CN116735883B - 一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，提供了一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，包括以下步骤，制备聚苯乙烯微球圆环形阵列，取相同尺寸的羧基修饰的聚苯乙烯微球，通过液桥自组装方式获得聚苯乙烯微球圆环形阵列；制备比色传感芯片，将所述聚苯乙烯微球圆环形阵列浸入到氨基封端的抗体分散液中进行化学偶联反应，并连续清洗5次，得到比色传感芯片。本发明是基于比色法用于羧肽酶N1的定量检测，体积小，操作方便，无需荧光标记，也不需要昂贵的实验仪器和专业的技术人员，解决了现有技术中检测方法多为非便携式的设备或手工检测方法，存在灵敏度低、重复性差，导致易出现漏检和假阳性问题。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及了一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法。
背景技术
目前一些常规的乳腺肿瘤标志物如CA153对乳腺癌的发生发展、预后监测及复发预警起到了重要作用，羧肽酶N可以水解蛋白质产生多肽C3f片段，并且具有特异性。羧肽酶N（CPN）可以通过切割C端残基在调节血管活性的肽激素，生长因子和细胞因子的过程中发挥重要作用。
目前血清肿瘤标志物的检测方法多为大型设备采用化学或电化学放光的检测方法，有高通量、高灵敏度等优势，但不能进行床旁检测；而另一种主要检测方法为人工操作的酶联免疫检测，但其有灵敏度/重复性差、易造成漏诊和假阳性，反应过程一定程度受环境因素影响，稳定性差等弱点。
发明内容
为了解决现有技术中检测方法多为非便携式的设备或手工检测方法，存在灵敏度低、重复性差，导致易出现漏检和假阳性问题，本发明提供了一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法。
本发明一方面提供了一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，包括以下步骤，
S1、制备聚苯乙烯微球圆环形阵列，取相同尺寸的羧基修饰的聚苯乙烯微球，通过液桥自组装方式获得聚苯乙烯微球圆环形阵列；
S2、制备比色传感芯片，将所述聚苯乙烯微球圆环形阵列浸入到氨基封端的抗体分散液中进行化学偶联反应，并连续清洗5次，得到比色传感芯片。
进一步，所述制备聚苯乙烯微球圆环形阵列，取相同尺寸的羧基修饰的聚苯乙烯微球，通过液桥自组装方式获得聚苯乙烯微球圆环形阵列包括：
S1-1、制备圆环形微柱模板，通过多层离子束曝光工艺光刻方法和反应离子蚀刻方法制备圆环形微柱模板；
S1-2、组装聚苯乙烯微球，在单晶硅片上滴羧基修饰的聚苯乙烯微球乙醇分散液，待聚苯乙烯微球乙醇分散液扩散并完全覆盖单晶硅片后，再覆盖到圆环形微柱模板，并用夹子进行固定；待溶剂在室温下挥发24h，得到聚苯乙烯微球圆环形阵列。
进一步，所述抗体分散液的温度为40℃。
进一步，所述圆环形微柱模板具备亲水性，所述亲水性经氧等离子体处理获得。
进一步，所述圆环形微柱模板的圆环形微柱侧壁为粗糙表面，微柱顶部为光滑表面。
进一步，所述圆环形微柱模板的圆环形微柱高度均为20μm，宽度为100μm，外径为500μm，内径为300μm。
进一步，所述聚苯乙烯微球的直径为500nm-500μm。
进一步，所述抗体为Anti-CPN1抗体或HRP标记的IgG H&L抗体中的一种或两种。
进一步，所述抗体包括Anti-CPN1抗体和HRP标记的IgG H&L抗体，所述Anti-CPN1抗体和所述HRP标记的IgG H&L抗体的体积比为9:1到1:9。
进一步，所述Anti-CPN1抗体经抗原特异性亲和层析法，再通过蛋白A亲和层析法进行纯化获得，所述HRP标记的IgG H&L抗体经亲和层析法分离出，再使用抗原耦合到琼脂糖珠并与马萝卜过氧化物酶连接。
