WO2010061772A1 - イムノクロマト媒体およびイムノクロマトグラフ法 - Google Patents

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WO2010061772A1
WO2010061772A1 PCT/JP2009/069609 JP2009069609W WO2010061772A1 WO 2010061772 A1 WO2010061772 A1 WO 2010061772A1 JP 2009069609 W JP2009069609 W JP 2009069609W WO 2010061772 A1 WO2010061772 A1 WO 2010061772A1
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immunochromatographic
antibody
substance
detected
detection
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PCT/JP2009/069609
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和也 塚田
恒子 藤井
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コニカミノルタエムジー株式会社
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
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    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention generally relates to an immunochromatograph using an immunochromatographic medium that detects and identifies a plurality of analytes (also referred to as analytes) in a single fluid sample, if present, on a single support. Regarding the law.
  • An object of the present invention is to provide an immunochromatographic medium and an immunochromatography method capable of simultaneously detecting and quantifying a plurality of items even when detecting a plurality of items exceeding four types of color tones capable of colored latex particles. .
  • the labeled reagent is An immunochromatographic medium, characterized in that it is a fluorescent nanoparticle and the detection site is in the form of dots.
  • An immunochromatographic method wherein the reacted chromatographic reaction solution is moved on the immunochromatographic medium and captured at a detection site where a substance capable of binding to the substance to be detected is immobilized to detect the substance to be detected.
  • the immunochromatographic medium and immunochromatographic method of the present invention enable simple and quantitative multiple simultaneous analysis by using a 1-strip immunochromatographic medium using fluorescent nanoparticles. That is, by using the immunochromatographic medium of the present invention, it is possible to emit multiple colors with one-wavelength excitation, so that not only can multiple items be detected at the same time without increasing the operation, but in the case of a line, 3-4 types of Although the detection site is the limit, since the area of the detection site occupied by the dot shape is small, a plurality of detection sites can be set. Therefore, even when the number of items is 3 to 4 or more, analysis can be performed in one strip, and detection can be performed without changing the amount of sample to be added. In addition, since dilution of the sample is unnecessary, a plurality of items can be detected with high sensitivity.
  • the support used in the immunochromatographic medium of the present invention can reach the chromatographic detection unit reliably by allowing the complex of the substance to be detected and the detection reagent to stably and quickly diffuse and move in the presence of a solvent.
  • it is necessary to have a pore size larger than that of the composite.
  • it is used for a glass fiber sheet, a porous material such as paper or nitrocellulose, a fiber matrix, or a thin layer chromatograph.
  • the carrier include silica, fine granular cellulose, and nylon 6,6.
  • Preferred porous materials for conducting a lateral flow support assay with high sensitivity and specificity include microporous cellulose esters, for example, cellulose esters with aliphatic carboxylic acids such as alkanecarboxylic acids, particularly preferably. Examples include microporous materials made from nitrocellulose. Moreover, the mixture of the said cellulose ester and nitrocellulose can also be used suitably.
  • the shape of the immunochromatographic medium having the support is usually a band shape, and the chromatographic detection sites are arranged in a dot shape. In the medium of the present invention, the length for moving the chromatographic reaction solution is usually about 1 to 10 cm, and the width is usually about 0.5 to 2 cm.
  • a plurality of detections can be performed at the same time by making the detection portion into a dot shape. If the detection accuracy can be maintained, many dots can be created in a single immunochromatographic medium, but the effectiveness of using quantum dots for detection, ease of visual recognition, and ease of handling Therefore, the number of dots is preferably 3 or more and 30 or less. More preferably, it is 5 or more and 30 or less.
  • the shape of the dot is preferably rectangular or circular, and the size is not particularly limited, but a size of about 1 to 5 mm is preferable because it is easy to view and easy to measure. Further, the interval between adjacent dots is set in a range where the fixing antibody does not bleed. The distance can be about 1 to 2 mm.
  • ⁇ Two-dimensional arrangements that are substantially equidistant from each other are preferable from the viewpoint of ease of measurement and visual certainty. Specifically, they are arranged in a matrix and the number of rows and columns can be about 1 to 6, respectively.
  • the dots are provided on the material covering the absorbent pad, and the fixing antibody can be immobilized by spraying or the like.
  • the dots can then be protected with a laminate or the like.
  • sample in the present invention various solutions are used, and biological liquid samples such as blood, plasma, serum, saliva, urine, milk, pleural effusion, mucous membrane, spinal fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid or feces are used. . Further, it may be obtained from a fermentation process, a cell culture, a chemical reaction mixture or the like. In addition to biological fluids or physiological fluids, other liquid samples such as water, food production test samples, water quality or soil test samples may be used.
  • the detection target may be any substance that specifically binds to the substance (substance that can bind to the substance to be detected).
  • a polypeptide, a protein, a complex protein, a polysaccharide, a lipid, a complex lipid examples include hormones and nucleic acids.
  • Examples of the substance that specifically binds include antibodies, receptors, and aptamers.
  • the labeling reagent means a detectable substance to be labeled that can be added to a specific binding component (antibody).
  • fluorescent nanoparticles are used. Fluorescent nanoparticles have the advantage of obtaining high emission with a small size.
  • quantum dots Because high emission intensity can be obtained by the quantum size confinement effect, and at the same time, different emission wavelengths can be obtained by changing the size with the same composition, and the half width of the emission wavelength is narrow.
  • the feature of the present quantum dot which has a great merit that multiple colors can be obtained from the visible light to the infrared region, exhibits the effect of the present invention higher.
  • Fluorescent nanoparticles include quantum dots that exhibit a quantum size effect, activator-type fluorescent particles that generate fluorescence by containing an activator, host-excited nanoparticles, and the like.
  • the material for the semiconductor nanoparticles according to the present invention various known fluorescent compounds and their raw materials can be used.
  • it can be formed using various semiconductor materials conventionally known as semiconductor nanoparticle materials.
  • semiconductor materials conventionally known as semiconductor nanoparticle materials.
  • Group IV, II-VI, and III-V group semiconductor compounds of the periodic table of elements and raw material compounds containing elements constituting these compounds can be used.
  • MgS, MgSe, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, HgS Mention may be made of HgSe and HgTe.
  • GaAs, GaN, GaPGaSb, InGaAs, InP, InN, InSb, InAs, AlAs, AlP, AlSb, and AlS can be exemplified.
  • Ge and Si are particularly suitable.
  • quantum dots examples include CdSe, CdTe, InP, InN, InAs, CdS, Si, and Ge.
  • Si and InP are preferably used from the viewpoints of handling properties and environmental suitability, and the effects of the present invention ( High convenience).
  • the quantum dot according to the present invention preferably exhibits a quantum confinement effect and is preferably a core / shell type quantum dot in order to obtain high luminance.
  • the core is silicon
  • silica can be selected as the shell
  • ZnS can be selected as the shell.
  • various conventionally known methods can be used, and an optimal manufacturing method is selected depending on the composition to be selected.
  • an optimum manufacturing method is selected depending on the composition of the core.
  • core shell type silicon quantum dots are preferably used.
  • silicon quantum dots When forming silicon quantum dots in the core part, high-frequency sputtering method that can easily control the particle size of silicon quantum dots, and acid treatment and stirring to change the form of silicon quantum dots from film form to particle form It is preferable to employ a manufacturing method including a process step.
  • This manufacturing method is characterized in that the form of the silicon quantum dots is changed from a film form to a particle form and dispersed in a solution to emit fluorescence.
  • an oxide film silicon may be formed by natural oxidation or annealing oxidation under an appropriate temperature and oxygen concentration condition.
  • a preferable core / shell type silicon quantum dot of the present invention is a core / shell type silicon quantum dot composed of a core part containing silicon and a shell layer containing silicon oxide, which increases the emission intensity. Therefore, it is also preferable that at least one of the core part and the shell layer contains a small amount of atoms such as Be, Ga, Mg, and Ge as a dopant.
