JPH05295000A - 共有結合的交雑種抗体、その調製法およびこれを使用する均質的免疫検定法 - Google Patents
共有結合的交雑種抗体、その調製法およびこれを使用する均質的免疫検定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 第１の半分子は第１の抗原に対する結合部位
を提供し、第２の半分子は第１の抗原に対して化学的に
異なる結合部位あるいは第２の抗原に対する結合部位を
提供し、かつ半分子が二硫化結合を介して互いに結合し
ている、本質的に２種類の異なる重い鎖−軽い鎖の半分
子からなる基本的に純粋な共有結合的交雑種抗体；Ｉｇ
Ｇ抗体の異質な半分子を選択的に再結合させることから
なるこれらの交雑種抗体の調整法；およびこれらの交雑
種抗体を使用する均質的免疫検定法。 【効果】 本発明の方法によれば、所望の共有結合的交
雑種抗体が高収率で生成され、また多くの場合精製する
必要がない。本発明の抗体は生体液中の大分子量の抗原
およびハプテンを測定するために用いることができ、特
に２種の異なる抗原の抗体による認識を必要とする免疫
検定法において有用である。本発明の免疫検定法は競合
的結合の均質的免疫検定法に比べて感度が良好である。
を提供し、第２の半分子は第１の抗原に対して化学的に
異なる結合部位あるいは第２の抗原に対する結合部位を
提供し、かつ半分子が二硫化結合を介して互いに結合し
ている、本質的に２種類の異なる重い鎖−軽い鎖の半分
子からなる基本的に純粋な共有結合的交雑種抗体；Ｉｇ
Ｇ抗体の異質な半分子を選択的に再結合させることから
なるこれらの交雑種抗体の調整法；およびこれらの交雑
種抗体を使用する均質的免疫検定法。 【効果】 本発明の方法によれば、所望の共有結合的交
雑種抗体が高収率で生成され、また多くの場合精製する
必要がない。本発明の抗体は生体液中の大分子量の抗原
およびハプテンを測定するために用いることができ、特
に２種の異なる抗原の抗体による認識を必要とする免疫
検定法において有用である。本発明の免疫検定法は競合
的結合の均質的免疫検定法に比べて感度が良好である。
Description
【０００１】本発明はＩｇＧ抗体の異質な半分子を選択
的に再結合させて共有結合的交雑種抗体を形成する方法
に関する。これらの抗体は生体液中の大分子量の抗原お
よびハプテン（結合質）を測定するために用いることが
できる。
的に再結合させて共有結合的交雑種抗体を形成する方法
に関する。これらの抗体は生体液中の大分子量の抗原お
よびハプテン（結合質）を測定するために用いることが
できる。
【０００２】交雑種抗体でＩｇＧに類別されるものは、
２種の抗原結合部位を有する異性両機能性の抗体で、そ
れぞれの結合部位は異なる免疫グロブリンに由来する。
通常２種の結合部位はそれぞれ異なる抗原を認識する
が、両種の結合部位が同じ抗原に結合することも可能
で、その他の特性例えば異形性においてのみ異なること
もあり得る。
２種の抗原結合部位を有する異性両機能性の抗体で、そ
れぞれの結合部位は異なる免疫グロブリンに由来する。
通常２種の結合部位はそれぞれ異なる抗原を認識する
が、両種の結合部位が同じ抗原に結合することも可能
で、その他の特性例えば異形性においてのみ異なること
もあり得る。
【０００３】交雑種抗体の合成は、２個の元来の免疫グ
ロブリン分子（Ｈ2Ｌ2）で抗原結合特異性の異なるもの
を還元的に分割して半分子（Ｈ1Ｌ1）となし（ただしＨ
は重い鎖、Ｌは軽い鎖を表す）、しかる後これら半分子
の混合物を再酸化することによって低い収量で達成され
た〔例えばHong氏その他「J. Biol. Chem.」第240巻第3
883頁(1965年)参照〕。この全く機会的な再酸化法は、
所望の交雑種抗体の理論的最高収率が５０％にとどまる
という点で不利を免れない。
ロブリン分子（Ｈ2Ｌ2）で抗原結合特異性の異なるもの
を還元的に分割して半分子（Ｈ1Ｌ1）となし（ただしＨ
は重い鎖、Ｌは軽い鎖を表す）、しかる後これら半分子
の混合物を再酸化することによって低い収量で達成され
た〔例えばHong氏その他「J. Biol. Chem.」第240巻第3
883頁(1965年)参照〕。この全く機会的な再酸化法は、
所望の交雑種抗体の理論的最高収率が５０％にとどまる
という点で不利を免れない。
【０００４】Luedtke氏その他〔「Biochemistry」第19巻
第1182頁(1980年)〕は、元来の免疫グロブリン分子との
混合物中における２種の免疫グロブリン半分子の再結合
の結果として交雑種抗体が産生することを記述してい
る。もとの免疫グロブリンのうちの１種類を除去した後
には、生じた免疫グロブリンの混合物は所望の交雑種抗
体を約４０％含有していた。所望の交雑種抗体を得るた
めにさらに精製する操作は行われなかった。
第1182頁(1980年)〕は、元来の免疫グロブリン分子との
混合物中における２種の免疫グロブリン半分子の再結合
の結果として交雑種抗体が産生することを記述してい
る。もとの免疫グロブリンのうちの１種類を除去した後
には、生じた免疫グロブリンの混合物は所望の交雑種抗
体を約４０％含有していた。所望の交雑種抗体を得るた
めにさらに精製する操作は行われなかった。
【０００５】免疫グロブリンの軽い鎖の異質的組み替え
によって二量体を形成することは、求核的置換反応〔Pe
abody氏その他「Biochemistry」第19巻第2827頁(1980年)
参照〕によって実施された。免疫グロブリンの軽い鎖
は、ある種の患者例えば多発性骨髄腫患者において異常
な高濃度に合成され、尿中に排出される。この種の試料
中の蛋白質を精製した結果、軽い鎖の二量体が得られ
た。１種類の軽い鎖の二量体の鎖の間の二硫化結合を亜
硫酸分解して二量体を分割したところチオ硫酸誘導体が
得られた。他の種類の軽い鎖の二量体は、鎖の間の二硫
化（ジスルフィッド）結合を還元することによって分割
され、それに対応する−ＳＨ化合物を生じた。これら２
種類の単量体が混在した場合には、求核的置換反応によ
って二硫化結合で結ばれた異質の軽い鎖の二量体が生じ
た。８０〜１００％の収率が報告された。これらの軽い
鎖の二量体は、１個の二硫化結合で共有結合的に結ば
れ、免疫的活性はない。他方において、天然の免疫グロ
ブリンは１個以上の二硫化結合を有し、重い鎖の間の二
硫化結合を特異的に分割して所望の半分子を得ることは
困難である。
によって二量体を形成することは、求核的置換反応〔Pe
abody氏その他「Biochemistry」第19巻第2827頁(1980年)
参照〕によって実施された。免疫グロブリンの軽い鎖
は、ある種の患者例えば多発性骨髄腫患者において異常
な高濃度に合成され、尿中に排出される。この種の試料
中の蛋白質を精製した結果、軽い鎖の二量体が得られ
た。１種類の軽い鎖の二量体の鎖の間の二硫化結合を亜
硫酸分解して二量体を分割したところチオ硫酸誘導体が
得られた。他の種類の軽い鎖の二量体は、鎖の間の二硫
化（ジスルフィッド）結合を還元することによって分割
され、それに対応する−ＳＨ化合物を生じた。これら２
種類の単量体が混在した場合には、求核的置換反応によ
って二硫化結合で結ばれた異質の軽い鎖の二量体が生じ
た。８０〜１００％の収率が報告された。これらの軽い
鎖の二量体は、１個の二硫化結合で共有結合的に結ば
れ、免疫的活性はない。他方において、天然の免疫グロ
ブリンは１個以上の二硫化結合を有し、重い鎖の間の二
硫化結合を特異的に分割して所望の半分子を得ることは
困難である。
【０００６】元来のＩｇＧ分子中の重い鎖の間の二硫化
結合を化学的手段によって還元しようとすれば、これに
伴って軽い鎖と重い鎖との間の二硫化結合も同時に還元
されることは不可避である〔Sears氏その他「Biochemis
try」第16巻第2031頁(1977年)参照〕。ＩｇＧを限定的に
蛋白分解してＦ(ａｂ′)２断片を生ずることが重い鎖の
間の結合を化学的処理に対して選択的に感受性を増すた
めに必要と考えられてきた〔Bobrzecka氏その他「Immun
ology Letters」第２巻第15頁(1980年)参照〕。このよう
な限定的蛋白分解からは、その後にクロマトグラフ法に
よる精製を要するような混合産物を生ずる。
結合を化学的手段によって還元しようとすれば、これに
伴って軽い鎖と重い鎖との間の二硫化結合も同時に還元
されることは不可避である〔Sears氏その他「Biochemis
try」第16巻第2031頁(1977年)参照〕。ＩｇＧを限定的に
蛋白分解してＦ(ａｂ′)２断片を生ずることが重い鎖の
間の結合を化学的処理に対して選択的に感受性を増すた
めに必要と考えられてきた〔Bobrzecka氏その他「Immun
ology Letters」第２巻第15頁(1980年)参照〕。このよう
な限定的蛋白分解からは、その後にクロマトグラフ法に
よる精製を要するような混合産物を生ずる。
【０００７】Rivat氏その他〔「Eur. J. Immunol.」第3巻
第537頁(1973年)〕は、免疫グロブリンの重い鎖の間の
二硫化結合を電気化学的手段を用いて還元して遊離の−
ＳＨ基を有する半分子を生成する操作を記述している。
しかしながら、これらの半分子は自動的な再酸化ならび
に同質的再結合を起こすので分離することができない。
これらの半分子の分析にアルキル化法が用いられたが、
この反応さえも窒素雰囲気中で実施せねばならなかっ
た。
第537頁(1973年)〕は、免疫グロブリンの重い鎖の間の
二硫化結合を電気化学的手段を用いて還元して遊離の−
ＳＨ基を有する半分子を生成する操作を記述している。
しかしながら、これらの半分子は自動的な再酸化ならび
に同質的再結合を起こすので分離することができない。
これらの半分子の分析にアルキル化法が用いられたが、
この反応さえも窒素雰囲気中で実施せねばならなかっ
た。
【０００８】競合的結合免疫検定法は、液体培地中に存
在する免疫反応物を定性的または定量的に検定するため
に広く用いられている。このような検定法の一つのタイ
プで均質的免疫検定法と称せられるものは、免疫反応物
−指示剤結合体と作用して指示剤を測定可能な態様に変
えるような特異的な免疫反応物受容体を利用している。
この指示剤は通常１種の酵素である。
在する免疫反応物を定性的または定量的に検定するため
に広く用いられている。このような検定法の一つのタイ
プで均質的免疫検定法と称せられるものは、免疫反応物
−指示剤結合体と作用して指示剤を測定可能な態様に変
えるような特異的な免疫反応物受容体を利用している。
この指示剤は通常１種の酵素である。
【０００９】Rubenstein氏その他による米国特許第3,81
7,837号(1974年6月18日)明細書には、標識剤−免疫反応
物結合体中の指示剤標識が抗体の免疫反応物への結合に
よって変調される均質的競合的免疫検定法を開示してい
る。
7,837号(1974年6月18日)明細書には、標識剤−免疫反応
物結合体中の指示剤標識が抗体の免疫反応物への結合に
よって変調される均質的競合的免疫検定法を開示してい
る。
【００１０】Rubenstein氏その他による米国特許第3,93
5,074号(1976年1月27日)明細書は、2個の附着部位を有
し、そのうち１個は対象となる免疫反応物と共通で他の
１個は免疫反応物と異質（指示剤標識）であるような反
応剤を用いる方法を開示している。附着部位に２個の抗
体が同時に結合することは立体配置的に妨げられてい
る。指示剤標識部位に結合されあるいは結合されない抗
体を測定することが未知の試料中の免疫反応物の量を知
る方法となる。
5,074号(1976年1月27日)明細書は、2個の附着部位を有
し、そのうち１個は対象となる免疫反応物と共通で他の
