WO2011092780A1 - 核酸分析装置，核酸分析反応デバイス、および核酸分析用反応デバイス用基板 - Google Patents

核酸分析装置，核酸分析反応デバイス、および核酸分析用反応デバイス用基板 Download PDF

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奈良原　正俊
今井　一成
斎藤　俊郎
伊名波　良仁
松井　拓也
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株式会社 日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analyzer, a nucleic acid analysis reaction device, and a substrate for a reaction device for nucleic acid analysis.
  • a cDNA fragment sample synthesized in advance by reverse transcription reaction from a DNA fragment or RNA sample for sequencing is prepared, and a dideoxy reaction is performed by a well-known Sanger method. After that, electrophoresis is performed, and the molecular weight separation development pattern is measured and analyzed.
  • Non-Patent Document 1 PCR is performed on microparticles using microparticles as a carrier for carrying DNA fragments. Thereafter, fine particles carrying PCR-amplified DNA fragments are put on a plate having a large number of holes in which the hole diameter is adjusted to the size of the fine particles, and read by a pyrosequencing method.
  • Non-Patent Document 2 PCR is performed on microparticles using microparticles as a carrier for supporting DNA fragments. Thereafter, the microparticles are dispersed and fixed on the glass substrate, an enzyme reaction (ligation) is performed on the glass substrate, a fluorescent dye is incorporated, and the sequence information of each fragment is obtained.
  • ligation enzyme reaction
  • Non-Patent Document 3 a large number of DNA probes having the same sequence are fixed on a substrate.
  • a DNA probe sequence and an adapter sequence of a complementary strand are added to the end of each DNA sample fragment.
  • the sample DNA fragments are immobilized on the substrate randomly one molecule at a time.
  • the DNA elongation reaction does not occur on the substrate, and after loading the substrate with the fluorescent dye, the unreacted substrate is washed and the fluorescence is detected to obtain the sequence information of the sample DNA.
  • the diameter of the hole on the plate shown in Non-Patent Document 1 is 44 ⁇ m, and the diameter of the fine particles is 22 ⁇ m. There is a problem that the density of particles on the plate is low and the number of DNA fragments that can be analyzed at one time is small.
  • the diameter of the fine particles of Non-Patent Document 2 is as small as 1 ⁇ m, and the density of the fine particles on the substrate is high.
  • the fine particles are randomly fixed on the substrate, it is necessary to use a two-dimensional sensor having a large number of pixels in order to separate and detect fluorescence from adjacent beads.
  • Non-Patent Document 3 the arrangement of DNA sample fragments to be measured is random. Similar to Non-Patent Document 2, the throughput is low and the detection device is expensive.
  • the inventors of the present invention have completed a reaction device for nucleic acid analysis with a high throughput that can be detected by a two-dimensional sensor having a small number of pixels.
  • the reaction device for nucleic acid analysis is a reaction device for nucleic acid analysis that includes a substrate and a reaction chamber that forms a flow path on the substrate, and detects nucleic acid immobilized on a carrier on the substrate.
  • a fine structure is arranged, and each carrier is fixed by the fine structure.
  • the fixed carrier can be arranged regularly by fixing the carrier with the regularly arranged microstructures.
  • the present invention provides a nucleic acid analyzer comprising a detection unit including a reaction device for nucleic acid analysis in which a carrier on which a nucleic acid to be detected is immobilized is regularly arranged on a substrate, an irradiation light source, and a two-dimensional sensor. It includes a fine structure on the top. By providing a certain regularity in the arrangement or shape of the fine structures, the position of the carrier can be controlled.
  • the carrier is a fine particle
  • the particle diameter is small, so that it can be arranged at a high density, and the particle shape has a large surface area, so that the amount of nucleic acid immobilized on the fine particle can be increased.
  • the fine structure can be arranged with high density by making the fine structure shorter than the carrier in the longitudinal direction as viewed from above.
  • each of the fine particles may be present in a state surrounded by a fine structure.
  • peeling of the carrier (for example, beads) in the solution is directly brought into contact with the microstructure or indirectly through control of the water flow. Can be prevented.
  • the fine particles can be two-dimensionally squarely arranged at high density according to the pixel size of the two-dimensional sensor.
  • the fine particles are made of a magnetic material, the fine particles can be fixed on the substrate by using a magnetic force.
  • the fine particles on which the DNA to be detected is immobilized are immobilized on the substrate. Detection with a two-dimensional sensor having a small number of pixels is possible. By reducing the number of data at the time of detection, the nucleic acid sequence can be analyzed with high throughput.