  • the quantum dots according to the present invention have an average particle diameter of 2 to 10 nm and visible light having a wavelength in the range of 400 to 900 nm when excited by ultraviolet to visible light having a wavelength in the range of 200 to 500 nm. It is preferable that it is a quantum dot of the aspect which shows light emission in the infrared region.
  • the average particle diameter of the quantum dots should originally be determined in three dimensions, but it is difficult because the particles are too fine, and in reality it must be evaluated with a two-dimensional image. Therefore, a transmission electron microscope (TEM) is used. It is preferable to obtain the average by taking a large number of images by changing the shooting scene of the electron micrograph.
  • TEM transmission electron microscope
  • the particle size can be adjusted depending on the sputtering conditions. Not only the area ratio between the silicon chip and the silica target material, but also the sputtering conditions such as high-frequency power and gas pressure (pressure during production. Even if the pressure is changed, the particle size can be controlled. At this time, the high frequency power is changed within the range of 10 to 500 W, and the gas pressure is within the range of 1.3 ⁇ 10 ⁇ 2 to 1.3 ⁇ 10 Pa (1 ⁇ 10 ⁇ 4 to 1 ⁇ 10 ⁇ 1 torr). Change with.
  • the labeling target substance fluorescent particles, etc.
  • avidin which is a kind of protein, together with biotin.
  • the form of the bond is not particularly limited, and examples thereof include a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, a coordinate bond, physical adsorption, and chemical adsorption.
  • a bond having a strong bonding force such as a covalent bond is preferable from the viewpoint of bond stability.
  • the organic molecule those having a mercapto group (thiol group), a carboxyl group, an amino group, etc. are preferably used. Specifically, mercaptopropionic acid, mercaptoundecanoic acid, aminopropanethiol, mercaptopropyltriethoxysilane, amino And propyltriethoxysilane.
  • a labeled reagent modified with an organic molecule and a reagent also referred to as a molecular labeling substance
  • the labeled reagent according to the present invention enables the biological material to be labeled by specifically binding and / or reacting with the target biological material by the reagent (also referred to as a molecular labeling substance).
  • the reagent in the labeled reagent in the present invention refers to a substance that can bind to the substance to be detected, for example, the antibody (also referred to as a specific binding component), a receptor, or an aptamer.
  • As a labeled reagent it is fixed in advance in a region to be reacted with a sample containing the added substance to be detected.
  • reagent examples include nucleotide chains, antibodies, antigens, and cyclodextrins.
  • the core / shell type silicon quantum dots are treated with mercaptoundecanoic acid
  • avidin and biotin can be used as organic molecules.
  • the carboxyl group of the nanoparticle is preferably covalently bonded to avidin
  • the avidin further selectively binds to biotin
  • biotin further binds to a reagent (also referred to as a molecular labeling substance) to become a labeled reagent.
  • a reagent also referred to as a molecular labeling substance
  • immunochromatography refers to the presence or absence of an analyte contained in a specimen sample using a membrane on which a specific binding component that specifically binds to the analyte is immobilized. It is a method of checking on time. More specifically, using a membrane provided with a determination unit that solid-phases a specific binding component that specifically binds to a detected substance in a sample, and a labeling reagent that specifically binds to the detected object, A so-called sandwich assay method in which a complex consisting of a specific binding component / detected object / labeling reagent is formed in the determination part on the membrane, and the detected object in the sample is detected by quantum dots that bind to the labeling reagent. It is.
  • the reaction between the analyte and the specific binding component and the labeling reagent includes antigen-antibody reaction, other receptor-receptor reaction, biotin-avidin specific binding reaction, and reaction between DNAs having complementary sequences.
  • the antigen-antibody reaction is preferable.
  • the membrane assay method described above preferably uses two types of membrane immunochromatography methods, that is, a flow-through membrane assay method or a lateral flow membrane assay method because it is simple and rapid.
  • the flow-through type membrane assay method allows a solution containing an analyte to pass in a direction perpendicular to a membrane coated with a specific binding component or a detection substance that specifically binds to the analyte.
  • a complex of a specific binding component that specifically binds to the detection target, a detection target, and a second labeling reagent that specifically binds to the detection target is formed on the membrane to detect or quantify the label. By doing so, the detected object is detected or quantified.
  • the lateral flow membrane assay method differs from the flow-through membrane assay method in that a solution containing the detection target is spread horizontally on the membrane using the same membrane, but the detection principle of the detection target is the same. It is. Of the two methods, the lateral flow membrane assay method is preferred from the viewpoint of simplicity and short measurement time.
  • a specific binding substance for capturing an object to be detected is a substance that forms a complex by binding to the object to be detected by a specific reaction such as an antigen-antibody reaction. Therefore, it is natural that the specific binding substance to be used differs depending on the substance to be detected.
  • the substance to be detected when the substance to be detected is a bacterium, virus, hormone, or other clinical marker, it reacts specifically to these substances. Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies that bind to each other. In addition, when the substance to be detected is an antibody, virus antigens, virus hollow particles, recombinant E. coli expressed protein, recombinant yeast expressed protein, and the like that specifically react with and bind to them.
  • the support to which the specific binding substance is bound is prepared, for example, by adsorbing a solution obtained by diluting the specific binding substance in a buffer or the like to the support and then drying it.
  • detected substances in the present invention include pathogenic microorganisms such as influenza virus antigens, antibodies against pathogenic microorganisms, peptide hormones, steroids, bioactive amines, vitamins, prostaglandins, antibiotics such as tetracycline, bacteria, and the like.
  • pathogenic microorganisms such as influenza virus antigens, antibodies against pathogenic microorganisms, peptide hormones, steroids, bioactive amines, vitamins, prostaglandins, antibiotics such as tetracycline, bacteria, and the like.
  • examples include nucleotides complementary to nucleic acid components derived from toxins to be produced, various tumor markers, agricultural chemicals, and pathogenic microorganisms.
  • pathogens that have a pandemic and need to be identified in a very short time, such as influenza virus and RS (Respiratory Synchronization) virus.
  • the assay method of the present invention is particularly effective for an object that is prone to false positives.
  • Samples to be analyzed by the assay method of the present invention include pharyngeal or nasal wipes, nasal aspirate, stool suspension, plasma, serum, urine, saliva, amniotic fluid, spinal fluid, pus, organ extracts, various tissue extracts
  • a biological sample such as liquid, food extract, culture supernatant, clean water, sewage, lake water, river water, seawater, soil extract, and sludge extract can be used, but are not limited thereto.
  • the pharyngeal or nasal wipe, nasal aspirate, nasal wash and stool suspension contain a large amount of high-viscosity biological components as described above, and false positives are likely to occur. It is effective in the evaluation of these specimens.
  • it is more effective in assays of pharyngeal or nasal wipes, nasal aspirates, or nasal lavage fluids.
  • Example 1 Production of monoclonal antibodies Purified IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12q70, GM-CSF, IFN ⁇ , Spleens were removed from BALB / c mice that were each immunized with TNF ⁇ antigen and maintained for a certain period, and mouse myeloma cells were obtained by the method of Keller et al. (Kohler, et. Al., Nature, vol. 256, p495-497 (1975)). Fused with (p3X63).
  • the obtained fused cells (hybridoma) were maintained in a 37 ° C. incubator to purify the cells (monocloning).
  • the obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected.
  • IgG was purified from the obtained ascites by affinity purification using Protein A column chromatography (manufactured by GE) to obtain two types of purified antibodies against each antigen.
  • (2) Production of Quantum Dots (Core / Shell Type Silicon Quantum Dots)
  • the core / shell type silicon quantum dots of the present invention are core / shell type silicon quantum dots produced by a high frequency sputtering method, and the following production steps are performed. It is manufactured after.
  • the high-frequency sputtering apparatus is a vacuum chamber having an argon gas introduction port and an exhaust port at the bottom of the side surface, a substrate holder that is attached to the upper surface of the vacuum chamber via an insulating material, cooled by cooling water introduced and discharged from the cooling pipe, And it is comprised from the high frequency electrode provided with the cathode shield attached to the lower surface of a vacuum chamber via the insulating material, and cooled with the cooling water introduce
  • argon gas is introduced into the vacuum chamber from the argon gas inlet, the argon gas is ionized by a high frequency controller, and the ionized argon ions are converted into a silicon chip and quartz glass which are target materials on the high frequency electrode. And depositing atoms and molecules emitted from the target material on the substrate held by the substrate holder to form an amorphous silicon oxide thin film.
