JPS58203919A - 免疫グロブリン半分子および交雑種抗体を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫グロブリン半分子の調製法、釉にＩｇＧ
抗体の異部な半分子を選択的に再結合させて共有結合酌
交雑種抗体を形成する方法に関する。これらの抗体は生
体液中の大分子量の抗原およびハプテン（結合部）を測
定するためｐｃ用いることができる。

交雑株抗体でＩｇＧに類別されるものは、２種の抗原結
合部位を有する異性両機能性の抗体で、それぞれの結合
部位は異なる免疫グロブリンに由来する。通常２ｓＩの
結合部位はそれぞれ異なる抗原′ｔ−認織するが、両種
の結合部位が同じ抗原に結合することも可能で、その他
の特性例えば異形性においてのみ異なることもあり得る
。

交雑株抗体の合成は、２個の元来の免疫グロブリン分子
（Ｈ２Ｌ２）で抗原結合特異性の興なるものを還元的に
分割して半分子（ＨＩＬｌ）となしくたたｌ、Ｈは重い
鎖、Ｌは軽い鎖を表わす）、しかる後これら半分子の混
合物を杏酸化することによって低い収量で達成された〔
例えｔ；ｆ　Ｈｏｎｇ氏その他ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、Ｊ第２４０巻第ｓ　８ａ　ｓ真（１９６５年）
参照〕。この全く機会的なｈｗ化法は、ｒ９Ｔ望の交雑
麺抗体の理論的最高収率が５１３％にとどまるという点
で不利金欠かれない。

Ｌｕｅｄｔｋ８氏その他〔「Ｂｉｏｃｈｅｍｌ　５ｔｒ
ｙ丁第１９巻第１１８２ｊｊ（１９８０年）〕は、元来
の免役グロブリン分子との混合物中における２ａの免役
クロプリン半分子の朽結合の結果として交雑讃抗体が産
垂することを記述している。もとＣ）免役グロブリンの
うちの１ａｌ類を除去した後にＩよ、生じた免疫グロブ
リンの混合物は／！ｒ望の全雑種抗体を約４０優含有し
ていた。所望の交帷抛抗体を得るためにさらに精製する
操作は行われなかった。

免疫グロブリンの軽い鎖の異質的組替えによ−）で二量
体を形成することは、求核的置換反応［Ｐｅａｂｏｄｙ
氏その他［Ｂｔ　ＯＱｈｅｍｌ　ｅｔｒｙ　Ｊ第１９巻
第２８２７負（１９８０年）参照〕によって実施された
。

免役グロブリンの軽い鎖は、ある種の患者例えけ多発性
骨ｌＫＩ腫患者において異常な高濃度に合成され、尿中
に排出される。この−の試料中の蛋白３！ｌをＮ製し７
ｔｌｉ１５果、軽い鎖の二量体が得らｔまた、１ｙａ類
の軽い鎖の二量体の鎖の間の二硫化結合を亜硫酸分解し
、て二量体を分割したところチオ執＃０４体が得られた
。他の種類の軽い鎖の二量体は、鎖の間の二硫化（ジス
ルフイット）結合を還元することによって分割され、そ
れに対応する一８Ｈ化合物を生じ次。これら２種類の単
量体が混在した一合には、求核的置換反応によって二硫
化Ｍ合で結はれた異質の軽い鎖　　　　′の二量体が生
じた。８０〜１００帰の収率が報告されｆｃ　ｏ　これ
らの軽い鎖の二量体は、１イーの二硫化結合で共有結合
的に結ばれ、免疫的活性はない。他方において、天然の
免疫グロブリンは１個以上の二硫化結合を有し、重い鎖
の間の二硫化結合を特異的に分割して所望の半分子を得
ることは困難である。

元来の工ｇＧ分子中の重い鎖の間の二硫化結合を化学的
手段ＫＬって還元しようとすれ汀、これに伴って軽い鎖
と重い鎖との間の二硫化結合も同時に還元されることは
不可避であるしＳθａｒｅ氏その他［Ｂｌ　ｏｃｈｅｍ
ｊ　５ｔｒｙ　Ｊ第１６巻第２０３１ｊｉｉ（１９７７
年）参照〕。工ｇＧを限定的に蛋白分解してＰ（ａｂ’
）２断片を生ずることが重い鎖の間の結合を化学的処理
に対して選択的に感受性を増すために必要と考えられて
きた［　Ｂｏ　ｂｒｚｅ　ｃｋａ氏その他ｒＩｍｒｎｕ
ｎｏｌｏｇｙ　ＬｅｔｔｅｒｓＪ第２巻第１５６（１９
８０年）参照〕。このような限定的蛋白分触からは、そ
の後にクロマトグラフ法によるｍ＆を景するような混合
産物を生ずる。

Ｒｊｖａｔ氏その他［ｒｌｌｔｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　Ｊ　Ｍ　５巻第５５７ｊｉｉｊ（１９７３年
）〕は、免疫グクロリンの重い鎖の間の二硫化結合を電
気化学的手段を用いて還元して遊綴の一８Ｈ基を有する
牛分子を生成する操作′ｆｒ記述している。しかしなが
ら、これらの牛分子は自動的な貴酸化ならびに同貴的褥
結台を起すので分離することができない。これらの半分
子の分析にアルキル化法が用いられたが、この反応さえ
も窒素雰囲気中で寮施せねばならなかった。

ｆ＃、台的結合免疫検定法は、液体培地中に存在する免
役反応物を短柱的１ｆｃは定量的に検定する六めに広く
用いられている。このような検定法の一つのタイプで均
質的免役検定法と称せられるものは、免疫反応物−指示
側結合体と作用して指ボ剤を測足可能な態様に変えるよ
うな特異的な免疫反応物受容体を利用している。、Ｃｆ
１指示剤は通常１種の排雪である、 Ｒｕｂｅｎａｔｅｌｎ氏その他による米国特許Ｍ＆８１
７，８３７号（１９７４年６月１８日）明細書に４１％
標識剤−免役反応物結合体中の指示剤１ａ錬力監抗体の
免役反応物への結合によって変調される胸部的競合的免
疫検定法を開示している。

Ｒｕｈ・ｅｎｓｔｅｉｎ氏その他による米国特許第へ９
５５β７４号（１９７６年１月２７日）明細誉壷ｔ１２
個の附３１１部位を有し、そのうち１個は対象となる免
疫反応物と共通で他の１個は免疫反応物とＩＪ４駕（指
示側標識）であるような反応剤を用いる方法を開示して
いる。耐着部位に２個の抗体ｔＥｒｄＪ時ＶＣＩＩ！１
合することは立体配置的に妨けられている。試示剤１１
１臓部位に結合されあるいＩま結合されない抗体を測定
することが未知の試料中の免疫反応物の童を知る方法と
なる。