本发明的优点在于：本发明利用聚苯乙烯微球圆环形阵列结构，提高比色传感芯片有效表面积，通过聚苯乙烯微球圆环形阵列结构与抗体进行化学偶联反应，使抗体分布均匀，有效捕获乳腺癌标志物羧肽酶N1(CPN1)，当羧肽酶N1(CPN1)亚基通过定制的抗体识别特异性地结合在纳米光子结构上时，会产生散射共振增强作用，显著改变散射光的颜色，通过本发明的比色传感芯片可以在10分钟内通过便携设备，如手机，实现快速检测，灵敏度达50pg/ml。本发明是基于比色法用于羧肽酶N1的定量检测，体积小，操作方便，无需荧光标记，也不需要昂贵的实验仪器和专业的技术人员，解决了现有技术中检测方法多为非便携式的设备或手工检测方法，存在灵敏度低、重复性差，导致易出现漏检和假阳性问题，为发展简便的高灵敏光学生物检测平台提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明的聚苯乙烯微球圆环形阵列排布示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的具体实施方式做出说明。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1 制备便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片
结合图1进行说明，
S1、制备聚苯乙烯微球圆环形阵列：
首先通过多层离子束曝光工艺光刻方法和反应离子蚀刻方法制备圆环形微柱模板。微柱侧壁为粗糙表面，微柱顶部保持单晶硅的光滑表面，模板的圆环形微柱高度均为20μm，宽度为100μm，外径为500μm，内径为300μm。并对该模板用氧等离子体处理成亲水特性。
组装聚苯乙烯微球：在1.5cm*1.5cm平整的单晶硅片上滴10μl的羧基修饰的聚苯乙烯微球乙醇分散液，等待胶体分散液扩散并覆盖整个单晶硅片上后，覆盖到圆环形微柱模板 并用夹子进行固定。缓慢等待溶剂在室温和压力下挥发24h，得到聚苯乙烯微球圆环形阵列。
S2、制备比色传感芯片：
将S1制备的圆环形阵列在浸入到10mg/ml的氨基封端的抗体分散液中进行化学偶联反应4h并取出，抗体分散液的温度为40℃，并放入超纯水中连续清洗5次，得到比色传感芯片。
其中抗体为Anti-CPN1 (ab232802)抗体或HRP标记的IgG H&L抗体。
实施例2灵敏度检测实验
实验例1：按照实施例1的制备方法制备比色传感芯片，其中，聚苯乙烯微球的直径为500nm，浓度为10mg/ml；抗体为Anti-CPN1抗体。
实验例2：与实验例1不同的是，聚苯乙烯微球的直径为5μm，浓度为10mg/ml；抗体为Anti-CPN1抗体。
实验例3：与实验例1不同的是，聚苯乙烯微球的直径为50μm，浓度为10mg/ml；抗体为Anti-CPN1抗体。
实验例4：与实验例1不同的是，聚苯乙烯微球的直径为500μm，浓度为10mg/ml；抗体为Anti-CPN1抗体。
实验例5：与实验例1不同的是，聚苯乙烯微球的直径为500nm，浓度为10mg/ml；抗体为HRP标记的IgG H&L抗体。
实验例6：与实验例1不同的是，聚苯乙烯微球的直径为500nm，浓度为10mg/ml；抗体为Anti-CPN1抗体和HRP标记的IgG H&L抗体，Anti-CPN1抗体和HRP标记的IgG H&L抗体的添加体积比为1:1。
使用实验例1至实验例6的比色传感芯片进行灵敏度检测，获取已知浓度为5ng/ml，20ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml羧肽酶N的血清提取液，将血清提取液滴加在比色传感芯片上进行抗原抗体反应。利用手机闪光灯作为灯源，装有即贴即用通用放大镜的华为P30手机拍摄前后两张照片。获得RGB值计算得到欧几里得距离ΔE，并根据羧肽酶N浓度值获得线性范围、检测限与标定曲线，计算检测限，具体结果如表1。
同时设置对照例：选用实验室型非便携式羧肽酶N1(CPN1)检测方法，即，将羧肽酶N1(CPN1)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的羧肽酶N1(CPN1)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的羧肽酶N1(CPN1)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的羧肽酶N1(CPN1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定已知浓度5 ng/ml，20 ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml，1000 ng/ml 羧肽酶N的分散液吸光度(OD值)，计算得到检测限为500 pg/mL。
表1灵敏度检测结果