  • the particle size was controlled by changing the area ratio between the silicon chip and the quartz glass constituting the target material, and the area ratio was changed for each particle so that the quantum dot size shown in Table 1 was obtained.
  • This area ratio is usually 1 to 50%, and is preferably set to 5 to 30% from the viewpoint of production efficiency and particle size distribution.
  • Step (2) The amorphous silicon oxide thin film is heat-treated in an inert gas (argon gas) atmosphere to form silicon quantum dots (core part) having a predetermined particle size in the amorphous silicon oxide thin film.
  • the heat treatment temperature was in the range of 1000 to 1100 ° C., and was adjusted according to the target particle size.
  • the heat treatment time was in the range of 50 to 70 minutes, and was changed depending on the particle size.
  • Step (3) The amorphous silicon oxide thin film after the heat treatment is treated with hydrofluoric acid to expose the silicon quantum dots.
  • a substrate on which a silicon oxide thin film on which silicon quantum dots are formed is attached to an acrylic plate, and the silicon oxide thin film is mounted on a container containing a hydrofluoric acid aqueous solution.
  • the concentration of the hydrofluoric acid aqueous solution was adjusted according to the state of the silicon oxide film obtained at 20 to 30%.
  • the container containing the hydrofluoric acid aqueous solution is installed in a constant temperature water tank equipped with a heater and containing pure water to perform the hydrofluoric acid aqueous solution treatment.
  • the treatment temperature was 40 ° C.
  • the treatment time was in the range of 8 to 15 minutes.
  • hydrofluoric acid evaporated from the acid aqueous solution in the container adheres to the surface of the thin film, and the silicon oxide portion in the silicon oxide thin film is gradually etched from the surface. As a result, a large number of silicon quantum dots are exposed in an aggregated state on the substrate.
  • Step (4) The substrate with the silicon quantum dots exposed is immersed in a solvent, whereby the silicon quantum dots are separated from the substrate to obtain a solution in which the silicon quantum dots are dispersed.
  • the substrate on which the silicon quantum dots are aggregated and exposed is immersed in a container containing ethanol. Put a magnetic stir bar in the container and stir with a stirrer or place the entire container on an ultrasonic cleaner to irradiate ultrasonic waves.
  • the treatment time for the stirring treatment was in the range of 60 to 600 seconds.
  • Step (5) The surface of the silicon quantum dots is naturally oxidized in an oxygen atmosphere or thermally oxidized by heating to form a shell layer made of silicon oxide around the core made of silicon quantum dots, and core / shell type silicon Get quantum dots.
  • silicon quantum dots dispersed in ethanol are naturally oxidized or thermally oxidized in an oxygen atmosphere.
  • a shell layer made of silicon oxide is formed around a core made of silicon quantum dots.
  • the treatment temperature was 25 to 35 ° C.
  • the optimum processing time was selected in the range of 8 to 14 hours.
  • Step (6) The core shell type silicon quantum dots are reacted in hydrogen peroxide water to hydroxylate the crystal surface. By the hydroxylation, the reaction with the silane coupling agent or the like can easily proceed.
  • the treatment temperature was adjusted to 25 to 35 ° C. when the above-described silicon quantum dots were reacted with hydrogen peroxide water to hydroxylate the crystal surface.
  • the optimum processing time was selected in the range of 10 to 30 minutes.
  • the concentration of the hydrogen peroxide solution was selected in the range of 20 to 35%.
  • the hydroxylated core shell type silicon quantum dots are washed with hot water. Specifically, when washing, the washing time was 30 to 240 seconds, and the treatment temperature was 75 to 80 ° C.
  • the obtained quantum dots were determined according to the following method.
  • the average particle diameter of the quantum dots is obtained by taking an electron micrograph using a TEM, measuring the cross-sectional area of a sufficient number of particles, and determining the diameter when the measured value is the area of the corresponding circle as the particle diameter.
  • the arithmetic average was taken as the average particle size.
  • the number of cluster particles photographed with a TEM is preferably 100 or more, and more preferably 1000 particles. In the present application, the arithmetic average of 1000 particles is defined as the average particle size.
  • the obtained particle sizes are shown in Table 1.
  • the core / shell type silicon quantum dot which is the labeling reagent of the present invention is labeled with a labeled reagent (bonding agent (molecular labeling substance) and an organic molecule through an organic molecule through the following steps.
  • a labeled reagent bonding agent (molecular labeling substance)
  • an organic molecule through an organic molecule through the following steps.
  • Biological substance labeling agent molecular labeling substance
  • Step (8) Bonding hydroxyl groups and organic molecules of the core-shell silicon quantum dots washed with hot water.
  • aminopropyltriethoxysilane and the quantum dots in Table 1 are stirred in ethanol at room temperature to cause a silane coupling reaction and introduce amino groups on the surface.
  • the obtained reaction product, N-hydroxysuccinimide and maleimide are mixed with polyethylene glycol having a molecular weight of 1000 as a functional group at both ends at room temperature and stirred for one day and night, and reacted to form polyethylene glycol having a maleimide group at the end as an organic molecule.
  • core / shell type silicon quantum dots (labeling reagent) bonded to each other are obtained.
  • (3) Production of quantum dot-labeled antibody Silicon quantum dots reacted with organic molecules are combined with a molecular labeling substance such as an antibody to obtain a labeled reagent.
  • a core / shell type silicon quantum dot in which polyethylene glycol having a maleimide group at the end is bound as an organic molecule is selected according to the following method by selecting different antibody species for each quantum dot particle size as shown in Table 1.
  • core shell type silicon quantum dots (labeled reagent) into which an antibody was introduced at the terminal were obtained.
  • a nitrocellulose membrane (Millipore) sheet (white) having a width of 3 cm ⁇ 10 cm was used as the membrane.
  • the anti-IL-1a antibody for fixation was placed at a position away from one end on the long axis side (this end is the upstream end and the opposite side is the downstream end).
  • Dot Co. was applied in the form of dots, and from there, in the vertical direction, the anti-IL-1b antibody for fixing, the anti-IL-2 antibody for fixing, the anti-IL-4 antibody for fixing, and the reaction termination below it
  • the indicated control antibody was applied in the same manner as IL-1a.
  • an anti-IL-6 antibody for immobilization is applied to the right side of the aforementioned IL-1a antibody for immobilization, and the anti-IL-7 antibody for immobilization, the anti-IL-8 antibody for immobilization, and the anti-IL-10 antibody for immobilization are vertically applied
  • a control antibody was applied below the control antibody.
  • IL-12q70 for immobilization was applied to the right side of the aforementioned immobilized IL-6 antibody, and anti-GM-CSF antibody for immobilization, anti-IFN ⁇ antibody for immobilization, and anti-TNF ⁇ antibody for immobilization were similarly applied in the vertical direction therefrom.
  • a control antibody was applied below the control antibody. After application, 45 ° warm air was blown for 10 minutes to dry. Next, in order to fix the member and increase the strength, a plastic backing sheet (manufactured by BioDot) is bonded to the opposite side (this surface is the lower surface) of the antibody application surface (this surface is the upper surface) of the membrane. did.
  • the quantum dot-labeled antibody pad prepared above was cut, placed on the upper surface of the membrane so that the upstream end of the membrane overlapped 2 mm, and pasted to obtain a sample dropping pad.
  • cellulose filter paper manufactured by Whatman Co., Ltd. having a width of 30 mm and a length of 10 cm was attached to the upper surface of the membrane so as to overlap with the downstream end of the membrane by 5 mm to obtain a sample absorption pad.
  • the immunochromatographic medium shown in FIG. 1 was produced.