Ｈａｍｍａｒｌｉｎｇ氏その他［ｒ、ｙ、　Ｉｔｘｐ、
　ＭｅｄＪ第１２８巻第１４６負（１９６８年）〕は、
二硫化結合で結ばれた２餉のＦａｂ’断片よりなる抗体
を用いての細１６表（２）の電子顕微鏡的観察を開示し
ている。１個のＦａｂ’断片は細胞！！面の抗原に対し
て特異的であり、亀の１曽のＰａｂ’断片は電子顕微鏡
によって鉋められる＊ｍ体に対して特異的である。

この検足方法は可溶性の抗原に対して一般的に適用する
ことはできず、稍巧な装置を必要とする。

１９８１年８月１９日に公告された欧州特許出願第０１
４．０５０号明細書は抗原結合部位と標識体結合部位と
を含む混合結合試薬で、２１１Ｊ５’ｒの部位は位歇が
空間的に離れているために抗原−ａｉｍ体結体物合物−
分子は両方の結合部位に結合す　　　”ることができな
いもの全利用する抗原およびハプテンｔｒｃ対する胸部
的免役検定法を開示している。標識体は、その活性が、
混合結合試薬の標識体結合部位への結合に際して変化す
るものが好ま」、い。標識体活性の測定値が液体試料中
の抗原の倉を示すことと彦る。混合結合ｔＩｔ薬は。

２個の異なる原形のままの免役グロブリン分子が互いに
結合」７て一体の試薬複合体を形成したものよりなる。

原形のままのＴｇＯからＩｇＧの半分子を製造するため
の効率のよい方法が必要とされている。

またそのような半分子から共有結合的交雑檜抗体を合成
するための集用的な方法も必要とされている、可溶性の
抗原に対する均餉的免投検定法において、共有結合的交
雑檜抗体を用いることの有利性は明らかである。

本発明の半分子は、本質的に純粋な重鎖−軽鎖の免疫グ
ロブリン半分子で、Ｒ−８−Ｘの＃Ｉ造（たたし式中Ｒ
はＨｌＬｌでありそしてＸは水索腺子＜Ｈ）あるいは８
０５である）を有するものである。こｔｌらの半分子は
、亜硫酸分解あるいは重い鯖のａｔｌの二硫化結合を還
元することによって免役クロプリン分子ｔ−ｉ＃ＩＡ−
軽鎖の半分子へ選択的１６分υ１することによって調製
きれる。

Ｘ発明の抗体は、央部的に純粋な共有結合酌交Ｈａ抗体
で、２８−の異なる重餉−軽鎖の半分子より本漬的にな
り、半分子中の一方は第１の抗原に対する結合部位を提
供し、他方は第１あるいは第２の抗原に対する化学的に
異なる結合Ｓ位を提供するものであり、また半分子は二
硫化結合を朋じて互いＫＭ合されているものである、こ
れらの抗体は、下−ピすなわち（Ａ、）　　第１の抗Ｉ
Ｊ！に対する抗体である免疫グロブリン分子を、１い鎖
の間の二硫化結合を加亜硫飲分解（ｓｕｌｆｌｔｏｌｙ
ｓｌｓ）することによって１鎖−＠鎖の半分子へ選択的
に分割してＳ−スルホン化された半分子を生成すること
、（Ｂ）第１の抗原または第２の抗原に対する抗体であ
る第２の免役グロブリン分子と重い鎖の間の二硫化結合
を還元することによって重鎖−＆鎗の半分子へ選択的に
分割して還元型σ１半分子を生成すること、 （Ｃ１前記工程（Ａ）から祷られたＳ−スルホン化され
た半分子を前記工程（Ｂｌから得た還元された半分子と
合体させること の諸工程によってＩＡｋされる。

各種の分析対象物（アナライト）を測定するための本発
明による均質的免役検定法は、下記の簿成分すなわち （Ａｌ１４１０半分子は第１の抗゛原に則する＃ｈ台部
位を提供し、第２の半分子は＠１の抗原に灼して化学的
に異なる結合部位または第２の抗原に対する結合部位を
提供し、かつここに云う半分子が二硫化結合を介して相
互に結合している２１１１０の異なる重鎖−軽鎖の半分
子から本漬的になる実負上純粋な共有結合的交雑糧抗体
、 （Ｂｌ　　分析対象物を含む生物学的試料、（Ｃ）　　
指示剤、ふ・よび （Ｄ）　　信号管発生する反応のための試薬逐次的ある
いは同時的にインキュベートする操作よりなる。

本発明の方法は、原形のまま・ＯＩｇＧ中の重い鎖の間
の二硫化結合を選択的に分割して重鎖−＠鎖の半分子（
ＨｌＬｌ）を生成し、かつまたかくして僧た異債の半分
子を秩序よく合体させて共有結合的交雑株抗体（Ｈ？Ｌ
？Ｈ”Ｌに）を生じさせるための数糧知の異なる方式を
包含する。交雑種抗体　　　　□の異部な両半部は二硫
化結合によって一緒にされている。この方法は所望の産
物を高い収率で生成し、また多くの場合精製を要しない
。２種類の半分子は、化学的に異なる２ケ所の結合部位
を提供しそれらは２８１類の異なる抗原に対することも
あり、あるいは同じ抗原に対してではめるが抗原上の異
なる位置において結合する場合もある。

本発明の方法は多段工程よりなる操作である、方法中の
最初の工程は２ａの異なる原形のままの１ｇ０分子中の
二硫化結合を選択的に分−１することである。単クロー
ン系の抗体を用いることも意図されている。元来の１ｇ
０分子から生じ喪中分子は、次に異債な半分子間の二硫
化結合の形成を助長するように組み合わされる。

重い鎖の間の結合を選択的に分割することとＸｇＧの半
分子を製造することはいくつかの方法によって達成され
る。一方法においては、原形のままの工ｇＧを５．５′
−ジチオビス（２−ニトロ安、１香酸）の存在下で、好
１１．〈は豪媒体体中で寥温ＶＣおいて窒業下に、亜硫
酸ナトリウムで加亜敬醗分解してＳ−スルホン化された
ＴｇＧの半分子を祷る。交雑種形成反応に用いうる２ｓ
類のＩｇ（１半分子のうちの一方はこのようにして８−
スルホン化される。

第２の方法ｖＣおいては、上記のようにして形成され７
１ｇ（Ｊ半分子をジチオスレイトール、β−メＡカプト
エタノールおよびβ−メルカプトエチルアミンのような
チオール基含有試薬と好ｉ　ｔ、、　＜は塩化ストロン
チウムを含むｓ１衝媒体中で結集下に＆応せしめる。し
かる後に、この反応の蛋白貴産物はゲルｐ過または透析
によってチオール試薬から分離される。この反応の蛋白
貴ｔｂｓは避難のスルフヒドリル基を担持するＩｇＧの
還元さｔｆｃ半分子である。