实施例3 便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片的应用
使用时，将待检测血清原液进行1μm孔径的滤膜进行过滤，获得羧肽酶N血清提取液，将血清提取液滴加在检测芯片上进行抗原抗体反应。利用手机闪光灯作为灯源，装有即贴即用通用放大镜的华为P30手机拍摄前后两张照片。通过RGB值计算得到欧几里得距离ΔE，基于上述的标定曲线获得乳腺癌病人血清原液的羧肽酶N的浓度值。
本发明利用聚苯乙烯微球圆环形阵列结构，提高比色传感芯片有效表面积，通过聚苯乙烯微球圆环形阵列结构与抗体进行化学偶联反应，使抗体分布均匀，有效捕获乳腺癌标志物羧肽酶N1(CPN1)，当羧肽酶N1(CPN1)亚基通过定制的抗体识别特异性地结合在纳米光子结构上时，会产生散射共振增强作用，显著改变散射光的颜色，通过本发明的比色传感芯片可以在10分钟内通过便携设备，如手机，实现快速检测，灵敏度达50pg/ml。本发明是基于比色法用于羧肽酶N1的定量检测，体积小，操作方便，无需荧光标记，也不需要昂贵的实验仪器和专业的技术人员，解决了现有技术中检测方法多为非便携式的设备或手工检测方法，存在灵敏度低、重复性差，导致易出现漏检和假阳性问题，为发展简便的高灵敏光学生物检测平台提供了新的思路。
对于本领域技术人员而言，本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1、制备聚苯乙烯微球圆环形阵列：取相同尺寸的羧基修饰的聚苯乙烯微球，通过液桥自组装方式获得聚苯乙烯微球圆环形阵列；
S2、制备比色传感芯片：将所述聚苯乙烯微球圆环形阵列浸入到氨基封端的抗体分散液中进行化学偶联反应，并连续清洗5次，得到比色传感芯片；
所述制备聚苯乙烯微球圆环形阵列：取相同尺寸的羧基修饰的聚苯乙烯微球，通过液桥自组装方式获得聚苯乙烯微球圆环形阵列包括，
S1-1、制备圆环形微柱模板：通过多层离子束曝光工艺光刻方法和反应离子蚀刻方法制备圆环形微柱模板；
S1-2、组装聚苯乙烯微球：在单晶硅片上滴羧基修饰的聚苯乙烯微球乙醇分散液，待聚苯乙烯微球乙醇分散液扩散并完全覆盖单晶硅片后，再覆盖到圆环形微柱模板，并用夹子进行固定；待溶剂在室温下挥发24h，得到聚苯乙烯微球圆环形阵列。
2.根据权利要求1所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述抗体分散液的温度为40℃。
3.根据权利要求2所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述圆环形微柱模板具备亲水性，所述亲水性经氧等离子体处理获得。
4.根据权利要求3所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述圆环形微柱模板的圆环形微柱侧壁为粗糙表面，微柱顶部为光滑表面。
5.根据权利要求4所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述圆环形微柱模板的圆环形微柱高度均为20μm，宽度为100μm，外径为500μm，内径为300μm。
6.根据权利要求5所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯微球的直径为500nm-500μm。
7.根据权利要求6所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述抗体为Anti-CPN1抗体、HRP标记的IgG H&L抗体中的一种或两种。
8.根据权利要求7所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述抗体包括Anti-CPN1抗体和HRP标记的IgG H&L抗体，所述Anti-CPN1抗体和所述HRP标记的IgG H&L抗体的体积比为9:1到1:9。
9.根据权利要求8所述的一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法，其特征在于，所述Anti-CPN1抗体经抗原特异性亲和层析法，再通过蛋白A亲和层析法进行纯化获得，所述HRP标记的IgG H&L抗体经亲和层析法分离出，再使用抗原耦合到琼脂糖珠并与马萝卜过氧化物酶连接。
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