid analysis device.
  • the present invention forms a metal thin film on the substrate surface, Introducing a linear molecular film adsorbed on the metal thin film, Selectively etching the metal thin film and the linear molecular film to form a plurality of dummy bonding pads; Removing the dummy bonding pad to expose the linear molecular film to form a plurality of bonding pads having a metal thin film and the linear molecular film; Fine particles are bonded to the exposed linear molecular film via chemical bonds, Immobilizing probe molecules to the microparticles via chemical bonds,
  • the present invention provides a method for producing a nucleic acid analysis device.
  • the dummy bonding pad has the same shape as the actual bonding pad, and corresponds to an etching mask formed on the linear molecular film that binds the fine particles and the metal thin film when patterning the metal thin film.
  • a thin film that suppresses nonspecific adsorption of the fine particles is formed on the etching mask (dummy bonding pad), but is removed together with the etching film before bonding the fine particles to the bonding pad. .
  • the present invention provides a nucleic acid analysis device in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate; Means for supplying a nucleotide having a fluorescent dye and a nucleic acid sample to the nucleic acid analysis device; Means for irradiating the nucleic acid analysis device with light; A luminescence detecting means for measuring fluorescence of a fluorescent dye incorporated in a nucleic acid chain by a nucleic acid extension reaction caused by coexistence of the nucleotide, the nucleic acid synthase, and the nucleic acid sample on the nucleic acid analysis device; A plurality of bonding pads formed on the substrate; and A thin film layer covering the substrate surface other than the bonding pad; One particulate adhered to each of the adhesive pads; Comprising one type of probe molecule fixed to the microparticle, Provided is a nucleic acid analyzer in which the fine particles and the bonding pad are bonded through a chemical bond,
  • the fine particles to be fixed to a large number of bonding pads of the nucleic acid analysis device can be reliably arranged in a desired arrangement, and as a result, nucleic acid analysis with high accuracy and reduced noise becomes possible.
  • FIG. 1 The perspective view for demonstrating an example of a structure of the nucleic acid analysis device by the Example of this invention.
  • Sectional drawing which shows the structure of a part of 1 Example of the nucleic acid analysis device shown in FIG.
  • Sectional drawing which shows the structure of a part of other Example of the nucleic acid analysis device shown in FIG.
  • the schematic sectional drawing explaining an example of the relationship between the dimension of the bonding pad formed in the board
  • substrate, and the diameter of the bead on the bonding pad The schematic sectional drawing explaining an example of the relationship between the dimension of the bonding pad formed in the board
  • nucleic acid sample fragment can be immobilized one by one by specifically reacting one-to-one with a plurality of, particularly a large number of metal bonding pad patterns such as gold formed on a substrate.
  • one-to-one means that the number of probe molecules is one-to-one because one or a plurality of molecules are used for each fine particle.
  • a nucleic acid analysis device in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, An effect of preventing non-specific adsorption of the fine particles on the substrate surface is provided with an adhesive pad at a fixed position of the fine particles on the substrate, and the fine particles and the adhesive pad are bonded through a chemical bond.
  • a nucleic acid analysis device characterized in that a part of the bonding pad is exposed from the thin film layer, and the bonding pad other than the part is buried in the thin film layer. Is done. It is preferable that the bonding pads are regularly arranged on the substrate. A plurality of probe molecules may be fixed to one fine particle.
  • the substrate Forming a thin film made of an organic polymer having an effect of preventing nonspecific adsorption of fine particles on the surface, a thin film made of an organic polymer having the same thickness as the bonding pad, and the size of the bonding pad for the fine particles
  • a nucleic acid analyzing device in which microparticles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, wherein the microparticles are fixed on the substrate on the fixing position.
  • a bonding pad wherein the fine particles and the bonding pad are bonded via a chemical bond, and a thin film layer having an effect of preventing nonspecific adsorption of the fine particles on the substrate surface;
  • a nucleic acid analyzing device is provided in which a part of the pad for use is exposed from the thin film layer, and the bonding pad other than the part is buried in the thin film layer.
  • one molecule or a plurality of molecules of the probe molecule may be fixed to the fine particle.
  • these molecules are the same (one type).
  • the probe molecule is a nucleic acid analysis device characterized in that it is a nucleic acid or a nucleic acid synthase.
  • the nucleic acid analysis device is characterized in that the fine particles are made of a material selected from a semiconductor, a metal, an inorganic polymer, and an organic polymer.
  • the bonding pad is preferably made of a material selected from gold, titanium, nickel, or aluminum. It is preferable that the apparent diameter of the bonding pad is not more than 1 times the apparent diameter of the fine particles.
  • the substrate It is preferable that thousands to hundreds of thousands of bonding pads are regularly arranged on the substrate.
  • a plurality of probe molecules can be immobilized on one fine particle. According to this aspect, it is easier to manage the number of probes and to manufacture a nucleic acid analysis device than to fix one probe molecule to one fine particle. It is preferable that the apparent diameter of the bonding pad is not more than 1 times the diameter of the fine particles.
  • a nucleic acid analysis device in which microparticles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, including a bonding pad at a fixed position of the microparticles on the substrate, And a detection pad are disclosed through a chemical bond.
  • a means for selecting and acquiring only fine particles having one molecular probe a nucleic acid analyzing device in which the fine particles are regularly fixed on a substrate, and a fluorescent dye for the nucleic acid analyzing device.
  • Disclosed is a nucleic acid analyzer that includes luminescence detection means for measuring the fluorescence of a fluorescent dye incorporated therein and acquires the base sequence information of a nucleic acid sample.
  • a bonding pad is provided at the fixed position of the fine particles on the substrate, and the fine particles and the bonding pad are bonded through a chemical bond, and the diameter of the bonding pad is equal to the diameter of the fine particles.
  • it has a thin film layer made of an organic polymer as a material on the substrate surface, a part of the bonding pad is exposed from the thin film layer, and the thin film layer other than the part of the bonding pad is the thin film layer. It discloses that it is a nucleic acid analysis device characterized by having a configuration buried in.
  • one molecule or a plurality of molecular probes are fixed to one fine particle.
  • all the molecules need to be the same species. If different probe molecules are present, different signals obtained are mixed, which hinders analysis.
  • the fine particles are made of a material selected from a semiconductor, a metal, an inorganic polymer, or an organic polymer. These may be spherical or non-spherical.
  • the bonding pad is made of a material selected from gold, titanium, nickel, or aluminum.
  • the planar shape is arbitrary such as a circle, a square, a rectangle, and an ellipse.
  • the fine average particle (sphere) is represented by the apparent average diameter
  • the bonding pad (film) is represented by the apparent average diameter.
  • the apparent average diameter D is (D 1 + D 2 ) / 2.
  • the size of the fine particles is preferably 1 nm to 200 nm, particularly 5 to 100 nm.
  • the size (apparent average diameter) of the bonding pad is preferably not more than twice the diameter of the fine particles, and particularly preferably not more than 1 time.
  • the thickness of the bonding pad is preferably 1 nm to 100 nm, particularly 3 to 50 nm, but is not particularly limited in the present invention. In the present specification, the diameters of the fine particles and the bonding pads are simply described, but these are used to include those that are not true spheres or true circles as described above.
  • the diameter L of the bonding pad is preferably not more than twice the diameter of the fine particles, particularly preferably not more than 1 time.
  • the major axis is not more than twice the apparent diameter of the fine particles.
  • Adhesive pads 102 having a thickness of 10 nm and a diameter of 40 nm are regularly formed on the smooth support substrate 101, for example, in a lattice shape as shown in FIG. This keeps the distance between the bonding pads uniform. If the bonding pad is partially too close, there may be noise in the signal.
  • the bonding pad 102 and the fine particles 103 are connected by chemical bonding via the linear molecules 105. It is preferable that the functional group 106 at the end of the linear molecule 105 and the bonding pad 102 are bonded by chemical interaction.
  • the functional group 106 has a weak interaction with the smooth support substrate 101 and a strong interaction with the bonding pad 102.