１個は免疫反応物と異質（指示剤標識）であるような反
応剤を用いる方法を開示している。附着部位に２個の抗
体が同時に結合することは立体配置的に妨げられてい
る。指示剤標識部位に結合されあるいは結合されない抗
体を測定することが未知の試料中の免疫反応物の量を知
る方法となる。
【００１１】Hammerling氏その他〔「J. Exp. Med」第128
巻第146頁(1968年)〕は、二硫化結合で結ばれた２個の
Ｆａｂ′断片よりなる抗体を用いての細胞表面の電子顕
微鏡的観察を開示している。１個のＦａｂ′断片は細胞
表面の抗原に対して特異的であり、他の１個のＦａｂ′
断片は電子顕微鏡によって認められる標識体に対して特
異的である。この検定方法は可溶性の抗原に対して一般
的に適用することはできず、精巧な装置を必要とする。
巻第146頁(1968年)〕は、二硫化結合で結ばれた２個の
Ｆａｂ′断片よりなる抗体を用いての細胞表面の電子顕
微鏡的観察を開示している。１個のＦａｂ′断片は細胞
表面の抗原に対して特異的であり、他の１個のＦａｂ′
断片は電子顕微鏡によって認められる標識体に対して特
異的である。この検定方法は可溶性の抗原に対して一般
的に適用することはできず、精巧な装置を必要とする。
【００１２】１９８１年８月１９日に公布された欧州特
許出願第034,050号明細書は抗原結合部位と標識体結合
部位とを含む混合結合試薬で、２箇所の部位は位置が空
間的に離れているために抗原−標識体結合物の単一分子
は両方の結合部位に結合することができないものを利用
する抗原およびハプテンに対する均質的免疫検定法を開
示している。標識体は、その活性が、混合結合試薬の標
識体結合部位への結合に際して変化するものが好まし
い。標識体活性の測定値が液体試料中の抗原の量を示す
こととなる。混合結合試薬は、２個の異なる原形のまま
の免疫グロブリン分子が互いに結合して一体の試薬複合
体を形成したものよりなる。
許出願第034,050号明細書は抗原結合部位と標識体結合
部位とを含む混合結合試薬で、２箇所の部位は位置が空
間的に離れているために抗原−標識体結合物の単一分子
は両方の結合部位に結合することができないものを利用
する抗原およびハプテンに対する均質的免疫検定法を開
示している。標識体は、その活性が、混合結合試薬の標
識体結合部位への結合に際して変化するものが好まし
い。標識体活性の測定値が液体試料中の抗原の量を示す
こととなる。混合結合試薬は、２個の異なる原形のまま
の免疫グロブリン分子が互いに結合して一体の試薬複合
体を形成したものよりなる。
【００１３】原形のままのＩｇＧからＩｇＧの半分子を
製造するための効率のよい方法が必要とされている。ま
たそのような半分子から共有結合的交雑種抗体を合成す
るための実用的な方法も必要とされている。可溶性の抗
原に対する均質的免疫検定法において、共有結合的交雑
種抗体を用いることの有利性は明らかである。
製造するための効率のよい方法が必要とされている。ま
たそのような半分子から共有結合的交雑種抗体を合成す
るための実用的な方法も必要とされている。可溶性の抗
原に対する均質的免疫検定法において、共有結合的交雑
種抗体を用いることの有利性は明らかである。
【００１４】本発明の半分子は、本質的に純粋な重鎖−
軽鎖の免疫グロブリン半分子で、Ｒ−Ｓ−Ｘの構造（た
だし式中ＲはＨ1Ｌ1でありそしてＸは水素原子(Ｈ)ある
いはＳＯ3である）を有するものである。これらの半分
子は、亜硫酸分解あるいは重い鎖の間の二硫化結合を還
元することによって免疫グロブリン分子を重鎖−軽鎖の
半分子へ選択的に分割することによって調製される。
軽鎖の免疫グロブリン半分子で、Ｒ−Ｓ−Ｘの構造（た
だし式中ＲはＨ1Ｌ1でありそしてＸは水素原子(Ｈ)ある
いはＳＯ3である）を有するものである。これらの半分
子は、亜硫酸分解あるいは重い鎖の間の二硫化結合を還
元することによって免疫グロブリン分子を重鎖−軽鎖の
半分子へ選択的に分割することによって調製される。
【００１５】本発明の抗体は、実質的に純粋な共有結合
的交雑種抗体で、２種類の異なる重鎖−軽鎖の半分子よ
り本質的になり、半分子中の一方は第１の抗原に対する
結合部位を提供し、他方は第１あるいは第２の抗原に対
する化学的に異なる結合部位を提供するものであり、ま
た半分子は二硫化結合を通じて互いに結合されているも
のである。これらの抗体は、下記すなわち (Ａ) 第１の抗原に対する抗体である免疫グロブリン分
子を、重い鎖の間の二硫化結合を加亜硫酸分解（sulfit
olysis）することによって重鎖−軽鎖の半分子へ選択的
に分割してＳ−スルホン化された半分子を生成するこ
と、(Ｂ) 第１の抗原または第２の抗原に対する抗体で
ある第２の免疫グロブリン分子と重い鎖の間の二硫化結
合を還元することによつて重鎖−軽鎖の半分子へ選択的
に分割して還元型の半分子を生成すること、(Ｃ) 前記
工程（Ａ）から得られたＳ−スルホン化された半分子を
前記工程（Ｂ）から得た還元された半分子と合体させる
ことの諸工程によって調製される。
的交雑種抗体で、２種類の異なる重鎖−軽鎖の半分子よ
り本質的になり、半分子中の一方は第１の抗原に対する
結合部位を提供し、他方は第１あるいは第２の抗原に対
する化学的に異なる結合部位を提供するものであり、ま
た半分子は二硫化結合を通じて互いに結合されているも
のである。これらの抗体は、下記すなわち (Ａ) 第１の抗原に対する抗体である免疫グロブリン分
子を、重い鎖の間の二硫化結合を加亜硫酸分解（sulfit
olysis）することによって重鎖−軽鎖の半分子へ選択的
に分割してＳ−スルホン化された半分子を生成するこ
と、(Ｂ) 第１の抗原または第２の抗原に対する抗体で
ある第２の免疫グロブリン分子と重い鎖の間の二硫化結
合を還元することによつて重鎖−軽鎖の半分子へ選択的
に分割して還元型の半分子を生成すること、(Ｃ) 前記
工程（Ａ）から得られたＳ−スルホン化された半分子を
前記工程（Ｂ）から得た還元された半分子と合体させる
ことの諸工程によって調製される。
【００１６】各種の分析対象物（アナライト）を測定す
るための本発明による均質的免疫検定法は、下記の構成
分すなわち (Ａ) 第１の半分子は第１の抗原に対する結合部位を提
供し、第２の半分子は第１の抗原に対して化学的に異な
る結合部位または第２の抗原に対する結合部位を提供
し、かつここに云う半分子が二硫化結合を介して相互に
結合している２種類の異なる重鎖−軽鎖の半分子から本
質的になる実質上純粋な共有結合的交雑種抗体、(Ｂ)
分析対象物を含む生物学的試料、(Ｃ) 指示剤、および
(Ｄ) 信号を発生する反応のための試薬逐次的あるいは
同時的にインキュベートする操作よりなる。
るための本発明による均質的免疫検定法は、下記の構成
分すなわち (Ａ) 第１の半分子は第１の抗原に対する結合部位を提
供し、第２の半分子は第１の抗原に対して化学的に異な
る結合部位または第２の抗原に対する結合部位を提供
し、かつここに云う半分子が二硫化結合を介して相互に
結合している２種類の異なる重鎖−軽鎖の半分子から本
質的になる実質上純粋な共有結合的交雑種抗体、(Ｂ)
分析対象物を含む生物学的試料、(Ｃ) 指示剤、および
(Ｄ) 信号を発生する反応のための試薬逐次的あるいは
同時的にインキュベートする操作よりなる。
【００１７】本発明の方法は、原形のままのＩｇＧ中の
重い鎖の間の二硫化結合を選択的に分割して重鎖−軽鎖
の半分子（Ｈ1Ｌ1）を生成し、かつまたかくして得た異
質の半分子を秩序よく合体させて共有結合的交雑種抗体
（Ｈ1 aＬ1 aＨ1 bＬ1 b）を生じさせるための数種類の異な
る方式を包含する。交雑種抗体の異質な両半部は二硫化
結合によって一緒にされている。この方法は所望の産物
を高い収率で生成し、また多くの場合精製を要しない。
２種類の半分子は、化学的に異なる２ケ所の結合部位を
提供しそれらは２種類の異なる抗原に対することもあ
り、あるいは同じ抗原に対してではあるが抗原上の異な
る位置において結合する場合もある。
重い鎖の間の二硫化結合を選択的に分割して重鎖−軽鎖
の半分子（Ｈ1Ｌ1）を生成し、かつまたかくして得た異
質の半分子を秩序よく合体させて共有結合的交雑種抗体
（Ｈ1 aＬ1 aＨ1 bＬ1 b）を生じさせるための数種類の異な
る方式を包含する。交雑種抗体の異質な両半部は二硫化
結合によって一緒にされている。この方法は所望の産物
を高い収率で生成し、また多くの場合精製を要しない。
２種類の半分子は、化学的に異なる２ケ所の結合部位を
提供しそれらは２種類の異なる抗原に対することもあ
り、あるいは同じ抗原に対してではあるが抗原上の異な
る位置において結合する場合もある。
【００１８】本発明の方法は多段工程よりなる操作であ
る。方法中の最初の工程は２種の異なる原形のままのＩ
ｇＧ分子中の二硫化結合を選択的に分割することであ
る。単クローン系の抗体を用いることも意図されてい
る。元来のＩｇＧ分子から生じた半分子は、次に異質な
半分子間の二硫化結合の形成を助長するように組み合わ
される。
る。方法中の最初の工程は２種の異なる原形のままのＩ
ｇＧ分子中の二硫化結合を選択的に分割することであ
る。単クローン系の抗体を用いることも意図されてい
る。元来のＩｇＧ分子から生じた半分子は、次に異質な
半分子間の二硫化結合の形成を助長するように組み合わ
される。
【００１９】重い鎖の間の結合を選択的に分割すること
とＩｇＧの半分子を製造することはいくつかの方法によ
って達成される。一方的においては、原形のままのＩｇ
Ｇを５,５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）の存
在下で、好ましくは緩衝媒体中で室温において窒素下
に、亜硫酸ナトリウムで加亜硫酸分解してＳ−スルホン
化されたＩｇＧの半分子を得る。交雑種形成反応に用い
うる２種類のＩｇＧ半分子のうちの一方はこのようにし
てＳ−スルホン化される。
とＩｇＧの半分子を製造することはいくつかの方法によ
って達成される。一方的においては、原形のままのＩｇ
Ｇを５,５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）の存
在下で、好ましくは緩衝媒体中で室温において窒素下
に、亜硫酸ナトリウムで加亜硫酸分解してＳ−スルホン
化されたＩｇＧの半分子を得る。交雑種形成反応に用い
うる２種類のＩｇＧ半分子のうちの一方はこのようにし
てＳ−スルホン化される。
【００２０】第２の方法においては、上記のようにして
形成されたＩｇＧ半分子をジチオスレイトール、β−メ
ルカプトエタノールおよびβ−メルカプトエチルアミン
のようなチオール基含有試薬と好ましくは塩化ストロン
チウムを含む緩衝媒体中で窒素下に反応せしめる。しか
る後に、この反応の蛋白質産物はゲル濾過または透析に
よってチオール試薬から分離される。この反応の蛋白質
産物は遊離のスルフヒドリル基を担持するＩｇＧの還元
された半分子である。
形成されたＩｇＧ半分子をジチオスレイトール、β−メ
ルカプトエタノールおよびβ−メルカプトエチルアミン
のようなチオール基含有試薬と好ましくは塩化ストロン
チウムを含む緩衝媒体中で窒素下に反応せしめる。しか
る後に、この反応の蛋白質産物はゲル濾過または透析に
よってチオール試薬から分離される。この反応の蛋白質
産物は遊離のスルフヒドリル基を担持するＩｇＧの還元
された半分子である。
【００２１】第３の方法においては、原形のままのＩｇ
Ｇは最初に適当な支持体（例えばアガロースビーズ）に
共有結合的に結合された例えばプロテインＡまたは抗原
のような受容体に結合せしめられる。次にジチオスレイ
トールまたはβ−メルカプトエタノールのようなチオー
ル基含有試薬を結合状態のＩｇＧと（室温、緩衝媒体
