JPH01114758A - パパインを含まない抗体フラグメント調製物の製造方法 - Google Patents
パパインを含まない抗体フラグメント調製物の製造方法Info
- Publication number
- JPH01114758A JPH01114758A JP63228924A JP22892488A JPH01114758A JP H01114758 A JPH01114758 A JP H01114758A JP 63228924 A JP63228924 A JP 63228924A JP 22892488 A JP22892488 A JP 22892488A JP H01114758 A JPH01114758 A JP H01114758A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- papain
- antibody
- antibody fragment
- digested
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 229940055729 papain Drugs 0.000 title claims abstract description 99
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 title claims abstract description 96
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 17
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 15
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 15
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003106 anti-papain Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 4,4'-dipyridyl disulfide Chemical compound C=1C=NC=CC=1SSC1=CC=NC=C1 UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000219173 Carica Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- -1 bis(maleimido) methyl Chemical group 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N dodecyl benzenesulfonate;sodium Chemical compound [Na].CCCCCCCCCCCCOS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940080264 sodium dodecylbenzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/6857—Antibody fragments
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ｌ」立背月
本発明は、抗体フラグメントを得るための全抗体の蛋白
分解消化に関する。特に、本発明は、パパイン消化全Ｉ
ｇＧ抗体から誘導されるＦ（ａｂ’）＊抗体フラグメン
トの製造に関する。
分解消化に関する。特に、本発明は、パパイン消化全Ｉ
ｇＧ抗体から誘導されるＦ（ａｂ’）＊抗体フラグメン
トの製造に関する。
全ＩｇＧ抗体から誘導される単価［Ｆ ａｂ及びＦａｂ
’］並びに二価［Ｆ ｆａｂ’Ｌ］抗体フラグメントの
使用は良く確立されている６例えば、かかるフラグメン
トは、標識化イムノアッセイ試薬として［Ｕｌｌｍａｎ
らのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
’］並びに二価［Ｆ ｆａｂ’Ｌ］抗体フラグメントの
使用は良く確立されている６例えば、かかるフラグメン
トは、標識化イムノアッセイ試薬として［Ｕｌｌｍａｎ
らのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
ｖｏｌ、 ７４． ｐ、 ２８ （１９８１１：イノウ
ニらのＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬｅｔｔｅｒｓ、 ｖｏｌ