  • quartz glass, sapphire, a silicon substrate, or the like can be used as the smooth support substrate.
  • the bonding pad 102 can be made of a material selected from gold, titanium, nickel, and aluminum.
  • the functional group 106 must be selected considering the combination of the smooth support substrate 101 and the bonding pad 102.
  • a sulfohydryl group, an amino group, a carboxyl group, a phosphate group, an aldehyde group, or the like may be used. it can.
  • the linear molecule 105 plays a role of connecting the fine particles 103 and the bonding pad 102 and is not particularly limited in length, but is preferably a linear molecule having about 3 to 20 carbon atoms.
  • the functional group 107 at the end of the linear molecule 105 brings about adhesion with the fine particles 103.
  • a thin film 108 for preventing nonspecific adsorption is formed on the smooth support substrate.
  • the thin film 108 preferably has the same thickness as that of the bonding pad 102 and completely covers the side surface of the bonding pad 102.
  • the thin film 108 is preferably made of an organic polymer that prevents nonspecific adsorption of the fine particles 103.
  • organic polymer for example, polyethylene glycol (PEG), polyacrylamide, 3-glycidoxypropylmethoxysilane (GOPS), or the like can be used as the organic polymer.
  • fine particles 103 metal fine particles, semiconductor fine particles, inorganic polymer fine particles, and organic polymer fine particles can be used.
  • gold fine particles having a diameter of 5 nm to 100 nm are commercially available and can be utilized.
  • semiconductor fine particles compound semiconductors such as CdSe having a diameter of about 10 nm to 20 nm are commercially available and can be utilized.
  • Fluorescence can be enhanced and observed by using fine particles having a diameter of about 100 nm or less, such as gold, silver, platinum, and aluminum, which can excite localized plasmons in the visible region.
  • the phenomenon of fluorescence enhancement by surface plasmon of gold fine particles is described in, for example, Nanotechnology, 2007, Vol. 18, pp 044017-044021. (Non-Patent Document 4).
  • the fluorescence of the fluorescent dye attached to the nucleotide can be enhanced and measured, and the signal / noise can be increased.
  • a fluorescent dye can always be placed in the enhancement field created by the localized plasmon, and stable fluorescence enhancement is obtained.
  • the fluorescence of each fluorescent dye is observed by exciting the semiconductor particles with light from an external light source and transferring the excitation energy to the fluorescent dye associated with the incorporated nucleotide.
  • the excitation light source may excite only the semiconductor fine particles, which is preferable in that one kind of light source may be used.
  • Qdot (R) streptavidin labeling manufactured by Invitrogen having a diameter of 15 to 20 nm can be used.
  • Inorganic polymer fine particles and organic polymer fine particles are added with labels that change the physical properties of particles such as density, particle size, and charge density, chemical properties such as functional groups and spacers, and biomolecules such as streptavidin.
  • the product is also commercially available.
  • silica fine particles having a diameter of 30 to 500 nm are commercially available as inorganic polymer fine particles.
  • Sicastar (R) amino group labeling manufactured by Micromod
  • Sicastar (R) streptavidin labeling manufactured by Micromod
  • latex fine particles having a diameter of 15 to 500 nm are commercially available as organic polymer fine particles.
  • latex microparticles that have a diameter of 15 to 500 nm such as Micromer® amino group label (manufactured by Micromod), or that have a diameter of 100 to 200 nm, such as Micromer® streptavidin label (manufactured by Micromod) may be used.
  • Amino-labeled fine particles of inorganic polymer and organic polymer can be modified by avidin by reacting biotin-succinimide (NHS-Biotin manufactured by Pierce) and finally reacting with streptavidin in the same manner as gold or platinum fine particles. it can.
  • an oligonucleotide is used as the nucleic acid capture probe 210, it can be easily fixed on the microparticles by synthesizing the end with biotin.
  • nucleic acid synthetase When a nucleic acid synthetase is used as the nucleic acid capture probe 210, RTS AviTag E.
  • the nucleic acid synthase can be easily immobilized on the microparticles by assembling an expression system using an E. coli biotinylation kit (manufactured by Roche Applied Science) to produce a nucleic acid synthase.
  • the functional group that can be used as the functional group 107 differs depending on the type of fine particles, but for example, when gold fine particles are used, a sulfohydryl group, an amino group, or the like is preferable.
  • semiconductor fine particles, inorganic polymer fine particles, or organic polymer fine particles fine particles whose surface is modified with streptavidin are commercially available, and biotin can be used as the functional group 107.
  • the probe molecule 104 for capturing nucleic acid a single strand of DNA or RNA nucleic acid molecule can be used. The end of the nucleic acid molecule is modified in advance in the same manner as the functional group 107 and reacted with the fine particles 103. Further, a nucleic acid binding protein or a nucleic acid synthase can be used as the probe molecule 104 for capturing a nucleic acid. Reagents for introducing avidin tags into expressed proteins are commercially available. By using such reagents to synthesize nucleic acid binding proteins and nucleic acid synthases, for example, the surface of semiconductor fine particles whose surface is modified with commercially available biotin can be easily prepared.
  • Nucleic acid-binding proteins and nucleic acid synthases can be immobilized on.
  • the probe molecule 104 that captures a nucleic acid
  • a nucleic acid sample molecule having a specific complementary sequence can be captured.
  • one probe molecule 104 is fixed to one particle 103, but a plurality of probe molecules may be fixed to one particle as shown in FIG. However, the probe molecules need to be of the same species.
  • a nucleic acid synthesizing enzyme or nucleotide can be supplied to cause a nucleic acid extension reaction on the substrate.
  • a nucleic acid binding protein when used, a nucleic acid having a specific sequence can be captured.
  • a nucleic acid synthase is used as the probe molecule 104, nonspecific nucleic acid sample molecules can be captured. Also in this case, a nucleic acid elongation reaction can be caused on the substrate by supplying nucleotides.
  • the number of probe molecules 104 to be fixed to one particle 103 is one molecule, but a plurality of probe molecules may be fixed to one particle as shown in FIG.
  • the probe molecule is a short nucleic acid sample fragment
  • only the fine particles to which one probe molecule is bound can be selectively obtained after the fine particles are bound.
  • the reaction is performed with the number of fine particles 10 times larger than the number of probe molecules
  • about 90% of the fine particles do not capture the probe molecules, and about 9% of the fine particles have one probe molecule captured. It was.
  • This result is in good agreement with the predicted result assuming a Poisson distribution. Therefore, if only the fine particles that have captured the probe molecules are captured, 90% or more of the collected fine particles are fine particles in which only one probe molecule is captured. In this state, it is possible to obtain fine particles with a single molecular bond of probe molecules with higher purity using separation by molecular weight, collection by magnetic fine particles, electrophoretic separation using a difference in charge, and the like.
  • a thin film process that has already been put to practical use in a semiconductor can be used. For example, after forming a thin film by vapor deposition / sputtering through a mask or vapor deposition / sputtering, it can be produced by dry or wet etching. Regular arrangement can be easily realized by using a thin film process.
  • the interval between the pads can be set arbitrarily, but when optical measurement is performed as the detection means, it is preferably 500 nm or more in consideration of the diffraction limit of light detection.
  • a method using a fluorescence detection method is preferred from the viewpoint of sensitivity and simplicity.
  • a nucleic acid sample is supplied to the nucleic acid analysis device, and the probe molecule 104 is made to capture the nucleic acid sample.
  • a nucleotide having a fluorescent dye is supplied, and when the probe molecule 104 is a DNA probe, a nucleic acid synthase is supplied.
  • a nucleic acid elongation reaction is caused on the device, and the fluorescence of the fluorescent dye incorporated into the nucleic acid chain during the elongation reaction is measured.
  • a so-called sequential extension reaction method in which one type of nucleotide is supplied, unreacted nucleotides are washed, fluorescence observation, different types of nucleotides are supplied, and the subsequent steps are repeated can be easily realized.