中、窒素下で）反応させる。その結果生ずる遊離のスル
フヒドリル基を有する結合状態のＩｇＧ半分子は、高い
塩濃度で低いpHの緩衝液を用いて支持体から分離させ、
そして同じ緩衝液に対して透析してチオール試薬を除去
することができる。
Ｇは最初に適当な支持体（例えばアガロースビーズ）に
共有結合的に結合された例えばプロテインＡまたは抗原
のような受容体に結合せしめられる。次にジチオスレイ
トールまたはβ−メルカプトエタノールのようなチオー
ル基含有試薬を結合状態のＩｇＧと（室温、緩衝媒体
中、窒素下で）反応させる。その結果生ずる遊離のスル
フヒドリル基を有する結合状態のＩｇＧ半分子は、高い
塩濃度で低いpHの緩衝液を用いて支持体から分離させ、
そして同じ緩衝液に対して透析してチオール試薬を除去
することができる。
【００２２】交雑体形成反応に用いうるＩｇＧの２種類
の半分子のうち第２のものは、上述の方法のうちの一方
法によって調製される遊離のスルフヒドリル基を含有す
る半分子である。
の半分子のうち第２のものは、上述の方法のうちの一方
法によって調製される遊離のスルフヒドリル基を含有す
る半分子である。
【００２３】異なる抗原結合特異性を有する交雑種抗体
を生成するためのＩｇＧ分子の秩序ある交雑は、種々の
操作によって達成される。一つの操作法においては、第
１の種類のＩｇＧから上述の加亜硫酸分解によってＳ−
スルホン化された半分子が誘導される。蛋白質産物（免
疫グロブリンの半分子）は、その他の加亜硫酸分解反応
産物から窒素ガスを室温で通気されている適宜の緩衝液
に対して透析することによって分離できる。チオール試
薬（もしそれが存在するときには）の除去は、ゲル濾過
あるいは例えばエチレンジアミンテトラ酢酸を含む完全
にガスを除き且つ窒素を通気するpH５の緩衝液中におけ
る透析によって蛋白質の再酸化を起こすことなく達成さ
れる。これらの方法によって生成された２種類の異なる
半分子の集団を等しいモル比の量に組み合わせ、嫌気的
条件下で適宜の緩衝液（塩化ストロンチウムまたはそれ
以外のアルカリ土金属塩を含む）中で透析する。下記の
求核的置換反応によって異質な両半部が二硫化結合によ
って連結されている所望の交雑種抗体産物を生ずる。す
なわち Ｒ−Ｓ−ＳＯ3 -＋Ｒ′−ＳＨ → Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ′＋Ｈ
ＳＯ3 - ただし式中ＲはＨ1 aＬ1 aを表し、そしてＲ′はＨ1 bＬ1 b
を表す。
を生成するためのＩｇＧ分子の秩序ある交雑は、種々の
操作によって達成される。一つの操作法においては、第
１の種類のＩｇＧから上述の加亜硫酸分解によってＳ−
スルホン化された半分子が誘導される。蛋白質産物（免
疫グロブリンの半分子）は、その他の加亜硫酸分解反応
産物から窒素ガスを室温で通気されている適宜の緩衝液
に対して透析することによって分離できる。チオール試
薬（もしそれが存在するときには）の除去は、ゲル濾過
あるいは例えばエチレンジアミンテトラ酢酸を含む完全
にガスを除き且つ窒素を通気するpH５の緩衝液中におけ
る透析によって蛋白質の再酸化を起こすことなく達成さ
れる。これらの方法によって生成された２種類の異なる
半分子の集団を等しいモル比の量に組み合わせ、嫌気的
条件下で適宜の緩衝液（塩化ストロンチウムまたはそれ
以外のアルカリ土金属塩を含む）中で透析する。下記の
求核的置換反応によって異質な両半部が二硫化結合によ
って連結されている所望の交雑種抗体産物を生ずる。す
なわち Ｒ−Ｓ−ＳＯ3 -＋Ｒ′−ＳＨ → Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ′＋Ｈ
ＳＯ3 - ただし式中ＲはＨ1 aＬ1 aを表し、そしてＲ′はＨ1 bＬ1 b
を表す。
【００２４】交雑の他の一操作法においては、上述のよ
うに第１のＩｇＧからＳ−スルホン化された半分子を誘
導する。。上述の重い鎖の間の結合を選択的に分割する
第３の方法によって第２のＩｇＧからスルフヒドリル基
を含む半分子を誘導する。しかしながら結合状態のＩｇ
Ｇ半分子は、それらが結合されていた支持体（抗原で被
覆されたビーズあるいはセファロースゲル上に固定化さ
れたプロテインＡなど）から溶離されない。その代わり
に、支持体は適宜の緩衝液に懸濁し、しかる後に遠心分
離することにより洗浄されてチオール試薬を除去する。
次に第１のＩｇＧのＳ−スルホン化された半分子を塩化
ストロンチウムを含む適宜の緩衝液中で第２のＩｇＧの
結合状態にあるスルフヒドリル含有半分子を加え、室温
で不活性気相下で保温（インキュベート）する。かくし
て求核性置換反応により支持体上で形成された交雑種抗
原は適宜の添加物（例えば高濃度の塩類または界面活性
剤）を含む緩衝液を用いて溶離することができる。
うに第１のＩｇＧからＳ−スルホン化された半分子を誘
導する。。上述の重い鎖の間の結合を選択的に分割する
第３の方法によって第２のＩｇＧからスルフヒドリル基
を含む半分子を誘導する。しかしながら結合状態のＩｇ
Ｇ半分子は、それらが結合されていた支持体（抗原で被
覆されたビーズあるいはセファロースゲル上に固定化さ
れたプロテインＡなど）から溶離されない。その代わり
に、支持体は適宜の緩衝液に懸濁し、しかる後に遠心分
離することにより洗浄されてチオール試薬を除去する。
次に第１のＩｇＧのＳ−スルホン化された半分子を塩化
ストロンチウムを含む適宜の緩衝液中で第２のＩｇＧの
結合状態にあるスルフヒドリル含有半分子を加え、室温
で不活性気相下で保温（インキュベート）する。かくし
て求核性置換反応により支持体上で形成された交雑種抗
原は適宜の添加物（例えば高濃度の塩類または界面活性
剤）を含む緩衝液を用いて溶離することができる。
【００２５】選択的分割のそれぞれの方法ならびに交雑
操作からの反応産物は下記の操作を用いて分析すること
ができる。
操作からの反応産物は下記の操作を用いて分析すること
ができる。
【００２６】非還元的条件下におけるドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）は、未知の蛋白質またはポリペプチドの電
気泳動的易動度を既知の蛋白質と比較して未知物質の分
子量を推定するために用いられる。この方法によれば、
反応混合液中における個々の重い鎖または軽い鎖ならび
にＩｇＧの半分子または完全分子の存在を決定すること
が可能になる。
リウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）は、未知の蛋白質またはポリペプチドの電
気泳動的易動度を既知の蛋白質と比較して未知物質の分
子量を推定するために用いられる。この方法によれば、
反応混合液中における個々の重い鎖または軽い鎖ならび
にＩｇＧの半分子または完全分子の存在を決定すること
が可能になる。
【００２７】ポリアクリルアミドゲルにおける等電点決
定法は、等電pH（すなわち特定の溶媒中で蛋白質が正味
の電荷ゼロとなるpH）の差を基礎として蛋白質を分離す
るために用いることができる。元来の抗体のどちらとも
異なる交雑種抗体の存在は、この手法によって決定する
ことができる。この手法はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法よりも判
別能が高い。
定法は、等電pH（すなわち特定の溶媒中で蛋白質が正味
の電荷ゼロとなるpH）の差を基礎として蛋白質を分離す
るために用いることができる。元来の抗体のどちらとも
異なる交雑種抗体の存在は、この手法によって決定する
ことができる。この手法はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法よりも判
別能が高い。
【００２８】寒天ゲル中における二重拡散法は、抗体に
よる抗原結合を検出する方法を提供する。ゲル中の別々
の凹みに入れられた抗原と抗体は互いに相手に向かって
拡散する。抗原が抗体によって結合されると沈澱物（不
溶性の抗原−抗体複合体）が凹みの中間に線となって生
じて視認される。２価の抗体のみがそれの抗原との間で
沈澱物を生ずる。交雑種抗体は、それぞれの抗原に関し
ては１価であるから、どちらの抗原との間にも沈澱物を
生じない。
よる抗原結合を検出する方法を提供する。ゲル中の別々
の凹みに入れられた抗原と抗体は互いに相手に向かって
拡散する。抗原が抗体によって結合されると沈澱物（不
溶性の抗原−抗体複合体）が凹みの中間に線となって生
じて視認される。２価の抗体のみがそれの抗原との間で
沈澱物を生ずる。交雑種抗体は、それぞれの抗原に関し
ては１価であるから、どちらの抗原との間にも沈澱物を
生じない。
【００２９】本発明の方法により調製した交雑種抗体
は、２種の異なる抗原の抗体による認識を必要とする免
疫検定法にとって有用である。特にこれらの抗体は、共
有結合的交雑種抗体に第１の抗原が結合するとそれが交
雑種抗体に対する第２の抗原の結合を変調させうる場合
に有用である。第１の抗原とは関心のある分析対象物で
あり、そして第２の抗原とは交雑種抗体に結合したとき
にその活性度が変調される酵素のごとき指示剤をいう。
は、２種の異なる抗原の抗体による認識を必要とする免
疫検定法にとって有用である。特にこれらの抗体は、共
有結合的交雑種抗体に第１の抗原が結合するとそれが交
雑種抗体に対する第２の抗原の結合を変調させうる場合
に有用である。第１の抗原とは関心のある分析対象物で
あり、そして第２の抗原とは交雑種抗体に結合したとき
にその活性度が変調される酵素のごとき指示剤をいう。
【００３０】生物学的試料中の分析対象物とは、その濃
度を測定することが望まれる物質をいう。生物学的試料
とは、全血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿、
あるいは細胞および組織の抽出液でありうる。
度を測定することが望まれる物質をいう。生物学的試料
とは、全血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿、
あるいは細胞および組織の抽出液でありうる。
【００３１】分析対象物は多くの場合これらの生物試料
液中に存在する蛋白質であるが、薬剤、ホルモン、ビタ
ミン、酵素、抗体、多糖質、細菌、原生動物、真菌、ウ
ィールス、細胞および組織の抗原、その他血液細胞また
は血液の液体部分中の物質もこれに含まれる。
液中に存在する蛋白質であるが、薬剤、ホルモン、ビタ
ミン、酵素、抗体、多糖質、細菌、原生動物、真菌、ウ
ィールス、細胞および組織の抗原、その他血液細胞また
は血液の液体部分中の物質もこれに含まれる。
【００３２】本発明による免疫検定法の第１の観点にお
いては、指示剤は交雑種抗体に結合したときにその活性
度が変調される酵素である。特異的なβ−ガラクトシダ
ーゼは、本発明による免疫検定法に用いるのに望ましい
酵素である。この酵素は抗体変調酵素断片（ＡＭＥＦ）
突然変異体として知られている大腸菌のＷ６１０１ｌａ
ｃ ｚ-菌株から単離される。野生型のβ−ガラクトシダ
ーゼに対する抗体は、この突然変異体の酵素を特異的に
活性化しうる。この変調はまた１価の抗体断片（Ｆａ
ｂ）により、そして従って交雑種抗体の１ケ所の結合部
位に結合することによって起こりうる。抗体と結合した
ときにその活性度が変調されるその他の使用可能な指示
剤酵素にはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ペニシ
リナーゼ、グルコースオキシダーゼおよび人間の前立腺
酸性ホスファターゼが含まれる。本発明による免疫検定
法においては、他の非酵素的指示剤すなわち蛍光性原子
団、放射能物質および生物発光または化学発光物質も機
