JP2011503568A - 固体支持体上への捕捉分子の固定化のための方法 - Google Patents

固体支持体上への捕捉分子の固定化のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、診断分析、より具体的には免疫アッセイの分野にあり、ここで捕捉分子は分析物を捕捉するために固体支持体上に固定化される。本発明は、固体支持体上への捕捉分子の固定化のための方法に関し、捕捉分子は、ビオチン化捕捉分子を得るためにビオチン分子に共有結合的に付着され、ビオチン化捕捉分子は、続いて、捕捉分子複合体を形成するために、高い親和性の結合メンバーと接触され、その後、捕捉分子複合体は固体支持体と接触される。

Description

本発明は、診断アッセイ、より具体的には免疫アッセイの分野にあり、ここで捕捉分子は分析物を捕捉するために固体支持体上に固定化される。
（臨床的）診断および汚染防止プログラムの分野における研究者らの主な目的の１つは、可能な限り迅速に正確なデータを得るための新規な分析戦略を提供することからなる。新規なスクリーニング試験が、商業的な目的のために必要とされるとき、該方法は、感度が高く、特異的であり、迅速であり、安価であり、および実施が容易でなければならない。一般に、免疫学的技術（免疫アッセイ）は、これらの要件をかなりの程度に満たし得る。
過去１０年間にわたって、使い捨ての側方流動免疫アッセイは、実験室、外来診療所、および一次診察の環境のどれにおいても、極めて成功してきた。このタイプのアッセイにおいて、典型的に、全ての反応成分は、多孔性の固体支持体、通常ニトロセルロース膜の上に、取込まれ得るかまたは固定化され得、そしてサンプルと、必要に応じて希釈剤の添加の後に、接触される（Zuk RF, Ginsberg VK, Houts T et al, (1985) Clin Chem 31:1144-1150、Bunce RA, Thorpe GH, Keen L (1991) Anal Chim Acta 249 : 263-269、およびMay K (1994) In: D Wild (ed): The Immunoassay Handbook. Macmillan Press, London, 233-235）。
この免疫アッセイ形式はまた、ストリップ試験、一工程ストリップ試験、免疫クロマトグラフィー試験、高速流動診断、高速免疫アッセイ（試験）、側方流動免疫アッセイ（ＬＦＩ）、オンサイト試験（アッセイ）、またはニアペイシェント試験（ＮＰＴ）として知られる。
免疫アッセイは、分析的な測定システムであり、これは、たとえば臨床的サンプルのような、サンプル中の特定の分析物の検出について、抗原と抗体との間の結合に依存する。
典型的な免疫アッセイにおいて、抗原または抗体は、通常、いくつかの種類の標識に付着され、そして次いで分析物を検出するための検出試薬として使用される。標識に付着される抗体または抗原のような検出試薬は、通常、結合体といわれる。標識は、たとえば、放射性標識または比色検出のための酵素、または免疫反応の直接的な可視化のための金、炭素、シリカ、もしくはラテックスのような着色コロイド粒子であり得る（Leuvering, JHW, Thal P JHM, Van der Waart M, Schuurs AHWM (1980) J Immunoassay 1(1):77-91）。
実際、コロイド状金粒子、または２５〜４０ｎｍの直径を有する金ナノクラスターはおそらく、側方流動免疫アッセイにおいて最も一般的に適用される標識である（Verheijen, R., in: Analytical Biotechnology 2002, Birkhauser Verlag Ed: T. Schalkhammer 134-166）。
典型的な免疫アッセイは、図１において例示されるような、試験ストリップを含む。このような試験ストリップは、図２において例示されるような、プラスチック製ハウジング上に装着され得る。
商業的環境において、典型的な試験ストリップは、多くの要素から作製され得、サンプルパッド、結合パッド、吸収パッド、および捕捉ゾーンに捕捉試薬を含む側方流動膜を、通常、２つの捕捉ライン：試験ラインおよびコントロールラインの形態で含む。捕捉試薬は典型的に、側方流動膜上に固定化される。試験における捕捉試薬は、分析物を結合し得る（それを捕捉する）分子を含む。この分子は、本明細書中で捕捉分子として言及される。
ハウジングの主な目的は、試験ストリップのいくつかの要素を固定すること、およびそれらを、互いに密接な接触に維持することである。さらに、ハウジングは、サンプルの寸法を良好に決定し得、そして通常、読取り表示を備える表示ウインドウを含む。
免疫アッセイの原理を記載する場合、たんぱくのような高分子量の分析物を検出するために通常使用される直接的なアッセイと、薬物残渣、抗体、ホルモンのような低分子量の分析物を検出するために通常使用される間接的または競合的なアッセイとを、区別しなくてはならない。
両方のタイプの試験において、使用者は、液体サンプル（緩衝液抽出物、乳汁、尿、血清、血漿、全血など）をサンプルパッド上に分注する。典型的な免疫アッセイにおいて、次いでサンプルはサンプルパッドを介して、結合パッドに流動し、ここでこれは放出し、そして結合体と混合する。他の構成がまた、当該分野において公知であり、たとえば、ここではサンプルは、先ず、捕捉試薬と接触され、次いで、続いて、結合体は捕捉領域と接触される（Verheijen, R., in: Analytical Biotechnology 2002, Birkhauser Verlag Ed: T. Schalkhammer 134-166）。
現在利用可能な免疫アッセイはしばしば、サンプル沈着点から近傍または下流に設置される結合体を用いる（図１）。次いで、サンプル自体は、結合パッドから結合体を再懸濁し、そしてそれを捕捉ゾーンに運搬するための頼みの綱である。このような免疫アッセイは、サンプルおよび結合体の十分な流動を提供するために、比較的大きなサンプルサイズを必要とし得る。