、 １８． ｐ、 １３３１ （１９８５１；及び西独
国特許出願ＤＥ ３４３０９０５号］、及び、免疫治
療薬として［Ｓｍ１ｔｈらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉ
ｎ ＨｕｍａｎＤｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ、 Ｈａｂｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｕｓｅ ｍ。
ニらのＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬｅｔｔｅｒｓ、 ｖｏｌ
、 １８． ｐ、 １３３１ （１９８５１；及び西独
国特許出願ＤＥ ３４３０９０５号］、及び、免疫治
療薬として［Ｓｍ１ｔｈらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉ
ｎ ＨｕｍａｎＤｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ、 Ｈａｂｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｕｓｅ ｍ。
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｎ、
Ｙ、、 ｐ、 ３６５ （１９７７１］用いられている
。免疫診断の分野では、かかる単価抗体フラグメントは
、例えば、リウマチ様のファクター及び／又は拮抗種Ｉ
ｇＧ抗体を含む試料による妨害が減少するなどの、未変
性又は全ＩｇＧ抗体を用いた他の試薬を凌ぐある種の有
利性を示す、抗体分子が分解すると抗体の特性を変化さ
せ、更にイムノアッセイ特性を劣化させる可能性がある
ので、抗体の分子結合性の保持、及び、試薬合成及び精
製中のそれらの結合活性は極めて重要である。かかる未
変性又は全ＩｇＧ抗体をｉｎ ｖｉｖｏ免疫治療薬とし
て用いると、血清疾病を起こす可能性がある。
Ｙ、、 ｐ、 ３６５ （１９７７１］用いられている
。免疫診断の分野では、かかる単価抗体フラグメントは
、例えば、リウマチ様のファクター及び／又は拮抗種Ｉ
ｇＧ抗体を含む試料による妨害が減少するなどの、未変
性又は全ＩｇＧ抗体を用いた他の試薬を凌ぐある種の有
利性を示す、抗体分子が分解すると抗体の特性を変化さ
せ、更にイムノアッセイ特性を劣化させる可能性がある
ので、抗体の分子結合性の保持、及び、試薬合成及び精
製中のそれらの結合活性は極めて重要である。かかる未
変性又は全ＩｇＧ抗体をｉｎ ｖｉｖｏ免疫治療薬とし
て用いると、血清疾病を起こす可能性がある。
当該技術において公知の方法によって、未変性又は全Ｉ
ｇＧ抗体を蛋白消化し、それからＦ （ａｂ’）ｘ抗体
フラグメントを得ることは周知である。この目的のため
に、通常、蛋白分解酵素ペプシンが用いられる０例えば
、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを、マウスの全Ｉｇ
Ｇ抗体［ＬａｍｏｙｉらのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、 ｖｏｌ、 ５６． ｐ、 ２３５ｆ１
９１１３） ］又はラットの全ＩｇＧ抗体［Ｒｏｕｓｓ
ｅａｕｘらのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ
、 ｖｏｌ、 ６４． ｐ、 １４１（１９８３） ］
のペプシン消化によって得ることができる。しかしなが
ら、ある種の抗体、特にモノクローナル抗体は、ペプシ
ンに対して感受性が極度に強く、かかる場合においては
、結合活性が減少しているか又は有さない抗体フラグメ
ントに速やかに分解される。かかる分解を防止するため
に、代わりに、ＩｇＧ分子を予め活性化されたパパイン
によって消化し、Ｆ （ａｂ’）ａ及びＦｃフラグメン
トを得ることができる［ ＰａｒｈａｍらのＪ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ。
ｇＧ抗体を蛋白消化し、それからＦ （ａｂ’）ｘ抗体
フラグメントを得ることは周知である。この目的のため
に、通常、蛋白分解酵素ペプシンが用いられる０例えば
、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを、マウスの全Ｉｇ
Ｇ抗体［ＬａｍｏｙｉらのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、 ｖｏｌ、 ５６． ｐ、 ２３５ｆ１
９１１３） ］又はラットの全ＩｇＧ抗体［Ｒｏｕｓｓ
ｅａｕｘらのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ
、 ｖｏｌ、 ６４． ｐ、 １４１（１９８３） ］
のペプシン消化によって得ることができる。しかしなが
ら、ある種の抗体、特にモノクローナル抗体は、ペプシ
ンに対して感受性が極度に強く、かかる場合においては
、結合活性が減少しているか又は有さない抗体フラグメ
ントに速やかに分解される。かかる分解を防止するため
に、代わりに、ＩｇＧ分子を予め活性化されたパパイン
によって消化し、Ｆ （ａｂ’）ａ及びＦｃフラグメン
トを得ることができる［ ＰａｒｈａｍらのＪ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ｖｏｌ、 ５３． ｐ、
１３３ （１９８２１］ 。
１３３ （１９８２１］ 。
上記記載のように、パパインを用いてペプシンに感受性
を有する抗体を消化することができるが、パパインによ
る消化によって、それから誘導される抗体フラグメント
の分子結合性の分解が大きく増加することが観察されて
いる０例えば、かかる分解によって、ヒンジ領域の利用
しつるスルフヒドリル基の数が減少し、場合によっては
スルフヒドリル基が消失してしまう、したがって、上記
記載のような、全ＩｇＧ分子をパパインによって消化す
ることが望ましい場合においては、従来方法によっては
、パパイン消化によって分解及び不活性化を受けやすい
ので、未変性活性Ｆ（ａｂ’）。
を有する抗体を消化することができるが、パパインによ
る消化によって、それから誘導される抗体フラグメント
の分子結合性の分解が大きく増加することが観察されて
いる０例えば、かかる分解によって、ヒンジ領域の利用
しつるスルフヒドリル基の数が減少し、場合によっては
スルフヒドリル基が消失してしまう、したがって、上記
記載のような、全ＩｇＧ分子をパパインによって消化す
ることが望ましい場合においては、従来方法によっては
、パパイン消化によって分解及び不活性化を受けやすい
ので、未変性活性Ｆ（ａｂ’）。
抗体フラグメントをその全ＩｇＧ抗体がら製造すること
ができなかった。
ができなかった。
したがって、本発明の目的は、パパインによって消化さ
れた全ＩｇＧ抗体から誘導される、パパインを含まない
Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント調製物を提供すること
である。
れた全ＩｇＧ抗体から誘導される、パパインを含まない
Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント調製物を提供すること
である。
本発明の他の目的は、ヒンジ領域に、利用しうる遊離ス
ルフヒドリル基を有するＦａｂ’抗体フラグメントを得
ることのできるＦ （ａｂ’）２抗体フラグメント調製
物を提供することである。
ルフヒドリル基を有するＦａｂ’抗体フラグメントを得
ることのできるＦ （ａｂ’）２抗体フラグメント調製
物を提供することである。
ｌ肌坐互Ｉ
パパインで消化された全ＩｇＧ抗体から誘導される抗体
フラグメントの分解の観察される増加の出所を測定する
試みにおいて、かかるフラグメントの分子結合性を、還
元剤の存在下又は不存在下で、ゲル濾過によって精製し
て、５Ｏ３−ＰＡＧＥ （ナトリウムドデシルベンゼン
スルホネート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によ
って評価した。非還元条件下では、Ｆｌａｂ’）２調製
物は実質的に純粋であり構造的に未変性であることが分
かった。しかしながら、重質フラグメント及び軽質鎖の
両方を生成する還元剤の存在下においては、調製物は小
さなフラグメント（２５，ｏＯｏダルトン未満）に分解
された。しかしながら、還元条件下での５Ｏ３−ＰＡＧ
Ｅ分析に先立って、Ｆｆａｂ’）ａ調製物をインドアセ
トアミドで処理すると、この分解の発生が防止された。
フラグメントの分解の観察される増加の出所を測定する
試みにおいて、かかるフラグメントの分子結合性を、還
元剤の存在下又は不存在下で、ゲル濾過によって精製し
て、５Ｏ３−ＰＡＧＥ （ナトリウムドデシルベンゼン
スルホネート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によ
って評価した。非還元条件下では、Ｆｌａｂ’）２調製
物は実質的に純粋であり構造的に未変性であることが分
かった。しかしながら、重質フラグメント及び軽質鎖の
両方を生成する還元剤の存在下においては、調製物は小
さなフラグメント（２５，ｏＯｏダルトン未満）に分解
された。しかしながら、還元条件下での５Ｏ３−ＰＡＧ
Ｅ分析に先立って、Ｆｆａｂ’）ａ調製物をインドアセ