能を発揮することができる。変調は通常指示剤活性の助
長という形で現れるが、不活性化という場合もありう
る。
いては、指示剤は交雑種抗体に結合したときにその活性
度が変調される酵素である。特異的なβ−ガラクトシダ
ーゼは、本発明による免疫検定法に用いるのに望ましい
酵素である。この酵素は抗体変調酵素断片（ＡＭＥＦ）
突然変異体として知られている大腸菌のＷ６１０１ｌａ
ｃ ｚ-菌株から単離される。野生型のβ−ガラクトシダ
ーゼに対する抗体は、この突然変異体の酵素を特異的に
活性化しうる。この変調はまた１価の抗体断片（Ｆａ
ｂ）により、そして従って交雑種抗体の１ケ所の結合部
位に結合することによって起こりうる。抗体と結合した
ときにその活性度が変調されるその他の使用可能な指示
剤酵素にはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ペニシ
リナーゼ、グルコースオキシダーゼおよび人間の前立腺
酸性ホスファターゼが含まれる。本発明による免疫検定
法においては、他の非酵素的指示剤すなわち蛍光性原子
団、放射能物質および生物発光または化学発光物質も機
能を発揮することができる。変調は通常指示剤活性の助
長という形で現れるが、不活性化という場合もありう
る。
【００３３】分析対象物がそれに特異的な結合部位に結
合すると、交雑種抗体上で指示剤に特異的な結合部位へ
の指示剤の結合が阻害される。かくして分析対象物の結
合部位が充満されたときには指示剤の活性度は変調され
ないので、検定の終結時に測定される指示剤の活性度は
生体液中にある分析対象物の濃度に比例する。
合すると、交雑種抗体上で指示剤に特異的な結合部位へ
の指示剤の結合が阻害される。かくして分析対象物の結
合部位が充満されたときには指示剤の活性度は変調され
ないので、検定の終結時に測定される指示剤の活性度は
生体液中にある分析対象物の濃度に比例する。
【００３４】本発明による免疫検定法は競合的結合の均
質的免疫検定法に比べて感度が良好である。それは１個
の分析対象物分子が交雑種抗体に結合すれば指示剤の活
性度を実質上完全に変調させる、すなわち直接的免疫検
定法となるからである。従来慣用の検定法においては、
１個以上の分析対象物分子が２価の抗体に結合し、指示
剤または標識剤の活性度は１個の分析対象物の分子が抗
体に結合しても必ずしも完全に変調されるとはいえな
い。
質的免疫検定法に比べて感度が良好である。それは１個
の分析対象物分子が交雑種抗体に結合すれば指示剤の活
性度を実質上完全に変調させる、すなわち直接的免疫検
定法となるからである。従来慣用の検定法においては、
１個以上の分析対象物分子が２価の抗体に結合し、指示
剤または標識剤の活性度は１個の分析対象物の分子が抗
体に結合しても必ずしも完全に変調されるとはいえな
い。
【００３５】ある種の状況下では、問題の分析対象物の
分子は酵素指示剤が共有結合的交雑種抗体に結合するこ
とを妨げるに充分なほど大きくない。これらの場合に
は、（既知濃度の）分析対象物の複合体を本発明の方法
に用いることができる。分析対象物複合体と遊離の分析
対象物は交雑種抗体への結合において競合する。分析対
象物複合体の結合は立体配置的またはイオン的に酵素指
示剤の結合を阻害し、かくしてその活性度の変調を妨げ
る。このような分析対象物複合体とは、分析対象物が大
分子量の担体蛋白質と共有結合したものでもよく、また
ラテックス粒子と結合したものでもよい。
分子は酵素指示剤が共有結合的交雑種抗体に結合するこ
とを妨げるに充分なほど大きくない。これらの場合に
は、（既知濃度の）分析対象物の複合体を本発明の方法
に用いることができる。分析対象物複合体と遊離の分析
対象物は交雑種抗体への結合において競合する。分析対
象物複合体の結合は立体配置的またはイオン的に酵素指
示剤の結合を阻害し、かくしてその活性度の変調を妨げ
る。このような分析対象物複合体とは、分析対象物が大
分子量の担体蛋白質と共有結合したものでもよく、また
ラテックス粒子と結合したものでもよい。
【００３６】任意的に交雑種抗体を修飾することもでき
る。例えばグルタルアルデヒド交叉結合によって蝶番
（ヒンジ）部分の弾力性を低下させれば、その結果酵素
指示剤の結合を立体配置的に妨げるために大きな分析対
象物を必要とすることはなくなる。
る。例えばグルタルアルデヒド交叉結合によって蝶番
（ヒンジ）部分の弾力性を低下させれば、その結果酵素
指示剤の結合を立体配置的に妨げるために大きな分析対
象物を必要とすることはなくなる。
【００３７】本発明の均質的交雑種抗体免疫検定法を実
施するには、交雑種抗体と酵素指示剤と未知量の分析対
象物を含む生体液とを混合して保温する。酵素指示剤の
変調された活性度を決定するための酵素検出試薬はその
後で加えればよい。場合によっては最初の混合および保
温段階で低分子の分析対象物を測定するために分析対象
物複合体を利用してもよい。また場合により交雑種抗体
を生体液と共に予め加温してしかる後に酵素指示剤を加
えてもよい。
施するには、交雑種抗体と酵素指示剤と未知量の分析対
象物を含む生体液とを混合して保温する。酵素指示剤の
変調された活性度を決定するための酵素検出試薬はその
後で加えればよい。場合によっては最初の混合および保
温段階で低分子の分析対象物を測定するために分析対象
物複合体を利用してもよい。また場合により交雑種抗体
を生体液と共に予め加温してしかる後に酵素指示剤を加
えてもよい。
【００３８】酵素指示剤を検出するための試薬は使用さ
れる酵素指示剤の種類によって決められる。これらの検
出試薬は、酵素指示剤に特異的な発色性または発蛍光性
の基質であることが好ましい。酵素の活性度を測定する
ための他の手段例えば電気化学的方法も本発明の方法に
用いることができる。
れる酵素指示剤の種類によって決められる。これらの検
出試薬は、酵素指示剤に特異的な発色性または発蛍光性
の基質であることが好ましい。酵素の活性度を測定する
ための他の手段例えば電気化学的方法も本発明の方法に
用いることができる。
【００３９】発色性の基質が酵素的に分解されて生ずる
色の測定値は、変調された酵素指示剤の活性度に比例す
る。従ってこの活性度は生体液中に存在する分析対象物
の量の函数である。このことから、既知濃度の分析対象
物を含む試料の一系列に対して免疫検定法を実施するこ
とによって生体液中の未知濃度の分析対象物を定量する
ことができる。
色の測定値は、変調された酵素指示剤の活性度に比例す
る。従ってこの活性度は生体液中に存在する分析対象物
の量の函数である。このことから、既知濃度の分析対象
物を含む試料の一系列に対して免疫検定法を実施するこ
とによって生体液中の未知濃度の分析対象物を定量する
ことができる。
【００４０】第２の観点において、本発明の免疫検定法
は分析対象物に特異的な１個の結合部位と酵素指示剤に
特異的な別の１個の結合部位とを有する共有結合的交雑
種抗体を用いるものである。しかしながらこの場合にお
いては、酵素指示剤の活性度は必ずしも交雑種抗体に結
合すると同時に変調されなくてもよい。交雑種抗体は、
酵素指示剤と酵素−分析対象物複合体とを空間配置上で
接近させる機能をはたす。酵素指示剤と酵素−分析対象
物複合体中の第２の異なる酵素とは、一方の酵素により
触媒される反応の産物が他方の酵素の基質となるように
選定することが好ましい。かようにして両方の酵素が空
間配置上で極めて近接（１５０Å）して交雑種抗体に結
合すれば、最終産物生成の速度が増大することが観察さ
れる。この際２種類の酵素のうちの一方は交雑種抗体に
直接結合するのでなく、複合体を形成している相手の分
析対象物を介して結合していることに注目せねばならな
い。生体液からの遊離の分析対象物は酵素−分析対象物
複合体の結合と競合する。従って分析対象物が多ければ
多い程酵素−分析対象物の少量が交雑種抗体に結合さ
れ、最終産物生成速度の増加は少ない。かように酵素反
応の速度と生体液中の分析対象物の濃度との間には反比
例的関係が観察される。
は分析対象物に特異的な１個の結合部位と酵素指示剤に
特異的な別の１個の結合部位とを有する共有結合的交雑
種抗体を用いるものである。しかしながらこの場合にお
いては、酵素指示剤の活性度は必ずしも交雑種抗体に結
合すると同時に変調されなくてもよい。交雑種抗体は、
酵素指示剤と酵素−分析対象物複合体とを空間配置上で
接近させる機能をはたす。酵素指示剤と酵素−分析対象
物複合体中の第２の異なる酵素とは、一方の酵素により
触媒される反応の産物が他方の酵素の基質となるように
選定することが好ましい。かようにして両方の酵素が空
間配置上で極めて近接（１５０Å）して交雑種抗体に結
合すれば、最終産物生成の速度が増大することが観察さ
れる。この際２種類の酵素のうちの一方は交雑種抗体に
直接結合するのでなく、複合体を形成している相手の分
析対象物を介して結合していることに注目せねばならな
い。生体液からの遊離の分析対象物は酵素−分析対象物
複合体の結合と競合する。従って分析対象物が多ければ
多い程酵素−分析対象物の少量が交雑種抗体に結合さ
れ、最終産物生成速度の増加は少ない。かように酵素反
応の速度と生体液中の分析対象物の濃度との間には反比
例的関係が観察される。
【００４１】本発明のこの観点において望ましい酵素系
は、西洋ワサビのパーオキシダーゼを指示剤酵素とし、
グルコースオキシダーゼを酵素−分析対象物複合体に用
いるものである。グルコースオキシダーゼはグルコース
と水の存在下で過酸化水素の生成を触媒する。かくして
生じた過酸化水素は西洋ワサビのパーオキシダーゼの基
質となり、適当な発色性基質の存在下で過酸化水素濃度
に比例する割合で色を生ずる。上記のように色の生成の
割合は生体液中の分析対象物の濃度と反比例的関係にあ
る。
は、西洋ワサビのパーオキシダーゼを指示剤酵素とし、
グルコースオキシダーゼを酵素−分析対象物複合体に用
いるものである。グルコースオキシダーゼはグルコース
と水の存在下で過酸化水素の生成を触媒する。かくして
生じた過酸化水素は西洋ワサビのパーオキシダーゼの基
質となり、適当な発色性基質の存在下で過酸化水素濃度
に比例する割合で色を生ずる。上記のように色の生成の
割合は生体液中の分析対象物の濃度と反比例的関係にあ
る。
【００４２】第３の観点においては、本発明の免疫検定
法は分析対象物に特異的な１個の結合部位と凝集性物質
すなわち指示剤に特異的な他の１個の結合部位とを有す
る共有結合的交雑種抗体を用いる。凝集性物質とは多価
蛋白質か、多ハプテン−蛋白質複合体かまたはハプテン
で、それぞれラテックス粒子に接着しているものであ
る。本発明の方法に有用なラテックス粒子の例は1981年
10月28日付米国特許出願第315,922号明細書に記載され
ている。
法は分析対象物に特異的な１個の結合部位と凝集性物質
すなわち指示剤に特異的な他の１個の結合部位とを有す
る共有結合的交雑種抗体を用いる。凝集性物質とは多価
蛋白質か、多ハプテン−蛋白質複合体かまたはハプテン
で、それぞれラテックス粒子に接着しているものであ
る。本発明の方法に有用なラテックス粒子の例は1981年
10月28日付米国特許出願第315,922号明細書に記載され
ている。
【００４３】本発明の第３の観点の方法は２段階に実施
される。第１段階は結合段階であって、交雑種抗体と生
体液からの分析対象物と多価の分析対象物−蛋白質複合
体のごとき多重の分析対象物（信号発生試薬）とが混合
される。交雑種抗体は、その１個の結合部位で生体液か
らの遊離の分析対象物に結合することもあり、あるいは
多重の分析対象物に結合することもある。第２段階では
凝集性物質が加えられ、交雑種抗体−多重分析対象物複
合体が凝集物質と結合して凝集を起こす。その結果濁度