あるいは、結合体はサンプル沈着ポイントから上流に位置し得る。このような免疫アッセイは、非常により小さなサンプル容量を必要とする。次いで、さらなる希釈剤が結合パッドから結合体を再懸濁し、そして捕捉ゾーンへのサンプルおよび結合体の十分な流動を提供するために、添加され得る。
なお、「上流」および「下流」は、免疫アッセイにおけるサンプルの流動の方向に関した対象物の位置を言及している。
たんぱくのような高分子量の分析物を検出するための直接的なアッセイ形式において、結合体は、分析物と反応性の特異的な抗体でコート化される金ナノクラスターからなり得る。その分析物がサンプル中に存在する場合、それは結合体と反応する。形成される分析物−結合体複合体は移動性であり、そして液体の流動とともに結合パッドから膜へ自由に移動し得る。試験ラインにて、複合体は、固定化された抗分析物抗体のような捕捉分子により捕捉され得る。それによって、サンプル中の分析物の存在は、着色された試験ラインを生じる。試験ラインの色強度は、サンプル中の分析物の濃度に比例し得る。
分析物の濃度が最も低い検出濃度よりも低い場合、または分析物が完全に不在である場合、試験ラインはなんら可視的ではない。試験ラインおよびコントロールラインを超えて流動する過剰なサンプルは、吸収パッド中に採集される（Verheijen, R., in:
Analytical Biotechnology 2002, Birkhauser Verlag Ed: T. Schalkhammer 134-166）。
低分子量の分析物を検出するための競合アッセイ形式において、結合体は、分析物に対する抗体でコートされた金ナノクラスターからなる。ここでは、試験ラインは、いわゆるキャリアたんぱくに結合される分析物からなる。サンプルに存在する分析物が多いほど、それは、結合体の制限された量の抗体への結合について、膜上の固定化された分析物とより効果的に競合する。従って、サンプル中の分析物の不在は、着色された試験ラインを生じ、一方、分析物の量の増加は、検出ゾーンにおけるシグナルの減少を生じる。サンプル中の分析物のある濃度にて、試験ラインはもはや可視的ではない。検出の限界は、試験捕捉ラインの全体の不可視性をまさに引起こす、サンプル中の分析物の量として規定される。
ストリップ試験を含む免疫アッセイは、ますます多くの分析物（高分子量および低分子量）のために市販されている。この試験形式についての最初の主な標的分析物は、妊娠の検出のためのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）であった。現在、非常に多様な免疫アッセイが利用可能である（Anonymous, Sylluabus of a two-day seminar on Solid Phase Membrane-Based Immunoassays, Paris, September 25-26th, 1997, Millipore
Corporation, Bedford, MA, USA、Anonymous, Syllabus of The Latex Course, London, October 1-3th, 1997, Organized by Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN, USA、Price CP, Thorpe GHG, Hall J, Bunce RA (1997) CP Prince, DJ Newman (eds): Principles and Practices of Immunoassays (2nd edition). MacMillan Reference Ltd, London, 579-603、Hobbs FDR, Delaney BC, Fitzmaurice DA et al (1997). Health Technology Assessment 1(5)）。
市販の免疫アッセイの例は、たとえば、ホルモン（妊娠、肥満度、排卵、更年期、性的障害、および甲状腺機能）、腫瘍マーカー（前立腺、結腸直腸など）、ウイルス（ＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎）、細菌（連鎖球菌ＡおよびＢ、クラミジアトラコマチス、梅毒トレポネーマ、ヘリコバクターピロリなど）、ＩｇＥ（アレルギー）、および心臓のモニタリングにおけるトロポニンＴの検出のための免疫アッセイである。これらの分析物の全ては、それらの存在または不在に基づいて測定される。一次医療におけるニアペイシェント試験の多数の概説については、上述のようにHobbs et al.（上記参照）によって発表されている。
免疫アッセイは単純に見えるが、それらの種々の要素間の複雑な相互作用は、開発および製造環境の両方において多くの挑戦を導く。これらの挑戦は定量的試験についてさらに多く、ここでは試験ラインの色強度は、生産ロット間で再現可能でなければならない。開発の観点から、首尾よい試験系を作製することは、その原材料間の相互作用、要素設計、および製造技術を最適化することを意味する。
典型的な免疫アッセイにおいて、それは移動相と固定相との間で区別される。移動相は、免疫アッセイにおいて使用され得る膜および／または異なるパッド上を移動し得る全ての分子からなり、一方、固定相は、パッドおよびまたは膜上を移動しないそれらの分子からなる。典型的に、移動相は、サンプル、サンプル中の分析物、希釈剤、および結合体を含み、一方、固定相は、典型的に、捕捉試薬を含み、コントロール捕捉ラインおよび試験捕捉ラインにおいて固定化される。
全ての免疫アッセイに共通する典型的なジレンマは、移動相が、膜から可能な限り低い障害を受けながら、膜上を、または膜を介して自由に移動し得、一方、固定相は移動できずに膜に付着されるべきであることが所望されることである。膜の孔径は、移動相の流速を測定する。高速アッセイについて、高速流動膜が好ましく、そしてこのような膜は、比較的大きな孔径により特徴づけられる。固定相において、特に、捕捉試薬がペプチドのような小分子からなる場合、捕捉試薬を担持することが、このような膜についての問題である。