  • a continuous reaction can be caused to obtain the base sequence information of the nucleic acid sample.
  • the realization of the so-called real-time reaction method is achieved by supplying the four types of nucleotides having different fluorescent dyes, causing a continuous nucleic acid extension reaction without washing, and performing continuous fluorescence observation. You can also.
  • the phosphate moiety is cleaved after the extension reaction, so that the fluorescence can be measured continuously without quenching to obtain the base sequence information of the nucleic acid sample. it can.
  • one particle 201 is fixed to the bonding pad 202.
  • the particles 201 are fixed on the bonding pad 202, there is a possibility that a plurality of particles 201 are fixed to one bonding pad 202. If a plurality of nucleic acids are fixed, information on different types of nucleic acid fragments will overlap, and accurate nucleic acid analysis will not be possible. Therefore, one particle 201 must be fixed to one bonding pad 202.
  • FIG. 4A if the diameter L of the bonding pad is large and the area thereof is large, two fine particles may be captured. Further, when the thickness of the bonding pad is large, the diameter L1 of the bonding pad is small, but there is a possibility that the fine particles are adsorbed on the bonding pad and two fine particles are captured as shown in FIG. 4B.
  • the diameter L of the bonding pad 202 is smaller than the diameter D of the fine particles 201, that is, the condition that diameter 2D / diameter L ⁇ 1. It was found that one fine particle 201 can be fixed to one bonding pad 202 when the portion other than the bonding pad is covered with a film that suppresses nonspecific adsorption. The fine particles repel each other and retreat from each other. However, when the apparent diameter of the bonding pad exceeds twice that of the fine particles, a plurality of adhesive pads can be combined with one adhesive pad to suppress the nonspecific adsorption. There is a concern that fine particles may be trapped. 4C is possible diameter L 2 of the apparent bonding pads is smaller than the diameter D of the apparent particle, when the thickness t 1 is large, the fine particles are trapped on the side face as shown in FIG. 4B There is sex.
  • the bonding pad is as thin as possible (t 2 ). This is because when the bonding pad is thick, the area of the side surface portion increases, and even when the diameter of the bonding pad 202 is equal to or smaller than the diameter of the fine particles 201, a plurality of fine particles 201 can be fixed to one bonding pad 202. This is because the nature increases.
  • the bonding pad 202 is thick, as shown in FIGS. 5 and 6, one side surface is covered with an organic polymer 204 that suppresses the adsorption of biomolecules such as PEG (polyethylene glycol).
  • PEG polyethylene glycol
  • a plurality of fine particles 201 can be prevented from being fixed to the bonding pad 202.
  • the thickness of the bonding pad does not affect the fixed number of fine particles. Therefore, according to the present invention, the thickness of the bonding pad can be easily controlled, and the manufacturing yield can be improved.
  • This method uses a PEG silane agent obtained by polymerizing PEG and a silane coupling agent.
  • PEG silane agent 2-methoxypolyethyleneoxypropyltrimethoxysilane (manufactured by Gelest) can be used.
  • a PEG silane film is formed on the nucleic acid analysis device to a thickness equivalent to that of the bonding pad 202. Since the single-layer PEG silane film is about 1 nm, a multilayer PEG silane film is manufactured to have the thickness of the bonding pad 202.
  • a PEG silane agent is dissolved in a solvent, and a catalyst such as triethylamine is added. The nucleic acid analysis device is immersed in this mixed solution at 60 ° C. for 1 hour.
  • the nucleic acid analysis device After removing the nucleic acid analysis device from the mixed solution, it is baked at 130 ° C. for 1 hour using an electric furnace.
  • the film thickness of the silane film on the substrate is measured with a spectroscopic ellipsometer. As a result of the measurement, a silane film having a film thickness of 14 nm was confirmed. It was also confirmed that the film thickness could be adjusted to 1 to 14 nm by changing the reaction conditions such as the concentration of PEG silane agent, baking temperature, and time.
  • the PEG silane film may cover the upper surface of the bonding pad.
  • the bonding pad 202 is made of titanium oxide and is made of quartz glass, which is the material of the smooth support substrate 301, only titanium oxide can be covered by using polyvinyl phosphoric acid (PVPA) as a silanol adsorption inhibiting molecule.
  • PVPA polyvinyl phosphoric acid
  • Polyvinyl phosphate (PVPA) adsorbs on titanium oxide but does not adsorb on quartz glass.
  • the silane film on the bonding pad can be removed due to the difference in adsorption power of the PEG silane film.
  • quartz glass and sapphire which are the materials of the smooth support substrate 301
  • the PEG silane film produced on the metal or metal oxide has a weak adsorbing force, so that the bonding pad is formed by a cleaning process using ultrasonic waves or a surfactant. Only the top can be removed.
  • the thickness of the PEG silane film is actually made to be equal to the thickness of the bonding pad 202, and the bonding pad 202 is covered in advance with silanol adsorption-inhibiting molecules, or the PEG silane film is formed and then removed by washing.
  • the nonspecific adsorption-preventing organic polymer 204 can be easily produced on a nucleic acid analysis device. This showed a high non-specific adsorption prevention effect and a significant noise reduction. At the same time, the ratio of the fine particles 201 fixed to the bonding pads 202 on a one-to-one basis can be significantly improved. Through the above improvement, the throughput of the nucleic acid analysis device can be remarkably improved.
  • a material constituting the bonding pad 305 for example, gold, titanium, nickel, and aluminum is formed on the smooth support substrate 301 by sputtering (b).
  • gold, aluminum, or nickel is used as the material for the bonding pad 305
  • titanium is used to reinforce the bonding between the substrate material and the bonding pad 305 material. It is preferable to add a thin film of chromium or chromium.
  • a pattern 303 is formed with a resist on the metal thin film 302 (c).
  • the metal thin film 302 other than the resist pattern is removed by etching (d).
  • the bonding pad 305 is completed.
  • linear molecules 304 that are not adsorbed on the smooth support substrate 301 and adsorbed on the bonding pad 305 are reacted (e).
  • the bonding pad 305 is gold, titanium, aluminum, or nickel, it is preferable to use a sulfohydryl group, a phosphate group, or a thiazole group as the functional group at the end of the linear molecule 304, respectively.
  • biotin can be used as the functional group of the linear molecule.
  • the fine particles 103 are bonded to the linear molecules 304 through chemical bonds, and one or more probe molecules are fixed to the surface of the fine particles (g).
  • the thin film 306 is made of an organic polymer that prevents nonspecific adsorption of the fine particles 103.
  • the type of organic polymer that prevents nonspecific adsorption is appropriately selected according to the surface state of the fine particles 103. When the surface state of the fine particles 103 has a negative charge, an organic polymer that is negatively charged is selected so as to repel. If the surface of the fine particles 103 is hydrophilic, the organic polymer is selected to be hydrophobic, and if the surface of the fine particles 103 is hydrophobic, the organic polymer is selected to be hydrophilic.
  • PEG polyethylene glycol
  • polyacrylamide polyacrylamide
  • PEG polyethylene glycol
  • GOPS 3-glycidoxypropylmethoxysilane
  • the linear molecules 403 can be reacted before etching the formed metal thin film 402.
  • a pattern is formed with the resist 404 (c).
  • the portions other than the portion protected by the resist 404 are removed together with the linear molecules 403 by etching (d).
  • a thin film of an organic polymer 405 for preventing nonspecific adsorption is formed on the resist 404 and the smooth support substrate 401 (e).
  • the resist 404 is removed to remove the resist 404 and the nonspecific adsorption-preventing organic polymer 406 formed thereon, thereby forming an adhesive pad to which the patterned linear molecules 403 are bonded ( f). Further, the fine particles 103 are bonded to the linear molecules 403 through chemical bonds, and one or more probe molecules are fixed to the surface of the fine particles (g).
  • avidin is modified in advance on the surface of the fine particles.