  • the substrate for a reaction device for nucleic acid analysis of the present invention will be described with reference to FIG.
  • Microstructures 102 are arranged in a grid pattern on the substrate 101 (the upper left diagram in FIG. 1).
  • a solution 104 (upper right diagram in FIG. 1) containing fine particles (also referred to as carriers or beads) 103 on which a nucleic acid to be detected is immobilized is fed onto a substrate 101.
  • the fine particles 103 are arranged in a lattice pattern on the substrate by causing the fine structure 102 and the fine particles 103 to interact (lower diagram in FIG. 1).
  • a substrate made of an inorganic material such as a glass substrate, a sapphire substrate, a silicon substrate, a substrate made of a metal such as stainless steel, or a substrate made of an organic material such as polymethyl methacrylate resin, polycarbonate resin, or cycloolefin resin is used. be able to.
  • the shape of the fine structure 102 various shapes such as a cylinder, a cone, a triangular prism, a triangular pyramid, and a quadrangular prism can be used.
  • the shape and size of these microstructures 102 vary during manufacturing even if they are in the same plane.
  • the structure may be tapered so that the particle 103 can be contacted at any position. preferable.
  • the taper means an inclination that becomes narrower from the side closer to the substrate of the microstructure to the side farther from the substrate.
  • the material of the fine structure 102 is not particularly limited as long as it can be finely processed below the diameter of the fine particles 103.
  • Examples of combinations of such materials and processing methods include processing combining photolithography and dry etching with silicon, and nanoimprint processing with polymethyl methacrylate resin and cycloolefin resin.
  • the fine structure 102 and the fine particles 103 are immobilized through various bonds.
  • a hydrophobic bond, an electrostatic interaction, a covalent bond, or the like can be used.
  • electrostatic interaction by introducing an amino group on the surface of the fine structure, the fine particles 103 to which DNA is adsorbed can be efficiently immobilized.
  • a covalent bond for example, an amino group or a sulfide group is introduced at the end of the DNA on which the microparticle 103 is immobilized, and reacts with a functional group on the surface of the substrate 101 and the microstructure 102 via a linker molecule. By doing so, it is possible to bond firmly. By using such a chemical bond, it is possible to prevent the fine particles 103 from being peeled off or dropped off during liquid feeding such as cleaning.
  • the material is an organic resin
  • introduction of hydroxyl groups or carboxyl groups by oxidation treatment examples include graft polymerization of monomer molecules having a desired functional group.
  • the linker molecule must be selected in consideration of the combination of the substrate 101 and the functional group at the DNA end.
  • a molecule having a sulfohydryl group, an amino group, a carboxyl group, a phosphate group, an aldehyde group, or the like can be used.
  • a functional group on the surface of the fine particle can also be used.
  • the surface of fine particles often has a carboxyl group on the surface to improve dispersibility, and this carboxyl group and a carboxyl group generated on the substrate surface by oxidation treatment or graft polymerization of an organic substrate are represented by a plurality of polyamines.
  • a metal ion can also be used as a linker.
  • tetravalent Zr ions are known to interact with a carboxyl group and single-stranded DNA.
  • a carboxyl group formed on the surface of an organic substrate by oxidation treatment or graft polymerization is used, It is possible to immobilize a valence Zr ion and immobilize it using the interaction between the Zr ion and single-stranded DNA.
  • the substrate 101 and the fine particle 103 are bonded via a carboxyl group generated by oxidation of the organic substrate and an amino group introduced into the DNA terminal on the fine particle surface.
  • Fine particles 103 having a diameter of 5 nm to 100 nm are commercially available, and these can be utilized.
  • the material constituting the fine particles include magnetic materials typified by polystyrene and iron oxide, and semiconductor fine particles. A magnetic material capable of utilizing magnetic force for arrangement is particularly preferable.
  • the smooth material is an inorganic material.
  • the material of the substrate 101 is an organic material such as PMMA, a mold method such as nanoimprint may be used.
  • reaction device for nucleic acid analysis An example of a preferred configuration of the reaction device for nucleic acid analysis of the present invention will be described with reference to FIG.
  • a plurality of regions 202 in which fine particles (not shown) are arranged in a lattice pattern are mounted on the substrate 201.
  • the interval between the regions 202 can be set appropriately depending on the specifications of the nucleic acid sample to be analyzed and the fluorescence detection apparatus.
  • Providing a plurality of reaction regions on the substrate 201 can be achieved by covering the light transmissive substrate 201 with a reaction chamber 204 provided with a flow path 203 in advance.