  • a BOX type fluorescence detection apparatus capable of shielding external light, comprising an excitation light source capable of automatic scanning, a fluorescence detector capable of detecting an excitation emission wavelength and fluorescence intensity capable of detecting spots emitted by the excitation light by automatic scanning. Detection was performed using.
  • the wavelength of the excitation light source was 280 nm. Evaluation was expressed as relative intensity when the same area spot emission intensity was set to 100 when AlexaFluor 430 (manufactured by Invitrogen) was used instead of quantum dots.
  • the detectability by automatic detection was evaluated as “ ⁇ ” when the spot signal could be clearly detected by the fluorescence detection unit, “ ⁇ ” when detection was not clear due to detection unit noise, and “ ⁇ ” when detection was impossible. The results are shown in Table 1.
  • * 1 Expressed as relative intensity when the same area spot emission intensity is 100 when AlexaFlor 430 is used instead of quantum dots.
  • * 2 The detectability by automatic detection is indicated as “ ⁇ ” when the spot signal can be clearly detected by the fluorescence detection part, “ ⁇ ” when the detection is not clear due to noise in the detection part, and “X” when detection is impossible.
  • cytokine detection using the immunochromatographic medium of the present invention was able to detect 12 types of cytokines at once, and all were detected with clear spots, and were clear without confusion. From this result, it can be seen that the configuration of the present invention provides a high-quality diagnostic method by adding a large function capable of discriminating various samples at once to the in-vitro diagnosis of the immunochromatography method characteristic of the conventional simplicity.
  • Example 1 (1) Preparation of monoclonal antibody The antibody prepared in Example 1 was used. (2) Preparation of Latex Particle Labeled Antibody One type of each antibody was dialyzed with 50 mM MES (2-Morpholeoethanesulfidic acid, monohydrate; manufactured by Dojindo) buffer solution (pH 6.0), and colored polystyrene latex particles (Magshere) Manufactured by Bangs Laboratories) were mixed in the combinations shown in Table 2 and reacted.
  • MES 2-Morpholeoethanesulfidic acid, monohydrate; manufactured by Dojindo
  • EDAC N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; manufactured by Sigma
  • EDAC N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; manufactured by Sigma
  • a final suspension 5 mM Tris, 0.04 (w / v)% BSA (bovine serum albumin)
  • an ultrasonic dispersion device manufactured by Olympus
  • the discrimination by the fluorescence detector was ambiguous for 4 to 8, 2 to 6, and 7 to 11 in the same row.
  • a colored latex was used, and even when attempting detection in the spot form as in the present invention, the emission was not clear and it was found that it was not suitable for multi-species detection.
  • a nitrocellulose membrane (Millipore) sheet (white) having a width of 3 cm ⁇ 10 cm was used as the membrane.
  • a positive pressure spray device BioJet; Bio Dot
  • BioJet Bio Dot
  • Six antibodies and finally a control antibody indicating completion of the reaction were applied in the same manner as the anti-IL-1a antibody.
  • the anti-IL-1a antibody for immobilization anti-IL-7 antibody for immobilization, anti-IL-8 antibody for immobilization, anti-IL-10 antibody for immobilization, anti-IL-12q70 antibody for immobilization, control antibody
  • an anti-IL-1a antibody for immobilization, an anti-GM-CSF antibody for immobilization, an anti-IFN ⁇ antibody for immobilization, and an anti-TNF ⁇ antibody for immobilization were similarly applied to the third membrane. After application, 45 ° warm air was blown for 10 minutes to dry. Next, in order to fix the member and increase the strength, a plastic backing sheet (manufactured by BioDot) is bonded to the opposite side (this surface is the lower surface) of the antibody application surface (this surface is the upper surface) of the membrane. did.
  • the quantum dot-labeled antibody pad prepared in 4 of Example 1 was cut and placed on the upper surface of the membrane so that the upstream end of the membrane overlapped by 2 mm to be a sample dropping pad.
  • cellulose filter paper manufactured by Whatman Co., Ltd. having a width of 30 mm and a length of 10 cm was attached to the upper surface of the membrane so as to overlap with the downstream end of the membrane by 5 mm to obtain a sample absorption pad.