ニトロセルロースはおそらく、免疫アッセイにおける側方流動膜について最も一般的に使用されるポリマーである。このような膜の孔径は、５〜２０μｍの間で変化し、これは、たんぱくブロッティングについて使用されるニトロセルロース膜の０．２〜１．２μｍの孔径に比較して大きい。大きな孔径は、小さな膜表面積、従って低いたんぱく結合能力、すなわち、０．４５μｍの孔径を備えるブロッティング膜について１１０μｇ ＩｇＧ／ｃｍ２の代わりに、２０〜３０μｇ ＩｇＧ／ｃｍ２を意味する。
多くの免疫アッセイが当該分野において記載されており、そして捕捉試薬、最も顕著には抗原または抗体の固定化のための方法は、当該分野において公知である。一般に、小ペプチドを固定化するための方法は、小ペプチドを、たとえばより大きなペプチド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなたんぱく、または糖のような、より大きな分子に結合する原理を用いる。一般に、組換え生物体において産生される、融合たんぱくを使用することがまた、記載されている。
当該分野において周知の方法は、捕捉分子自体よりも良好に膜上に担持される捕捉試薬を得るために、小ペプチドのような捕捉分子を、ＢＳＡまたはオボアルブミンのようなより大きなたんぱくに結合することである。（Verheijen, R., in: Analytical
Biotechnology 2002, Birkhauser Verlag Ed: T. Schalkhammer 134-166）。他の公知の方法は、固体支持体への捕捉分子の固定化に基づき、ここではビオチンおよびストレプトアビジンの高い親和性結合が用いられる。これらの先行技術の方法において、アビジンまたはストレプトアビジンは先ず、固体支持体上に固定化され、そしてその後、ペプチドのようなビオチン化捕捉分子を捕捉するために使用される。
他の分子へのビオチンの結合は、ビオチン化として当該分野において公知のプロセスである。ビオチンは、アビジンおよびストレプトアビジンのようなたんぱくに強力に結合し、そしてビオチン化された分子は、固定化されたアビジンまたはストレプトマイシンン分子をその上に有する表面によって容易に捕捉される。ビオチン−アビジン複合体およびビオチン−ストレプトアビジン複合体は、極めて大きな会合定数（Ｋａ＝アビジンについて、１０１５Ｍ−１、およびストレプトアビジンについて１０１３Ｍ−１）を有し、共有結合にエネルギー的に等価であり、そして広範の温度およびｐＨにわたって安定である。
ビオチン化は典型的に、標的たんぱく上の暴露されるリジン残基を標識するために、ビオチンの化学的に活性な形態を使用して達成される。リジンは、最も頻繁に存在するアミノ酸の１つであり、および化学的ビオチン化は、それゆえ、本質的に全てのたんぱくをビオチン化するために使用され得る。
ビオチン／ストレプトアビジン相互作用は、いくつかの場合について、免疫アッセイ手順おける他の方法において利用されてきた。たとえば、米国特許第５１２６２４１号において、固体支持体に接着されるストレプトアビジンは、複合体を形成するためのインキュベーションを包含する手順において、ビオチン化抗原を結合するために使用され、ここでは、測定される分析物は、標識および固体支持体と、これら３つ全てを結合し得る抗体への接近について競合する。
米国特許第４４９６６５４号は、アビジン結合された紙ディスクを使用して、ビオチン化抗体を捕捉し、ディスク上の抗体と、ｈＣＧを含むと思われる溶液とを反応し、次いで標準的な測定技術を使用してディスク上のｈＣＧの量を測定することにより行われる、ヒト絨毛ゴナドトロピンについてのアッセイを記載する。このアッセイは、ビオチン／アビジン連結を介して固体支持体に結合される抗ｈＣＧおよび標識化抗ｈＣＧから形成されるｈＣＧのサンドイッチを生じる。このアッセイは、サンプルの側方流動を含まない。
米国特許第５００１０４９号は、ヒトＨＩＶに対する抗体を測定するための方法を記載し、これはストレプトアビジンで誘導体化される固体支持体を、抗ＨＩＶと反応性のビオチン化ペプチドとともにインキュベートすること、次いで任意の結合抗体を標識化抗体受容体で検出することを包含する。また、これらのアッセイにおいて、側方流動は行われない。
米国再発行特許第３４１３２号は、米国特許第４９４５０４２号の再発行であるが、抗体についての直接的なアッセイを記載し、ここでは分析物は、標識化エピトープと、ストレプトアビジン／ビオチンリンクを介して基質に結合されるエピトープとの間のリンクとして作用する抗体である。また、側方流動形式は必要とされないので、反応の速さは重要ではない。
本出願の目的は、免疫アッセイにおける捕捉試薬の固定化のための代替の技術、好ましくは、先行技術よりも利点を伴う固定化技術を少なくとも提供することである。このような利点は、免疫アッセイの、特異性、感度、費用、もしくは製造する容易さにおいて、およびまたは最終的に診断アッセイ自体の費用もしくは操作する容易さにおける利点において、見出され得る。
驚くべきことに、抗原または抗体のような捕捉分子が、ビオチンおよび結合メンバー、たとえば、抗ビオチン抗体、アビジン、キャプトアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、もしくはストレプトアビジンヒドラジド、またはそれらの誘導体に結合されながら膜上に固定化され、その後、このように得られた複合体が固体支持体上に固定化される場合、改善された特異性およびまたは感度が達成され得ることが見出された。
したがって、本発明は、固体支持体上への捕捉分子の固定化のための方法に関し、該方法において、捕捉分子は、ビオチン化捕捉分子を得るためにビオチン分子に共有結合的に付着され、ビオチン化捕捉分子は、続いて、複合体を形成するために結合メンバーと接触され、その後複合体は固体支持体と接触される。