  • the reaction chamber 204 is made of a resin substrate such as PDMS (Polydimethylsiloxane) in which a groove of the flow path 203 is dug in advance for forming the flow path, and is used by being bonded to the substrate 201.
  • the reaction device for nucleic acid analysis produced by bonding includes a temperature control unit 205 for storing and temperature controlling a nucleic acid sample, a reaction enzyme, a buffer, a nucleotide substrate, etc., a dispensing unit 206 for sending out the reaction solution, and a valve for controlling the flow of the solution. 207 and the waste liquid tank 208 can be used. If necessary, install a temperature controller to control the temperature. At the end of the reaction, the cleaning liquid is supplied through the flow path 203 and stored in the waste liquid tank 209.
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • a method for producing a substrate for a reaction device for nucleic acid analysis will be described with reference to FIG.
  • a microstructure 503 is formed using a stamper 502 on a substrate 501 made of a thermoplastic resin such as a cycloolefin resin (Zeonor 1060R, manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.).
  • a substrate 501 having a microstructure 503 is obtained by a nanoimprint method in which the stamper 502 is pressed against the substrate 501 heated to the glass transition temperature or higher.
  • the stamper 502 has a concave or convex shape that is directly or intersecting with its extension line, and the marker 504 is simultaneously formed on the substrate 501 having the fine structure 503.
  • the position and angle of the fine structure 503 can be estimated even from a low-magnification image in which the fine structure 503 cannot be directly observed, and the final fine particle position can be estimated.
  • the arrangement method is not limited to this, and can be freely changed in accordance with the arrangement of the CCD elements.
  • the fine structure is formed at different intervals in the vertical direction and the horizontal direction according to the arrangement intervals of the light receiving elements May be arranged.
  • the light receiving element is a CCD having a honeycomb structure, it may be arranged in a square lattice shape inclined by 45 degrees from the arrangement angle of the CCD.
  • the fine structures are arranged at regular intervals, but also, for example, an arrangement in which the distance between the first and second lines is short, the distance from the next third line is long, and the distance from the fourth line is also short may be employed.
  • reaction device substrates for nucleic acid analysis The fine structure formed on the substrate 601 used in the reaction device for nucleic acid analysis is not limited to the above-described structure, and may be described below.
  • the fine structure may be composed of a first fine structure 602 and a second fine structure 603 having a center point inside a quadrangle formed by the center point.
  • the second microstructure 603 is characterized in that the height from the surface of the substrate 601 is lower than that of the first microstructure 602.
  • Such a second microstructure 603 can be created by using OEBR, ZEP2000, or the like, which is an analog resist, for example, and reducing the irradiation dose at the time of 603 electron beam drawing compared to 602.
  • a stamper may be created using a substrate having the first microstructure 602 as a master, and then created using a nanoimprint method as shown in FIG.
  • the reflection of autofluorescence from the substrate 601 is reduced during fine particle observation. It becomes possible to do. Further, by providing a space below the fine particles 604, the substrate can be uniformly supplied to the surface of the fine particles 604, which is the reaction site, and the enzyme reaction efficiency can be improved. Thus, for example, in the case of a sequence reaction as shown in a nucleic acid analysis method described later, a phase shift is prevented and a longer base length can be read.
  • the efficiency of cleaning the surface of the fine particles is improved, so that the cleaning time can be shortened in a short time, and the overall throughput is improved.
  • a phenomenon may occur in which a part of the reagent in the previous reaction cycle remains and reacts in the next cycle, but the amount of reagent residue for each cycle can be increased by improving the washability. It is possible to reduce and improve the reliability of data.
  • the top view is a plan view showing the substrate 601 before fixing the fine particles 604, and the second view from the top is a cross-sectional view of the substrate 601 before fixing the fine particles 604.
  • the lowermost figure is a cross-sectional view of the substrate 601 after the fine particles are arranged. This also applies to FIGS. 5 and 6.
  • FIG. 5 An inverted pyramid structure 605 (FIG. 5) and a quadrangular prism structure 606 having a taper (FIG. 6). These structures can be obtained by anisotropic etching of Si.
  • the inverted pyramid structure is produced by forming a groove in the substrate.
  • a nucleic acid analyzer comprises: means for supplying one or more types of biomolecules comprising nucleotides, nucleotides having fluorescent dyes, nucleic acid synthase, primers, and nucleic acid samples to a reaction device for nucleic acid analysis; and the reaction device for nucleic acid analysis The fluorescence of the fluorescent dye incorporated into the nucleic acid chain by the nucleic acid extension reaction caused by the presence of the nucleotide, the nucleic acid synthase, and the nucleic acid sample on the reaction device for nucleic acid analysis. Fluorescence measuring means for measuring.
