JPH04178399A

JPH04178399A - 安定なアビジン―ビオチン化タンパク質複合体溶液の製造方法

Info

Publication number: JPH04178399A
Application number: JP30264590A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Kono; 直幸河野; Shinzo Obata; 伸三小畠
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1990-11-09
Publication date: 1992-06-25
Anticipated expiration: 2012-02-19
Also published as: JP2583153B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は、アビジン−ビオチンシステムに於て用いられ
る安定なアビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶液の
製造方法に関する。

［発明の背景コ卵白から得られる糖タンパク質のアビジン、或はストレ
プトマイセスによって産生される糖鎖を持たないストレ
フトアビジンはビタミンの一種であるビオチンと特異的
に結合する。ビオチンをタンパク質に結合させると通常
タンパク質１分子あたりに複数個のビオチンがこれに結
合する。また、アビジン１分子あたりにビオチンは複数
個結合できる。従って、ビオチンが結合したタンパク質
、即ちビオチン化タンパク質とアビジンを反応させると
複数個のビオチン化タンパク質と複数個のアビジンの結
合した複合体が形成される。この複合体はビオチン化タ
ンパク質とアビジン或はストレフトアビジンとが３次元
構造゛を形成しているものと思われるが構造等は不明で
ある。このアビジン−ビオチン化タンパク質複合体を用
いたアビジン−ビオチンシステムは免疫組織化学染色、
ハイブリドーマのスクリーニング、ＤＮＡプルーブ染色
。

固定相酵素免疫測定、二重標識研究等に於て広く利用さ
れている。また、アビジン−ビオチンシステムは蛍光或
は酵素を用いる検出方法の中でも感度の高い方法である
ことが一般によく知られている（特開昭５９−２２４５
６４号公報等）ａしかしながら、従来の製造方法、即ち
、アビジンとビオチン化タンパク質を混合し、一定時間
熟成反応させる方法により得られたアビジン−ビオチン
化タンパク質複合体溶液は安定性が極めて悪く、アビジ
ン−ビオチン化タンパク質複合体としての使用可能な期
間は調製後数時間乃至数日間しかなかった。そのため該
複合体を効率よく使用するには、必要量を用時調製しな
ければならないという煩わしさがあり、しかも該複合体
溶液が使用可能になるまでにはアビジンとビオチン化タ
ンパク質を混合した後、３０分程度の熟成時間が必要で
あるため、すぐには使用に供せないという不便さもあっ
た。それ故、長期間保存可能で、しかも随時使用可能な
アビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶液の出現が切
に望まれていた。

［発明の目的コ本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、長
期間安定に保存でき、且つ随時使用可能なアビジン−ビ
オチン化タンパク質複合体溶液とその製法方法を提供す
ることを目的とする。

［発明の構成コ本発明はアビジンとビオチン化タンパク質とを一定時間
反応させた後、反応停止剤を加えて反応を停止させるこ
とを特徴とする安定なアビジン−ビオチン化タンパク質
複合体溶液の製造方法及び該方法により得られたアビジ
ン−ビオチン化タンパク質複合体溶液の発明である。

即ち、本発明者らは、長時間安定に保存し得るアビジン
−ビオチン化タンパク質複合体溶液を求めて鋭意研究を
重ねた結果、アビジンとビオチン化タンパク質とを一定
時間反応させた後、適当な反応停止剤を加えてアビジン
−ビオチン化タンパク質複合体の形成反応を停止させる
ことにより該目的を達成し得ることを見出し、本発明を
完成するに至った。

本発明に於て用いられるビオチン化タンパク質としては
、例えばビオチン化ペルオキシダーゼ。

ビオチン化アルカリホスファターゼ、ビオチン化β−ガ
ラクトシダーゼ等のビオチン化酵素があげられる。

本発明に於てアビジンの代わりにストレフトアビジンを
用いることも可能である。

本発明に於て用いられる反応停止剤としては例えばグル
タルアルデヒド、パラホルムアルデヒド或は免疫組織染
色に用いられるＺａｍｂｏｎｉ固定液、ＰＬＰ固定液（
何れも主成分はバラホルムアルデヒド）等のアルデヒド
類が好ましく挙げられるが、これらに限定されるもので
はなくアビジン−ビオチン化タンパク質複合体の形成反
応を停止する能力を有し、且つ得られた該複合体の使用
目的に於て悪影響を及ぼさないものであれば何れにても
よい。