  • metal fine particles other than gold or platinum are used, the surface is oxidized by heat treatment in an oxygen atmosphere, then aminosilane is reacted, and then biotin-succinimide (NHS-Biotin manufactured by Pierce) is reacted. Finally, react with streptavidin. Thereby, it is possible to easily avidin-modify the surface of the metal fine particles.
  • the nucleic acid analysis device of this example can be manufactured by reacting the fine particles on which the nucleic acid capture probe is immobilized with the smooth support substrate 401.
  • the nucleic acid analyzer of the present embodiment includes means for supplying a nucleotide having a fluorescent dye, a nucleic acid synthase, and a nucleic acid sample to the nucleic acid analysis device, means for irradiating the nucleic acid analysis device with light, and on the nucleic acid analysis device. And a luminescence detection means for measuring the fluorescence of the fluorescent dye incorporated into the nucleic acid chain by the nucleic acid extension reaction caused by the coexistence of the nucleotide, the nucleic acid synthase, and the nucleic acid sample.
  • the device 505 is installed in a reaction chamber composed of a cover plate 501, a detection window 502, an inlet 503 that is a solution exchange port, and an outlet 504.
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • the thickness of the detection window 502 is 0.17 mm.
  • Laser light 509 and 510 oscillated from a YAG laser light source (wavelength 532 nm, output 20 mW) 507 and a YAG laser light source (wavelength 355 nm, output 20 mW) 508 are circularly polarized only by the ⁇ / 4 plate 511, and the dichroic mirror is used.
  • the two laser beams are adjusted to be coaxial by 512 (reflecting 410 nm or less), then condensed by a lens 513, and then irradiated to the device 505 through a prism 514 at a critical angle or more.
  • the fluorescence emitted from the detection window 502 is converted into a parallel light beam by the objective lens 515 ( ⁇ 60, NA 1.35, working distance 0.15 mm), and the background light and the excitation light are blocked by the optical filter 516, thereby forming an image.
  • An image is formed on the two-dimensional CCD camera 518 by the lens 517.
  • Non-Patent Document 5 as a nucleotide with a fluorescent dye, a 3′-O-allyl group is inserted as a protecting group at the 3′OH position of ribose, and pyrimidine Can be used which are linked to a fluorescent dye via an allyl group at the 5-position or the 7-position of purine. Since the allyl group is cleaved by light irradiation or contact with palladium, quenching of the dye and control of the extension reaction can be achieved simultaneously. Even in the sequential reaction, it is not necessary to remove unreacted nucleotides by washing. Furthermore, since no washing step is required, the extension reaction can be measured in real time.
  • nucleotide is linked to the dye via a functional group that can be cleaved by light irradiation. Can be used.
  • the above-described example of the nucleic acid analyzer can be applied.
  • Qdot (R) 565 manufactured by Invitrogen
  • it can be sufficiently excited with a YAG laser light source (wavelength 532 nm, output 20 mW) 307.
  • This excitation energy emits fluorescence by moving to Alexa 633 (manufactured by Invitrogen), which is not excited by light of 532 nm.
  • Alexa 633 manufactured by Invitrogen
  • dyes associated with unreacted nucleotides are not excited, and are only captured by DNA probes and close to the semiconductor fine particles to emit light, so that the captured nucleotides can be identified by fluorescence measurement. Is possible.
  • Fine particles of inorganic polymer or organic polymer are not excited even when irradiated with light from an external light source. Therefore, the fluorescent dye does not emit light due to the transfer of excitation energy, and unreacted nucleotides also emit light, which may cause noise.
  • the incorporated nucleotides can emit light by binding to the nucleic acid synthase a fine particle that causes energy transfer such as a semiconductor fine particle.
  • the fluorescence of the incorporated nucleotide can be enhanced by binding gold, silver, platinum, aluminum, or the like to the nucleic acid synthase.
  • gold, silver, platinum, aluminum or the like is used as the material of the metal pad for fixing the fine particles, the fluorescence around the metal pad is enhanced, so that the signal / noise can be increased.
  • the analysis time can be shortened and the device and the analysis device can be simplified without the need for a washing step.
  • nucleic acid fragments can be fixed to a substrate by finely aligning them at high density and regularly through fine particles, and without increasing the steps of the manufacturing process of the nucleic acid analysis device, only by simple substrate processing, Since only one molecule of nucleic acid sample fragments can be immobilized at a high rate and noise reduction can be realized by suppressing nonspecific adsorption of fine particles, a nucleic acid sample can be analyzed with low running cost and high throughput.
  • YAG laser light source 509,510 ... Laser beam, 511 ... ⁇ / 4 plate, 512 ... Dichroic mirror, 513 ... Lens, 514 ... Prism, 515 ... Objective lens, 516 ... Optical filter, 517 ... Imaging lens, 518 ... Two-dimensional CD camera.

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Abstract