トアミドで処理すると、この分解の発生が防止された。
したがって、パパインがＳＤＳの存在下における還元条
件下で活性であり、その活性をインドアセトアミドによ
って完全に抑止しうることが公知であるので（Ｐａｒｈ
ａｍらの上記文献参照）、かかるデータによってＦｆａ
ｂ’ｌ＊調製物がパパインを不純物として含んでいるこ
とが示唆される。
件下で活性であり、その活性をインドアセトアミドによ
って完全に抑止しうることが公知であるので（Ｐａｒｈ
ａｍらの上記文献参照）、かかるデータによってＦｆａ
ｂ’ｌ＊調製物がパパインを不純物として含んでいるこ
とが示唆される。
また、未変性ＩｇＧ抗体、及び、ゲル濾過によって精製
されたパパイン誘導Ｆ （ａｂ’）、抗体フラグメント
調製物を含む混合物を、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析すると、インドアセトアミドの非存在下で
は高度の試料分解が観察されるのに対して、インドアセ
トアミドの存在下においては蛋白消化は見られなかった
。したがって、かかるデータによって、更に、還元によ
って活性化し、アルキル化によって不活性化し、ＳＯ３
の存在下で活性を保持する、パパイン及びシスティンプ
ロテアーゼをＦ（ａｂ’ｌ＝調製物が不純物として含有
するという仮説が支持される。
されたパパイン誘導Ｆ （ａｂ’）、抗体フラグメント
調製物を含む混合物を、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析すると、インドアセトアミドの非存在下で
は高度の試料分解が観察されるのに対して、インドアセ
トアミドの存在下においては蛋白消化は見られなかった
。したがって、かかるデータによって、更に、還元によ
って活性化し、アルキル化によって不活性化し、ＳＯ３
の存在下で活性を保持する、パパイン及びシスティンプ
ロテアーゼをＦ（ａｂ’ｌ＝調製物が不純物として含有
するという仮説が支持される。
したがって、以上の点から、パパイン不純物は、抗体フ
ラグメント中に混入している微量のパパインの存在によ
ると思われる。かかる混入は、パパインによる全ＩｇＧ
抗体の蛋白消化及び／又は、引き続く、共有結合による
消化生成物の精製中に、パパイン及びＦ （ａｂ’ｌｚ
分子におけるスルフヒドリル基の間でジスルフィド交換
が起こり、例えば、１以上のＦａｂ’−３−５−パパイ
ン及び同様のパパイン会合消化生成物が得られることの
結果である可能性が最も高い。
ラグメント中に混入している微量のパパインの存在によ
ると思われる。かかる混入は、パパインによる全ＩｇＧ
抗体の蛋白消化及び／又は、引き続く、共有結合による
消化生成物の精製中に、パパイン及びＦ （ａｂ’ｌｚ
分子におけるスルフヒドリル基の間でジスルフィド交換
が起こり、例えば、１以上のＦａｂ’−３−５−パパイ
ン及び同様のパパイン会合消化生成物が得られることの
結果である可能性が最も高い。
ジスルフィド交換によるＦａｂ’抗体フラグメント中へ
のパパインのかかる導入は、分子結合性の有害効果及び
還元後のかかる抗体フラグメントの結合活性を有しうる
ものであり、ゲル清適又はイオン交換クロマトグラフィ
ーのような当該技術において公知の方法によっては除去
できない。特に、感知されるパパイン会合消化生成物が
、還元剤の不存在下におけるゲル？濾過及び親和クロマ
トグラフィーによってＦ（ａｂ’１．と共に精製され、
カチオン交換クロマトグラフィーを用いてＦ（ａｂ’ｌ
＊からパパイン会合消化生成物を分離することが試みら
れた。パパイン（ｐＩ ９．６）がカチオン交換物質に
よって保持されることを示すことは可能であったが、Ｆ
（ａｂ’１．からパパイン−Ｆａｂ’複合体を分離する
ことには成功しなかった。一方、還元剤の存在下で上記
記載のように精製すると、パパインを含まないＦａｂ調
製物が得られた。しかしながら、還元剤の存在下におけ
るパパイン消化によって、Ｆａｂ抗体フラグメント、即
ちスルフヒドリル基を有さないものが得られることが分
かっているので、かかる抗体フラグメントは、例えば酵
素によって抗体フラグメン、トを標識化するためのヒン
ジ領域における遊離スルフヒドリル基を必要とする、当
該技術において公知な方法によるイムノアッセイ試薬合
成の目的には望ましくないものである。
のパパインのかかる導入は、分子結合性の有害効果及び
還元後のかかる抗体フラグメントの結合活性を有しうる
ものであり、ゲル清適又はイオン交換クロマトグラフィ
ーのような当該技術において公知の方法によっては除去
できない。特に、感知されるパパイン会合消化生成物が
、還元剤の不存在下におけるゲル？濾過及び親和クロマ
トグラフィーによってＦ（ａｂ’１．と共に精製され、