典型的な試験ストリップの模式図。Ａは上面図。Ｂは側面図。 ストリップ装置において使用されたハウジングの例。
捕捉分子がビオチンで標識され、次いで溶液中で抗ビオチン抗体、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンヒドラジドのような結合メンバーに結合された後、このように得られた複合体を固体支持体に固定化する方法は、ビオチン標識化分子が固体支持体に既に固定化された結合メンバーによって捕捉される公知の固定化技術よりも特別の利点を生じたことが見出された。
したがって、本発明は、固体支持体上への捕捉分子の固定化のための方法に関し、該方法において、捕捉分子は、ビオチン化捕捉分子を得るためにビオチン分子に共有結合的に付着され、ビオチン化捕捉分子は先ず、複合体を形成するために結合メンバーと接触され、その後、複合体は固体支持体と接触される。
先行技術の方法において、結合メンバーへのビオチンの結合は、典型的に、結合メンバーは固体支持体に付着されながら行われる。本発明は、複合体が、溶液中でビオチン化捕捉分子と結合メンバーとの間で形成された後の捕捉分子の固定化に関する。その後にのみ、ビオチン化捕捉分子および結合メンバーを含む複合体は、次いで、固体支持体上に固定化される。
この状況における結合メンバーは、ビオチンに結合し得る分子として解釈されるべきである。これは、たとえば、抗ビオチン抗体のようなビオチンと可逆的な結合を形成し得る分子であり得る。それはまた、高い親和性定数を伴う分子のような、高い親和性の結合メンバーであり得る。このような高い親和性の結合メンバーは、共有結合に匹敵する結合をビオチン化複合体と形成し得る。当業者は、これが、Ｋａ＝１０１５Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１、ストレプトアビジンについて、典型的には１０１３Ｍ−１の程度にあることを認識するであろう。
高親和性の結合メンバーは、アビジン、キャプトアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンヒドラジド、またはそれらの誘導体からなる群から有利に選択され得る。
この方法は、結合メンバーは、ビオチン化捕捉分子と混合される際は固体支持体に結合されず、ビオチンと結合メンバーとの間の結合の形成の後にのみ、このように得られた複合体は、固体支持体上に固定化されるという点で上記の先行技術とは異なることが理解されるべきである。疑いの回避のために、捕捉分子複合体を形成するためのビオチン化捕捉分子と、結合メンバーとの接触は、溶液中または任意の他の形態中で行われ、ここではビオチン化捕捉分子および結合メンバーのいずれも固体支持体に付着されない。
この文脈における用語「捕捉分子」は、分析物、特に抗原または抗体のような別の分子に結合し得る分子として解釈されるべきである。抗原は、ハプテン、糖、ペプチド、たんぱく、多糖、および当業者に公知の多くのもののような広範な分子からなり得る。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、ヒトの臨床的サンプル、または唾液、汗、痰、尿、血液、血漿、血清、膣液、もしくは脳脊髄液のような体液に由来し得る。これらはまた、マウス、ラット、ウサギ、ラマ、およびラクダのような実験動物に、または細菌、酵母、もしくはヒト細胞のような組換え供給源に由来し得る。
本発明に従う方法は、捕捉分子が複数の小分子からなる場合、有利に用いられ得る。この文脈において、用語「小分子」は、１００，０００（１０万）Ｄａを下回る、好ましくは５０，０００Ｄａ、たとえば４０，０００、３０，０００、２０，０００、または１０，０００Ｄａを下回る分子量を伴う分子を意味するとして解釈されるべきである。特に利点は、小分子がさらに１０，０００Ｄａよりも小さい、たとえば、８０００、６０００、４０００、２０００、または１０００Ｄａよりも小さい場合に得られる。このような小分子の例は、抗体フラグメント、天然のペプチドの合成物質またはハプテンであり得る。
あるいは、用語「複数の小分子」はまた、たとえば、膜のような固体支持体の孔径の関数として、機能的に規定され得る。固体支持体への分子の接着または結合は、固体支持体の孔径に依存することが当該分野において知られる。孔径が大きくなるほど、ペプチドのような捕捉分子の、固体支持体への結合は、より小さい孔径を備える固体支持体への結合よりも小さくなる。したがって、小分子はまた、特定の孔径を備える所与の膜には結合しない、または検出可能には結合しない分子として規定され得る。
特に有利な結果は、複数の小分子がペプチドであった場合に得られた。本研究において、ペプチドは５〜１００アミノ酸の範囲において、たとえば、１０、１２、１４、１６、１９、２０、３０、５０、または８０アミノ酸が使用された。このようなペプチドは、固体支持体、特に多孔性膜、さらに特に、大きな孔径を備える多孔性膜に対するそれらの乏しい結合が知られる。このようなペプチドがビオチンに結合され、そして本発明に従う方法において使用された場合、得られるアッセイの改善された感度および特異性が観察された。さらに、作製する方法は、先行技術の方法に比較して、より容易であり、およびより労働集約的でなかった。さらに、検出領域にて、陽性サンプルの得られるラインは、先行技術に比較してより鮮明およびより明瞭であった。
この点における用語「固体支持体」は、免疫アッセイを行うのに適切な任意の支持体または表面として解釈されるべきである。特に、方法は、材料を介するキャピラリー流動を許容するために多孔性である固体支持体を用いる。このような多孔性の固体支持体の例はニトロセルロース膜である。
小分子のような任意の捕捉分子にビオチン分子を共有結合的に付着するための方法は、当該分野において公知であり、およびビオチン化のためのキットは、たとえば、Roche