  • the substrate 305 is installed in a reaction chamber composed of a cover plate 301 provided with a channel in advance, an inlet 303 as a solution exchange port, and an outlet 304.
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • a laser beam 308 and 309 oscillated from a YAG laser light source (wavelength 532 nm, output 20 mW) 306 and a YAG laser light source (wavelength 355 nm, output 20 mW) 307 are coaxially combined with a dichroic mirror 311 (reflecting 410 nm or less).
  • the light is condensed by the lens 312 and then irradiated onto the substrate 305 through the prism 313 at a critical angle or more.
  • the fluorescence emitted from the cover plate 301 is converted into a parallel light beam by the objective lens 314, the background light and the excitation light are blocked by the optical filter 315, and imaged on the two-dimensional CCD camera 317 by the imaging lens 316.
  • a modification of the nucleic acid analyzer shown in FIG. 7 will be described with reference to FIG.
  • the difference from the nucleic acid analyzer shown in FIG. 7 is that a temperature adjustment element 419 is installed under the reaction device and that laser light generated from the light sources 406 and 407 is irradiated through the optical fiber 418. . Since the reaction device is in direct contact with the temperature adjustment element 419, the temperature difference between the temperature adjustment element 419 and the solution temperature on the reaction device can be reduced, and the efficiency of the sequence reaction can be increased.
  • Reference numerals 406 and 407 denote laser light sources that irradiate the reaction device from a square (opening) at the tip via a 418 optical fiber.
  • a sequential reaction method can be used in addition to the above-described ligation method.
  • a nucleotide with a fluorescent dye as disclosed in Non-Patent Document 4, a 3′-O-allyl group is inserted as a protecting group at the 3′OH position of ribose, and at the 5-position of pyrimidine or purine.
  • Non-Patent Document 5 since the washing step as disclosed in Non-Patent Document 5 is not necessary, it is possible to measure the extension reaction in real time. As described above, by assembling a nucleic acid analyzer using the reaction device for nucleic acid analysis of this example, the analysis time can be shortened and the reaction device and the analyzer can be simplified without entering a washing step. In addition to the sequential reaction method, it is also possible to measure the base extension reaction in real time, which can greatly improve the throughput compared to the conventional technique.

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Abstract

　２次元センサの画素サイズに合わせて、検出対象の核酸が固定化された微粒子を基板上に格子状に配列した核酸分析用反応デバイスを提供する。　本発明の核酸分析用反応デバイスは、基板１０１上に流路を形成する反応チャンバーを備え、基板１０１上で微粒子１０３に固定された核酸を検出する核酸分析用反応デバイスであって、基板１０１上に配列した微細構造体１０２によって検出対象の核酸が固定化された微粒子１０３が配置されている。