　本発明は、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを予め固定した微粒子を、基板上に形成された金などの金属製の接着用パッドパターンに結合させる方法において、基板表面に接着用パッドと同等の厚みを有する微粒子吸着防止膜を形成することと、接着用パッドに対する微粒子の大きさを変えることにより、核酸試料断片が一分子だけ付いた微粒子を一個ずつグリッド状に固定する方法に関する。本発明により、多種類の核酸断片試料を高密度にかつ規則正しく整列させて基板上に固定できるため、高スループットに核酸試料を分析できる。例えば、１ミクロン間隔で微粒子を固定すれば、１０６核酸断片／ｍｍ２という高密度が容易に達成できる。

Description

核酸分析デバイス、その製造法及び核酸分析装置
　本発明は、核酸分析デバイス、その製造方法及びそれを用いた核酸分析装置に関する。
　核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されている。現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
　これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ試料断片を数多く固定して、並列に数多くの断片の配列情報を決定する方式が提案されている。この方式を用いたＤＮＡシーケンサを超並列シーケンサと呼ぶ。超並列シーケンサでは、蛍光標識した塩基を基質としたＤＮＡ伸長反応を、基板上の数十万～数百万箇所で並列して行う。反応した塩基の蛍光を検出し、ＤＮＡの塩基配列を決定する。また、超並列シーケンサはクラスタ方式と単分子方式分類される。以下、それぞれの方式について説明する。
　はじめにクラスタ方式について説明する。クラスタ方式はＤＮＡを増幅したＤＮＡの束であるクラスタを対象に解析する。例えば、非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行い、ＤＮＡのコピーを増幅する。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出す。
　また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばらまいて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション反応）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
　次に単分子方式について説明する。単分子方式は、非増幅で標識核酸をプローブにハイブリダイゼーションさせ、１塩基ずつ蛍光色素付きヌクレオチドで伸長させながら塩基配列を同定する。この方法は非特許文献３で報告されている。例えば、非特許文献３では、多数の穴を形成したプレートを予め用意しておき、その上に核酸合成酵素を配置させる方法を用い、蛍光色素付きヌクレオチドを取り込ませて伸長させながら蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
Ｎａｔｕｒｅ　２００５，Ｖｏｌ．４３７，ｐｐ．３７６－３８０ Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２００，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１０５１－１０６３ Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００９，Ｖｏｌ．３２３．ｐｐ．１３３－１３８ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．０４４０１７－０４４０２１． Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．２００６，Ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．１９６３５－１９６４０
　超並列シーケンサにおいて、クラスタ方式はＤＮＡを増幅したＤＮＡの束であるクラスタを対象に解析するが、単分子方式はＤＮＡを増幅せず直接解析する。増幅工程が不要な単分子方式は、工程とランニングコストを省くことができる。また、クラスタ方式では、増幅された複数ＤＮＡの間でシーケンス反応のタイミングがずれる現象（ｄｅｐｈａｓｉｎｇ）により解読できる塩基長が制限される。しかし、単分子方式でｄｅｐｈａｓｉｎｇは原理的に生じないため、解読できる塩基長を格段に伸ばせる可能性が示されているが、そのためには数十万個の核酸試料断片を基板上に１分子ずつ又はグループ毎に固定する技術が必要である。このとき、できるだけ規則正しく、平滑な基板上に核酸試料を整列させて固定することが望まれる。なぜなら、核酸試料を担持させた微粒子を平滑支持基板上にばらまいてランダムに固定させる方法は容易であるが、蛍光測定で配列を読み取る段になると、ＣＣＤカメラで検出したランダムに存在する微粒子画像から数値データを取得する際に、データ処理に膨大な時間がかかってしまうためである。
　したがって、本発明の目的は、上記の課題を解決することである。
　本発明は、基板と、その基板上に形成された複数の接着用パッドと、
該接着用パッド以外の前記基板面を被覆する薄膜層と、
それぞれの前記接着用パッドに接着された１つの微粒子と、
前記微粒子に固定された１種類のプローブ用分子を備え、
前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記薄膜層は前記基板表面に対する前記微粒子の非特異的な吸着を抑制するものであることを特徴とする核酸分析デバイスを提供するものである。
　また、本発明は、基板面に金属薄膜を形成し、
該金属薄膜を選択的にエッチングして複数の接着用パッドを形成し、
それぞれの接着用パッドに、接着用パッドに吸着する線状分子膜を導入し、
該線状分子膜に、微粒子を導入して、各接着用パッドに化学結合を介して接着し、
該微粒子にプローブ分子を化学結合を介して固定する、
ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法を提供するものである。
　更に本発明は、基板面に金属薄膜を形成し、
該金属薄膜に吸着する線状分子膜を導入し、
該金属薄膜及び線状分子膜を選択的にエッチングして複数のダミー接着用パッドを形成し、
該ダミー接着用パッドを除去して前記線状分子膜を露出させて、金属薄膜と前記線状分子膜を有する複数の接着用パッドを形成し、
露出した線状分子膜に、微粒子を化学結合を介して接着し、
該微粒子にプローブ分子を、化学結合を介して固定する、
ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法を提供するものである。ここでダミー接着用パッドとは、実際の接着用パッドと同形のもので、金属薄膜のパターニングの際に、微粒子と金属薄膜を結合する線状分子膜の上に形成されるエッチングマスクに相当する。なお、このエッチングマスク（ダミー接着用パッド）の上には、前記微粒子の非特異的な吸着を抑制する薄膜が形成されるが、微粒子を接着用パッドに接合する前にエッチング膜とともに除去される。
　更にまた、本発明は、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段を備え、上記核酸用デバイスが、その基板上に形成された複数の接着用パッドと、
該接着用パッド以外の前記基板面を被覆する薄膜層と、
それぞれの前記接着用パッドに接着された１つの微粒子と、
前記微粒子に固定された１種類のプローブ用分子を備え、
前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記薄膜層は前記基板表面に対する前記微粒子の非特異的な吸着を抑制するものである核酸分析装置を提供するものである。
　本発明によれば、核酸分析デバイスの多数の接着用パッドに固定する微粒子を確実に所望の配列に配置することができ、その結果、高精度で、ノイズを低減した核酸分析が可能となる。
本発明の実施例による核酸分析デバイスの構成の一例を説明するための斜視図。 図１に示した核酸分析デバイスの１実施例の一部の構成を示す断面図。 図１に示した核酸分析デバイスの他の実施例の一部の構成を示す断面図。 基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の一例を説明する概略断面図。 基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の他の例を説明する概略断面図。 基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の更に他の例を説明する概略断面図。 本発明の実施例による基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の一例を説明する概略断面図。 本発明の他の実施例による基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係を説明する概略断面図。 核酸分析デバイスの製造法を説明するためのフロー図。 核酸分析デバイスの他の製造法を説明するためのフロー図。 本発明による核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の構成例を説明するための図。
　本発明者が核酸試料断片を基板上に１分子ずつ、高密度に且つ規則正しく整列させて固定する技術について鋭意検討した結果、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを予め固定した微粒子を、基板上に形成された金などの複数、特に多数の金属製の接着用パッドパターンに１対１で特異的に反応させることで、核酸試料断片を１個ずつ固定できる方法を見出した。ここで１対１とは、プローブ用分子は微粒子１個につき、１つ又は複数であっても１種類の分子であるので、１対１であると言う意味である。
　本発明によれば、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、
　前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、基板表面に前記微粒子の非特異的な吸着を防止する効果を有する薄膜層を有し、前記接着用パッドの一部分が前記薄膜層から露出し、前記一部分以外の前記接着用パッドは前記薄膜層に埋もれた構成をとることを特徴とする核酸分析デバイスが提供される。前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることが好ましい。１つの微粒子に複数のプローブ分子が固定されていてもよい。
　より具体的に説明すると、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを予め固定した微粒子を、基板上に形成された金などの金属製の接着用パッドパターンに結合させる際に、基板表面に微粒子の非特異的吸着防止効果を有する有機ポリマーからなる薄膜を形成することと、有機ポリマーからなる薄膜が接着用パッドと同等の厚みを有することと、微粒子に対する接着用パッドの大きさを変えることにより、核酸試料断片を一分子捕捉した微粒子が接着用パッドに１対１で固定される割合を著しく向上させることが可能となる。
　本発明の他の実施態様によれば、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、基板表面に前記微粒子の非特異的な吸着を防止する効果を有する薄膜層を有し、前記接着用パッドの一部分が前記薄膜層から露出し、前記一部分以外の前記接着用パッドは前記薄膜層に埋もれた構成をとることを特徴とする核酸分析デバイスが提供される。
　上記核酸分析用デバイスにおいて、前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が１分子又は複数分子が固定されていることができる。複数のプローブ分子が固定される場合、それらの分子は同一（１種類）である。
　また前記プローブ分子は、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイスである。前記微粒子が半導体、金属、無機ポリマーや有機ポリマーから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイスである。前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることが望ましい。前記接着用パッドの見かけ上の直径が前記微粒子の見かけ上の直径の１倍以下であることが好ましい。