Diagnostics, Indianapolis、カタログ番号11 008960 001から市販されている。当業者は、ビオチン化捕捉分子を、どのように扱い、結合メンバーまたはアビジン、キャプトアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、もしくはストレプトアビジンヒドラジド、またはそれらの誘導体のような高い親和性の結合メンバーと、どのように結合させるのかを知っているであろう。
ニトロセルロース膜Millipore HF075、HF090、HF120、HF135、HF180、またはHF240に、合成ペプチドを直接的に結合することが試みられた。その目的のために、国際公開第０３／０５０５４２号において記載されるような以下の合成の１２マーペプチドが、膜上にスポットされ、そして乾燥された。
0002-27 H Q K R G Cit G W S R A A
0002-29 H Q R R V Cit G W S R A A
0002-31 H Q R R T Cit G G S R A A
0002-32 H Q R K W Cit G A S R A A
0002-36 H Q F R F Cit G Cit S R A A
0002-37 H Q K W R Cit G R S Cit A A
0002-63 H Q F R F Cit G W S R A A
0107-32 K P Y T V Cit K F M R R P
0107-35 A R F Q M Cit H Cit R L I R
0107-45 Y S F V W Cit S H A R P R
0113-30 A R F Q M R H Cit R L I R
0218-36 R N L R L Cit R E R N H A
ここで、「Cit」は、シトルリンを表し、そして他のアミノ酸は、アミノ酸についての一文字コードにおいて示される。さらに、これらのペプチドの環状改変体（実施例１）がまた、同じ設定において試験された。
これらの直鎖状および環状ペプチドは、関節リウマチを患う患者からの血清中の抗体とのそれらの優れた反応性が知られる。乾燥された膜は、抗体の低い力価から非常に高い力価にわたる２０個のこのような血清を用いて、反応性について試験され、そしていずれのペプチドも膜上に担持されないようであり、このことは、ペプチドが適用されたいずれのラインも抗体との有意な反応を与えなかったという事実により明らかであった。
次いで、同じペプチドがビオチン化され（実施例２）、そして上記と同じ様式において反応性について試験された。また、反応は何ら観察されず、このことは、ビオチン化ペプチドが膜によって担持されるにはまた小さすぎたという事実に起因された。実施例の節において、高い血漿サンプル、中程度の血漿サンプル、低い血漿サンプルのみの参照パネルを用いて得られた結果が示される。
比較例を提供するために、先行技術の方法が、ペプチドをより効果的に固定化するために使用された。したがって、結合体は、ペプチドとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との間で調製され、そしてその結合体はニトロセルロース上にスポットされた。いくつかの偽陽性の結果が、偽陰性と同様に得られた。全体で、これは平均の結果として評価された（表１）。
次に、ビオチン化ペプチドは、抗ビオチンモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（Jacksons laboratories、製品２００−００２−０９６ ＩｇＧ画分）を含む結合メンバーと反応され、次いで膜上にスポットされた。このことはアッセイの感度を改善したが、ペプチド−ＢＳＡ結合体を用いる先行技術の方法と同じ特異性が観察された（表２および表３）。
ビオチン化ペプチドが、捕捉分子複合体を膜上に固定化する前に、アビジン、キャプトアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、もしくはストレプトアビジンヒドラジドまたはそれらの誘導体のような、高い親和性の結合メンバーと混合された場合、結果が非常に改善された。上述のいずれの方法に比較しても、より少ない偽陽性が確認され、そして良好な特異性が得られた。特に、ストレプトアビジンは非常に良好に作用し、このことは、１００％の特異性および１００％の感度を伴うアッセイを生じた（表２および表３）。
実施例において、いくつかのペプチドが、関節リウマチ（ＲＡ）を伴う患者からの抗体とのそれらの反応性について試験された。全ての場合において、先行技術の方法に比較して改善された反応性が観察された。この意味における改善された反応性は、アッセイの改善された感度もしくは特異性、またはその両方として解釈されるべきである。したがって、本発明はまた、上記の方法に関し、ここで捕捉分子は、関節リウマチを患う患者から得られた抗体と反応性の抗原である。
ＲＡ抗体との改善された反応性が、環状シトルリン化ペプチドが捕捉分子として使用された場合に観察された（表３）。
本発明に従う方法は、広範な固体支持体を伴って用いられ得る。有利な結果は、固体支持体が、Millipore HF075、HF090、HF120、HF135、HF180、またはHF240のような高速流動膜、または同等の流動特性を伴う膜からなる群から選択された場合に得られた。
本発明はまた、本発明に従うプロセスにより得ることが可能な、そこに固定化される捕捉分子複合体を備える固体支持体に関する。このような固体支持体は、たとえば、抗体または抗原の検出、たとえば、関節リウマチに特異的な抗体の検出、のための免疫アッセイにおいて使用され得る。このような免疫アッセイにおいて、環状シトルリン化ペプチドは固体支持体上に有利に固定化される。
実施例において、いくつかの捕捉分子複合体が固体支持体とどのように接触されるのかが記載される。これは機械の補助を伴って行われたが、このことが必須であると解釈されるべきではない。当業者は、捕捉分子を固体支持体上に沈着するための他の選択肢を認識し、浸漬、噴霧、ブロッティング、スポッティング、およびその他多くのものが挙げられるが、これらに制限されない。
実施例１：ペプチド