  • Example 1 As the effect of the present invention can be understood by comparing Example 1 with Comparative Examples 1 and 2, the configuration of the present invention has a great advantage that various types of clear detection can be easily performed at a time.
  • detection advantage of the present invention quantitative detection at each spot is possible, and it can be expected to bring about great progress in diagnosis by immunochromatography.

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Abstract

　本発明は、着色ラテックス粒子が可能な色調数、４種類を超える複数項目を検出する場合でも、さらに複数項目を同時に検出かつ定量可能なイムノクロマト媒体およびイムノクロマトグラフ法を提供することである。このイムノクロマト媒体は、支持体上に、標識化試薬に固定化させた標識付き試薬と、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部位とを持つイムノクロマト媒体において、該標識化試薬が、蛍光ナノ粒子であり、該検出部位がドット状であることを特徴とする。

Description

イムノクロマト媒体およびイムノクロマトグラフ法
　本発明は、一般的に単一の流体試料中の、もし存在する場合は複数の分析物（アナライトともいう）を、１支持体で複数項目検出し、識別するイムノクロマト媒体を用いたイムノクロマトグラフ法に関する。
　迅速診断試験の分野は長年にわたって進化してきており、多様な種類の試料中の分析物の検出が可能となっている。迅速イムノアッセイをベースとする試験の多くは、試験片を内蔵する堅いケースを含む。しかし最近、堅いケースを持たないイムノクロマトグラフィックアッセイが開発された。このような試験は、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋｓ）ないし尿試験紙と称されるが、あらかじめ決められた量の対象液体試料を入れた容器に直接浸すことができる。試料を受入れるパッドを有するディップスティックの先端は、通常液体試料と接触し、液体が流路を移動上昇する。現在のイムノクロマトグラフィー用ディップスティックの１つの欠点は、ただ１つの分析物の存在しか検出できないことである。たとえば一度に１つの分析物しか評価できないことから、単一分析物の迅速分析を使用することはしばしば制約的であることが認識されている。そのため、必要な試料の量が増えることにより、試料採取に負担がかかる、あるいは試料の希釈により微量検体の検出が困難になる。また中心部への試料添加の制御がうまくいかない場合、同一量の試料がそれぞれのストリップに展開できない可能性がある。したがって、簡易取り扱い性が劣ってしまう、さらにはストリップのロット差が拡大し、データの精度が低下してしまう可能性がある。
　一方、複数項目の分析法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、１ストリップ上へのライン数には限界があり、コントロールと試験ゾーンを交互に配置する本特許文献においては、被検物質は３種類までが限界であると思われる。また、試料添加部から近いラインと遠いラインとでは、反応する試料の濃度に大きな差が現れると考えられるため、ライン部分によって感度が異なる可能性がある。
特表２００７－５０６１１５号公報
　本発明の目的は、着色ラテックス粒子が可能な色調数、４種類を超える複数項目を検出する場合でも、さらに複数項目を同時に検出かつ定量可能なイムノクロマト媒体、およびイムノクロマトグラフ法を提供することである。
　本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．支持体上に、標識化試薬に固定化させた標識付き試薬と、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部位とを持つイムノクロマト媒体において、該標識化試薬が、蛍光ナノ粒子であり、該検出部位がドット状であることを特徴とするイムノクロマト媒体。
　２．前記ドット状の検出部位におけるドット数が、３以上３０以下であることを特徴とする前記１に記載のイムノクロマト媒体。
　３．前記１または２に記載のイムノクロマト媒体を用いるイムノクロマトグラフ法であって、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な、標識化試薬に固定化させた標識付き試薬と、被検出物質とを反応させたクロマト反応液を、前記イムノクロマト媒体上を移動させ、被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部位で捕捉して被検出物質を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフ法。
　４．前記標識化試薬が、量子ドットであることを特徴とする前記３に記載のイムノクロマトグラフ法。
　５．被検出物質を３項目以上１５項目以下同時に検出できることを特徴とする前記３又は４に記載のイムノクロマトグラフ法。
　複数項目を同時に検出かつ定量可能なイムノクロマト媒体およびイムノクロマトグラフ法を提供することができる。
本発明のイムノクロマトアッセイ媒体の１例を示す平面図及び断面図である。 本発明のイムノクロマトアッセイ媒体の１例を示す検出方法である。 メンブレンを使ったイムノクロマト媒体の１例を示す概略図である。
　本発明のイムノクロマト媒体およびイムノクロマトグラフ法は、蛍光ナノ粒子を用いた１ストリップイムノクロマト媒体を使用することで、簡易に定量的な複数同時分析が可能となる。すなわち、本発明のイムノクロマト媒体を使用することで、１波長励起で多色発光が可能なため、操作を増やさずに同時に複数項目を検出できるばかりでなく、ライン状の場合、３～４種類の検出部位が限界であるが、ドット状にすることにより占める検出部位面積が小さくて済むため、より複数の検出部位を設定することが可能である。したがって、３～４種類以上の項目数でも、１ストリップで分析ができるため、添加する試料量を変化させずに検出が可能となる。また、試料の希釈も不必要であるため、複数項目を高感度に検出可能である。
　本発明のイムノクロマト媒体に使用される支持体は、溶媒の存在下、検出しようとする物質と検出試薬との複合体が安定かつ速やかに拡散・移動して、クロマトグラフ検出部に確実に到達できるよう、複合体より大きい孔径を有することが必要であり、具体的には、例えば、ガラス繊維状のシート、紙やニトロセルロースなどの多孔質物質、または繊維状マトリクス、薄層クロマトグラフに用いられるシリカ、微細顆粒セルロース、ナイロン６，６などの担体を挙げることができる。感度・特異性が高いラテラルフロー式支持体アッセイを行うために好ましい多孔質物質としては、微多孔質セルロースエステル、たとえばアルカンカルボン酸などの脂肪族カルボン酸とのセルロースエステルが挙げられ、特に好ましくはニトロセルロースから作られた微多孔質物質が挙げられる。また、前記セルロースエステルとニトロセルロースの混合物も好適に用いることができる。上記支持体を持つイムノクロマト媒体の形状は、通常帯状で、クロマトグラフ検出部位はドット状に配列する。本発明の媒体において、クロマト反応液を移動させる長さは、通常１～１０ｃｍ程度、幅は通常０．５～２ｃｍ程度である。
　本発明では検出部をドット状とすることで、複数の検出を同時に行うことができる。検出の精度を保つことができれば、数多くのドットを一枚のイムノクロマト媒体中に作成することが可能であるが、検出に量子ドットを使用することの有効性や視認のしやすさ、扱い易さなどからドットの数は３以上３０以下が好ましい。更に好ましくは５以上３０以下である。
　ドットの形状は矩形、円形、が好ましく使用でき、その大きさは特に制限はないが、視認のしやすさ、測定のしやすさから、１～５ｍｍ程度の大きさが扱いやすく好ましい。また、隣接するドット間の間隔は、固定用抗体が、にじまない範囲で設けられる。１～２ｍｍ程度の距離とすることができる。
　測定のしやすさ、視認の確実性から、互いにほぼ等距離離間した２次元的配置が好ましい。具体的には行列状に配列し、行と列の数はそれぞれ１～６程度とすることができる。
　ドットは吸収パッドを覆う材料に設けられ、噴霧等で固定用抗体を固定化する事ができる。その後ドットはラミネート等で、保護することができる。
　本発明における試料には、種々の溶液が用いられ、生物由来の液体試料、例えば血液、血漿、血清、唾液、尿、乳汁、胸水、粘膜、髄液、腹腔液、羊水あるいは糞便等が用いられる。また、発酵プロセス、細胞培養、または化学反応混合物などから得たものであってもよい。また、生物学的流体または生理学的流体の他に、他の液体サンプル、例えば水、食品の製造検定サンプル、または、水質あるいは土壌検査サンプルなどであってもよい。検出対象としては、それに対して特異的に結合する物質（被検出物質と結合可能な物質）が存在するものであればよく、例えばポリペプチド、たんぱく質、複合たんぱく質、多糖類、脂質、複合脂質、ホルモン類、核酸等が例示される。これ、特異的に結合する物質とは、抗体、レセプター、またアプタマー等が例示される。
［標識化試薬］
　標識化試薬は、特異的結合構成物（抗体）に付加されることが可能な検出可能な標識目的の物質を意味し、本発明においては、蛍光ナノ粒子が用いられる。蛍光ナノ粒子は、小サイズで高い発光を得られるメリットがある。好ましくは量子ドットを用いたほうがよく、量子サイズ閉じ込め効果により高い発光強度が得られると同時に、同一組成でサイズ変更により異なる発光波長を得られる特性を有し、しかも発光波長の半値幅が狭いため可視光～赤外領域まで多色が得られる大きなメリットを有する、本量子ドットの特徴は本発明の効果をより高く発揮させる。
　蛍光ナノ粒子としては量子サイズ効果を発揮する量子ドット、賦活剤を含有することで蛍光を生じる賦活剤型蛍光粒子、母体励起型ナノ粒子などを用いることができる。
　本発明においては、量子ドットとしては、特に下記の半導体ナノ粒子を用いることが好ましい。