が増大し、それは分光光度計を用いて測定できる。凝集
の程度は生体液中の分析対象物の濃度に反比例する。
される。第１段階は結合段階であって、交雑種抗体と生
体液からの分析対象物と多価の分析対象物−蛋白質複合
体のごとき多重の分析対象物（信号発生試薬）とが混合
される。交雑種抗体は、その１個の結合部位で生体液か
らの遊離の分析対象物に結合することもあり、あるいは
多重の分析対象物に結合することもある。第２段階では
凝集性物質が加えられ、交雑種抗体−多重分析対象物複
合体が凝集物質と結合して凝集を起こす。その結果濁度
が増大し、それは分光光度計を用いて測定できる。凝集
の程度は生体液中の分析対象物の濃度に反比例する。
【００４４】本発明の方法は、１価の抗体断片すなわち
半分子(Ｈ1Ｌ1)の調製に有用である。先行技術文献中に
は、ＦａｂおよびＦａｂ′断片のごとき１価の抗体断片
の有用性についての報告がある。Ｆａｂ断片は原形のま
まのＩｇＧから酵素パパインを用いる限定的蛋白質分解
によって生成されうる。それらの断片は抗原との結合に
関しては１価であるが、ＩｇＧのＦc領域を欠いてい
る。Ｆａｂ′断片は原型のままのＩｇＧのペプシン分解
により誘導されるＦ(ａｂ)2断片の重い鎖の間の二硫化
結合の還元によって生成されうる。Ｆａｂ′断片もまた
１価であるがＦc領域を欠いている。本発明の方法によ
り合成される半分子は、抗原との結合に関して１価であ
り、反応性のスルフヒドリル基またはチオ硫酸基を含
み、かつ重要なＦc領域を保持している。それらの合成
は迅速でありしかも精製の段階を要しない。
半分子(Ｈ1Ｌ1)の調製に有用である。先行技術文献中に
は、ＦａｂおよびＦａｂ′断片のごとき１価の抗体断片
の有用性についての報告がある。Ｆａｂ断片は原形のま
まのＩｇＧから酵素パパインを用いる限定的蛋白質分解
によって生成されうる。それらの断片は抗原との結合に
関しては１価であるが、ＩｇＧのＦc領域を欠いてい
る。Ｆａｂ′断片は原型のままのＩｇＧのペプシン分解
により誘導されるＦ(ａｂ)2断片の重い鎖の間の二硫化
結合の還元によって生成されうる。Ｆａｂ′断片もまた
１価であるがＦc領域を欠いている。本発明の方法によ
り合成される半分子は、抗原との結合に関して１価であ
り、反応性のスルフヒドリル基またはチオ硫酸基を含
み、かつ重要なＦc領域を保持している。それらの合成
は迅速でありしかも精製の段階を要しない。
【００４５】実施例１ 交雑種抗体の合成 Ａ．Ｓ−スルホン化された半分子の調製 抗西洋ワサビパーオキシダーゼ抗体（抗ＨＲＰ）を含む
家兎血清から採取した市販のＩｇＧ分画を西洋ワサビパ
ーオキシダーゼと結合させたアガロースビーズ上で免疫
親和性クロマトグラフ法によりさらに精製した。抗ＨＲ
Ｐを含む結合分画は燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解さ
れた２.５Ｍチオシアン化ナトリウムを用いて親和性吸
着剤から溶離された。ＰＢＳ緩衝液の組成は、塩化ナト
リウム０.１４Ｍ、塩化カリウム２mM、燐酸二水素ナト
リウム８mM、燐酸二カリウム１.５mM、および場合によ
りアジ化ナトリウム０.０２％（容量中重量）を含有し
そしてpH７.４であった。溶離液を４mMのエチレンジア
ミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するpH８.５の０.１
Ｍ硼酸塩液を何回も取り代えて透析した。抗ＨＲＰの最
終濃度はＩｇＧの１mg／ml溶液が２８０nmにおいて１.
４の光学濃度を有すると仮定して２mg／mlに調整され
た。
家兎血清から採取した市販のＩｇＧ分画を西洋ワサビパ
ーオキシダーゼと結合させたアガロースビーズ上で免疫
親和性クロマトグラフ法によりさらに精製した。抗ＨＲ
Ｐを含む結合分画は燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解さ
れた２.５Ｍチオシアン化ナトリウムを用いて親和性吸
着剤から溶離された。ＰＢＳ緩衝液の組成は、塩化ナト
リウム０.１４Ｍ、塩化カリウム２mM、燐酸二水素ナト
リウム８mM、燐酸二カリウム１.５mM、および場合によ
りアジ化ナトリウム０.０２％（容量中重量）を含有し
そしてpH７.４であった。溶離液を４mMのエチレンジア
ミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するpH８.５の０.１
Ｍ硼酸塩液を何回も取り代えて透析した。抗ＨＲＰの最
終濃度はＩｇＧの１mg／ml溶液が２８０nmにおいて１.
４の光学濃度を有すると仮定して２mg／mlに調整され
た。
【００４６】この精製抗ＨＲＰの０.５ml（１mg）に固
体状亜硫酸ナトリウム６.２６mgおよび５,５′−ジチオ
ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）０.５mgを添
加した。反応液は窒素気流中で室温において３時間撹拌
し、しかる後１mMのＥＤＴＡを含む２０mM Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホ
ン酸（ＴＥＳ）緩衝液（pH６.５）に対して一夜透析し
た。その産物はＳ−スルホン化された家兎抗ＨＲＰの半
分子であった。
体状亜硫酸ナトリウム６.２６mgおよび５,５′−ジチオ
ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）０.５mgを添
加した。反応液は窒素気流中で室温において３時間撹拌
し、しかる後１mMのＥＤＴＡを含む２０mM Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホ
ン酸（ＴＥＳ）緩衝液（pH６.５）に対して一夜透析し
た。その産物はＳ−スルホン化された家兎抗ＨＲＰの半
分子であった。
【００４７】Ｓ−スルホン化された家兎抗ＨＲＰを非還
元的条件下で不連続的ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
により分析したところ、みかけの分子量７５,０００ダ
ルトンで半分子Ｈ1Ｌ1に該当する１本のバンドが現れ
た。５％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（βＭ
Ｅ）で還元したところ、みかけの分子量が５５,０００
および２３,０００でそれぞれ遊離の重い鎖（Ｈ）なら
びに遊離の軽い鎖（Ｌ）に該当する２本のバンドが認め
られた。
元的条件下で不連続的ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
により分析したところ、みかけの分子量７５,０００ダ
ルトンで半分子Ｈ1Ｌ1に該当する１本のバンドが現れ
た。５％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（βＭ
Ｅ）で還元したところ、みかけの分子量が５５,０００
および２３,０００でそれぞれ遊離の重い鎖（Ｈ）なら
びに遊離の軽い鎖（Ｌ）に該当する２本のバンドが認め
られた。
【００４８】Ｂ．還元された（ＳＨ）半分子の調製 Ｉｇ分画は、抗グルコースオキシダーゼ（抗ＧＯ）を含
む市販のヤギ血清から、その血清にpH７.０の蒸留水に
溶解した硫酸アンモニウムの飽和溶液を同量で加えるこ
とによって調製された。この溶液を室温で３０分撹拌
し、しかる後４℃で８０００×ｇで遠心分離した。上清
液を傾瀉し、沈澱塊を飽和の硫酸アンモニウムに再懸濁
し、遠心分離し、そして上清液を再び傾瀉した。沈澱塊
を当初の血清の量の半分の蒸留水に再び溶解し、生じた
溶液をＰＢＳに対して徹底的に透析した。透析を終えた
液を、ガラスフィルター付濾斗中でプロテインＡと結合
したセファロースＣＬ−４Ｂゲル（ファルマシア社製
品）に加えた。Ｉｇ分画２.５ml当たり約５mlのゲルを
用いた。ゲルを２０倍量のＰＢＳで洗いそしてＩｇＧを
含む結合分画を１倍量のpH３.０の０.１Ｍグリシンで溶
離した。溶離液はＰＢＳに対して徹底的に透析した。透
析を終えた溶液をアミコン(Amicon)ＰＭ−３０膜を用い
る限外濾過法により蛋白質含量２mg／mlにまで濃縮し、
そしてその純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％と判
定された。このＩｇＧ分画を、グルコ−スオキシダーゼ
を結合したアガロースビーズ上で免疫親和性クロマトグ
ラフ法によりさらに精製した。抗ＧＯの溶離は前記の抗
ＨＲＰについてと同様にして実施した。最終濃度は２mg
／mlに調整した。
む市販のヤギ血清から、その血清にpH７.０の蒸留水に
溶解した硫酸アンモニウムの飽和溶液を同量で加えるこ
とによって調製された。この溶液を室温で３０分撹拌
し、しかる後４℃で８０００×ｇで遠心分離した。上清
液を傾瀉し、沈澱塊を飽和の硫酸アンモニウムに再懸濁
し、遠心分離し、そして上清液を再び傾瀉した。沈澱塊
を当初の血清の量の半分の蒸留水に再び溶解し、生じた
溶液をＰＢＳに対して徹底的に透析した。透析を終えた
液を、ガラスフィルター付濾斗中でプロテインＡと結合
したセファロースＣＬ−４Ｂゲル（ファルマシア社製
品）に加えた。Ｉｇ分画２.５ml当たり約５mlのゲルを
用いた。ゲルを２０倍量のＰＢＳで洗いそしてＩｇＧを
含む結合分画を１倍量のpH３.０の０.１Ｍグリシンで溶
離した。溶離液はＰＢＳに対して徹底的に透析した。透
析を終えた溶液をアミコン(Amicon)ＰＭ−３０膜を用い
る限外濾過法により蛋白質含量２mg／mlにまで濃縮し、
そしてその純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％と判
定された。このＩｇＧ分画を、グルコ−スオキシダーゼ
を結合したアガロースビーズ上で免疫親和性クロマトグ
ラフ法によりさらに精製した。抗ＧＯの溶離は前記の抗
ＨＲＰについてと同様にして実施した。最終濃度は２mg
／mlに調整した。
【００４９】この精製したヤギの抗ＧＯ液１.０ml（１m
g）にＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂから調製
したＧＯと結合せしめたセファロース４Ｂ １mlを加え
た。セファロースに対するＧＯのおよその比は、湿潤ゲ
ル１ml当たり２mgであった。抗体はゲルと共に１時間室
温で継続的に混合しながら保温した。しかる後ゲルを臨
床用遠心器で遠心分離しそして上清液を採取した。その
上清液の光学濃度を２８０nmにおいて測定した。ＩｇＧ
の１mg／mlの溶液の光学濃度を１.４とする基準値か
ら、抗ＧＯ抗体の約５０％がゲルに結合されたと推定さ
れた。ゲルを３回０.１Ｍ硼酸塩／４mM ＥＤＴＡ（pH
８.５）液に懸濁し、しかる後、上清液の遠心分離およ
び吸引によって洗浄した。最終回洗浄の後に沈澱塊を
０.１Ｍ硼酸塩／４mM ＥＤＴＡを含むpH８.５の１４mM
βＭＥ液の同量中に再懸濁し、窒素気流下に室温で３０
分間振盪しながら保温した。ゲルを遠心分離によって懸
濁液から分離し、上清液を吸引除去し、０.１Ｍグリシ
ン／４mM ＥＤＴＡ（pH３.０）の液を用いてゲルを溶離
した。溶離液を０.０２Ｍグリシン／４mM ＥＤＴＡ（pH
３.０）の液に対して窒素ガスを継続的に通気しながら
透析した。生成物は還元型（ＳＨ）のヤギ抗ＧＯ抗体で
あった。還元されたヤギ抗ＧＯ標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により非還元的条件下で分析した結果、みかけの分子量
７５,０００ダルトンに該当する１本のバンドが現れ
た。また２本の副バンド（全蛋白質の１０重量％以下）
が現れ、みかけの分子量はそれぞれ５５,０００および