Description

核酸分析装置，核酸分析反応デバイス、および核酸分析用反応デバイス用基板
　本発明は、核酸分析装置，核酸分析反応デバイス、および核酸分析用反応デバイス用基板に関する。
　ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
　現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
　これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。
　非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担時する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
　また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
　さらに、非特許文献３では、基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。
　以上のように、基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。
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　しかしながら、上記のようなパラレル解析法を用いても、ヒトの全ての遺伝子を解析するには数日間必要であり、さらにスループットが高い解析方法が望まれている。非特許文献１に示されているプレート上の穴の直径は４４μｍ、微粒子の直径は２２μｍである。プレート上の粒子の密度が低く、一度に解析できるＤＮＡ断片数が少ない問題がある。非特許文献２の微粒子の直径は１μｍと小さく、基板上の微粒子の密度は高い。しかしながら、微粒子が基板上にランダムに固定化されているため、近接するビーズからの蛍光を切り分けて検出するために、画素数が多い２次元センサを用いる必要がある。解析当たりのデータ数が増えるため、データ転送時間が長くなり、解析のスループットが低くなる問題がある。また、開口数ＮＡの大きな集光レンズを使う必要があり、検出装置が高価になる問題もある。ライゲーション反応を行うために複数の反応溶液を送液するが、送液時の抵抗によりビーズが基板上よりはがれてしまう問題もある。非特許文献３においても、測定対象のＤＮＡ試料断片の配置はランダムである。非特許文献２と同様にスループットが低く、検出装置が高価な問題がある。
　本発明の発明者らは、鋭意研究の結果、少ない画素数の２次元センサで検出可能なスループットが高い核酸分析用反応デバイスを完成させた。
　この核酸分析用反応デバイスは、基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備え、基板上で担体に固定された核酸を検出する核酸分析用反応デバイスであって、基板上には規則的に微細構造体が配置されており、微細構造体によって各担体が固定される。
　規則的に配置された微細構造体によって、担体が固定されることにより、固定される担体を規則的に配置させることが可能となる。
　それゆえ、画素数が少ない２次元センサを用いても隣接する担体からの蛍光を切り分けて検出することができる。従って、解析当たりのデータ数が減るため、データ転送時間が短くなり、解析のスループットを高くすることができる。さらに、開口数ＮＡの大きな集光レンズを使う必要がなく、検出装置を安価にすることができる。
　本発明は、検出対象の核酸が固定化された担体が基板上に規則的に配列した核酸分析用反応デバイス，照射光源，２次元センサを含む検出ユニットからなる核酸分析装置であって、前記基板上に微細構造体を含むことを特徴とする。この微細構造体の配置、あるいは形状に一定の規則性を持たせることにより、担体の位置を制御することが可能となる。
　また、担体が微粒子であれば、粒子直径が小さいため高密度で配列できるとともに、粒子形状は表面面積が大きいため微粒子上の核酸固定量を高めることができる。
　また、担体よりも微細構造体の方が上方から見た長手方向の長さが短くすることで、微粒子を高密度に配列することができる。
　また、前記一つ一つの微粒子が、微細構造体に囲まれた状態で存在してもよい。微粒子が固定化された基板上に試薬を含む溶液を送液する際に、送液中の担体（例えばビーズ）のはがれを、微細構造体との接触により直接、あるいは水流の制御を介して間接的に防止することができる。
　また、微細構造体を格子状に配列することにより、２次元センサの画素サイズに合わせて、微粒子を高密度に２次元に正方配列することができる。
　また、微粒子が磁性材料からなるので、磁力を用いて、基板上に微粒子を固定化することができる。
　２次元センサの画素に合わせて配列させた微細構造体を用いて、検出対象のＤＮＡが固定化された微粒子を基板上に固定化する。画素数が少ない２次元センサでの検出を可能とする。検出時のデータ数を低減することで、核酸配列を高スループットに分析することができる。
本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析反応デバイスの製造方法の一例を説明するための図である。 本発明の拡散分析用デバイス上における微細構造体の他のバリエーションについて説明するための図である。 本発明の拡散分析用デバイス上における微細構造体の他のバリエーションについて説明するための図である。 本発明の拡散分析用デバイス上における微細構造体の他のバリエーションについて説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応装置の構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応装置の構成の一例を説明するための図である。
　本発明の一実施形態について、図を参照して説明する。
　〔核酸分析用反応デバイスに用いる基板及び微粒子について〕
　本発明の核酸分析用反応デバイス用基板について図１を用いて説明する。基板１０１の上に微細構造体１０２を格子状に配置する（図１左上図）。基板１０１上に検出対象である核酸が固定化された微粒子（担体，ビーズとも称す）１０３を含む溶液１０４（図１右上図）を送液する。微細構造体１０２と微粒子１０３を相互作用させることで微粒子１０３を基板上に格子状に配列する（図１下図）。