第３のｈａにおいては、原形のままの工ｇＧは最初に適
当な支持体（例えばアガロースビーズ）に共有結合的に
結合された例えばプロティンＡまたは抗原のよう々受容
体に結合せしめられる。

次にジチオスレイトールまたはβ−メルカプトエタノー
ルのようなチオール基含有試薬を結合状態のＩｇＧと（
室温、＊働媒体中、室巣−トで）反応させる。その結果
生ずる遊離のスルフヒドリル基を有する結合状態のＩｇ
Ｇ半分子は、高い塩：ａ度で低いｐｎの緩衝液を用いて
支持体から分離させ、そして同じ緩衝液に対して透析し
てチオール試薬を除去することができる、 交雑体形成反応に用いうるＩｇＧの２樵類の半分子のう
ち第２のものは、上述の方法のうちの一力法によってｌ
Ｉ！ｌ製される遊離のスルフヒドリル基を含有する半分
子である。

異なる抗原結合特異性を有する交雑糧抗体を生成するた
めの工ｇＧ分子の秩序ある交雑は、！１１〜の操作によ
って達成される。一つの操作法においては、第１の種類
のＩｇＧから上述の加亜硫飯分解ＶＣよって８−スルホ
ン化された半分子が−４される。蛋白質産物（免疫グロ
ブリンの半分子）は、その他の加亜硫酸分解反応産物か
ら窒素カスを璽龜で通気されている適宜の緩衝液ＶＣ対
して力析することによって分離できる。チオール試薬（
電しそれが存在するときには）の除去は、ゲルー過ある
いは例えばエチレンジアミンテトフ酢＃ｋを含む死金に
ガスを除き且っ輩ｓｒｓ気するｐ）（５の緩衝液中にお
ける透析によって蛋白質の再酸化を起こすことなく達成
される、これらの方法によって生成され＊２ａｉ類の異
なる半分子の集団を勢しいモル比の量に組み酋わせ、嫌
気的条件下で適宜の緩衝液（塩化ス　　　”トロンチウ
ムまたはそれ以外のアルカリ土金属堪を言む）中で透析
する。下記の求核的書換反応によって異質な両半部が二
硫化結合によって連結されている所望の交雑種抗体産物
を生ずる。

すなわち Ｒ−８−８Ｏｓ−＋Ｒ’−８Ｈ４Ｒ−８−８−Ｒ’　＋
Ｈ１３０３−ただし式中ＲはＨＰ：Ｌ′：ヲ表わし、イ
（、てＲ′は）代貸を表わす。

交ｔｌ＆の他の一操作法においては、上述のように第１
の工ｇＧからＳ−スルホン化された半分子を誘導する。

上述の重い鎖の間の結合を選択的に分割する第３の方法
によって第２のＩｇＧからスルフヒドリル基を含む半分
子を誘導する。しかしながら結合状態の工ｇＧ半分子は
、それらが結合されていた支持体（抗原で被覆されたビ
ーズあるいはセファロースゲル上に固定化されたプロテ
ィンＡなど）から溶離されない、その代わりに、支持体
は適宜の緩衝液に懸濁し、しかる後に遠心分離すること
により洗浄されてチオール試薬を除去する。次に第１の
工ｇＧのＳ−スルホン化された半分子を塩化ストロンチ
ウムを含む適宜の緩＠液中で第２の工ｇＧの結合状態に
あるヌルフヒドリル含有半分子を加え、室温で不活性気
相下で＆温（インキュベート）する。

かくして求杉性置換反応により支持体上で形成された父
雑種抗原は適宜の添加物（例えは高濃度の塩類または界
面活性剤）を含む緩衝液を用いて俗離することができる
。

選択的分割のてれそれの方法ならびに交雑操作からの反
応産物は下記の操作を用いて分析することができる。

非還元的粂件下におけるドテシル硫酸ナトリウム（ＱＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＣ）Ｋ）
は、未知の蛋白質またはホリにブチドの電気泳動的易動
度を既仰の蛋白質と比較して未知物置の分子量を推定す
るために用いられる。

この方法によれば、反応混合液中における個々の重い鎖
または軽い鎖ならびに工ｇＧの半分＋１たは完全分子の
存在を決定することか可能になる。

ポリアクリルアミドゲルにおける等電点決定法は、等電
ｐＨ（すなわち特定の浴媒中で蛋白質が正味の電荷ゼロ
となるｐＨ）の差を基礎として蛋白質を分離するために
用いることができる。

元来の抗体のどちらとも異なる交雑棟抗体の存在は、こ
の手法によって決定することができる。

この手法はＳＤＳ　−ＰＡＧＫ法よりも判別能か高い。

寒天ゲル中における二重拡散法は、抗体による抗原結合
を検出する方法を提供する。ケル中の別々の凹みに入れ
られた抗原と抗体は互いに相手に向かって拡散する。抗
原か抗体によって結合されると沈澱物（不溶性の抗原−
抗体複合体）が凹みの中間に線となって生して税込され
る。２価の抗体のみがそれの抗原との間で沈澱物を生ず
る。交雑権抗体は、それぞれの抗原に関ｔ、″′Ｃは１
価であるから、どちらの抗原との間ＩｔＣも沈澱物を生
じない。

本発明の方法により調製した交雑謹抗体は、２１ＰＩＡ
の異なる抗原の抗体による１繊を必要とする免役検足ａ
−にとって有用である。特にこれらの抗体は、共有ｆＩ
ｈ合的交雑極抗体に＄１の抗原が結合するとそれが交雑
種抗体に対する第２の抗原の粘合を変調させうる場合に
有用である。

第１の抗原とは関心のある分析対象物であり、そして第
２の抗原とは交雑−抗体に結合したときにその活性度が
変調される＃索のごとき指示剤をいう。

生物学的試料中の分析対象物とは、その濃度を御１足す
ることが望まれる物餉をいう。生物手釣試料とは、全皿
欣、血清、血漿、極液、脳背髄液または尿、あるいは細
胞および組織の抽出液でありうる。

分析対象物は多くの場合これらの生物試料液中に存在す
る蛋白質であるが、薬剤、ホルモン。

ビタミン、酵素、抗体、多糖質、細菌、原生動物、７Ｘ
繭、ウイールス、細胞および組織の抗原、その他血液細
胞または血液の液体部分子の物質もこれに含まれる。

本発明による免役検定法のＭｌの観点においては、指示
剤は交雑株抗体に結合したときにその活性度が変調され
る＃索である。特異的なβ−カシクトシダーセは、本発
明による免役検定法に用いるのに望ましい＃鴬である。