以下の直鎖状ペプチドは、Polypeptide Laboratories, 365 Maple Avenue, Torrance CA 90503から商業的に得られた。
2-27 H Q K R G Cit G W S R A A
2-29 H Q R R V Cit G W S R A A
2-31 H Q R R T Cit G G S R A A
2-32 H Q R K W Cit G A S R A A
2-36 H Q F R F Cit G Cit S R A A
2-37 H Q K W R Cit G R S Cit A A
2-63 H Q F R F Cit G W S R A A
107-32 K P Y T V Cit K F M R R P
107-35 A R F Q M Cit H Cit R L I R
107-45 Y S F V W Cit S H A R P R
113-30 A R F Q M R H Cit R L I R
218-36 R N L R L Cit R E R N H A
これらのペプチドの環状改変体はまた、Polypeptide Laboratories, 365 Maple Avenue, Torrance CA 90503から商業的に得られた。これらのペプチドは、それらのシステイン残基を介して環状化され、そして以下の一次配列を有した。
環状2-27 G S Q H C H Q K R G Cit G W S R A A C G-NH2
環状2-29 G S Q H C H Q R R V Cit G W S R A A C G-NH2
環状2-31 G S Q H C H Q R R T Cit G G S R A A C G-NH2
環状2-32 G S Q H C H Q R K W Cit G A S R A A C G-NH2
環状2-36 G S Q H C H Q F R F Cit G Cit S R A A C G-NH2
環状2-37 G S Q H C H Q K W R Cit G R S Cit A A C G-NH2
環状2-63 G S Q H C H Q F R F Cit G W S R A A C G-NH2
環状107-32 G S Q H C K P Y T V Cit K F M R R P C G-NH2
環状107-35 G S Q H C A R F Q M Cit H Cit R L I R C G-NH2
環状107-45 G S Q H C Y S F V W Cit S H A R P R C G-NH2
環状113-30 G S Q H C A R F Q M R H Cit R L I R C G-NH2
環状218-36 G S Q H C R N L R L Cit R E R N H A C G-NH2
ペプチドのＣ末端はアミド化された。
先行技術例：ＢＳＡへのペプチドの結合
ＢＳＡ−ペプチド複合体を、実施例１において示されるような直鎖状または環状ペプチドにＢＳＡを架橋することにより調製した。その目的のために、ペプチドを合成し、ここではシステイン残基は、実施例１において示されるペプチドのＮ−末端側に付加された。ＢＳＡの架橋は、Pierce, Meridian Road Rockford IL, 製品番号２２３２２から得られたクロスリンカーｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを、製造業者のプロトコルに従って使用して達成された。要するに、ＢＳＡは、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌにて溶解された際に活性化され、そして１ｍｇ ＢＳＡ当たり、２０μｇのクロスリンカーが添加された。混合物は室温で１時間インキュベートされ、そして反応は、１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４の最終濃度でブロックされた。遊離のクロスリンカーはＰＤ１０カラムで除去された。ペプチドは活性化ＢＳＡの１ｍｇ当たり１ｍｇにて添加され、そして２時間室温にてインキュベートされた。遊離ペプチドは、ＰＢＳ ｐＨ７．４に対する透析によって除去された。
ポリアクリルアミドゲル分析は、ＢＳＡ−ペプチド複合体について１００ｋＤａの分子量を表し、平均して約１３個のペプチド分子が１つのＢＳＡ分子に付着されたことを意味する。
以下のペプチドが得られた。
BSA2-27 BSA C H Q K R G Cit G W S R A A
BSA2-29 BSA C H Q R R V Cit G W S R A A
BSA2-31 BSA C H Q R R T Cit G G S R A A
BSA2-32 BSA C H Q R K W Cit G A S R A A
BSA2-36 BSA C H Q F R F Cit G Cit S R A A
BSA2-37 BSA C H Q K W R Cit G R S Cit A A
BSA2-63 BSA C H Q F R F Cit G W S R A A
BSA107-32 BSA C K P Y T V Cit K F M R R P
BSA107-35 BSA C A R F Q M Cit H Cit R L I R
BSA107-45 BSA C Y S F V W Cit S H A R P R
BSA113-30 BSA C A R F Q M R H Cit R L I R
BSA218-36 BSA C R N L R L Cit R E R N H A
実施例２：捕捉分子のビオチン化
実施例１において示される直鎖状および環状ペプチドのセットはまた、Polypeptide
Laboratories, 365 Maple Avenue, Torrance CA 90503から得られ、Ｎ末端ビオチン残基を伴った。これらのペプチドは以下の一次構造を有した。
ビオチン2-27 ビオチンH Q K R G Cit G W S R A A
ビオチン2-29 ビオチンH Q R R V Cit G W S R A A