カチオン交換クロマトグラフィーを用いてＦ（ａｂ’ｌ
＊からパパイン会合消化生成物を分離することが試みら
れた。パパイン（ｐＩ ９．６）がカチオン交換物質に
よって保持されることを示すことは可能であったが、Ｆ
（ａｂ’１．からパパイン−Ｆａｂ’複合体を分離する
ことには成功しなかった。一方、還元剤の存在下で上記
記載のように精製すると、パパインを含まないＦａｂ調
製物が得られた。しかしながら、還元剤の存在下におけ
るパパイン消化によって、Ｆａｂ抗体フラグメント、即
ちスルフヒドリル基を有さないものが得られることが分
かっているので、かかる抗体フラグメントは、例えば酵
素によって抗体フラグメン、トを標識化するためのヒン
ジ領域における遊離スルフヒドリル基を必要とする、当
該技術において公知な方法によるイムノアッセイ試薬合
成の目的には望ましくないものである。
本発明によって得られる溶液によって、パパインに対し
て結合するための抗体を用いてパパイン会合消化生成物
を調製物から分離してパパイン消化全１ｇＧ抗体から誘
導される、パパインを含まない抗体フラグメントを得る
方法が提供される。
て結合するための抗体を用いてパパイン会合消化生成物
を調製物から分離してパパイン消化全１ｇＧ抗体から誘
導される、パパインを含まない抗体フラグメントを得る
方法が提供される。
特に、全ＩｇＧ抗体をまずパパインで処理し、好ましく
は還元剤で活性化して、Ｆ（ａｂ’１２抗体フラグメン
ト、Ｆｃ（重質鎖）抗体フラグメント、バルク（ｂｕｌ
ｋｌパパイン及び全てのパパインを会合した消化生成物
を含む、その消化抗体調製物を生成する。バルクパパイ
ンを消化抗体調製物から除去し、全てのパパイン会合消
化生成物のパパイン成分に結合させるために混合物に加
えられる、パパインに対する抗体によって調製物を処理
する０次に、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを、好ま
しくは、固定化形態の、パパインに対する抗体及びＦｃ
抗体フラグメントに特異な結合物質によって、Ｆｃ抗体
フラグメント及び抗体結合パパイン会合消化生成物から
分離して、パパイン会合消化生成不純物を含まないＦ（
ａｂ’）２抗体フラグメント調−物を得る。
は還元剤で活性化して、Ｆ（ａｂ’１２抗体フラグメン
ト、Ｆｃ（重質鎖）抗体フラグメント、バルク（ｂｕｌ
ｋｌパパイン及び全てのパパインを会合した消化生成物
を含む、その消化抗体調製物を生成する。バルクパパイ
ンを消化抗体調製物から除去し、全てのパパイン会合消
化生成物のパパイン成分に結合させるために混合物に加
えられる、パパインに対する抗体によって調製物を処理
する０次に、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを、好ま
しくは、固定化形態の、パパインに対する抗体及びＦｃ
抗体フラグメントに特異な結合物質によって、Ｆｃ抗体
フラグメント及び抗体結合パパイン会合消化生成物から
分離して、パパイン会合消化生成不純物を含まないＦ（
ａｂ’）２抗体フラグメント調−物を得る。
したがって、本発明方法は、パパインを含んでいると、
上記記載のようにペプシン消化に感受性を有するように
なってしまう、パパイン消化全ＩｇＧ抗体から誘導され
るパパインを含まないＦ （ａｂ’）ｉ抗体フラグメン
ト調製物を得るために特に有用である。特に、本発明に
よる、パパインに対する抗体を用いることによって、存
在していると、それから誘導されるＦａｂ’抗体フラグ
メントの分子結合性を分解してしまうパパイン会合消化
生成物が、全て、Ｆ（ａｂ’ｌ＊抗体フラグメント調製
物から除去される。更に、強還元条件下、又は、ナトリ
ウムドデシルベンゼンスルホネートのような変性剤の存
在下における還元条件下においてかかるパパイン会合消
化生成物が存在しても、得られる抗体フラグメントの結
合活性が減少する。更に、本発明による抗パパイン処理
Ｆ（ａｂ’）＊抗体調製物から得られるＦａｂ’抗体フ
ラグメントは、ヒンジ領域に遊離スルフヒドリル基を有
し、したがって、以下に更に詳細に説明するように、イ
ムノアッセイ試薬合成において用いるのに極めて望まし
いものである。かかる、パパインを含まないＦ（ａｂ’
）、抗体フラグメント調製物は、また、その中に含まれ
るＦ（ａｂ’ｌａ抗体フラグメントの優れた長期安定性
を示す。
上記記載のようにペプシン消化に感受性を有するように
なってしまう、パパイン消化全ＩｇＧ抗体から誘導され
るパパインを含まないＦ （ａｂ’）ｉ抗体フラグメン
ト調製物を得るために特に有用である。特に、本発明に
よる、パパインに対する抗体を用いることによって、存
在していると、それから誘導されるＦａｂ’抗体フラグ