　数千～数十万の多数の前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることが好ましい。また、１つの微粒子に複数のプローブ分子を固定することができる。この態様によれば、１つの微粒子に１つのプローブ分子を固定するよりも、プローブ数の管理が簡便となり、核酸分析デバイスの製造が容易である。前記接着用パッドの見かけ上の直径が前記微粒子の見かけ上に直径の１倍以下であることが好ましい。
　以下、本発明を具体的な実施例により説明する。以下の実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、基板上の微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、微粒子と検出用パッドとが化学結合を介して結合したデバイスを開示する。
　さらに、本実施例では、分子プローブを１分子有する微粒子だけを選別して取得する手段と、その微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であることを開示する。
　更に、本実施例では基板上の前記微粒子の固定位置に接着用のパッドを備え、微粒子と接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、接着用パッドの直径が微粒子の直径と同等あるいはそれ以下の大きさであり、基板表面に有機物ポリマーを材料とする薄膜層を有し、前記接着用パッドの一部分が前記薄膜層から露出し、前記接着用パッドの前記一部分以外は前記薄膜層に埋もれた構成をとることを特徴とする核酸分析デバイスであることを開示する。
　さらに、本実施例では、微粒子１個に対して、１分子又は複数の分子プローブが固定されていることを開示する。１つの微粒子に対して複数のプローブ分子が固定されるとき、それらの分子は全て同一種である必要がある。異なったプローブ分子が存在すれば得られる異なった信号が混在し、解析に支障をきたすことになる。
　さらに、本実施例では微粒子が半導体、金属、無機ポリマーまたは有機ポリマーから選ばれる材料からなることを開示する。これらは真球形状でもよいし、非真球形状でもよい。
　さらに、本実施例では接着用パッドが、金、チタン、ニッケル、またはアルミから選ばれる材料からなることを開示する。接着用パッドは薄いほどよく、その厚さが一定限度を超えると、複数の微粒子が接着用パッドに付着する可能性が有る。またその平面形状は円形、正方形、矩形、楕円形など任意である。
　本発明において、プローブ分子を固定する微細粒子は真球又は真球に近いものが多いが、全て真球であるとは限らず、不定形又は多角形のものがある。また上記微粒子を接着する接着用パッドは真円形状でなくともよい。そのため本明細書では、微細粒子（球体）については見かけの平均直径、接着用パッド（膜）については見かけの平均直径で表す。たとえば、微粒子が長径Ｄ１と短径Ｄ２を持つ場合、その見かけの平均直径Ｄは、（Ｄ１＋Ｄ２）／２となる。Ｄ１＝Ｄ２のときはＤ＝Ｄ１又はＤ２であり、同様に、接着用パッドの平面図が長方形、楕円或いはその他の形状で、長辺Ｌ１＋短辺Ｌ２を持つ場合、接着用パッドの見かけの平均直径Ｌは、［（Ｌ１ ２＋Ｌ２ ２）］１／２となる。正方形のときは、Ｌ＝√（２・Ｌ１）又は√（２・Ｌ２）となる。ただし、接着用パッドが真円形又はそれに近似する形状のときは、Ｌ＝Ｌ１又はＬ２である。
　微粒子の大きさ（見かけの平均直径）は、１ｎｍ～２００ｎｍ、特に５～１００ｎｍがよい。また接着用パッドの大きさ（見かけの平均直径）は微粒子の直径の２倍以下がよく、１倍以下が特に好ましい。また接着用パッドの厚さは、１ｎｍ～１００ｎｍ、特に３～５０ｎｍが好ましいが本発明では特に制限されない。なお、本明細書では、単に微粒子及び接着用パッドの直径と記載するが、これらを上記のように真球又は真円形でないものも含む意味で使用する。
　接着用パッドの直径Ｌは、微細粒子の直径の２倍以下が好ましく、特に１倍以下が好ましい。接着用パッドが非円形又は楕円である場合、その長径は微細粒子の見かけの直径の２倍以下であることが望ましい。
　以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
　本実施例のデバイスの構成を、図１、２を用いて説明する。平滑支持基板１０１の上に厚さ１０ｎｍ、直径４０ｎｍの寸法を持つ接着用パッド１０２が規則正しく、例えば図１に示すように格子状に形成されている。これにより接着用パッド間の距離が一様に保たれる。部分的に接着用パッドが接近しすぎると、信号にノイズがはいりこむ可能性が有る。
接着用パッド１０２と微粒子１０３は、線状分子１０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子１０５の末端の官能基１０６と、接着用パッド１０２とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基１０６は、平滑支持基板１０１との相互作用が弱く、接着用パッド１０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑支持基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができる。
　また、接着用パッド１０２は、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基１０６には、平滑支持基板１０１と接着用パッド１０２との組合せを考えて選択しなければならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。線状分子１０５は、微粒子１０３と接着用パッド１０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。
　線状分子１０５の末端の官能基１０７は、微粒子１０３との接着性をもたらす。平滑支持基板には非特異的吸着防止用の薄膜１０８が形成されている。薄膜１０８は接着用パッド１０２の厚みと同程度の厚みを有しており接着用パッド１０２の側面部を完全に覆っていることが好ましい。薄膜１０８は微粒子１０３の非特異的吸着を防止する有機ポリマーを材料としていることが好ましい。例えば、有機ポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、３－グリシドキシプロピルメトキシシラン（ＧＯＰＳ）などを用いることができる。
　微粒子１０３としては、金属微粒子や半導体微粒子、無機ポリマー微粒子、有機ポリマー微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ～１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が１０ｎｍ～２０ｎｍ程度のＣｄＳｅ等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。
　微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金、銀、白金、アルミニウム等の直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光を増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ　０４４０１７－０４４０２１．（非特許文献４）に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定することができ、信号／ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。
　半導体微粒子を用いた場合には、半導体微粒子を外部光源の光で励起しておき、取り込まれたヌクレオチドに付随する蛍光色素にその励起エネルギーを移動させることにより、個々の蛍光色素の蛍光を観察することもできる。この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。例えば、直径が１５～２０ｎｍであるＱｄｏｔ（Ｒ）ストレプトアビジン標識（インビトロジェン社製）を利用することができる。
　無機ポリマー微粒子及び有機ポリマー微粒子は、密度、粒径、電荷密度などの粒子の物性を変えたものや、官能基やスペーサーなどの化学的性質、ストレプトアビジンをはじめとする生体分子などの標識が付加されたものも市販されている。
　無機ポリマー微粒子を用いる場合、市販の微粒子を用いることができる。また、無機ポリマー微粒子として、直径３０～５００ｎｍのシリカ製の微粒子が市販されている。例えば、シリカ微粒子である直径が３０～５００ｎｍであるＳｉｃａｓｔａｒ（Ｒ）アミノ基標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）や、直径が１００～５００ｎｍであるＳｉｃａｓｔａｒ（Ｒ）ストレプトアビジン標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を用いることができる。
　また、有機ポリマー微粒子として、直径１５～５００ｎｍのラテックス製の微粒子が市販されている。例えば、ラテックス微粒子である直径が１５～５００ｎｍであるＭｉｃｒｏｍｅｒ（Ｒ）アミノ基標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）や、直径が１００～２００ｎｍであるＭｉｃｒｏｍｅｒ（Ｒ）ストレプトアビジン標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を用いることができる。無機ポリマー及び有機ポリマーのアミノ基標識微粒子は、金または白金微粒子と同様に、ビオチン－スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することができる。核酸捕捉プローブ２１０としてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、容易に微粒子上に固定できる。
　核酸捕捉プローブ２１０として核酸合成酵素を用いる場合には、予め、ＲＴＳ　ＡｖｉＴａｇ　Ｅ．ｃｏｌｉビオチン化キット（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて発現系を組み、核酸合成酵素を作ることにより、容易に、核酸合成酵素を微粒子上に固定できる。官能基１０７として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基，アミノ基等が好ましい。半導体微粒子や無機ポリマー微粒子、有機ポリマー微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基１０７としてビオチンを用いることができる。
　核酸を捕捉するプローブ分子１０４には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基１０７と同様に予め修飾しておき、微粒子１０３と反応させておく。また、核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸結合タンパク質や核酸合成酵素を用いることもできる。発現タンパク質にアビジンタグを導入する試薬が市販されており、このような試薬を用いて核酸結合タンパク質や核酸合成酵素を合成することにより、例えば、市販のビオチンで表面が修飾された半導体微粒子表面に容易に核酸結合タンパク質や核酸合成酵素を固定できる。核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸分子の一本鎖を用いた場合には、特定の相補配列を有する核酸試料分子を捕捉することができる。図２では１つのプローブ分子１０４が１つの微粒子１０３に固定されているが、図３に示すように複数のプローブ分子を１つの微粒子に固定してもよい。ただし、プローブ分子は同一種である必要がある。
　捕捉後に、核酸合成酵素やヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすこともできる。また、核酸結合タンパク質を用いた場合にも特定の配列を持っている核酸を捕捉することができる。そして、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、非特定の核酸試料分子を捕捉できる。この場合も、ヌクレオチドを供給することにより基板上で核酸伸長反応を起こすことができる。