　本発明に係る半導体ナノ粒子の材料としては、公知の種々の蛍光発光性化合物及びその原料を用いることができる。例えば、従来、半導体ナノ粒子の材料として知られている種々の半導体材料を用いて形成することができる。具体的には、例えば、元素の周期表のIV族、II－VI族、及びIII－Ｖ族の半導体化合物及びこれらの化合物を構成する元素を含む原料化合物を用いることができる。
　II－VI族の半導体の中では、特に、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ及びＨｇＴｅを挙げることができる。
　III－V族の半導体の中では、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ及びＡｌＳを挙げることができる。
　IV族の半導体の中では、Ｇｅ及びＳｉは特に適している。
　上記の量子ドットの例としてはＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＣｄＳ、Ｓｉ、Ｇｅなどが上げられるが好ましくはＳｉ、ＩｎＰがその取り扱い性、環境適性の面から用いられ、本発明効果（簡便性）を高く発揮する。
　本発明に係る量子ドットは量子閉じ込め効果を高く発揮し、高い輝度を得るためにコア／シェル型量子ドットが好ましい。例えばコアがシリコンの場合にはシリカをシェルに選択したり、コアがＣｄＳｅの場合はシェルにＺｎＳを選択できる。コアの量子ドットの製造方法においては、従来公知の種々の方法を利用することができるが、選択する組成によって最適な製造方法が選択される。シェルについてもコアの組成によって最適な製造方法が選択される。本発明で好ましくコアシエル型シリコン量子ドットが用いられる。そのコア部のシリコン量子ドットを形成する場合、シリコン量子ドットの粒子サイズを容易に制御することのできる高周波スパッタリング法と、シリコン量子ドットの形態を膜形態から粒子形態へ変えるための酸処理と攪拌処理をする工程を含む製造方法を採用することが好ましい。この製造方法の場合、シリコン量子ドットの形態を、膜形態から粒子形態に変え、溶液中に分散させて蛍光発光させる点に特徴がある。シェルの形成においてもシリコン量子ドットの場合、適正な温度、酸素濃度条件のもと自然酸化やアニール酸化によって酸化膜（シリカ膜）を形成してもよい。
　なお、本発明の好ましいコア／シェル型シリコン量子ドットは、シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットでことを特徴とするが、発光強度を高めるために、コア部及びシェル層のうち少なくともいずれか一方にドーパントとして、Ｂｅ、Ｇａ、Ｍｇ、Ｇｅ等の原子を微量含有させることも好ましい。
　本発明に係る量子ドットは、平均粒径が２～１０ｎｍであり、かつ２００～５００ｎｍの範囲内の波長の紫外～可視光により励起されたときに、４００～９００ｎｍの範囲内の波長の可視光から赤外領域に発光を示す態様の量子ドットであることが好ましい。
　本発明において、量子ドットの平均粒径は本来３次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。
　粒子サイズの調整はスパッタ条件で変更ができ、シリコンチップとシリカのターゲット材料の面積比だけでなく、スパッタリング条件である高周波電力やガス圧（作製中の圧力であり、本製造プロセスではアルゴンガスの圧力）を変化させても、粒子サイズを制御することが可能である。このとき、高周波電力は１０～５００Ｗの範囲内で変化させ、ガス圧は、１．３×１０－２～１．３×１０Ｐａ（１×１０－４～１×１０－１ｔｏｒｒ）の範囲内で変化させる。
　当該有機分子としては標識化試薬の標識目的物質（蛍光粒子など）と試薬（＝分子標識物質）とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
　当該有機分子としては、メルカプト基（チオール基）、カルボキシル基、アミノ基等を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオール、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
［標識付き試薬］
　本発明に係る標識付き試薬は、有機分子修飾された標識化試薬と、試薬（分子標識物質ともいう）とが有機分子により結合されている。本発明に係る標識付き試薬は試薬（分子標識物質ともいう）が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。本発明における標識付き試薬中の試薬は、被検出物質と結合可能な物質、例えば前記抗体（特異的結合構成物ともいう）、レセプター、アプタマーを指し、標識化試薬により標識をした物質を、本標識付き試薬として、添加した被検出物質を含む試料と反応させる領域に予め固定しておくものである。
　当該試薬としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。
　具体的には、コア／シェル型シリコン量子ドットをメルカプトウンデカン酸で処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合当該ナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに試薬（分子標識物質ともいう）と結合することにより標識付き試薬となる。
〈メンブレンアッセイ法測定原理〉
　本発明の測定原理について簡単に述べる。本発明において“イムノクロマトグラフ法”とは、被検出物に特異的に結合する特異的結合構成物が固相化されたメンブレンを用いて検体試料中に含まれる被検出物の存在の有無を短時間に検査する方法である。より詳細には、検体中の被検出物に特異的に結合する特異的結合構成物を固相化した判定部を設けたメンブレンと、被検出物に特異的に結合する標識試薬を用いて、メンブレン上の判定部に、特異的結合構成物／被検出物／標識試薬からなる複合体を形成させて、標識試薬に結合する量子ドットにより検体中の被検出物を検出する、いわゆるサンドイッチアッセイ法である。
　被検出物と前記特異的結合構成物及び標識試薬との反応としては、抗原抗体反応、その他の受容体とレセプターの反応、ビオチンとアビジンの特異的結合反応、相補的配列を持つＤＮＡ同士の反応等が挙げられるが抗原抗体反応であることが好ましい。
　前記のメンブレンアッセイ法は、２種類のメンブレンイムノクロマト法、すなわちフロースルー式メンブレンアッセイ法またはラテラルフロー式メンブレンアッセイ法を利用するものであることが、簡便かつ迅速であるため好ましい。
　フロースルー式メンブレンアッセイ法は被検出物を含む溶液を、被検出物と特異的に結合する特異的結合構成物や検出用物質が塗布されたメンブレンに対して垂直方向に通過させるものであり、被検出物に特異的に結合する特異的結合構成物、被検出物、被検出物に特異的に結合する第２の標識化試薬の複合体を膜上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被検出物の検出あるいは定量を行う。
　ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法は、同様なメンブレンを用いてメンブレンに対して被検出物を含む溶液を水平方向に展開させる点でフロースルー式メンブレンアッセイ法と異なるが、被検出物の検出原理は同様である。２種類の方法のうち、簡便さと測定時間の短さの面からラテラルフロー式メンブレンアッセイ法が好ましい。
＜被検出物に特異的に結合する特異的結合構成物＞
　被検出物を捕捉するための特異的結合物質は、被検出物と、抗原抗体反応のような特異的反応により結合して、複合体を形成する物質である。従って、被検出物により使用する特異的結合物質が異なることは当然であるが、一般には被検出物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。そのほか、被検出物質が抗体の場合には、これらに対して特異的に反応して結合するウイルス抗原、ウイルス中空粒子、遺伝子組換え大腸菌発現タンパク質、遺伝子組換え酵母発現タンパク質等が挙げられる。
　このような特異的結合物質を上述した支持体表面に結合させる方法としては、物理的吸着であってもよく、または化学的な結合によるものであってもよい。特異的結合物質が結合した支持体の調製は、例えば、特異的結合物質を緩衝液等に希釈した溶液を支持体に吸着してその後乾燥することにより行われる。
　本発明において、複数種類の被検出物を検出又は定量するために、支持体上には各々の被検出物に対する特異的結合物質を固相化する必要があるが、それぞれ支持体上の異なる位置に固相化されることが必要である。
＜被検出物＞
　本発明でいう被検出物にはインフルエンザウイルス抗原等の病原微生物や病原微生物に対する抗体、ペプチドホルモン、ステロイド、生理活性アミン類、ビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬、及び病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができる。特にインフルエンザウイルスやＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス等の様に、大流行し、ごく短時間に特定する必要がある病原体の診断に、極めて有用である。
　また、本発明のアッセイ法は、偽陽性を生じやすい被検出物において特に有効である。
　２種類以上の被検出物が、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＲＳウイルスから選ばれる２種類以上である場合に特に有効に偽陽性を防ぐことができる。
　本発明のアッセイ法により分析するための検体は、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、便懸濁液、血漿、血清、尿、唾液、羊水、髄液、膿、臓器抽出液、各種組織抽出液等の生体試料、食品抽出液、培養上清、上水、下水、湖水、河川水、海水、土壌抽出液、汚泥抽出液を用いることができるがこれらに限定されない。特に咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液及び便懸濁液には、前記のように高粘度の生体由来の成分が多く含まれ、偽陽性が生じ易いので、本発明のアッセイ法はこれらの検体の評価において有効である。更に前記の検体のうち、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、または鼻腔洗浄液のアッセイにおいてより有効である。