２３,０００ダルトンに該当した。これら三者はそれぞ
れ半分子（Ｈ1Ｌ1）、遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖
に該当する。５％（ｖ／ｖ）のβＭＥを加えたところ、
７５,０００ダルトンのバンドは予期された通り５５,０
００および２３,０００ダルトンのバンドに転化した。
g）にＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂから調製
したＧＯと結合せしめたセファロース４Ｂ １mlを加え
た。セファロースに対するＧＯのおよその比は、湿潤ゲ
ル１ml当たり２mgであった。抗体はゲルと共に１時間室
温で継続的に混合しながら保温した。しかる後ゲルを臨
床用遠心器で遠心分離しそして上清液を採取した。その
上清液の光学濃度を２８０nmにおいて測定した。ＩｇＧ
の１mg／mlの溶液の光学濃度を１.４とする基準値か
ら、抗ＧＯ抗体の約５０％がゲルに結合されたと推定さ
れた。ゲルを３回０.１Ｍ硼酸塩／４mM ＥＤＴＡ（pH
８.５）液に懸濁し、しかる後、上清液の遠心分離およ
び吸引によって洗浄した。最終回洗浄の後に沈澱塊を
０.１Ｍ硼酸塩／４mM ＥＤＴＡを含むpH８.５の１４mM
βＭＥ液の同量中に再懸濁し、窒素気流下に室温で３０
分間振盪しながら保温した。ゲルを遠心分離によって懸
濁液から分離し、上清液を吸引除去し、０.１Ｍグリシ
ン／４mM ＥＤＴＡ（pH３.０）の液を用いてゲルを溶離
した。溶離液を０.０２Ｍグリシン／４mM ＥＤＴＡ（pH
３.０）の液に対して窒素ガスを継続的に通気しながら
透析した。生成物は還元型（ＳＨ）のヤギ抗ＧＯ抗体で
あった。還元されたヤギ抗ＧＯ標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により非還元的条件下で分析した結果、みかけの分子量
７５,０００ダルトンに該当する１本のバンドが現れ
た。また２本の副バンド（全蛋白質の１０重量％以下）
が現れ、みかけの分子量はそれぞれ５５,０００および
２３,０００ダルトンに該当した。これら三者はそれぞ
れ半分子（Ｈ1Ｌ1）、遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖
に該当する。５％（ｖ／ｖ）のβＭＥを加えたところ、
７５,０００ダルトンのバンドは予期された通り５５,０
００および２３,０００ダルトンのバンドに転化した。
【００５０】Ｃ．交雑種抗体の調製 Ｓ−スルホン化された家兎抗ＨＲＰと還元されたヤギ抗
ＧＯとの等量を混合しそして透析管に移した。かくして
生じた溶液を室温で２４時間２０mM ＴＥＳ、１mM ＥＤ
ＴＡおよび０.１Ｍ塩化ストロンチウムの液（pH６.５）
に対して窒素ガスを継続的に通気しながら透析した。混
合液をしかる後ＰＢＳに対して２４時間透析した。
ＧＯとの等量を混合しそして透析管に移した。かくして
生じた溶液を室温で２４時間２０mM ＴＥＳ、１mM ＥＤ
ＴＡおよび０.１Ｍ塩化ストロンチウムの液（pH６.５）
に対して窒素ガスを継続的に通気しながら透析した。混
合液をしかる後ＰＢＳに対して２４時間透析した。
【００５１】透析した溶液を、非還元的条件下でＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析した結果、みかけの分子量１５
０,０００ダルトンに該当する１本の主バンドが現れ
た。そしてそれは５％（ｖ／ｖ）のβＭＥにより還元し
たところ、みかけの分子量それぞれ５５,０００および
２３,０００ダルトンの２本のバンドを生じた。これら
三者の分子量は、それぞれ生成物である共有結合的交雑
種抗体、遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖に該当する。
（ゲルが過負荷になった際には非還元的条件下で５５,
０００および２３,０００ダルトンに該当する弱いバン
ドが検出された。これらのバンドは多分抗ＧＯの還元中
に生じた遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖を表すもので
ある。）
−ＰＡＧＥにより分析した結果、みかけの分子量１５
０,０００ダルトンに該当する１本の主バンドが現れ
た。そしてそれは５％（ｖ／ｖ）のβＭＥにより還元し
たところ、みかけの分子量それぞれ５５,０００および
２３,０００ダルトンの２本のバンドを生じた。これら
三者の分子量は、それぞれ生成物である共有結合的交雑
種抗体、遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖に該当する。
（ゲルが過負荷になった際には非還元的条件下で５５,
０００および２３,０００ダルトンに該当する弱いバン
ドが検出された。これらのバンドは多分抗ＧＯの還元中
に生じた遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖を表すもので
ある。）
【００５２】共有結合的交雑種抗体の特性を寒天ゲル二
重拡散法によりさらに詳しく検定した。原形の抗体すな
わち抗ＨＲＰおよび抗ＧＯをそれぞれＨＲＰおよびＧＯ
に対して拡散させた際には沈降バンドが認められたのに
対して、本発明の方法によりＳ−スルホン化された抗Ｈ
ＲＰおよび還元された抗ＧＯから形成された交雑種抗体
はＨＲＰおよびＧＯのいずれとも沈降物を形成し得なか
った。またＳ−スルホン化された抗ＨＲＰをＨＲＰに対
して拡散させたとき、ならびに還元された（ＳＨ）抗Ｇ
ＯをＧＯに対して拡散させたときにも沈降を生じなかっ
たので、これらの半分子が抗原との結合に関して１価の
ものであることが確認された。しかるに交雑種抗体をヒ
ツジの抗家兎ＩｇＧ抗体またはヒツジの抗ヤギＩｇＧ抗
体に対して拡散させたときには沈降が認められ、この抗
体の二重的（交雑種的）特性が示された。
重拡散法によりさらに詳しく検定した。原形の抗体すな
わち抗ＨＲＰおよび抗ＧＯをそれぞれＨＲＰおよびＧＯ
に対して拡散させた際には沈降バンドが認められたのに
対して、本発明の方法によりＳ−スルホン化された抗Ｈ
ＲＰおよび還元された抗ＧＯから形成された交雑種抗体
はＨＲＰおよびＧＯのいずれとも沈降物を形成し得なか
った。またＳ−スルホン化された抗ＨＲＰをＨＲＰに対
して拡散させたとき、ならびに還元された（ＳＨ）抗Ｇ
ＯをＧＯに対して拡散させたときにも沈降を生じなかっ
たので、これらの半分子が抗原との結合に関して１価の
ものであることが確認された。しかるに交雑種抗体をヒ
ツジの抗家兎ＩｇＧ抗体またはヒツジの抗ヤギＩｇＧ抗
体に対して拡散させたときには沈降が認められ、この抗
体の二重的（交雑種的）特性が示された。
【００５３】上述のように調製した交雑種抗体を、さら
に固相免疫沈降法により酵素抗原に結合する能力につい
て分析した。交雑種抗体２５μlを１０リットルのグル
コースオキシダーゼ（ＰＢＳ中１mg／ml）と共に1時間
室温で保温した。１％の卵白アルブミン（ＯＶＡ）およ
び０.０５％のトリトンＸ−１００（ローム・アンド・
ハース社から市販の非イオン性界面活性剤）を含むＰＢ
Ｓにヤギの抗家兎ＩｇＧで被覆したラテックスビーズ
（ビオーラド社製品）の懸濁液７５リットルを上記に加
え、そして１時間室温で振盪しながら保温した。懸濁液
を遠心分離し、沈澱塊をＰＢＳ／ＯＶＡ／トリトンＸ−
１００緩衝液で３回洗浄して遠心分離した。最終回洗浄
の後ビーズをＰＢＳに溶解した０.１Ｍグルコース液５
００リットル、５mMのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）液１００リットルおよびＰＢＳに溶解した西洋ワサ
ビパーオキシダーセ（１mg／ml）液１０リットル中に再
懸濁した。そして発色の度合いを４６０nmにおいて追跡
測定した。この測定の対照としては、家兎／ヤギ交雑種
抗体に代えてヤギの抗グルコースオキシダーゼ抗体の自
家交雑体の使用および抗体なしまたはグルコースオキシ
ダーゼなしの測定を含めた。
に固相免疫沈降法により酵素抗原に結合する能力につい
て分析した。交雑種抗体２５μlを１０リットルのグル
コースオキシダーゼ（ＰＢＳ中１mg／ml）と共に1時間
室温で保温した。１％の卵白アルブミン（ＯＶＡ）およ
び０.０５％のトリトンＸ−１００（ローム・アンド・
ハース社から市販の非イオン性界面活性剤）を含むＰＢ
Ｓにヤギの抗家兎ＩｇＧで被覆したラテックスビーズ
（ビオーラド社製品）の懸濁液７５リットルを上記に加
え、そして１時間室温で振盪しながら保温した。懸濁液
を遠心分離し、沈澱塊をＰＢＳ／ＯＶＡ／トリトンＸ−
１００緩衝液で３回洗浄して遠心分離した。最終回洗浄
の後ビーズをＰＢＳに溶解した０.１Ｍグルコース液５
００リットル、５mMのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）液１００リットルおよびＰＢＳに溶解した西洋ワサ
ビパーオキシダーセ（１mg／ml）液１０リットル中に再
懸濁した。そして発色の度合いを４６０nmにおいて追跡
測定した。この測定の対照としては、家兎／ヤギ交雑種
抗体に代えてヤギの抗グルコースオキシダーゼ抗体の自
家交雑体の使用および抗体なしまたはグルコースオキシ
ダーゼなしの測定を含めた。
【００５４】この測定における発色反応の基礎は下記の
通りである。すなわち交雑種抗体は、それが有する家兎
からの（ＨＲＰと結合する）特性によりヤギの抗家兎Ｉ
ｇＧ抗体で被覆されたビーズに結合された。グルコース
オキシダーゼは交雑種抗体が存在したときにのみこれら
のビーズによって沈降された。（原型のままのヤギの抗
グルコースオキシダーゼ抗体あるいはその同じ抗体の半
分子の存在は測定に影響しない。これはそれらがヤギの
抗家兎ＩｇＧで被覆されたビーズによって沈降されない
からである。このことは本実施例に記載したと同じ方法
により自身で交雑体化されたヤギの抗グルコースオキシ
ダーゼ抗体を用いる対照測定により証明された。）遊離
のグルコースオキシダーゼを全部除去するまで洗浄した
後にグルコース、ＯＰＤおよびＨＲＰを加えた。グルコ
ースオキシダーゼはグルコースを加水分解してＨ2Ｏ2を
発生し、これがＨＲＰのための基質となった。交雑種抗
体によって結合されたグルコースオキシダーゼの存在下
（遊離のＧＯはすべて洗浄除去された）においてのみ発
色が起こった。
通りである。すなわち交雑種抗体は、それが有する家兎
からの（ＨＲＰと結合する）特性によりヤギの抗家兎Ｉ
ｇＧ抗体で被覆されたビーズに結合された。グルコース
オキシダーゼは交雑種抗体が存在したときにのみこれら
のビーズによって沈降された。（原型のままのヤギの抗
グルコースオキシダーゼ抗体あるいはその同じ抗体の半
分子の存在は測定に影響しない。これはそれらがヤギの
抗家兎ＩｇＧで被覆されたビーズによって沈降されない
からである。このことは本実施例に記載したと同じ方法
により自身で交雑体化されたヤギの抗グルコースオキシ
ダーゼ抗体を用いる対照測定により証明された。）遊離
のグルコースオキシダーゼを全部除去するまで洗浄した
後にグルコース、ＯＰＤおよびＨＲＰを加えた。グルコ
ースオキシダーゼはグルコースを加水分解してＨ2Ｏ2を
発生し、これがＨＲＰのための基質となった。交雑種抗
体によって結合されたグルコースオキシダーゼの存在下
（遊離のＧＯはすべて洗浄除去された）においてのみ発
色が起こった。
【００５５】上記のごとく測定したときに、本実施例に
より合成された交雑種抗体は発色を引き起こした。測定
操作から抗体またはグルコースオキシダーゼを除いたと
きには、発色はなかった。ヤギ／家兎交雑種抗体に代え
て自家交雑したヤギの抗グルコースオキシダーゼ抗体を