　１つの微粒子１０３に固定するプローブ分子１０４は、１分子であることが最も好ましいが、図３に示すように、１つの微粒子に複数のプローブ分子を固定してもよい。
　プローブ分子が短い核酸試料断片である場合、微粒子を結合させた後に、１つのプローブ分子が結合した微粒子だけを選択的に取得することができる。例えば、微粒子の数をプローブ分子の数よりも１０倍多くして反応させると、約９０％の微粒子にはプローブ分子が捕捉されず、約９％の微粒子にはプローブ分子が一分子補足されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果とよく一致している。したがって、プローブ分子を捕捉した微粒子のみを捕捉すれば、捕集した微粒子のうち９０％以上はプローブ分子を一分子のみ捕捉した微粒子となる。この状態で、分子量による分離や磁気微粒子による捕集、電荷の差を用いた電気泳動分離などを利用してプローブ分子が一分子結合した微粒子をさらに高い純度で取得することができる。
　接着用パッド１０２を平滑支持基板１０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると５００ｎｍ以上が好ましい。
　本実施例の核酸分析デバイスから核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度や簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、核酸分析デバイスに対して核酸試料を供給し、プローブ分子１０４に核酸試料を捕捉させる。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、プローブ分子１０４がＤＮＡプローブである場合には、核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、ヌクレオチドの一種類を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察，違う種類のヌクレオチドの供給、以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後に蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いることにより、連続的な反応を起こし、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
　一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
　接着用パッド２０２に１個の微粒子２０１が固定される理由について図４Ａ，４Ｂを用いて説明する。接着用パッド２０２上に微粒子２０１を固定させる際、一つの接着用パッド２０２に複数個の微粒子２０１が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着用パッド２０２には、１個の微粒子２０１を固定させねばならない。図４Ａの場合、接着用パッドの直径Ｌが大きく、その面積が大きいと、微粒子が２個捕捉される可能性が有る。また、接着用パッドの厚さが大きいと、接着用パッドの直径Ｌ１は小さいが、接着用パッドに微粒子が吸着して図４Ｂのように２つの微粒子が捕捉される可能性が有る。
　そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着用パッド２０２の直径Ｌが微粒子２０１の直径Ｄに比べて小さい、すなわち直径２Ｄ／直径Ｌ≧１という条件が成り立ち、かつ接着用パッド以外の部分が非特異的吸着を抑制する皮膜により覆われているときは、１つの接着用パッド２０２に１個の微粒子２０１を固定できることを見出した。微粒子同士は反発して互いに退け合うが、接着用パッドの見かけ上の直径が微粒子の２倍を超えると、上記非特異的吸着を抑制する皮膜を組み合わせても、１つの接着用パッドに複数の微粒子が捕捉されることが懸念される。図４Ｃは、接着用パッドの見かけ上の直径Ｌ２が微粒子の見かけ上の直径Ｄよりも小さいが、その厚さｔ１が大きいと、図４Ｂに示すように側面に微粒子が捕捉される可能性がある。
　これに対し、接着用パッド１０２の径Ｌに比べて同等以上の大きさの径Ｄの微粒子２０１が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子２０１に覆い隠されてしまい、別の微粒子２０１と反応できなくなってしまうものと説明される。
　したがって、接着用パッドはできる限り薄い(ｔ２)ほうが好ましい。これは、接着用パッドに厚みがあると側面部の面積が増え、接着用パッド２０２の直径が微粒子２０１の直径以下の場合でも、１つの接着用パッド２０２に複数の微粒子２０１が固定される可能性が高まるためである。
　ただし、接着用パッド２０２に厚みがあったとしても、図５、６に示すように、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの生体分子の吸着を抑制する有機ポリマー２０４で側面部を覆うことで、１つの接着用パッド２０２に複数の微粒子２０１が固定するのを防ぐことができる。この場合、接着用パッドの厚さが微粒子の固定数に影響を与えることはなくなる。したがって、本発明によれば、接着用パッドの形成にあたりその厚さの制御が容易になり、また製造歩留まりも向上することになる。
　以下、核酸分析デバイスにシランカップリング剤を用いて接着用パッド２０２の側面をＰＥＧで覆う方法について説明する。この方法はＰＥＧとシランカップリング剤を重合させたＰＥＧシラン剤を使用する。ＰＥＧシラン剤として２－メトキシポリエチレンオキシプロピルトリメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）を用いることができる。核酸分析デバイスに接着用パッド２０２の厚みと同等の厚さにＰＥＧシラン膜を作製する。単層のＰＥＧシラン膜は約１ｎｍであるため、多層のＰＥＧシラン膜を製造して接着用パッド２０２の厚みにする。製造方法としてはＰＥＧシラン剤を溶媒に溶解し、トリエチルアミンなどの触媒を加える。この混合液に核酸分析デバイスを６０℃で１時間浸漬する。
　核酸分析デバイスを混合液から取り出した後、電気炉を用いて１３０℃で１時間ベークする。分光エリプソメーターで基板上のシラン膜の膜厚を測定する。測定の結果、膜厚１４ｎｍのシラン膜を確認した。ＰＥＧシラン剤の濃度、ベーク温度、時間などの反応条件を変えることで、１～１４ｎｍに膜厚を調整できることも確認した。実際に厚み１０ｎｍの接着用パッド２０２を有する核酸分析デバイスに対して１０ｎｍの厚みを持つＰＥＧシラン膜を成膜した結果、接着用パッド２０２の側面をＰＥＧシラン膜で覆うことができた。これは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による核酸分析デバイス断面観察により確認した。
　接着用パッドの材質によっては、ＰＥＧシラン膜が接着用パッドの上面も覆ってしまう可能性がある。その場合、ＰＥＧシラン膜処理前に接着用パッド２０２をシラノール吸着阻害分子などで覆うことでＰＥＧシラン剤が接着用パッドの上面に結合するのを防ぐことができる。例えば、平滑支持基板３０１の材料である石英ガラスで接着用パッド２０２が酸化チタンの場合、シラノール吸着阻害分子としてポリビニルリン酸（ＰＶＰＡ）を使用することで、酸化チタンのみ覆うことができる。ポリビニルリン酸（ＰＶＰＡ）は酸化チタンには吸着するが、石英ガラスには吸着しない。
　また、シラノール吸着阻害分子を使用しなくてもＰＥＧシラン膜の吸着力の違いで接着用パッド上のシラン膜だけを取り除くことができる。平滑支持基板３０１の材料である石英ガラスやサファイアと比べて、金属や金属酸化物上に作製されたＰＥＧシラン膜は吸着力が弱いため超音波や界面活性剤を用いた洗浄工程によって接着用パッド上のみ取り除くことができる。実際にＰＥＧシラン膜の厚みが接着用パッド２０２の厚みと同等となるように作製し、接着用パッド２０２をシラノール吸着阻害分子で事前に覆う、あるいはＰＥＧシラン膜を形成してから洗浄によって除去することで、接着用パッド２０２の側面部のみを完全に覆うことができることを確認した。さらに接着用パッド２０２の側面部のみをＰＥＧシラン膜で完全に覆った核酸分析デバイスにアビジンで表面を修飾された微粒子２０１を反応させた。その結果、接着用パッド２０２の上面部には微粒子２０１が固定されるが、接着用パッド２０２の側面に微粒子２０１が固定されないことを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により確認した。
　以上のように非特異的吸着防止有機ポリマー２０４は核酸分析デバイス上に容易に作製することができる。これにより高い非特異的吸着防止効果を示し大幅なノイズの低減が示された。同時に微粒子２０１が接着用パッド２０２に１対１で固定する割合を著しく向上させることができた。以上の改善により核酸分析デバイスのスループットを著しく向上させることができる。
　核酸分析デバイスの製造方法の例を、図７と図８を用いて説明する。
　図７において、平滑支持基板３０１上に接着用パッド３０５を構成する材料、例えば、金、チタン、ニッケル、アルミニウムをスパッタリングで製膜する（ｂ）。これを金属の薄膜３０２とする。平滑支持基板３０１としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド３０５の材料として金，アルミニウム，ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着用パッド３０５材料との間に接着を補強するためにチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。
　この金属の薄膜３０２の上にレジストでパターン３０３を形成する（ｃ）。次にレジストパターン以外の金属の薄膜３０２をエッチングにより除去する（ｄ）。さらにレジスト３０３を剥離すると接着用パッド３０５が完成する。次に、平滑支持基板３０１には吸着せず、接着用パッド３０５には吸着する線状分子３０４を反応させる（ｅ）。接着用パッド３０５が金，チタン，アルミ，ニッケルの場合には、線状分子３０４末端の官能基としては、各々、スルホヒドニル基，リン酸基，チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の官能基には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を平滑支持基板３０１と反応させた後、接着用パッド３０５を形成した以外の平滑支持基板３０１表面に薄膜３０６を作製する（ｆ）。
　次に、線状分子３０４に微粒子１０３を、化学結合を介して接着し、更に微粒子の表面に１つ又は複数のプローブ分子を固定する（ｇ）。
　薄膜３０６は微粒子１０３の非特異的吸着を防止する有機ポリマーを材料とする。非特異的吸着を防止する有機ポリマーの種類は微粒子１０３の表面状態に合わせて適宜選択する。微粒子１０３の表面状態が負の電荷を有している場合は、反発するように負に帯電している有機ポリマーを選択する。微粒子１０３の表面が親水性ならば、有機ポリマーは疎水性のものを選択し、微粒子１０３の表面が疎水性ならば、有機ポリマーは親水性のものを選択する。例えば、親水性のアビジンが修飾された微粒子１０３に対して非特異的吸着防止用有機ポリマー３０６としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、３－グリシドキシプロピルメトキシシラン（ＧＯＰＳ）などを用いることができる。
　核酸分析デバイスの製造法の他の例を図８で説明する。この方法を用いることで、接着用パッド４０６と平滑支持基板４０１に選択性を持たない線状分子４０３でも接着用パッド４０６上のみに線状分子を残すことができる。
　線状分子４０３は図８（ｂ）に示すように、製膜した金属の薄膜４０２のエッチングの前に反応させることもできる。その場合、線状分子４０３を反応させてからレジスト４０４でパターンを形成する（ｃ）。レジスト４０４で保護された部分以外はエッチングにより、線状分子４０３ごと除去される（ｄ）。その後、レジスト４０４及び平滑支持基板４０１上に、非特異的吸着防止用有機ポリマー４０５の薄膜を形成する（ｅ）。