　以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの態様に限定されるものではない。
　≪ヒトサイトカインの測定≫
　［実施例１］
（１）モノクローナル抗体の作製
　精製ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｑ７０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα抗原を各々免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラー等の方法（Ｋｏｈｌｅｒ、ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５－４９７（１９７５））よりマウスミエローマ細胞（ｐ３Ｘ６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、細胞の純化（単クローン化）を行った。得られた該細胞２株を各々プリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムクロマトグラフィー（ＧＥ製）を用いたアフィニティ精製によってＩｇＧを精製し、各々の抗原に対する精製抗体を２種類ずつ得た。
（２）量子ドット（コア／シェル型シリコン量子ドット）の作製
　本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、高周波スパッタリング法により製造されたコア／シェル型シリコン量子ドットであって、下記製造工程を経て製造される。
　工程（１）：ターゲット材料としてシリコンとシリカを用い、高周波スパッタリング法により基板上にアモルファス酸化ケイ素薄膜を作製した。高周波スパッタリング装置は、側面下部にアルゴンガス導入口と排気口を備える真空チャンバー、真空チャンバーの上面に絶縁材料を介して取り付けられ、冷却管から導入、排出される冷却水で冷却される基板ホルダー、及び、真空チャンバーの下面に絶縁材料を介して取り付けられ、冷却管から導入、排出される冷却水で冷却される陰極シールドを備える高周波電極から構成されている。
　そして、上記装置において、アルゴンガスを真空チャンバー内にアルゴンガス導入口から導入し、高周波コントローラによりアルゴンガスをイオン化し、イオン化されたアルゴンイオンを、高周波電極上のターゲット材料であるシリコンチップと石英ガラスへ衝突させ、ターゲット材料から放出された原子や分子を基板ホルダーに保持した基板上に堆積させ、アモルファス酸化ケイ素薄膜を形成する。
　ターゲット材料を構成するシリコンチップと石英ガラスの面積比を変化させることで粒子サイズを制御し、表１記載の量子ドットサイズになるように粒子毎に面積比を変更した。この面積比は、通常、１～５０％であり、製造効率や粒度分布から好ましくは５～３０％で設定される。
　工程（２）：上記アモルファス酸化ケイ素薄膜に不活性ガス（アルゴンガス）の雰囲気中で熱処理を施し、アモルファス酸化ケイ素薄膜内に所定粒子サイズのシリコン量子ドット（コア部）を形成する。上記熱処理の際、熱処理温度は１０００～１１００℃の範囲で行い、目的とする粒子サイズによって調整した。また、熱処理時間は５０～７０分の範囲とし、粒子サイズによって変更した。
　工程（３）：上記熱処理後アモルファス酸化ケイ素薄膜に、フッ酸による処理を施して、シリコン量子ドットを露出させる。
　具体的には、シリコン量子ドットが形成された酸化ケイ素薄膜を載置する基板をアクリル板に貼り付け、フッ酸水溶液を収容する容器に対し、上記酸化ケイ素薄膜を下にして装着する。このとき，フッ酸水溶液の濃度は２０～３０％で得られた酸化ケイ素膜の状態によって調整した。
　そして、上記フッ酸水溶液を収容する容器を、ヒーターを備え、純水を収容する恒温水槽内に設置し、フッ酸水溶液処理を行う。上記処理の際、処理温度は４０℃で行った。また、処理時間は８～１５分範囲で行った。
　上記フッ酸水溶液処理においては、容器内の酸水溶液から蒸発したフッ酸が薄膜の表面に付着し、酸化ケイ素薄膜中の酸化ケイ素部分を表面から徐々にエッチングしていく。その結果、基板上には、多数のシリコン量子ドットが凝集状態で露出する。
　工程（４）：上記シリコン量子ドットが露出した基板を溶媒中に浸漬させることで、シリコン量子ドットを基板より離散させて、シリコン量子ドットが分散した溶液を得る。具体的には、シリコン量子ドットが凝集露出した基板を、エタノールを収容した容器に浸漬する。容器内に磁気撹拌子をいれ、スターラーにて撹拌する又は容器ごと超音波洗浄器に載置して超音波照射を行う。この撹拌処理により、基板上に凝集状態で露出していたシリコン量子ドットは、基板から離散し、エタノール中に分散する。攪拌処理の処理時間は６０～６００秒の範囲で行った。
　工程（５）：シリコン量子ドットの表面を酸素雰囲気中で自然酸化、または加熱して熱酸化し、シリコン量子ドットからなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成し、コア／シェル型シリコン量子ドットを得る。具体的には、エタノール中分散したシリコン量子ドットを酸素雰囲気において自然酸化、または加熱して熱酸化させる。酸化処理においては、シリコン量子ドットからなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成する。
　上記処理の際、処理温度は２５～３５℃で行った。また、処理時間は８～１４時間の範囲で最適時間を選択した。
　工程（６）：上記コアシエル型シリコン量子ドットを過酸化水素水中で反応させ、結晶表面を水酸化させる。水酸化させることにより、シランカップリング剤などとの反応が容易に進行するようにできる。
　具体的には、上述のシリコン量子ドットを過酸化水素水と反応させ、結晶表面を水酸化させる際、処理温度は２５～３５℃に調整した。また処理時間は１０～３０分の範囲で最適時間を選択した。過酸化水素水の濃度は、２０～３５％の範囲で選択した。
　工程（７）：上記水酸化したコアシエル型シリコン量子ドットを熱水により洗浄する。具体的には、洗浄する際、洗浄時間は３０～２４０秒とし、処理温度は７５～８０℃とした。得られた量子ドットを下記の手法に従い求めた。量子ドットの平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とした。ＴＥＭで撮影するクラスター粒子数としては１００個以上が好ましく、１０００個の粒子を撮影するのが更に好ましい。本願においては、１０００個の粒子の算術平均を平均粒径とした。求めた粒子サイズは表１に示した。
　なお、本発明の標識化試薬であるコア／シェル型シリコン量子ドットは、以下の工程を経て、標識付き試薬の役割物質（分子標識物質）と有機分子を介して結合させることにより標識付き試薬（生体物質標識剤）とする。
　工程（８）：上記熱水洗浄したコアシエルシリコン量子ドットの水酸基と有機分子と結合させる。
　具体的にはアミノプロピルトリエトキシシランと表１の量子ドットをエタノール中で室温攪拌し、シランカップリング反応を生じアミノ基を表面に導入する。得られた反応物とＮ－ヒドロキシスクシンイミドとマレイミドを両末端に官能基としてもつ分子量１０００のポリエチレングリコールと室温下で混合し１昼夜攪拌し、反応させて末端にマレイミド基をもつポリエチレングリコールを有機分子として結合させたコア／シェル型シリコン量子ドット（標識化試薬）を得る。
（３）量子ドット標識化抗体の作製
　有機分子と反応させたシリコン量子ドットを抗体などの分子標識物質と結合させ、標識付き試薬を得る。
　具体的には末端にマレイミド基をもつポリエチレングリコールを有機分子として結合させたコア／シェル型シリコン量子ドットを表１記載の如く量子ドット粒子サイズごとに異なる抗体種を選択して下記手法に従い反応させて、末端に抗体を導入したコアシエル型シリコン量子ドット（標識付き試薬）を得た。
　（量子ドット標識抗体パッドの作製）
　前記で作製した量子ドット標識抗体を陽圧噴霧装置（ＢｉｏＪｅｔ；Ｂｉｏ　Ｄｏｔ社製）を用いて、幅１５ｍｍのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、５０℃の温風を１分間吹き付けて乾燥させ、量子ドット標識抗体パッドを作製した。
（４）メンブレン固定用抗体の作製
　前記（１）で作製した精製抗体のうち標識化に用いなかった方を、固定液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に透析し、透析後に０．０２μｍろ過を行い、固定液で希釈して固定用抗体を調整した。
（５）ヒトサイトカイン検出用イムノクロマト媒体の作製
　ヒトサイトカイン検出用イムノクロマトアッセイ媒体は、図１に示すものと同様の構成のものを用いた。
　メンブレンは、幅３ｃｍ×１０ｃｍのニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）シート（白色）を用いた。図１に示すように、その長軸側の一端（この端を上流端、反対側を下流端とする）から離れた位置に、固定用抗ＩＬ－１ａ抗体を陽圧噴霧装置（ＢｉｏＪｅｔ；Ｂｉｏ　Ｄｏｔ社製）を用いて、ドット状に塗布し、そこから垂直方向に、固定用抗ＩＬ－１ｂ抗体、固定用抗ＩＬ－２抗体、固定用抗ＩＬ－４抗体、その下方に反応終了を示すコントロール抗体をＩＬ－１ａ同様に塗布した。さらに前述の固定用ＩＬ－１ａ抗体の右側に、固定用抗ＩＬ－６抗体を塗布し、垂直方向に固定用抗ＩＬ－７抗体、固定用抗ＩＬ－８抗体、固定用抗ＩＬ－１０抗体、その下方にコントロール抗体を塗布した。更に前述の固定ＩＬ－６抗体の右側に固定用ＩＬ－１２ｑ７０を塗布し、そこから垂直方向に、固定用抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体、固定用抗ＩＦＮγ抗体、固定用抗ＴＮＦα抗体を同様に塗布し、その下方にコントロール抗体を塗布した。塗布後、４５度の温風を１０分間吹き付けて乾燥した。次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ社製）を接着した。
　次に、上記で作製した量子ドット標識抗体パッドを切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２ｍｍ重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッドとした。