ビオチン2-31 ビオチンH Q R R T Cit G G S R A A
ビオチン2-32 ビオチンH Q R K W Cit G A S R A A
ビオチン2-36 ビオチンH Q F R F Cit G Cit S R A A
ビオチン2-37 ビオチンH Q K W R Cit G R S Cit A A
ビオチン2-63 ビオチンH Q F R F Cit G W S R A A
ビオチン107-32 ビオチンK P Y T V Cit K F M R R P
ビオチン107-35 ビオチンA R F Q M Cit H Cit R L I R
ビオチン107-45 ビオチンY S F V W Cit S H A R P R
ビオチン113-30 ビオチンA R F Q M R H Cit R L I R
ビオチン218-36 ビオチンR N L R L Cit R E R N H A
ビオチン化および環状：
ビオチン環状2-27 ビオチンG S Q H C H Q K R G Cit G W S R A A C G-NH2
ビオチン環状2-29 ビオチンG S Q H C H Q R R V Cit G W S R A A C G-NH2
ビオチン環状2-31 ビオチンG S Q H C H Q R R T Cit G G S R A A C G-NH2
ビオチン環状2-32 ビオチンG S Q H C H Q R K W Cit G A S R A A C G-NH2
ビオチン環状2-36 ビオチンG S Q H C H Q F R F Cit G Cit S R A A C G-NH2
ビオチン環状2-37 ビオチンG S Q H C H Q K W R Cit G R S Cit A A C G-NH2
ビオチン環状2-63 ビオチンG S Q H C H Q F R F Cit G W S R A A C G-NH2
ビオチン環状107-32 ビオチンG S Q H C K P Y T V Cit K F M R R P C G-NH2
ビオチン環状107-35 ビオチンG S Q H C A R F Q M Cit H Cit R L I R C G-NH2
ビオチン環状107-45 ビオチンG S Q H C Y S F V W Cit S H A R P R C G-NH2
ビオチン環状113-30 ビオチンG S Q H C A R F Q M R H Cit R L I R C G-NH2
ビオチン環状218-36 ビオチンG S Q H C R N L R L Cit R E R N H A C G-NH2
実施例３：アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンヒドラジドを使用する捕捉分子複合体の調製
上記されるようなペプチドを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解した。それらは、ペプチド：アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンヒドラジドのモル比５：２において、ＰＢＳ中のアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンヒドラジドのいずれかの１ｍｇ／ｍｌ溶液と混合された。混合物は室温にて１０分間インキュベートされ、そして迅速に使用された。アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンヒドラジドはPierceから得られた。
比較実験において、ここではペプチドは、１：１、２：１、４：１および５：２のモル比において、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンヒドラジドと混合され、そしてＲＡ抗体の制限されたセットを用いて試験された。５：２モル比が至適であるようであった。他の比率もなお、受容され得る結果を生じ、それゆえ、比率は重要ではなく、そしてそれぞれ個々の捕捉分子複合体について至適化され得ることが結論される。一般に、モル過剰のペプチドまたはたんぱくを使用することは有利である。
実施例４：モノクローナル抗ビオチン抗体を使用する捕捉分子複合体の調製
上記のようなビオチン化ペプチドが、１ｍｇ／ｍｌの濃度にてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解された。それらは、Jacksons laboratories、製品２００−００２−０９６ ＩｇＧ画分から得られるモノクローナル抗ビオチン抗体の１．３ｍｇ／ｍｌ溶液と混合された。混合物は３７℃にて３０分間インキュベートされ、そして迅速に使用された。
実施例５：固体支持体上への捕捉分子複合体の固定化。
捕捉分子複合体は、Kinematic 1600を使用して細線の形態において固体支持体上にスポットされた。使用された固体支持体は、Millipore HF075、HF090、HF120、HF135、HF180、およびHF240膜であった。ストライプ速度は、１０ｃｍ／秒の速度にて、０．９μｌ／ｃｍであった。膜は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１％Pluronic F68、市販の界面活性剤、を含有するＰＢＳ溶液を使用してブロックされた。その目的のために、全ストリップは、以下の設定：流動測度５ｃｍ／秒、ディスペンサー１０μｌ／秒、ｙ軸２０、およびマイクロメーター０．０を使用して、空気ジェットディスペンス先端を備える
Biodot XYZ 3000を使用して噴霧された。膜は、乾燥室において室温（２１℃）で２４時間乾燥され、そして５ｍｍ幅の切片に切断された。切片の長さは約３０ｍｍであり、捕捉分子複合体は、上部から約７ｍｍに縞状に配置した。種々の膜タイプを用いて得られた結果は本質的に同じであった。ＨＦ１８０膜は、流動特性および感度／特異性の至適な組合せを提供した。これらの結果は、表１〜表３において示され、他の膜を用いて得られた結果は、同一でない場合、同等のものであった。