　基板１０１としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコン基板などの無機物質からなる基板、ステンレスなどの金属からなる基板、ポリメタクリル酸メチル樹脂，ポリカーボネート樹脂，シクロオレフィン樹脂などの有機物質からなる基板を用いることができる。
　微細構造体１０２の形状としては、円柱，円錐，三角柱，三角錐，四角柱など様々な形状を用いることができる。一般に、これら微細構造体１０２の形状や大きさは同一面内であっても製造時にばらつきが生じるものである。１つの微粒子１０３に接触する複数の微細構造体１０２の形状や大きさがばらついていても、いずれかの位置で微粒子１０３と接触することが可能なように構造体にはテーパーがついていることが好ましい。なお、ここでのテーパーは微細構造体の基板に近い側から遠い側に向かって細くなるような傾斜という意味である。
　微細構造体１０２の材質としては、微粒子１０３の直径以下の微細な加工ができれば特に制限はない。この様な材質と加工方法の組み合わせとしては、シリコンでのフォトリソグラフィとドライエッチングを組み合わせた加工やポリメタクリル酸メチル樹脂やシクロオレフィン樹脂でのナノインプリント加工などが上げられる。
　微細構造体１０２と微粒子１０３は種々の結合を介して固定化される。この様な結合様式としては、疎水性結合，静電相互作用，共有結合などが用いることができる。静電相互作用であれば、微細構造体表面にアミノ基を導入することで、効率良くＤＮＡが吸着した微粒子１０３を固定化することができる。また、共有結合であれば、例えば、微粒子１０３の固定化されたＤＮＡの末端にアミノ基やスルフィド基を導入しておき、リンカー分子を介して基板１０１及び微細構造体１０２表面の官能基と反応することで強固に結合することができる。このような化学結合の利用により、洗浄などの送液時における微粒子１０３の剥離や脱落を防ぐことができる。
　基板表面への官能基の導入に際しては、その材質を考慮したうえで適切な手法を選択する必要があるが、例えばその材質が有機樹脂であるならば、酸化処理による水酸基やカルボキシル基の導入，所望の官能基を有したモノマー分子のグラフト重合などが挙げられる。
　リンカー分子としては、基板１０１とＤＮＡ末端の官能基の組み合わせを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を持つ分子を用いることができる。またＤＮＡ末端の官能基以外にも微粒子表面上の官能基を利用することもできる。例えば、微粒子の表面は分散性向上のため表面にカルボキシル基を有することが多いが、このカルボキシル基と有機基板の酸化処理やグラフト重合により基板表面に生じたカルボキシル基を、ポリアミンに代表される複数のアミノ基を持った分子とカルボジイミドなどの試薬を用いて固定することができる。また、リンカーとして金属イオンを用いることもできる。例えば四価のＺｒイオンはカルボキシル基と一本鎖ＤＮＡとに相互作用を示すことが知られており、例えば有機基板表面の酸化処理、若しくはグラフト重合により表面に形成されたカルボキシル基を用い、四価Ｚｒイオンを固定し、そのＺｒイオンと一本鎖ＤＮＡの相互作用を利用して固定化することが可能である。
　なお、このようなリンカーの利用は必須ではなく、例えば有機基板の酸化により生じたカルボキシル基と、微粒子表面上のＤＮＡ末端に導入されたアミノ基を介して、基板１０１と微粒子１０３を結合することも可能である。微粒子１０３としては、直径５ｎｍ～１００ｎｍのものが市販されており、これらを活用することができる。微粒子を構成する材料としては、ポリスチレン，酸化鉄に代表される磁性材料，半導体微粒子などがあるが、配列に磁力が活用可能な、磁性材料が特に好ましい。
　微細構造体１０２を基板１０１上に形成する方法としては、平滑材料が無機材料であれば半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。一方、基板１０１の材料がＰＭＭＡなどの有機材料であれば、ナノインプリントの様なモールド方式を用いても良い。
　〔核酸分析用反応デバイスについて〕
　本発明の核酸分析用反応デバイスの好ましい構成の一例について図２を参照して説明する。基板２０１の上に、微粒子（不図示）が格子状に配置されている領域２０２が複数搭載されている。領域２０２の間隔は、解析しようとする核酸試料，蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。複数の反応領域を基板２０１の上に設けるには、予め流路２０３を設けた反応チャンバー２０４を光透過性の基板２０１の上にかぶせることで達成できる。反応チャンバー２０４は、流路の形成には流路２０３の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体からなり、基板２０１上に貼り合わせて使用することになる。貼り合わせによって作製した核酸分析用反応デバイスは、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット２０５，反応液を送り出す分注ユニット２０６，液の流れを制御するバルブ２０７，廃液タンク２０８と共に用いることができる。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応終了時には、洗浄液が流路２０３を通じて供給され、廃液タンク２０９に収納される。
　〔核酸分析用反応デバイス用基板の製造方法〕
　核酸分析用反応デバイス用基板の製造方法を、図３を用いて説明する。シクロオレフィン樹脂（ゼオノア１０６０Ｒ、日本ゼオン社製）などの熱可塑性樹脂からなる基板５０１上にスタンパ５０２を用いて微細構造体５０３を作製する。ガラス転移温度以上に加熱した基板５０１に対してスタンパ５０２を押し付けるナノインプリント工法によって、微細構造体５０３を有した基板５０１を得る。この際、スタンパ５０２は、直接、若しくはその延長線が交差する形状の凹若しくは凸を有しており、微細構造体５０３を有した基板５０１にはマーカー５０４も同時に形成される。このマーカー５０４を作成することで、直接微細構造体５０３を観察できない低倍率の画像からでも、微細構造体５０３の配置位置や角度を推定し、最終的な微粒子の位置を推定することができる。