このＳ＊は抗体変調酵素断片（ＡＭＫＦ　）突然変異体
として知られている大腸菌のＷ６１０１１ａｃ　ｚ″′
′薗株単離される。野生型のβ−カラクトシダーセに対
する抗体は、この突然変異体のＭｌ基を特異的に活性化
しうる、この変調はま九１価の抗体断片（］４ａｂ）に
より、そして従って交雑種抗体の１ケバ１の結合部位に
結合することによって起りつる。

１１体と結合したときにその活性度が変調されるそのイ
ルの使用可能な指示剤酵素にはフェニルアラ−゛ニンヒ
トロキシラーセ％にニシリナーゼ、グル１−スオキシタ
ーゼおよび人間の前立腺酸性ボスファターセが含まれる
。本発明による免疫検定法においては、他の非酪素的ル
示剤す々わち螢光性１以子団、放射能物質および生物発
光または化学発光物質も機能を発弾することができる。

笈鯛は通常指示側活性の助長という形で現われ右が、不
活性化という場合もＩＪ）うる。

分析対象物がそれに特異的な結合部位に結合すると、交
雑釉抗体上で指示剤に特異的な結合部位への指ボ剤の結
合が阻害される。かくして分析対象物の結合部位が充満
されたときには指水剤の活性度は変調嘔れないので、検
定の終結時に測定される指示剤の活性度は生体液中にあ
る分析対象物のき度に比例する。

本発明による免疫検定法は競合的結合の均負的免凝検定
法に比べて感度が良好である。それは１個の分析対象物
分子が交＃移抗体に結合すれは指示剤の活性度を実餉上
完全に変調させる、すなわちｍｈ的免疫検定法となるか
らである。

従来慣用の検定法においては、１個り上の分析対象物分
子が２価の抗体に結合し、指不剤またはＩｌｉ誠剤の活
性度は１個の分析対象物の分子が抗体に結合しても必ず
しも児全Ｋｉ−されるとはいえない。

ある釉の状況下では、間鵜の分析対象物の分子は＃素指
水剤が共有結合的交雑権抗１Ｘ　ｔｉｃ　Ｍ　＠するこ
とを妨げるに充分なほど大きくない　これらの機会には
、（既知ｍ嵐の）分析対象物の複合体を本発明の方法に
用いることができる。

分析対象物複合体と遊離の分析対象物は交雑種抗体への
結合において競合する、分析対象物複合体の結合は立体
配置的またはイオン的に酵素指示剤の結合を阻害し、か
くしてその活性度のに調を防げる。このような分析対象
物複合体とは、分析対象物が大分子量の担体蛋白質と共
有結合したものでもよく、またラテックス粒子と結合し
たものでもよい。

任意的に交雑種抗体を修飾することもできる。

例えはグルタルアルデヒド交叉結合によって蝶番（ヒン
ジ）部分の弾力性を低下させれば、その結果酵素指示剤
の結合を立体配置的に妨げるために大きな分析対象物を
必要とすることはなくなる。

本発明の均質酌交雑種抗体免疫検定法を実施するには、
交雑糧抗体と酵素指示剤と未矧量の分析対象物を含む生
体液とを混合して保温する。

酵素指示剤の変調された活性度を決定するための酵素検
出試薬はその後で加えればよい。場合によって最初の混
合および保温段階で低分子の分析対象物を測定するため
に分析対象物複合体を利用してもよい。また場合によシ
交雑種抗体を生体液と共に予め加温してしかる後に酵素
指示剤を加えてもよい。

酵素指示剤を検出するための試薬は使用される酵素指示
剤の糧類によって決められる。これらの検出試薬は、酵
素指示剤に特異的な発色性または発螢光性の基質である
ことが好ましい。

酵素の活性度を測定するための他の手段例えば電気化学
的方法も本発明の方法に用いることができる。

発色性の基質が酵素的に分解されて生ずる色の測定値は
、変調された酵素指示剤の活性度に比例する。従ってこ
の活性度は生体液中に存在する分析対象物の量の函数で
ある。このことがら、既知濃度の分析対象物を含む試料
の一系列に対して免疫検定法を実施することによって生
体液中の未矧濃度の分析対象物を定量することができる
。

第２の叢点において、本発明の免疫検定法は分析対象物
に％異的な１個の結合部位と酵素指示剤に特異的な別の
１個の結合部位とを有する共有結合酌交雑種抗体を用い
るものである。しかしながらこの場合においては、酵素
指示剤の活性度は必ずしも交雑種抗体に結合すると同時
に変調されなくてもよい。交雑穐抗体は、酵素指示剤と
酵素−分析対象物複合体とを空間配置上で接近させる機
能をはたす。酵素指示剤と酵素−分析対象物複合体中の
渠２の異なる算素とは、−万の酵素により触媒される反
応の産物が能力の酵素の基質となるように選定すること
が好ましい。かようにして両方の酵素が空間配置上で極
めて近′＃（１５０Ａ）して交雑種抗体に結合すれば、
最終産物生成の速度が増大することが観察される。この
際Ｚａｌ類の酵素のうちの一方は交雑穐抗体に直接結合
するのでなく、複合体を形成している相手の分析対象物
を介して結合していることに注目せねばならない。生体
液からの遊離の分析対象物は酵素−分析対象物複合体の
結合と競合する。従って分析対象物が多けｎば多い種酵
素−分析対象物の少量が交雑株抗体に結合され、最終産
物生底速度の増加は少ない、かように酵素反応の速度と
生坏液中の分析対象物の濃度との間には反比例的関係が
観察される。

本発明のこの観点において望ましい酵素系は、西洋ワサ
ビのパーオキシダーゼを指示剤酵素とし、グルコースオ
キシダーゼを酵素−分析対象物複合体に用いるものであ
る。グルコースオキシダーゼはグルコースと水の存在下
で過酸化水素の生、成を触媒する。かくして生じた過酸
化水素は西洋ワサビのパーオキシダーゼの基質となり、
適当な発色性基質の存在下で過酸化水素濃度に比例する
割合で色を生ずる。上記のように色の生成の割合は生体
液中の分析対象物の濃度と反比例的関係にある。

第５の観点においては、本発明の免疫検定法は分析対象
物に特異的な１個の結合部位と凝集性物質すなわち指示
剤に特異的な他の１個の結合部位とを有する井有結曾的
交雑種抗体を用いる。凝集性物質とは多価蛋白質か、多
ハプテンー蛋白質複合体かまたはハブテンで、それぞれ
ラテックス粒子に接着しているものである。本発明の方
法に有用なラテックス粒子の例は１９８１年１０月２８
日付米国特許出願第３１５，９２２号明細書に記載され
ている。