本発明は、通常安定化剤の存在下に実施される。

本発明に於て用いられる安定化剤としては、タンパク質
安定化剤であれば何れにても使用できるが、通常、ポリ
オール類が好ましく用いられる。ポリオール類の具体例
としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール
、サッカロース等が挙げられるが、中でもグリセロール
がより好ましく用いられる。

これらの安定化剤はその種類により若干具なるが通常１
反応液中の濃度が１〜６０ｗｔ／ｖｏ１％となるように
添加され、グリセロールの場合は通常５０ｗｔように添
加さ九、グリセロールの場合は通常５０−Ｌ／ｖｏ１％
前後の濃度が好ましく用いられる。

アビジンとビオチン化タンパク質の反応は通常、室温で
行われ１反応時間は通常数十分乃至数時間、好ましくは
１時間前後である。またアビジンとビオチン化タンパク
質の混合割合はアビジン１モルに対し、通常ビオチン化
タンパク質０．１〜１０モル好ましくは１〜２モル、よ
り好ましくは１．５モル前後が用いられる。

本発明に係るアビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶
液は長期間安定に保存可能であり、しかも、使用したい
時にはそのまますぐに使用できる（用時調製の場合のよ
うに３０分間の熟成時間を要さない、、）。

本発明に係るアビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶
液を免疫組織染色、酵素免疫測定法、ウェスタンブロン
ティング、ハイブリドーマのスクリーニング等に使用す
ると、極めて高感度にこれを実施することができる。

即ち１本発明に係るアビジン−ビオチン化タンに使用す
れば操作は簡便で、感度も高く、試液の無駄もない。

以下に実施例により、本発明を更に詳細に述べるが、本
発明はこれらにより何等限定されるものではない。

［実施例コ実施例１．安定なストレフトアビジン−ビオチン化ペル
オキシダーゼ複合体溶液の調製グリセロールを５０ｗｔ／ｖｏ１％含有する０、１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　　９５＋ｎｌにストレフト
アビジン１ｍｇ及びビオチン化ペルオキシダーゼ１ｍｇ
を加えてよく攪拌し、室温下１時間静置した後、反応停
止剤のＺａｍｂｏｎｉ固定液５ＩＩＩＪを加えよく攪拌
して、ストレフトアビジン−ビオチン化ペルオキシダー
ゼ複合体溶液を得た。

尚、この時の複合体の分子量はＨＰＬＣより約２０万と
推定された。

実施例２．実施例１のストレフトアビジン−ビオチン化
ペルオキシダーゼ複合体溶液による組織抗原の染色（光
学顕微鏡観察による）（操作手原）１）組織を１０％ホルマリンで固定し、常法に従ってパ
ラフィン切片とした後、脱パラフィン、水洗、３％過酸
化水素水で１５分間インキュベートした。

２）　０．ＯＩＭリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ
と略記する。）にて５分間ずつ３回洗浄した。

３ン次に１０％正常ヤギ血清で室温１０分間反応させた
後、更に各種抗原に対応する２００倍に希釈したウサギ
抗体と室温で１時間反応させた。

４）５分間ずつ３回ＰＢＳ洗浄した後、ビオチン化抗ウ
サギ抗体で室温１０分間反応させた。

５）ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、実施例１でｍ
製したストレフトアビジン−ビオチン化ペルオキシダー
ゼ複合体溶液と室温１５分間反応させた。

６）ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、色素混合液で
５分間反応させ、然る後蒸留水で充分に洗浄した。

７）マイヤーへマドキシリン溶液で３分間後染色し、股
木、透徹、封入して光Ｍ試料とした。

（結果） ■　横紋筋の組織切片を試料としたものでは、Ｄ　ｅ　
ｓ　ｍ　ｉ　ｎが（＋）にでた。

■　胃癌の組織切片を試料としたものでは、ＨＭＡが（
＋）にでた６ ■　大腸癌の組織切片を試料としたものでは、ＣＥＡが
（＋）にでた。

■　リンパ節の組織切片を試料としたものでは、ＬＣＡ
が（＋）にでた。

尚、上記のから■のいずれの場合も特異性に優れ従来の
複合体による方法と相関し、且つ染色像も極めて鮮明で
あった。

尚、実施例１に於てＺａｍｂｏｎｉ固定液の代わりにＰ
ＬＰ固定液、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒ
ドを夫々反応停止剤として用いて得られたストレフトア
ビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を１本
実施例で用いた該複合体溶液の代わりに用いた場合も、
本実施例と全く同様の結果が得られた。