　次いで、レジスト４０４を剥離することでレジスト４０４及びその上に形成された非特異的吸着防止用有機ポリマー４０６を除くと、パターン化された線状分子４０３が結合した接着用パッドが形成される（ｆ）。更に線状分子４０３に微粒子１０３を、化学結合を介して接着し、更に微粒子の表面に１つ又は複数のプローブ分子を固定する（ｇ）。
　微粒子表面には、予めアビジンを修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン－スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン－スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させる。これにより、金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。
　核酸捕捉プローブを固定した微粒子を平滑支持基板４０１と反応させることにより、本実施例の核酸分析デバイスを製造することができる。
　本実施例では、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図９を参照しながら説明する。本実施例の核酸分析装置は、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバに前記のデバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を使用する。
　また、検出窓５０２の厚さは０．１７ｍｍとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０８から発振するレーザ光５０９および５１０を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー５１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ５１３によって集光し、その後、プリズム５１４を介してデバイス５０５へ臨界角以上で照射する。
　以下、微粒子として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。
この場合、レーザ照射により、デバイス５０５表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したＤＮＡプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は、対物レンズ５１５（×６０，ＮＡ１．３５，作動距離０．１５ｍｍ）により平行光束とされ、光学フィルタ５１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ５１７により２次元ＣＣＤカメラ５１８上に結像される。
　逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、非特許文献５に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′－Ｏ－アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′－Ｏ－アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。
　微粒子として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてＱｄｏｔ（Ｒ）５６５（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）３０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、ＤＮＡプローブに捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するので、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。
　材質が無機ポリマーや有機ポリマーの微粒子は、外部光源の光を照射しても励起しない。そのため、励起エネルギーの移動による蛍光色素の発光は起こらず、未反応のヌクレオチドも発光し、ノイズとなる可能性がある。しかし、核酸合成酵素に半導体微粒子などのエネルギー移動をもたらす微粒子を結合することで、取り込まれたヌクレオチドだけを発光させることができる。あるいは、核酸合成酵素に金、銀、白金、アルミニウム等を結合させれば、取り込まれたヌクレオチドの蛍光を増強させることができる。あるいは、微粒子を固定する金属パッドの材料に金、銀、白金、アルミニウム等を用いれば、金属パッド周囲の蛍光が増強されるため、信号／ノイズを高くすることができる。
　上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることにより、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善を図ることができる。
　本発明により、多種類の核酸断片を、微粒子を介して、高密度に且つ規則正しく整列させて基板に固定でき、核酸分析デバイスの製造工程のステップを増やすことなく、簡易的な基板処理だけで、核酸試料断片を高い率で一分子だけ固定することができ、かつ微粒子の非特異的吸着の抑制によるノイズ低減を実現できるため、低ランニングコストかつ高スループットに核酸試料を分析できる。
１０１，２０３，３０１，４０１…平滑支持基板、１０２，２０２，３０５…接着用パッド、１０３，２０１…微粒子、１０４…プローブ分子、１０５…線状分子、１０６，１０７，２０５，２０６，３０４，４０３…線状分子末端の官能基、１０８，２０４，３０６，４０５…非特異的吸着防止用有機ポリマー、３０２，４０２…金属の薄膜、３０３，４０４…レジスト、５０１…カバープレート、５０２…検出窓、５０３…注入口、５０４…排出口、５０５…核酸分析デバイス、５０６…流路、５０７，５０８…ＹＡＧレーザ光源、５０９，５１０…レーザ光、５１１…λ／４板、５１２…ダイクロイックミラー、５１３…レンズ、５１４…プリズム、５１５…対物レンズ、５１６…光学フィルタ、５１７…結像レンズ、５１８…２次元ＣＣＤカメラ。

Claims (18)

  1. 　基板と、
    その基板上に形成された複数の接着用パッドと、
    該接着用パッド以外の前記基板面を被覆する薄膜層と、
    それぞれの前記接着用パッドに接着された１つの微粒子と、
    前記微粒子に固定された１種類のプローブ用分子を備え、
    前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記薄膜層は前記基板表面に対する前記微粒子の非特異的な吸着を抑制するものであることを特徴とする核酸分析デバイス。
  2. 　請求項１記載の核酸分析用デバイスにおいて、前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が１分子固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
  3. 　請求項１記載の核酸分析用デバイスにおいて、前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。
  4. 　請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、前記微粒子が半導体、金属、無機ポリマーや有機ポリマーから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
  5. 　請求項１記載の核酸分析用デバイスにおいて、
    　前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
  6. 　基板面に金属薄膜を形成し、
    該金属薄膜を選択的にエッチングして複数の接着用パッドを形成し、
    それぞれの接着用パッドに、接着用パッドに吸着する線状分子を導入し、
    該線状分子に、微粒子を、化学結合を介して接着し、
    該微粒子にプローブ分子を、化学結合を介して固定する、
    ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法。
  7. 　前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることを特徴とする請求項６記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  8. 　１つの微粒子に複数のプローブ分子が固定されていることを特徴とする請求項６記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  9. 　前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径の２倍以下であることを特徴とする請求項６記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  10. 　基板面に金属薄膜を形成し、
    該金属薄膜に吸着する線状分子膜を導入し、
    複数のダミー接着用パッドを形成して該金属薄膜及び金属薄膜を選択的にエッチングし、該ダミー接着用パッドを除去して前記線状分子膜を露出させて、金属薄膜と前記線状分子膜を有する複数の接着用パッドを形成し、
    露出した線状分子に微粒子を、化学結合を介して接着し、
    該微粒子にプローブ分子を、化学結合を介して固定する、
    ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法。
  11. 　前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることを特徴とする請求項１０記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  12. 　１つの微粒子に複数のプローブ分子が固定されていることを特徴とする請求項１０記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  13. 　前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径の２倍以下であることを特徴とする請求項１０記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  14. 　検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
    前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
    前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
    前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段を備え、
    前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、前記基板上の前記微粒子の固定位置に複数の接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッド以外の部分が線状分子膜により
    被覆されていることを特徴とする核酸分析装置。
  15. 　請求項１４記載の核酸分析装置において、前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とする核酸分析装置。
  16. 　請求項１４記載の核酸分析装置において、前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析装置。
  17. 　請求項１４記載の核酸分析装置において、前記微粒子が、半導体、金属、無機ポリマーや有機ポリマーから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。
  18. 　請求項１４記載の核酸分析装置において、前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。
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