本発明の第６の観点の方法は２段階に実施される。第１
段階は結合段階であって、交雑種抗体と生体液からの分
析対象物と多価の分析対象物−蛋白質複合体のごとき多
重の分析対象物（信号発生試薬）とが混合される。交雑
種抗体は、その１個の結合部位で生体液からの遊離の分
析対象物に結合することもあり、ろるいは多重の分析対
象物に結合することもある。第２段階では凝集性物質が
加えられ、交雑棟抗体−多重分析対象物複合体が凝集物
質と結合して凝集を起こす。その結果濁度が増大し、そ
れは分光光度計を用いて測定できる。１疑集の程度は生
体液中の分析対象物の濃度に反比例する。

本発明の方法は、１価の抗体断片すなわち半分子（Ｈｌ
Ｌｌ）の調製ＶＣ有用である。先行孜術又献中には、　
ＦａｂおよびＦａｂ’断片のととき１価の抗体断片の有
用性についての報告がある。　Ｆａｂ断片は原形のまま
のＩｇＧから酵素パパインを用いる限定的蛋白鵞分解く
よって生成されうる。

それらの断片は抗原との結合に関しては１価であるが、
　　ＩｇＧのＩＰ。領域を欠いている。ｔａｂ’断片は
原形のｔまの工ｇＧのＲ−／シン分解により豹導される
Ｆ（ａｂ）２断片°の重い鎖の間の二硫化結合の還元に
よって生成されうる。Ｐａｂ’断片もまた１価であるが
ＰＣ領域を欠いている。本発明の方法により合成される
半分子は、抗原との結合に関して１価であり１反応性の
スルフヒドリル基またはチオａｍ基を含み、かつ重要な
ＦＱ領領域保持している。それらの合成は迅速でありし
かも精製の段階を蚤しない。

例１　交雑種抗体の合成 Ａ、　　Ｓ−スルホン化された半分子の１ｌＩ１１ｊｌ
ｉ！抗西洋ワサビパーオキシダーゼ抗体（抗ＨＲＰ　）
を含む家兎血清から採取した市販のＩｇＧ分ｌｌ１ｌｔ
西洋ワサビパーオキシダーゼと結合させ九アガロースビ
ーズ上で免疫親和性クロマトグラフ法によりさらに精製
した。抗ＨＲＰを含む結合分画は燐酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｂ）に溶解された２、５Ｍチオシアン化ナトリウムを用
いて親和性吸着剤から溶離された。ＰＢＳ緩衝液の組成
は、塩化ナトリウム０．１４Ｍ、塩化カリウム２ｍＭ、
燐酸二水素ナトリウム８ｍＭ１燐酸二カリウム１５ｍＭ
、および場合によジアジ化ナトリウム０．０２１！（容
量中重量）を含有しそしてｐＨ７，４であった。溶離液
を４ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢ＩＩｋ（１ｉＤＴ
Ａ　）を含有するｐＨ８，５の０．１Ｍ硼酸塩液を何回
も取り代えて透析した。抗ＨＲＰ　ｏ′□最終濃度はＩ
ｇＧの１■／−溶液が２８０゜ｎｍ　においてｔ４の光
字濃度を有すると仮定して２叩／−に調整された。

この精製抗ＨＲＰの０．５ｗｔ（１＋５９）Ｋ固体状亜
硫酸ナトリウム６．２６■および５．５′−ジチオビス
（２−ニトロ安層香除）　（ＤＴＮＢ）　０．５譜を添
加した。

反応敵はＩｌ！素気流中で室温において３時間攪拌し、
しかる後１　ｍＭのＩＴＡを含む２０ｍＭＮ−）リス（
ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン
酸（Ｔ］１Ｃ８）緩衝ｆｌｉ　（ｐＨ６−５）　Ｋ対し
て一夜透析した。その産物は８−スルボン化されｆｃ家
兎抗ＨＲＰの半分子であった。

Ｓ−スルホン化された家兎抗ＨＲＰを非還元的条件下で
不遅綬的８Ｄ８−ポリアクリルアミドゲルにより分析し
たところ、みがけの分子量７５βｏ。

ダルトンで半分子Ｈ１Ｌ１に該当する１本のバンドが担
われた。５％（Ｖ／Ｖ　）のβ−メルカプトエタノール
（βＭｉｎ）で還元したところ、みかけの分子量が５５
．ＯＤＤお工び２４０００でそれぞれ遊離の１い鎖（Ｈ
）ならびに遊離の軽い鎖（Ｌ）に該当する２本のバンド
が認められた。

Ｂ、　　１１元され７’ｔ（ＳＨ）半分子ノｗＩ４製Ｉ
ｇ分画は、抗グルコースオキダーゼ（抗Ｇｏ）を含む市
販のヤギ血清から、その血清にｐ）（７，０の蒸留水に
溶解した硫酸アンモニウムの飽和溶液を同量で加えるこ
とによって調製された。この溶液を室温で３０分攪拌し
、しかる後４ｃで８０ＤＯＸｆで遠心分離したゎ上清液
を傾瀉し、沈澱塊を飽和の硫酸アンモニウムに再懸淘し
、遠心分離し、そして上清液を再び傾瀉した。沈澱塊を
当初の血清の量の半分の蒸留水に杏び溶解し、生じた溶
液をＰＢＢに対して徹底的に透析した。透析を終えた液
を、ガラスフィルター付Ｐ斗中でプロティンＡと結合し
たセファロースＣＬ−４Ｂゲル（ファルマシア社製品）
に加えた。

１８分１１１１ｉ２．５ｇａｔ当り約５−のゲルを用い
た。ゲルｔ−２０倍量のＰＢＳで洗いそして工ｇＧ　を
含む結合分画を１倍量のｐＨ３，０の０．１Ｍグリシン
で溶離した。溶離液はＰＢＳ　Ｉｃ対して徹底的に透析
した。

透析を終えた溶液をアミコン（Ｊｍｉｃｏｎ）ＰＭ−５
０膜を用いる限外テ過法によシ蛋白質含量２■／７！に
まで濃縮し、そしてその純度は５ＤＥＩ−ＰＡＩ　Ｋよ
って９５％と判定された。このＩｇＧ分画を、グルコー
スオキシダーゼを結合したアガロースヒース上で免疫親
和性クロマトグラフ法によりさらに精製した。抗■の溶
離は前記の抗ＨＲＰについてと同様にして実施した。最
終濃度は２■／−に調整した。