用いたときには発色はなかった。これらの結果は、所望
の交雑種抗体産物が得られたことを立証している。
より合成された交雑種抗体は発色を引き起こした。測定
操作から抗体またはグルコースオキシダーゼを除いたと
きには、発色はなかった。ヤギ／家兎交雑種抗体に代え
て自家交雑したヤギの抗グルコースオキシダーゼ抗体を
用いたときには発色はなかった。これらの結果は、所望
の交雑種抗体産物が得られたことを立証している。
【００５６】実施例２ (１) 固定化した抗体のβ−メルカプトエタノールを用
いた還元によるＩｇＧ半分子の調製 プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂゲルを０.１Ｍ
硼酸塩／４mM ＥＤＴＡ緩衝液（pH８.５）中で膨潤させ
た。５０％（ｖ／ｖ）の懸濁液５０リットルに１mg／ml
の家兎抗西洋ワサビパーオキシダーゼＩｇＧ溶液を加え
た。これを１時間室温でたえず撹拌しながら保温し、し
かる後遠心分離した。上清液を吸引除去し、沈澱塊を
０.１Ｍ硼酸塩／４mM ＥＤＴＡ（pH８.５）緩衝液で３
回洗浄した。最終回洗浄の後に沈澱塊を同じ緩衝液に溶
解した１４mM β−メルカプトエタノール１００リット
ルに再懸濁しそして窒素気流下に室温で１５分間保温し
た。しかる後これを遠心分離し、上清液を吸引除去し、
そして沈澱塊を硼酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液で３回洗浄し
た。沈澱塊はプロテインＡ−セファロースゲルに結合さ
れた還元型の半分子を含んでいた。還元型の家兎抗ＨＲ
Ｐ半分子の収率は７５％で、そのうち９０％は洗浄段階
を経た後にもゲルに結合されていた。結合された半分子
はそのままで（下記の(２)参照）利用することもでき、
また０.１Ｍグリシン／１mM ＥＤＴＡによりゲルから溶
離することもできる。生成物の特性を上述の操作により
検定した。
いた還元によるＩｇＧ半分子の調製 プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂゲルを０.１Ｍ
硼酸塩／４mM ＥＤＴＡ緩衝液（pH８.５）中で膨潤させ
た。５０％（ｖ／ｖ）の懸濁液５０リットルに１mg／ml
の家兎抗西洋ワサビパーオキシダーゼＩｇＧ溶液を加え
た。これを１時間室温でたえず撹拌しながら保温し、し
かる後遠心分離した。上清液を吸引除去し、沈澱塊を
０.１Ｍ硼酸塩／４mM ＥＤＴＡ（pH８.５）緩衝液で３
回洗浄した。最終回洗浄の後に沈澱塊を同じ緩衝液に溶
解した１４mM β−メルカプトエタノール１００リット
ルに再懸濁しそして窒素気流下に室温で１５分間保温し
た。しかる後これを遠心分離し、上清液を吸引除去し、
そして沈澱塊を硼酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液で３回洗浄し
た。沈澱塊はプロテインＡ−セファロースゲルに結合さ
れた還元型の半分子を含んでいた。還元型の家兎抗ＨＲ
Ｐ半分子の収率は７５％で、そのうち９０％は洗浄段階
を経た後にもゲルに結合されていた。結合された半分子
はそのままで（下記の(２)参照）利用することもでき、
また０.１Ｍグリシン／１mM ＥＤＴＡによりゲルから溶
離することもできる。生成物の特性を上述の操作により
検定した。
【００５７】(２) 交雑種抗体の調製 上記(１)のようにして調製した沈澱塊に、上記実施例１
のＡのように調製したＳ−スルホン化されたヤギの抗Ｇ
Ｏ半分子の同重量を２０mM ＴＥＳ／１mM ＥＤＴＡ／
０.１Ｍ ＳｒＣｌ2に溶解したものを加えた。沈澱塊を
再懸濁し、室温において窒素気流下で一夜撹拌した。し
かる後上清液を除去し、沈澱塊を２０mMＴＥＳ／１mM
ＥＤＴＡ／０.１Ｍ ＳｒＣｌ2液で１回洗浄し、さらに
ＴＥＳ／ＥＤＴＡ液で２回洗浄した。結合生成物である
ＩｇＧ交雑種抗体をpH３.０の０.１Ｍグリシン液で溶解
し、そしてＰＢＳ中に透析した。生成物の特性を上記の
操作により検定した。
のＡのように調製したＳ−スルホン化されたヤギの抗Ｇ
Ｏ半分子の同重量を２０mM ＴＥＳ／１mM ＥＤＴＡ／
０.１Ｍ ＳｒＣｌ2に溶解したものを加えた。沈澱塊を
再懸濁し、室温において窒素気流下で一夜撹拌した。し
かる後上清液を除去し、沈澱塊を２０mMＴＥＳ／１mM
ＥＤＴＡ／０.１Ｍ ＳｒＣｌ2液で１回洗浄し、さらに
ＴＥＳ／ＥＤＴＡ液で２回洗浄した。結合生成物である
ＩｇＧ交雑種抗体をpH３.０の０.１Ｍグリシン液で溶解
し、そしてＰＢＳ中に透析した。生成物の特性を上記の
操作により検定した。
【００５８】参考例１ β−メルカプトエチルアミンを用いた還元によるＩｇＧ
半分子の調製 ２mg／mlの家兎ＩｇＧ溶液９００ｌに２０mM ＴＥＳ／
１mM ＥＤＴＡの液（pH６.５）に溶解した１Ｍ β−メ
ルカプトエチルアミン１００リットルを加えた。３７℃
で２時間保温し、しかる後試料をＴＥＳ／ＥＤＴＡ液中
で平衡したセファデックスＧ−２５ゲルを通過させた。
これらの条件下でＩｇＧの約８０％が還元された半分子
に転化された。残りの２０％は重い鎖の二量体および遊
離の軽い鎖であった。かくして生成された還元型の半分
子は、実施例１Ｃに従って共有結合的交雑種抗体の製造
に利用することができる。生成物は上述の操作を利用し
て示性化された。
半分子の調製 ２mg／mlの家兎ＩｇＧ溶液９００ｌに２０mM ＴＥＳ／
１mM ＥＤＴＡの液（pH６.５）に溶解した１Ｍ β−メ
ルカプトエチルアミン１００リットルを加えた。３７℃
で２時間保温し、しかる後試料をＴＥＳ／ＥＤＴＡ液中
で平衡したセファデックスＧ−２５ゲルを通過させた。
これらの条件下でＩｇＧの約８０％が還元された半分子
に転化された。残りの２０％は重い鎖の二量体および遊
離の軽い鎖であった。かくして生成された還元型の半分
子は、実施例１Ｃに従って共有結合的交雑種抗体の製造
に利用することができる。生成物は上述の操作を利用し
て示性化された。
【００５９】実施例３ 別法による共有結合的交雑種抗体の合成 実施例１Ｂに記述したように精製したヤギの抗グルコー
スオキシダーゼ抗体を、実施例１Ａに記述した家兎の抗
ＨＲＰ抗体と同様にしてＳ−スルホン化することができ
る。余分のＤＴＮＢを除去するために透析した後に、反
応混合液を０.０１４Ｍ βＭＥ濃度に調整し、そして２
０mMグリシン、４mM ＥＤＴＡおよび０.１Ｍ ＳｒＣｌ2
の緩衝液（pH３.０）に対して一夜透析することができ
る。しかる後溶液と実施例１Ａにより調製したＳ−スル
ホン化された家兎の抗ＨＲＰ抗体とを実施例１Ｃに記述
したように交雑することができる。
スオキシダーゼ抗体を、実施例１Ａに記述した家兎の抗
ＨＲＰ抗体と同様にしてＳ−スルホン化することができ
る。余分のＤＴＮＢを除去するために透析した後に、反
応混合液を０.０１４Ｍ βＭＥ濃度に調整し、そして２
０mMグリシン、４mM ＥＤＴＡおよび０.１Ｍ ＳｒＣｌ2
の緩衝液（pH３.０）に対して一夜透析することができ
る。しかる後溶液と実施例１Ａにより調製したＳ−スル
ホン化された家兎の抗ＨＲＰ抗体とを実施例１Ｃに記述
したように交雑することができる。
【００６０】このような合成による所望の交雑種抗体の
収率は９０％に接近すると期待される。それはこのＳ−
スルホン化経路による還元型抗グルコースオキシダーゼ
抗体の収率は９０％に達するからである。
収率は９０％に接近すると期待される。それはこのＳ−
スルホン化経路による還元型抗グルコースオキシダーゼ
抗体の収率は９０％に達するからである。
【００６１】参考例２ 単クローン抗体から半分子の合成 単クローン抗体を用いて、実施例１Ａに記述したように
してＳ−スルホン化された半分子を調製し、その特性を
検定した。所望のＳ−スルホン化された半分子の収率は
１００％であった。単クローン抗体は抗テオフィリン抗
体（部類１の重い鎖および軽い鎖の同類体）ならびに抗
ジゴキシン抗体（部類３の重い鎖および軽い鎖の同類
体）であった。出発物質となる単クローン抗体を限外濾
過により２mg／mlにまで濃縮した腹水から親和性法によ
り精製しそして寒天ゲル中における二重拡散法により軽
い鎖の同類体および重い鎖の部類分けについて検定し
た。
してＳ−スルホン化された半分子を調製し、その特性を
検定した。所望のＳ−スルホン化された半分子の収率は
１００％であった。単クローン抗体は抗テオフィリン抗
体（部類１の重い鎖および軽い鎖の同類体）ならびに抗
ジゴキシン抗体（部類３の重い鎖および軽い鎖の同類
体）であった。出発物質となる単クローン抗体を限外濾
過により２mg／mlにまで濃縮した腹水から親和性法によ
り精製しそして寒天ゲル中における二重拡散法により軽
い鎖の同類体および重い鎖の部類分けについて検定し
た。
【００６２】実施例４ 交雑種抗体試薬を用いる酵素活性化免疫検定法 大分子量の分析対象物に対する免疫検定法に下記の物質
すなわち(ａ) 分析対象物および酵素指示剤に対して特
異的結合性を有する共有結合的交雑種抗体（米国特許出
願第315,922号参照）、(ｂ) その活性度が共有結合的
交雑種抗体への結合によって変調される信号発生性酵素
指示剤、(ｃ) 比色定量ならびに蛍光定量的信号発生反
応のための試薬、および(ｄ) 分子量が≧10,000、さら
に多くの場合には≦100,000の蛋白質である分析対象物
を含む生物試料を用いる。
すなわち(ａ) 分析対象物および酵素指示剤に対して特
異的結合性を有する共有結合的交雑種抗体（米国特許出
願第315,922号参照）、(ｂ) その活性度が共有結合的
交雑種抗体への結合によって変調される信号発生性酵素
指示剤、(ｃ) 比色定量ならびに蛍光定量的信号発生反
応のための試薬、および(ｄ) 分子量が≧10,000、さら
に多くの場合には≦100,000の蛋白質である分析対象物
を含む生物試料を用いる。
【００６３】生物試料としては血清試料でも尿試料でも
また全血液試料でもよい。酵素指示剤とは、酵素または
酵素のサブユニットであって抗体によって結合されなけ
れば不活性のもの、すなわち大腸菌ＡＭＥＦ突然変異体
のβ−ガラクトシターゼまたは人間の前立腺酸性ホスフ
ァターゼである。信号発生反応のための試薬とは、酵素
指示剤の発色性または発蛍光性基質にpH４〜１０の水性
緩衝液中の任意の追加の副構成分または陽イオンを加え
たものである。
また全血液試料でもよい。酵素指示剤とは、酵素または
酵素のサブユニットであって抗体によって結合されなけ
れば不活性のもの、すなわち大腸菌ＡＭＥＦ突然変異体
のβ−ガラクトシターゼまたは人間の前立腺酸性ホスフ
ァターゼである。信号発生反応のための試薬とは、酵素
指示剤の発色性または発蛍光性基質にpH４〜１０の水性
緩衝液中の任意の追加の副構成分または陽イオンを加え
たものである。
【００６４】物質（ａ）、（ｂ）および（ｄ）は試料
（ｃ）を加える以前に少時一緒に０〜５０℃、さらに多
くの場合には２２〜４６℃に保温することが好ましい。
しかしながら、場合によっては酵素指示剤を加える前に
成分（ａ）および（ｂ）を予め保温（インキュベート）
するのが望ましいこともある。また全部の物質を同時に
加えてもよい。保温の時間は通常３０分以下そして多く
の場合１〜４分間である。酵素によって発生せられた信
号の測定は、物質（ｃ）の添加後通常３０分以内そして
多くの場合３分以内に行われる。
（ｃ）を加える以前に少時一緒に０〜５０℃、さらに多
くの場合には２２〜４６℃に保温することが好ましい。
しかしながら、場合によっては酵素指示剤を加える前に
成分（ａ）および（ｂ）を予め保温（インキュベート）
するのが望ましいこともある。また全部の物質を同時に
加えてもよい。保温の時間は通常３０分以下そして多く
の場合１〜４分間である。酵素によって発生せられた信