　なお、図３では、微細構造体を格子状に配置させた例を説明した。しかしながら、配置方法はこれに限定されず、ＣＣＤ素子の配置に合わせる形で自由に変更することができる。例えば、ＣＣＤを構成する受光素子の配置間隔が縦方向と横方向とで異なる長方画素ＣＣＤを用いるのであれば、その受光素子の配置間隔にあわせ縦方向と横方向とで異なる間隔で微細構造を配置してもよい。また、例えば受光素子がハニカム構造のＣＣＤであればＣＣＤの配置角度から４５度傾けた正方格子状に配置させてもよい。
　また、一定間隔で微細構造が並ぶだけでなく、たとえば一本目と二本目の間隔が短くその次の三本目との間隔が長い、そして四本目との間隔がまた短くなるような配置でもよい。
　〔核酸分析用反応デバイス用基板の他のバリエーションについて〕
　核酸分析用反応デバイスに用いる基板６０１に形成する微細構造体は、上述したものに限定されず、以下に説明するものでもよい。
　微細構造体は、第一の微細構造体６０２と、その中心点が形成する四角形の内部に中心点を持つ第二の微細構造体６０３からなるものでもよい。この第二の微細構造体６０３は、基板６０１面からの高さが第一の微細構造体６０２に比べ低いことを特徴とする。このような第二の微細構造体６０３は、例えばアナログ型レジストであるＯＥＢＲやＺＥＰ２０００などを用い６０３の電子線描画時の照射線量を６０２に比べ少なくすることで作成できる。または、第一の微細構造体６０２を有する基板をマスタとしてスタンパを作成の上、図３のようにナノインプリント工法を用いて作成しても良い。このような高さの異なる二種類以上の微細構造体６０２，６０３を有する基板を用い微粒子６０４を基板から浮いた状態で固定することで、微粒子観察時に基板６０１からの自家蛍光の写りこみを低減することが可能となる。また、微粒子６０４下部に空間を設けることにより、反応の場である微粒子６０４の表面へ基質を均一に供給することができ、酵素反応効率の向上が可能となる。これにより、例えば後述する核酸分析方法に示すようなシーケンス反応であれば、位相のずれを防ぎ、より長い塩基長の読み取りが可能となる。また、基板面から微粒子６０４を浮かせることで、微粒子表面の洗浄の効率が向上するため短時間での洗浄時間の短縮が図れ、全体としてのスループットの向上に繋がる。また後述する核酸分析方法に示すような反応系では、前回反応サイクル時の試薬が一部残渣し次サイクルで反応する現象が起こりうるが、洗浄性を向上させることでサイクルごとの試薬残渣量を低減しデータの信頼性向上をもたらすことが可能となる。
　なお、図４では、一番上の図が微粒子６０４を固定する前の基板６０１を示す平面図であり、上から二番目の図が微粒子６０４を固定する前の基板６０１の断面図であり、一番下の図は微粒子を配置させた後の基板６０１の断面図である。この点は、図５および図６についても同様である。
　このような、微粒子６０４の下部に空間を設けるための構造としては、他には逆ピラミッド構造６０５（図５）やテーパーを有した四角柱構造６０６（図６）などがある。これらの構造はＳｉの異方性エッチングなどにより得ることができる。なお、逆ピラミッド構造は、基板に溝を形成することにより、作製している。
　〔核酸分析装置について〕
　本発明の核酸分析装置について図７を用いて説明する。核酸分析装置は、核酸分析用反応デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマー及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析用反応デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析用反応デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。
　より具体的には、予め流路を設けたカバープレート３０１と溶液交換用口である注入口３０３と排出口３０４から構成される反応チャンバーに基板３０５を設置する。なお、カバープレート３０１の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）３０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）３０７から発振するレーザ光３０８および３０９をダイクロイックミラー３１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ３１２によって集光し、その後、プリズム３１３を介して基板３０５へ臨界角以上で照射する。カバープレート３０１より出射される蛍光は、対物レンズ３１４により平行光束とされ、光学フィルタ３１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ３１６により２次元ＣＣＤカメラ３１７上に結像される。
　図７に示した核酸分析装置の変形例を図８を用いて説明する。図７に示した核酸分析装置との違いは、反応デバイスの下に温調素子４１９が設置されている点と光源４０６，４０７から生じたレーザ光を光ファイバ４１８を介して照射する点である。反応デバイスが温調素子４１９と直接接しているため、温調素子４１９と反応デバイス上の溶液温度の間の温度差を小さくすることができ、シーケンス反応の効率を高めることができる。４０６，４０７はレーザ光源で４１８の光ファイバを介してその先端の四角（開口部）から反応デバイスに向かって照射している。
　〔核酸分析用反応デバイスと核酸分析装置を用いた核酸分析方法について〕
　非特許文献２に開示されている方法に従い、測定対象のＤＮＡを断片化，増幅した後、エマルジョンＰＣＲ法を用いて測定対象のＤＮＡ断片が固定化されたビーズを作製する。続いて、非特許文献６に開示されている方法に従い、アクリルゲルを用いて本発明の核酸分析用反応デバイス上にビーズを固定化する。次に、ビーズが固定化された核酸分析用反応デバイスを図８に示した核酸分析装置に設置する。最後に、非特許文献２に開示されている方法に従い、
　（１）アンカープライマーのハイブリダイゼーション
　（２）蛍光プライマーのライゲーション
　（３）蛍光検出
　（４）アンカープライマーと蛍光プライマーの除去
　（５）（１）から（４）の繰り返し
を行い、塩基配列を決定する。