この精製し念ヤギの抗Ｇｏ液１．０−（１Ｍ９）にＣＮ
Ｂｒで活性化したセファロース４Ｂから調製したＧＯと
結合せしめたセファロース４Ｂ　１−を加えた。セファ
ロースに対するＧＯのおよその比は、湿潤ゲル１−当り
２ｗ１ｇでめった。抗体はゲルと共に１時間室温で継続
的に混合しながら保過した。しかる後ゲルを臨床用遠心
器で遠心分離しそして上清液を採取した。その上清液の
光学濃度を２８０　ｎｍにおいて測定した。工ｇ（）の
１ｍ９／−の溶液の光学濃度を１，４とする基準値から
、Ｖｒ、ＧＯ抗体のｌＪ５０９６がケ゛ルに結合された
と推定された。ゲルを６回０．１Ｍ硼酸塩７４ｍＭ　Ｋ
ＤＴＡ（ｐＨ８，５）液に懸濁し、しかる後、上溝液の
遠心分離および吸引によって洗浄した。最終回洗浄の後
に沈澱塊２ｏ、１ｕｇｊＩ＆塩／　４　ｍＭ　ＦｉＤＴ
Ａを含む１）Ｈ８，５の１４ｍＭβＭＥ液の同量中に再
懸濁し、窒素気流下に室温で５０分間畿盪しながら保温
した。

ケ゛ルを遠心分離によって懸濁液から分離し、上清液を
吸引除去し、０．１Ｍグリシン／　４ｍＭ　ＫＤＴＡ（
ｐＨ３，０）の液を用いてゲルを溶離した。溶離！ｋＯ
，ｏｚｕグリシン７４　ｍＭ　Ｆｌ！ＤＴＡ　（ｐＨ６
，０）の液に対して窒素ガスを継続的に通気しながら透
仇し友。生成物は還元型（ＳＨ）のヤギ抗Ｇｏ抗体であ
った。還元されたヤギ抗Ｇｏ標品を５ＤＳ−ＰＡＧｌｎ
により非還元的条件下で分析した結果、みがけの分子量
７５，０００ダルトンに該括する１本のバンドが現われ
た。また２本の副バンド（全蛋白負の１０重童俤以下）
が現われ、みがけの分子蓋はそれぞれ５５，０００お工
び２３［００ダルトンに該当した。これら三者はそれぞ
れ半分子（ＨｌＬｌ）。

遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖に該当する。

５　％　＜Ｖ／ｖ）　（ＤβＭＫを加えたところ、７５
．ＯＯＯタルトンのバンドは予期された通り５５，００
０および２４０００ダルトンのバンドに転化した。

Ｃ８交雑棟抗体の調製 Ｓ−スルホン化された家兎抗ＨＲＰと還元されたヤギ抗
ＧＯとの等量を混合しそして透析管に移した。かくして
生じた容液を室温で２４時間２０ｍＭ　ＴＫＳ　、　１
ｍＭ　１１１１：ＤＴＡおよびＯ，１Ｍ塩化ストロンチ
ウムの液（ｐＨ６，５）に対して窒素ガスを継続的に通
気しながら透析した。混合液をしかる後ＰＢＳに対して
２４時間透析した。

透析した溶液を、非還元的条件下でＳＤＳ　−ＰＡＧＥ
により分析した結果、みかけの分子量１５０，０００ダ
ルトンに該当する１本の主バンドが現われた。

そしてそれは５％（ｖ／ｖ　）のβＭｌにより還元した
ところ、みかけの分子量それぞれ５５，０００および２
３，０００ダルトンの２本のバンドを生じた。

これら王者の分子量は、それぞれ生成物である共有結合
的交雑糧抗体、遊離の重い鎖および遊離の軽い鎖に該当
する。、（ゲルが過負荷になり几際には非還元的条件下
で５５，０００および２６．０００ダルトンに該当する
弱いバンドが検出された。これらのバンドは多分抗ＧＯ
の還元中に生じた遊端の重い鎖および遊離の軽い鎖ｆｔ
表わすものである。） 共有粘合的父雑橿抗体の瞥性を摩天ゲルニｌ拡散法によ
りさらに詳しく検定しｆｃ、原形の抗体すなわち抗ＨＲ
Ｐおよび抗ＧＯをそれぞれＨＲＰおよびＧＯに対して拡
散させた際には沈降バンドがＶめられたのに対して、本
発明の方法にょシ８−スルホン化された抗Ｔ（ＲＰおよ
び還元された抗Ｇｏから形成された交雑種抗体はＩ（Ｒ
ＰおよびＧｏのいずれとも沈降物を形成し得なかった。

またＳ−スルホン化された抗ＨＲＰをＨＲＰに対して拡
散させたとき、ならびに還元された（　ＥＩＨ）抗ＧＯ
をＧｏＫ幻して拡散させたときにも沈降を年じなかった
ので、これらの半分子が抗原との結合に関して１価のも
のであることが確認された。しかるに交雑種抗体をヒツ
ジの抗家兎工ｇＧ抗体またはヒツジの抗ヤギｒｇＧ抗体
に対して拡散させたときには沈降が認められ、この抗体
の二重的（交雑釉的）特性が示された。

上述のように調製した交雑種抗体を、さらに固相免疫沈
降法に工９＃素抗原に結合する能力について分析した。

交雑樵抗体２５μｌを１０ｔのグルコースオキシダーゼ
（ＰＢＳ　中１　ｑ／ｖｒｌ　）と共に１時間室温で保
温した。１チの卵白アルブミン（ＯＶＡ　）および０．
０５％のトリトンＸ−１００（ローム・アンド・ハース
社から市販の非イオン性界面活性剤）を含むＰＢＳにヤ
ギの抗家兎工ｇＧで被覆したラテックスビーズ（ビオー
ラド社裂品）の懸濁液７５１を上記に加え、そして１時
間室温で振盪しながら保温した。懸濁液を遠心分離し、
沈−塊をＰＢＸｌｏＶＡ　／　トリトンＸ−１００１Ｉ
ｋ衝液で３回洗浄して遠心分離した。最終回洗浄の後ビ
ーズｉ　ＰＢＳに溶解し［０，１Ｍグルコース液５０Ｄ
ｔ、５ｍＭの０−）ユニレンジアミン（ＯＰＤ）液１０
０ｔおよびＰＢＳに１ｌｉ１屏した西洋ワサビバーオキ
シダーセ（ＩＮｇ／ｍ）奴ＩＣ１ｌ中に再懸濁した。そ
して発色の度合を４６　Ｌｌ　ｎｍにおいて追跡＃１定
した。この測定の対照としては、家兎／ヤギ交雑種抗体
に代えてヤギの抗グルコースオキシダーセ抗体の自家交
雑体の使用および抗体なしまたはグルコースオキシダー
ゼなしの測定含金めた。