実施例６：免疫アッセイ、すなわち、側方流動アッセイの実施
吸収パッドは、ストリップの上部に付着され、そしてストリップの底部は、７５μｌの抗体溶液を含有する１．５ｍｌのエッペンドルフ反応容器中に置かれた。抗体溶液は、ストリップ内に十分に移動することを許容された。次いで、ストリップは、７５μｌの結合体溶液を含有する別の容器中に置かれ、そして液流は吸収パッドに到達することを許容された。このことは、２０分間室温にて行われることを許容された。
抗体溶液は、１５μｌ ヒト血漿と、６０μｌ ＰＢＳ／１％ ＢＳＡとを混合することにより調製された。４つの異なるヒト血漿サンプルが使用された。
ａ）正常なヒト血漿、非反応性
ｂ）低い力価の関節リウマチ血漿
ｃ）中程度の力価の関節リウマチ血漿
ｄ）高い力価の関節リウマチ血漿。
血漿サンプルは、Trina International Nanikon Switzerland、カタログ番号DA 1708から得られたマスターバッチに由来した。高い力価の血漿は、EuroDiagnostica免疫スキャンＲＡ抗ＣＣＰ試験キット；EuroDiagnostica BV Arnhem、The Netherlands、カタログ番号RA-96RTにおいて測定された場合、１６００ユニット／ｍｌの力価が得られるまで、マスターバッチ血漿を正常なヒト血漿中に希釈することにより調製された。中程度の力価の血漿は、４００ユニット／ｍｌの力価が得られるまで高い力価の血漿を希釈することにより得られ、低い力価の血漿は、２５ユニット／ｍｌの力価が得られるまで、正常なヒト血漿中のさらなる希釈により得られた。
結合体溶液は、British Biocell International（ＢＢＩ）；抗ヒトＩｇＧ金結合体カタログ番号BA GAHL 40から得られた３０μｌの金結合体と、７０μｌの分離用緩衝液とを混合することにより調製された。使用された分離用緩衝液は、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳからなった。
各装置に対するラインの色強度が、０〜１１にわたる視覚的尺度（「Ｒａｎｎ尺度」）を使用して測定され、ここでは０は無色を表し、および１１は最も強い色調を示す。ＲＡＮＮ尺度は、比較計として使用され、ここでは試験シグナル強度は、等価なＲＡＮＮ尺度の強度に比較され、そして結果を記録する目的のために値を割り当てられる。ＲＡＮＮ記録カードは、５つの列からなり、強度は非常に弱いから非常に強いまでにわたって変化する。カードの両端は１および１０のライン強度に対応する。試験ラインの強度が記録カード上の最小の強度ラインを下回る場合、試験ラインの強度は０と記録される。試験ラインの強度が記録カード上の最小の強度ラインに等しい場合、試験ラインの強度は１と記録される。試験ラインの強度が記録カード上の最小の強度ラインと、次の強度ラインとの間にある場合、試験ラインの強度は２と記録されるというようである。得られ得る最大の値は、１１であり、ＲＡＮＮ記録カード上の最大の強度ラインよりも強いことを示す。
上記のような材料を用いて得られた各試験ゾーンにおけるストリップの強度は、表１〜表３においてまとめられる。
Figure 2011503568
Figure 2011503568
Figure 2011503568

Claims (13)

  1. 固体支持体上での捕捉分子の固定化のための方法であって、捕捉分子は、ビオチン化捕捉分子を得るために、ビオチン分子に共有結合的に付着され、ビオチン化捕捉分子は、捕捉分子複合体を形成するために先ず結合メンバーと接触され、その後捕捉分子複合体は、固体支持体と接触されることを特徴とする方法。
  2. 前記結合メンバーは、アビジン、キャプトアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、もしくはストレプトアビジンヒドラジド、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、高い親和性の結合因子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記捕捉分子が小分子であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記捕捉分子がペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記捕捉分子は、関節リウマチを患う患者から得られる抗体と反応性の抗原であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記捕捉分子は環状シトルリン化ペプチドであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 前記固体支持体はニトロセルロース膜であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記固体支持体は、高速流動膜であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記膜は、Millipore HF075、HF090、HF120、HF135、HF180、もしくはHF240または匹敵するもしくは等価な流動特性を備える膜からなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、捕捉分子複合体が固定化される固体支持体。
  11. 請求項１０に記載の固体支持体を含む抗体または抗原の検出のための免疫アッセイ。
  12. 関節リウマチに特異的な抗体の検出のための、請求項１１に記載の免疫アッセイ。
  13. 環状シトルリン化ペプチドが前記固体支持体上に固定化されることを特徴とする請求項１２に記載の免疫アッセイ。
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