　また、本発明は前述のライゲーションによる方法以外に逐次反応方式を用いることができる。蛍光色素付きヌクレオチドとして、非特許文献４に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′－Ｏ－アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
　さらに、本実施例では、非特許文献５に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。上記のように、本実施例の核酸分析用反応デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，反応デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
１０１，２０１，３０５，５０１，６０１　基板
１０２，５０３　微細構造体
１０３，６０４　微粒子
１０４　溶液
２０２　微粒子が格子状に配置されている領域
２０３　流路
２０４　反応チャンバー
２０５　温調ユニット
２０６　分注ユニット
２０７　バルブ
２０８　廃液タンク
３０１　カバープレート
３０３　注入口
３０４　排出口
３０６，３０７　ＹＡＧレーザ光源
３０８，３０９　レーザ光
３１０　ダイクロイックミラー
３１２　レンズ
３１３　プリズム
３１４　対物レンズ
３１５　光学フィルタ
３１６　結像レンズ
３１７　２次元ＣＣＤカメラ
４１８　光ファイバ
４１９　温調素子
５０２　スタンパ
５０４　マーカー
６０２　第一の微細構造体
６０３　第二の微細構造体
６０５　逆ピラミッド構造（微細構造体）
６０６　四角柱構造（微細構造体）

Claims (18)

  1. 　基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備え、基板上で担体に固定された核酸を検出する核酸分析用反応デバイスであって、
    　基板上には規則的に微細構造体が配置されており、微細構造体によって各担体が固定されることを特徴とする核酸分析用反応デバイス。
  2. 　担体よりも微細構造体の方が上方から見た長手方向の長さが短い請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  3. 　微細構造体によって担体は下部が基板と接触しないように固定される請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  4. 　各担体は微細構造体に囲われて存在することを特徴とする請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  5. 　微細構造体は、第１の微細構造体と、第１の微細構造体よりも基板から突出する高さが低い第２の構造体から構成されており、
    　担体は、第１の微細構造体により、周りから固定され、第２の微細構造体に下方から支えられて固定される請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  6. 　微細構造体は、断面が三角形状の溝である請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  7. 　微細構造体は、断面が三角形状の突起である請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  8. 　微細構造体は格子状に配置されている請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  9. 　各担体は、４つの微細構造体に接触する請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  10. 　基板上に、回転および／または収差によるゆがみを補正するためのマーカーを備えた請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  11. 　基板には、担体を補足するための官能基が導入されている請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  12. 　担体が磁性材料からなる請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  13. 　担体は微粒子である請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
  14. 　担体に固定された核酸を検出する基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備えた核酸分析用反応デバイスと、
    　照射光源と、
    　２次元センサを含む検出ユニットとを備えた核酸分析装置であって、
    　基板上には規則的に微細構造体が配置されており、該微細構造体によって担体が固定されることを特徴とする核酸分析装置。
  15. 　担体に固定された核酸を検出する基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備え、基板上に規則的に配置され担体を固定する微細構造体を備えた、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素，プライマー及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、
    　核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
    　核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマー及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
  16. 　担体に固定された核酸を検出するために用いられる核酸分析用反応デバイス用基板であって、基板上には規則的に微細構造体が配置されており、微細構造体によって各担体が固定されることを特徴とする核酸分析用反応デバイス用基板。
  17. 　微細構造体は格子状に配置されている請求項１６に記載の核酸分析用反応デバイス用基板。
  18. 　４つの微細構造体が囲われて担体が固定されることを特徴とする請求項１７に記載の核酸分析用反応デバイス用基板。
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