この測定における発色反応の基礎は下記の通りである。

すなわち交雑種抗体は、それが有する家兎からの（ＨＲ
Ｐと結合する）特性によりヤギの抗家兎工ｇＧ抗体で被
覆されたビーズに結合と された。グルコースオキシダーゼは交雑種抗体が存在し
たときにのみこれらのビーズによって沈降された。（原
形のままのヤギの抗グルコース万キシダーセ抗体あるい
はその同じ抗体の半分子の存在は測定に影響しない。こ
れはそれらがヤギの抗家兎工ｇＧで被覆されたピースに
よって沈降されないからである。このことは本例に　　
　　□記載したと同じ方法により自身で交雑体化された
ヤギの抗グルコースオキシダーゼ抗体ヲ用いる対照潰１
１定により証明された。）遊離のグルコースオキシダー
ゼを全部除去するまで洗浄した後にグルコース、ＯＰＤ
およびＨＲＰを加えた。グルコースオキシダーゼはグル
コースを加水分解してＨ２Ｏ２を発生し、これがＨＲＰ
のための基礎となった。交雑糧抗体によって結合された
グルコースオキシダーゼの存在下（遊離のＧＯはすべて
洗浄除去された）においてのみ発色が起こった。

上記のごとく測定したときに、本例によ。り合成された
交雑種抗体は発色を引き起こした。測定操作から抗体ま
たはグルコースオキシダーゼを除いたときには、発色は
なかつ友。ヤギ５／家兎交雑橿抗体に代えて自家交雑し
たヤギの抗グルコースオキシダーセ抗体を用いたときに
は発色はなかった、これらの結果は、所望の交雑種抗体
産物が得られたことを立証している、例２　固定化した
抗体のβ−メルカプトエタノールを用いた還元によるＩ
ｇＧ半分子の調製プロティンＡ−セファロースＣＬ−４
Ｂ　ケル’ｉｏ、ＩＭ硼酸塩／　４　ｍＭ　ｌｌ１ＤＴ
Ａ　緩衝液（ｐＨ８，５）中で膨潤させた。５０％（ｖ
／ｖ　）の懸濁液ＳＯＺに１■／−の家兎抗西洋ワサヒ
バーオキシダーセＩｇＧ浴１を加えた。これを１時間室
温でたえず攪拌しながら保温し、しかる後遠心分離した
。上滑液を吸引除去し、沈澱塊ｔ−０，１Ｍ硼酸塩／４
ｍＭ　Ｆ！ＤＴＡ。

（ｐＨａ５）緩衝液で３回洗浄した。最終回洗浄の後に
沈澱塊を同じ緩衝液に溶解した１４ｍＭβ−メルカプト
エタノール１００ノに再懸濁しそして窒素気流下に室温
で１５分間保温した、しかる後これを遠心分１１ｍ＋、
上滑液を吸引除去し、そして沈澱塊をｓ＃１塩／ＦＤＴ
Ａ緩衝液で６回洗浄した。沈澱塊はプロティンな−セフ
ァロースゲルに結合された還元型の半分子を言んでいた
。

還元型の家兎抗ＨＲＰ半分子の収率は７５％で、そのう
ち９０暢は洗浄段階を経九後にもゲルに結合されていた
。結合された半分子はそのままで（例３参照）利用する
こともでき、また０、１Ｍグリシン７１ｍＭ口ＴＡによ
シヶ゛ルから溶離することもできる。生成物の特性を上
述の操作により検定した。

例３　交雑種抗体の調製 上記の例により調製した沈殿塊に、上記例１のＡのよう
に１ｌｉＩｌ１１！シたＳ−スルホン化されたヤギの抗
ＧＯ半分子の同重量を２（ｌ　ｍＭ　ＴμｓハｍＭ　Ｂ
ＤＴＡ／　０．　Ｉ　Ｍ　ＢｒＣ１２に浴解したものを
加えた。沈殿塊を再懸濁し、室温において窒素気流下で
一夜攪拌した。しかる後上清液を除去し、沈殿塊を２０
ｍＭ　ＴＫＳ　／　１　ｍＭ　ＥｌｉＤＴＡ／　０．１
　Ｍ　ａｒＣＬ２液で１回洗浄し、笛らにＴＦ！Ｓ／Ｆ
ｉＤＴＡ液で２回洗浄した。結合生成物である工ｇＧ交
雑橿抗体をｐＨ３，０の０．１Ｍグリシン液で浴解し、
そしてＰＢＳ中に透析した。

生成物の特性を上記の操作により検定した、例４　β−
メルカプトエチルアミンを用いた還元によるＩｇＧ半分
子のＷ＠袈 ２藁９／−の家兎工ｇＧ　ｆｆ１ｒ液９００ｔに２０　
ｍＭ　ＴＫＳ／１ｍＭ　Ｅｌ！ＤＴＡＯ液（ｐＨ６，５
）に溶鱗した１Ｍβ−メルカプトエチルアミン１００１
を加えた。３７℃で２時間保温し、しかる後試料をＴＫ
Ｓ／ｍＤＴＡ液中で平衡したセファデックスＧ−２５ゲ
ルを通過させた。これらの条件下で工ｇＧの約８０％が
還元された半分子に転化された。残りの２０％は重い鎖
の二量体および遊離の軽い鎖であった。かくして生成さ
れた還元型の半分子は、例１ｃに従って共有結合的交雑
１抗俸の製造に利用することができる。生成物は上述の
操作を利用して示　　　：性化された。

例５　別法による共有結合的交雑１抗体の合成例１Ｂに
記述したように精製したヤギの抗グルコースオキシダー
セ抗体’ｔ、％ＩＡＫＦ述した家兎の抗ＨＲＰ抗体と同
様にしてＳ−スルホン化することができる。余分のＤＴ
ＮＢを除去するために透析した後に、反応混合液を０．
０１４ＭβＭＫ濃度に調整し、そして２０　ｍＭグリシ
ン、４ｍＭＫＤＴＡおよび０．ＩＭ　５ｒＣ１２の緩衝
液（ｐＨ３，０）に対して一夜透析することができる。

しかる後溶液と例１Ａにより調製したＳ−スルホン化さ
れた家兎の抗ＨＲＰ抗体とを例１Ｃに記述したように交
雑することができる。

このような合成による所望の交雑種抗体の収率は９０チ
に接近すると期待される。それはこの日−スルホン化経
路による還元型抗グルコースオキシダーゼ抗体の収率は
約９０％に達するからである。

例６　単クローン抗体から半分子の合成重クローン抗体
を用いて、例Ｉ　ＡＫ記述したようにしてＳ−スルホン
化された半分子を調製し、その特性を検定した。所望の
８−スルホン化された半分子の収率は１００囁であった
。単クローン抗体は抗テオフィリン抗体（部類１の重い
Ｓおよび軽い鎖の同類体）ならびに抗ジゴキシン抗体（
部類３の重い鎖および軽い鎖の同類体）であった。出発
物質となる単クローン抗体を限外濾過により２ｍｙ／−
にまで濃縮した腹水から親和性法により精良しそして球
天ゲル中に。