号の測定は、物質（ｃ）の添加後通常３０分以内そして
多くの場合３分以内に行われる。
【００６５】酵素指示剤が不活性であってそして抗体に
結合されたときにのみ活性となる場合には、発生せられ
る信号の量は試料中の分析対象物の濃度に反比例するこ
とになる。酵素指示剤が活性でそして抗体に結合された
ときにのみ不活性化される場合には、発生せられる信号
の量は試料中の分析対象物の濃度に正比例することにな
る。
結合されたときにのみ活性となる場合には、発生せられ
る信号の量は試料中の分析対象物の濃度に反比例するこ
とになる。酵素指示剤が活性でそして抗体に結合された
ときにのみ不活性化される場合には、発生せられる信号
の量は試料中の分析対象物の濃度に正比例することにな
る。
Claims (7)
- 【請求項１】 第１の半分子は第１の抗原に対する結合
部位を提供し、第２の半分子は第１の抗原に対して化学
的に異なる結合部位あるいは第２の抗原に対する結合部
位を提供し、かつ半分子が二硫化結合を介して互いに結
合している、本質的に２種類の異なる重い鎖−軽い鎖の
半分子からなる基本的に純粋な共有結合的交雑種抗体。 - 【請求項２】 第１および第２の半分子が異なる抗原に
対して化学的に異なる結合部位を提供する請求項１記載
の共有結合的交雑種抗体。 - 【請求項３】 第１の半分子が分析対象物に対する結合
部位を提供しそして第２の半分子が指示剤に対する結合
部位を提供する請求項２記載の共有結合的交雑種抗体。 - 【請求項４】 下記の諸段階すなわち (Ａ) 重い鎖の間の二硫化結合の加亜硫酸分解により第
１の抗原に対する抗体である第１の免疫グロブリン分子
をその重い鎖−軽い鎖の半分子に選択的に分割してＳ−
スルホン化された半分子を生成すること、 (Ｂ) 重い鎖の間の二硫化結合の還元により、第１の抗
原または第２の抗原に対する抗体である第２の免疫グロ
ブリン分子をその重い鎖−軽い鎖の半分子に選択的に分
割して還元された半分子を生成すること、そして (Ｃ) 前記(Ａ)段階からのＳ−スルホン化された半分子
と前記(Ｂ)段階からの還元型半分子を合体させることを
包含する共有結合的交雑種抗体の調製法。 - 【請求項５】 下記の諸構成分すなわち (Ａ) 第１の半分子は第１の抗原に対する結合部位を提
供しそして第２の半分子は第１のあるいは第２の抗原に
対する化学的に異なる結合部位抗原に対する結合部位を
提供し、そしてこれら半分子が二硫化結合を介して互い
に結合されているものである本質的に異なる２種類の重
い鎖−軽い鎖の半分子からなる基本的に純粋な共有結合
的交雑種抗体、 (Ｂ) 分析対象物を含む生物試料、 (Ｃ) 指示剤および (Ｄ) 信号発生反応のための試薬 を順次的または同時的に保温（インキュベート）する諸
段階を包含する、分析対象物測定のための均質的免疫検
定法。 - 【請求項６】 指示剤が酵素でありそして信号発生反応
試薬が酵素の基質である請求項５記載の均質的免疫検定
法。 - 【請求項７】 指示剤が凝集性物質でありそして信号発
生反応試薬が多重分析対象物である請求項５記載の均質
的免疫検定法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/374,971 US4479895A (en) | 1982-05-05 | 1982-05-05 | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies |
| US374971 | 1982-05-05 | ||
| US06/374,970 US4446233A (en) | 1982-05-05 | 1982-05-05 | Homogeneous immunoassay using covalent hybrid antibodies |
| US374970 | 1982-05-05 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58077697A Division JPS58203919A (ja) | 1982-05-05 | 1983-05-04 | 免疫グロブリン半分子および交雑種抗体を製造する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05295000A true JPH05295000A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=27006845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3232894A Pending JPH05295000A (ja) | 1982-05-05 | 1991-09-12 | 共有結合的交雑種抗体、その調製法およびこれを使用する均質的免疫検定法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0096463B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05295000A (ja) |
| CA (1) | CA1194415A (ja) |
| DE (1) | DE3368064D1 (ja) |
| DK (1) | DK199783A (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3583278D1 (de) * | 1984-04-23 | 1991-07-25 | Boston Biomed Res Inst | Doppelspezifische antikoerper-determinanten. |
| NL8501219A (nl) * | 1985-04-29 | 1986-11-17 | Stichting Vrienden Van De Stic | Immunologisch complex, de bereiding en toepassing daarvan. |
| US4954617A (en) * | 1986-07-07 | 1990-09-04 | Trustees Of Dartmouth College | Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes |
| GB8626767D0 (en) * | 1986-11-10 | 1986-12-10 | Unilever Plc | Assays |
| US5086002A (en) * | 1987-09-07 | 1992-02-04 | Agen Biomedical, Ltd. | Erythrocyte agglutination assay |
| IL87768A (en) * | 1987-09-17 | 1994-12-29 | Agen Ltd | Blood assay including erythrocyte agglutination and reagent for the assay comprising conjugate of erythrocyte binding molecule and analyte binding molecule |
| IT1235349B (it) * | 1988-12-23 | 1992-06-30 | Biodata Spa | Saggio immunologico per determinazioni in fase omogenea |
| AU665758B2 (en) * | 1991-04-26 | 1996-01-18 | Surface Active Limited | Novel antibodies, and methods for their use |
| US5447846A (en) * | 1992-07-17 | 1995-09-05 | Fuji Photo Film C., Ltd. | Homogeneous Immunoassay process using covalent conjugate of enzyme and plural monoclonal antibodies for different epitopes on analyte |
| GB9316369D0 (en) * | 1993-08-06 | 1993-09-22 | Surface Active Ltd | Diagnostic method |
| JP2005172694A (ja) * | 2003-12-12 | 2005-06-30 | Fuji Photo Film Co Ltd | タンパク質の検出方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2508132C3 (de) * | 1974-03-08 | 1980-10-16 | Teijin Ltd., Osaka (Japan) | Verfahren zur Herstellung von Humanimmunglobulin-Derivaten und parenteral applizierbare Lösung hiervon |
| US4156081A (en) * | 1977-04-15 | 1979-05-22 | Syva Company | Theophylline antigens and antibodies |
| AU556548B2 (en) * | 1980-03-03 | 1986-11-06 | Milton David Goldenberg | Tumor localization and therapy with labeled antibodies and antibody fragments specific to tumor-associated markers |
| DE3134361A1 (de) * | 1981-08-31 | 1983-03-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur enzymimmuno-bestimmung in homogener phase |
-
1983
- 1983-05-03 CA CA000427324A patent/CA1194415A/en not_active Expired
- 1983-05-04 DE DE8383302514T patent/DE3368064D1/de not_active Expired
- 1983-05-04 EP EP83302514A patent/EP0096463B1/en not_active Expired
- 1983-05-04 DK DK199783A patent/DK199783A/da not_active Application Discontinuation
-
1991
- 1991-09-12 JP JP3232894A patent/JPH05295000A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1194415A (en) | 1985-10-01 |
| DK199783D0 (da) | 1983-05-04 |
| DE3368064D1 (en) | 1987-01-15 |
| EP0096463A1 (en) | 1983-12-21 |
| DK199783A (da) | 1983-11-06 |
| EP0096463B1 (en) | 1986-12-03 |
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