　次に、幅３０ｍｍ×長さ１０ｃｍのセルロースろ紙（ワットマン社製）をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５ｍｍ重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッドとした。
　次に、サンプル滴下パッドの上流端の幅７ｍｍを除いて、上面全面を透明なプラスチックラミネート（Ａｄｈｅｓｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）で被覆した。図１に示すイムノクロマト媒体を作製した。
（６）クロマト反応混合試料液の調製
　ヒトサイトカインを５００ｐｇ／ｍｌになるようにＰＢＳＴ　バッファー水溶液に混合してクロマト反応用試料液とした。
（７）ヒトサイトカインの検出
　上記（５）で作成したイムノクロマトアッセイ媒体の検体滴下部に上記（６）のクロマト反応液を滴下し、クロマト展開した。１０分後に検出部におけるシグナルを検出した。図２に示すように自動走査できる励起光光源と励起光よって発光したスポットを自動走査で検出できる励起発光波長と蛍光強度を検出できる蛍光検出器を備える、外光を遮蔽できるＢＯＸ型蛍光検出装置を使い検出を行った。励起光源の波長は２８０ｎｍとした。評価はＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４３０（インビトロジェン社製）を量子ドットの代わりに用いたときの同一面積スポット発光強度を１００としたときの相対強度で表した。自動検出による検出性はスポットシグナルが蛍光検出部で明確に検出できたときに○とし、検出部ノイズで紛れて検出が明確でないときを△、検出不能を×とした。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＊１：ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４３０を量子ドットの変わりに用いたときの同一面積スポット発光強度を１００としたときの相対強度で表した。
＊２：自動検出による検出性はスポットシグナルが蛍光検出部で明確に検出できたときに○とし、検出部ノイズで紛れて検出が明確でないときを△、検出不能を×とした。
　表１に示すように本発明のイムノクロマト媒体を用いたサイトカイン検出は１２種のサイトカインを一度に検出でき、いずれも明確なスポットで検出され、判別の混同無く明確であった。この結果は、本発明の構成により、従来の簡便性に特徴あるイムノクロマト法の体外診断に一度に多種検体を判別できる大きな機能が加わり、高品位な診断法を提供する事が解る。
　［比較例１］
（１）モノクローナル抗体の作製
　実施例１で作製したものを使用した。
（２）ラテックス粒子標識抗体の作製
　各抗体のうち１種類を５０ｍＭ　ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ；同仁化学社製）緩衝液（ｐＨ６．０）溶液で透析後、着色ポリスチレンラテックス粒子（Ｍａｇｓｈｅｒｅ社製、Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａ　ｔｏｒｉｅｓ社製）を表２に示す組み合わせで混合し、反応させた。次に、ＥＤＡＣ（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩；Ｓｉｇｍａ社製）を最終濃度０．１％になるよう添加した後、２時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液（５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，０．０４（ｗ／ｖ）％　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））中に浮遊させ、超音波分散装置（オリンパス社製）にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
（３）ラテックス粒子標識抗体パッドの作製
　実施例１と同様に作製した。
（４）メンブレン固定用抗体の調整
　実施例１と同じものを用いた。
（５）ヒトサイトカイン検出用イムノクロマトアッセイ媒体の作製
　実施例１と同様に作製した。抗体の配置は実施例１と同様にして抗体を配置した。
（６）ヒトサイトカインの検出
　イムノクロマトスポットの色を目視観察すると同時に蛍光検出器においてもその発色を検出した。その結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、蛍光検出器での判別についても横に同列にならぶ４対８、２対６、７対１１は判別があいまいであった。本比較例では発色ラテックスを使用し、本発明の如くスポット状で検出を試みても、発光が明確でなく、多種検出には適さないことがわかる。
　［比較例２］
　モノクローナル抗体の作製、量子ドットの作製、量子ドット標識化抗体の作製、量子ドット標識化抗体パッドの作製は、実施例１と同様に作製した。またメンブレン固定用抗体の調整においても実施例１と同様に行った。
（１）ヒトサイトカイン検出用イムノクロマトアッセイ媒体の作製
　ヒトサイトカイン検出用イムノクロマトアッセイ媒体は、図１に示すものと同様の構成のものを用いた。
　メンブレンは、幅３ｃｍ×１０ｃｍのニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）シート（白色）を用いた。図３に示すように、その長軸側の一端（この端を上流端、反対側を下流端とする）から離れた位置に固定用抗ＩＬ－１ａ抗体を陽圧噴霧装置（ＢｉｏＪｅｔ；Ｂｉｏ　Ｄｏｔ社製）を用いて、ライン状に塗布し、そこからさらに離れた位置に、固定用抗ＩＬ－１ｂ抗体、固定用抗ＩＬ－２抗体、固定用抗ＩＬ－４抗体、固定用抗ＩＬ－６抗体、最後に反応終了を示すコントロール抗体を抗ＩＬ－１ａ抗体と同様に塗布した。また、第２のメンブレンに、固定用抗ＩＬ－１ａ抗体、固定用抗ＩＬ－７抗体、固定用抗ＩＬ－８抗体、固定用抗ＩＬ－１０抗体、固定用抗ＩＬ－１２ｑ７０抗体、コントロール抗体を、さらに第３のメンブレンに、固定用抗ＩＬ－１ａ抗体、固定用抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体、固定用抗ＩＦＮγ抗体、固定用抗ＴＮＦα抗体を同様に塗布した。塗布後、４５度の温風を１０分間吹き付けて乾燥した。次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ社製）を接着した。
　次に、実施例１の４で作製した量子ドット標識抗体パッドを切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２ｍｍ重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッドとした。
　次に、幅３０ｍｍ×長さ１０ｃｍのセルロースろ紙（ワットマン社製）をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５ｍｍ重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッドとした。
　次に、サンプル滴下パッドの上流端の幅７ｍｍを除いて、上面全面を透明なプラスチックラミネート（Ａｄｈｅｓｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）で被覆した。
　図３に示す第１メンブレンを使ったイムノクロマト媒体を作製した。第２メンブレン、第３メンブレンも同様に作成した。
（２）ヒトサイトカインの検出
　実施例１と同様に行い、目視観察と蛍光検出器により、１２種評価した。結果を表３に示す。なお、コントロール抗体ＩＬ－１ａ（番号６，１１）の目視観察の結果も示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３からわかるように本発明の量子ドット標識を使用すればラインごとの明確さは際立つが、１メンブレンあたりの検出種には限界があり、コントロールを除き、５種が限度であることがわかり、本発明１の如く１２種を対象にする場合には３つのメンブレンが必要であり、簡便性に劣り、検出も複雑化していることが解る。
　本発明の効果は実施例１と比較例１、２を比較すればわかるように、本発明の構成は１度に簡便に多種の明瞭な検出が可能な、大きな優位性をもつ。本発明の検出優位性を発揮することにより、各スポットでの定量的な検出も可能でありイムノクロマト法による診断に大きな進歩をもたらすことが期待できる。
　ａ　サンプル滴下パッド
　ｂ　メンブレン
　ｃ　バッキングシート
　ｄ　サンプル吸収パッド
　ｅ　ラミネート
　ｆ　ドット状検出部位
　ｇ　蛍光検出器
　ｈ　光源
　ｉ　コントロール抗体塗布部
　ｊ　ＩＬ－４抗体塗布部
　ｋ　ＩＬ－１ｂ抗体塗布部
　ｌ　ＩＬ－６抗体塗布部
　ｍ　ＩＬ－２抗体塗布部
　ｎ　ＩＬ－１ａ抗体塗布部

Claims (5)

  1. 支持体上に、標識化試薬に固定化させた標識付き試薬と、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部位とを持つイムノクロマト媒体において、該標識化試薬が、蛍光ナノ粒子であり、該検出部位がドット状であることを特徴とするイムノクロマト媒体。
  2. 前記ドット状の検出部位におけるドット数が、３以上３０以下であることを特徴とする請求項１に記載のイムノクロマト媒体。
  3. 請求項１または２に記載のイムノクロマト媒体を用いるイムノクロマトグラフ法であって、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な、標識化試薬に固定化させた標識付き試薬と、被検出物質とを反応させたクロマト反応液を、前記イムノクロマト媒体上を移動させ、被検出物質と結合可能な物質を固定化した検出部位で捕捉して被検出物質を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフ法。
  4. 前記標識化試薬が、量子ドットであることを特徴とする請求項３に記載のイムノクロマトグラフ法。
  5. 被検出物質を３項目以上１５項目以下同時に検出できることを特徴とする請求項３又は４に記載のイムノクロマトグラフ法。
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