おける二重拡散法により軽い鎖の同類体および重い鎖の
部類分けについて検定した。

＠Ｊ　７　　交雑種抗体試薬を用いる酵素活性化免疫検
定法 大分子量の分析対象物に対する免疫横定法に下記の材料
すなわち （ａ＋　　分析対象物お工びｙ＃素指指示剤対して特異
的結合性を有する共有結合酌交雑種抗体（米国特許出願
第３１５，９２２号参照）、（ｂ）その活性度が共有結
合酌交雑種抗体への結合によって変調される信号発生性
酵素指示剤、（ｃｉ　　比色定量ならびに螢光定量的信
号発生反応のための試薬、および （ｄｌ　　分子量が≧１０．［１００，さらに多くの場
合には≦１００，０００の蛋白質である分析対象物を含
む生物試料 を用いる。

生物試料としては血清試料でも尿試料でもまた全血液試
料でもよい。酵素指示剤とは、酵素または酵素のサブユ
ニットでおって抗体によって結合されなけれは不活性の
もの、すなわち大腸菌ＡＪｉｌ四突然変異体のβ−ガラ
クトシダーゼまたは人間の前立腺酸性ホスファター七で
ある。

信号発生反応のための試薬とは、酵素指示剤の発色性ま
たは発螢光性基質にｐＨ４〜１０の水性緩衝液中の任意
の追加の副槽成分または陽イオン金加えたものである。

材料（ａ）、（ｂ）および（ａ）は試料（ｃ’ｌを加え
る以前に少時−緒に０〜５０Ｃ５さらに多くの場合には
２２〜４６℃に保温することが好ましい。しかしながら
、場合によっては酵素指示剤を加える前に成分（ａ）お
よび（ｂｊを予め保＊Ｌ（インキュー＜−ト）するめが
望ましいこともある。また全部の材料を同時に加えても
よい。保温の時間は通常５０分以下そして多くの場合１
〜４分間である。酵素によって発生せられた信号の測定
は、材料（ｃｉの添加後通常３０分以内そして多くの場
合３分以内に行われる。

酵素指示剤が不活性であってそして抗体に結合されたと
きにのみ活性となる場合には、発生せられる信号の倉は
試料中の分析対象物の励度に反比例することになる。酵
素指示剤が活性でそして抗体に結合されたときにのみ不
活性化される場合には、発生せられる信号の量は試料中
の分析対象物の濃度に正比例することになる。

モアースーア／ドーコンパニ−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　　僧ｍＲ−Ｂ−Ｘ　（ただし式中ＲハＨＩ　Ｌｉ
   を表わしそしてＸはＨあるいは５ｏ５−を表わす）を有
   する基本円に純粋な免疫グロブリンの重い鎖−軽い鎖の
   半分子。 ２）ジゴキシンに対する単クローン抗体から得られ、式
   中のＸが８０３−でめジそ・してジゴキシンに対する抗
   原結合特異性を有する特許請求の範囲第１項記載の免疫
   クロプリン半分子。 ６）テオフィリンに対する単クローン抗体から得られ、
   式中のＸが５ｏ３−でめりそしてテオフィリンに対する
   抗原結合特異性を肩する特許請求の範囲第１項記歇の９
   ｅ、投クロプリン半分子。 ４）重い鎖の間の二硫化結合の加亜硫酸分解によシ免疫
   グロブリン分子を選択的に分割して重い鎖−軽い鎖の半
   分子ンすることよりなる、免疫グロブリンのＳ−スルホ
   ン化された半分子を調製する方法、 ５）重い鎖の間の二硫化結合の加亜硫酸分解によシ免疫
   グロブリン分子を選択的に分割して重い鎖−軽い鎖の半
   分子とし、しかる後Ｓ−スルホン化された半分子を還元
   することよりなる、免疫グロブリンめ還元型半分子を調
   製する方法、 ６）重い鎖の間の二硫化結合の還元により免疫グロブリ
   ン分子を選択的に分刻して重い鎖−軽い鎖の半分子とす
   ることよシなる、免疫グロブリンの還元型半分子を調製
   する方法。 ７）第１の半分子は第１の抗原に対する結合部位を提供
   し、第２の半分子は第１の抗原に対して化学的に異なる
   結合部位あるいは第２の抗原に対する結合部位を提供し
   、かつ半分子が二硫化結合を介して互いに結合している
   、本質的に２種類の異なる重い鎖−軽い鎗の半分子から
   なる基本的に純粋な共有結合酌交雑種抗体。 ８）第１および第２の半分子が興なる抗原に対して化学
   的に異なる結合部位を提供する特許請求の範囲第７項記
   載の共有結合的交雑程抗体。 ９）第１の半分子が分析対象物に対する結合部位を提供
   しそして第２の半分子が指示剤に対する結合部位を提供
   する特許請求の範囲＃ｓ８項記載の共有結合酌交雑種抗
   体。 １０）下記の緒段階すなわち （Ａ）　　重い鎖の間の二硫化結合の加亜硫酸分解によ
   り＠１の抗原に対する抗体である籐１の免疫グロブリン
   分子をその重い鎖−軽い餉の半分子に選択的に分割して
   Ｓ−スルホン化された半分子を生成すること、 （ｂｌ　　重に鎖の間の二硫化結合の還元により、第１
   の抗原または第２の抗原に対する抗体である第２の免役
   グロブリンをその重い鎖−軽い鎖の半分子に選択的に分
   割して還元された半分子を生成すること、そして （Ｃ）　　前＋に：（Ａｔ段階からの８−スルホン化さ
   れ九半分子と前記（Ｂ）段階からの還元機半分子を合体
   させること を包含する共有結合的交雑抛抗体の調製法。 １１）下記の諸鱒成分すなわち 囚　ｍｌの半分子は、＠１の抗原に対する結合部位を提
   供しそして［２の半分子は第１０　　　　゛抗ＩＮＫ対
   する化学的ＶＣ異なる結合部位あるいは＃！２の抗原に
   対する結合部位を提供し、そしてこれら半分子が二硫化
   結合を介して互に結合されているものである本質的に異
   なる２種類の重い鎖−軽い鎖の半分子からなる基本的に
   純粋な共有結合酌交ｍ機抗体、０）分析対象物を含む生
   物試料、 （Ｃ）　　指示剤および Φ）信号発生反応のための試薬 ・七順次的または同時的に保温（インキュベート）する
   諸段階を包含する、分析対象物＃ｊ定のための均質的免
   疫検定法。 １２）指示剤が酵素でありそして信号発生反応試薬が酵
   素の基質である特許請求の範［９１１項記載の均質的免
   疫検定法。 １６）指示剤が凝集性物質てありそして信号発生反応試
   薬が多１分析対象物である特許請求の範囲第１１項記載
   の均質的免疫検定法。