比較例１．従来法によるストレフトアビジン−ビオチン
化ペルオキシダーゼ複合体溶液の調製０、ＩＭリンＷＲ
緩衝液（ｐＨ６，０）　１００ｍ１にストレフトアビジ
ン１ｍｚ、ビオチン化ペルオキシダーゼｌｌｌ１ｇを混
合し室温に３０分間おき、熟成させた。

実施例３．実施例１と比較例１のストレフトアビジン−
ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液の保存安定性の
比較（ＥＬＩＳＡによる）（操作手順）１）抗原（ウサギＩｇＧ）を２０　μｇ＃＋１．２　μ
ｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０２　μｇ／ｍｌ、
０．００２　μｇ／ｍｌの各濃度に調製後、９６六マイ
クロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７
℃で１時間インキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０　（花王■登録商標）添加ＰＢＳ　（以下、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎと略記する。）で３回洗浄した。

２）１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ−Ｔすｅｅｎを
２００μｍ７％４ｅ１１ずつ分注し、３７°Ｃで１時間
インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔ％Ｊｅｅｎで３回洗
浄した。

３）ビオチン化抗ウサギＩｇＧをＰＢＳ４ｗｅｅｎで５
０倍希釈し１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で
１０分間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで
３回洗浄した。

４）実施例１又は比較例１で調製したストレフトアビジ
ン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を１００μ
ｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で５分間インキュベー
トした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎて３回洗浄した。

５）発色試液（ｏ−フェニレンジアミン、Ｈ２Ｏ。溶液
）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で３分間反
応させた。

６）６Ｎ硫酸を５０μｌ／ＩＩｅｌｌずつ分注し１発色
反応を停止させた。

７）分光光度計で０Ｄ４９□ｎｍ値を測定した。

（結果）表　　　１表１より明らかな如く、本発明に係る複合体溶液は４℃
で１年間保存しても、調製直後の複合体溶液とＥＬＩＳ
Ａの感度に差は認められなかった。これに対し、従来の
複合体溶液は４℃で１週間保存すると調製直後と比べて
著しい感度の低下が認められた。

尚、実施例１に於てＺａｍｂｏｎｉ固定液の代わりにＰ
ＬＰ固定液、パラホルムアルデヒド、り′ルタルアルデ
ヒドを夫々反応停止剤として用いて得られたストレフト
アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を、
実施例１で得られた該複合体溶液の代わりに用いた場合
も、実施例１で得られた複合体溶液の場合とほぼ同様の
結果が得られた。

［発明の効果］以上述べた如く１本発明の方法により得られたアビジン
−ビオチン化タンパク質複合体溶液は長期間安定に保存
可能であり、しかも随時使用可能なので、使用の都度調
製せずに済み、操作が簡便となり、経済的且つ効率的で
あり、斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。

手続補正書平成３年９月１１日１、事件の表示平成２年特許願第３０２６４５号２、発明の名称安定なアビジンービオチノ化タンパク質複合体溶液の製
造方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人郵便番号　５４１住所　大阪府大阪市中央区道修町三丁目１番２号６　純
正の内容（１）明細書７頁１行目１こＪ８載の「よう１こ添加さ
れ、グリセロールの場合１ま通常５０ｖＬｊを肖；１除
する。

〈２）明細書７頁２０行目１こＪ８載の［アビジン−ビ
オチン化タンｊのあと１こ、　「ノクク質複合体を各種
アビシノービオチン／ステム」を挿入−ｒる。

以　　上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アビジンとビオチン化タンパク質とを一定時間反
応させた後、反応停止剤を加えて反応を停止させること
を特徴とする安定なアビジン−ビオチン化タンパク質複
合体溶液の製造方法。
（２）安定化剤の存在下にアビジンとビオチン化タンパ
ク質とを反応させる請求項（１）に記載の製造方法。
（３）安定化剤がポリオール類である請求項（２）に記
載の製造方法。
（４）ポリオール類がグリセロールである請求項（３）
に記載の製造方法。
（５）ビオチン化タンパク質がビオチン化酵素である請
求項（１）〜（４）の何れかに記載の製造方法。
（６）ビオチン化酵素がビオチン化ペルオキシダーゼで
ある請求項（５）に記載の製造方法。
（７）アビジンがストレフトアビジンである請求項（１
）〜（６）の何れかに記載の製造方法。
（８）反応停止液がグルタルアルデヒド、パラホルムア
ルデヒド、Ｚａｍｂｏｎｉ固定液、又はＰＬＰ固定液で
ある請求項（１）〜（７）の何れかに記載の製造方法。
（９）請求項（１）に記載の製造方法により得られたア
ビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶液。