メントの分子結合性を分解してしまうパパイン会合消化
生成物が、全て、Ｆ（ａｂ’ｌ＊抗体フラグメント調製
物から除去される。更に、強還元条件下、又は、ナトリ
ウムドデシルベンゼンスルホネートのような変性剤の存
在下における還元条件下においてかかるパパイン会合消
化生成物が存在しても、得られる抗体フラグメントの結
合活性が減少する。更に、本発明による抗パパイン処理
Ｆ（ａｂ’）＊抗体調製物から得られるＦａｂ’抗体フ
ラグメントは、ヒンジ領域に遊離スルフヒドリル基を有
し、したがって、以下に更に詳細に説明するように、イ
ムノアッセイ試薬合成において用いるのに極めて望まし
いものである。かかる、パパインを含まないＦ（ａｂ’
）、抗体フラグメント調製物は、また、その中に含まれ
るＦ（ａｂ’ｌａ抗体フラグメントの優れた長期安定性
を示す。
ましい の看日
本発明において用いるための全ＩｇＧ抗体のための免疫
グロブリン源は、通常の抗血清及びモノクローナル法の
ようないかなる利用しつる方法によって得ることもでき
る０例λば、適当な免疫源によるマウス、ウサギ、モル
モット又はヤギのような動物の免疫をはじめとする良く
確立された技術によって抗血清を得ることができる。ま
た、免疫グロブリンは、適当な免疫源を用いることを含
む、体細胞のハイブリダイゼーション技術によって、通
常、モノクローナル抗体と称されるものを生成すること
によって得ることができる。
グロブリン源は、通常の抗血清及びモノクローナル法の
ようないかなる利用しつる方法によって得ることもでき
る０例λば、適当な免疫源によるマウス、ウサギ、モル
モット又はヤギのような動物の免疫をはじめとする良く
確立された技術によって抗血清を得ることができる。ま
た、免疫グロブリンは、適当な免疫源を用いることを含
む、体細胞のハイブリダイゼーション技術によって、通
常、モノクローナル抗体と称されるものを生成すること
によって得ることができる。
通常、全ＩｇＧ抗体を還元剤の存在下でパパインによっ
て消化すると、消化生成物、即ち、Ｆｆａｂ’ｌｔ抗体
フラグメントも、Ｆａｂ’ （スルフヒドリル基）及
び／又はＦａｂ（スルフヒドリル基なし）抗体フラグメ
ントに還元される。還元消化生成物の一部又は全部がＦ
ａｂ抗体フラグメントを含むか否かは、消化された全Ｉ
ｇＧ抗体の種類によると理解すべきである。しかしなが
ら、どちらの場合においても、スルフヒドリル基の存在
が例えば酵素及び同様の標識体がそれに結合するために
必要である場合には、Ｆａｂ抗体フラグメントが存在す
ることは望ましくない。
て消化すると、消化生成物、即ち、Ｆｆａｂ’ｌｔ抗体
フラグメントも、Ｆａｂ’ （スルフヒドリル基）及
び／又はＦａｂ（スルフヒドリル基なし）抗体フラグメ
ントに還元される。還元消化生成物の一部又は全部がＦ
ａｂ抗体フラグメントを含むか否かは、消化された全Ｉ
ｇＧ抗体の種類によると理解すべきである。しかしなが
ら、どちらの場合においても、スルフヒドリル基の存在
が例えば酵素及び同様の標識体がそれに結合するために
必要である場合には、Ｆａｂ抗体フラグメントが存在す
ることは望ましくない。
かかる結合反応に必要なスルフヒドリル基を有するＦａ
ｂ’抗体フラグメントを得るために、パパインを還元剤
で予め活性化した後に、過剰の還元剤から予め活性化し
たパパインを分離することができる（ Ｐａｒｈａｍら
の上記文献参照）、シたがって、かかる方法によって未
変性Ｆ（ａｂ’ｌ＝及びＦｃ抗体フラグメントが得られ
、これを次に、蛋白Ａ特異結合親和カラムを用いるよう
な当該技術において公知の方法によって分離することが
できる。上記記載の方法によってバルクパパインは全て
除去されるが、Ｆａｂ’−５−５−パパイン、Ｆｃ−３
−５−パパイン及び同様のパパイン会合消化生成物の形
態で存在するパパインは、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメ
ントをそのＦａｂ’及びＦｃ抗体フラグメントに還元す
るために用いられる還元剤によって再活性化される。し
たがって、かかる還元条件下においてかかるパパイン会
合消化生酸物が存在すると、所望のＦａｂ’抗体フラグ
メントが更に分解し、かつ、かかる再活性化パパインに
よってその活性が結果として低下する可能性がある。
ｂ’抗体フラグメントを得るために、パパインを還元剤
で予め活性化した後に、過剰の還元剤から予め活性化し
たパパインを分離することができる（ Ｐａｒｈａｍら
の上記文献参照）、シたがって、かかる方法によって未
変性Ｆ（ａｂ’ｌ＝及びＦｃ抗体フラグメントが得られ
、これを次に、蛋白Ａ特異結合親和カラムを用いるよう
な当該技術において公知の方法によって分離することが
できる。上記記載の方法によってバルクパパインは全て
除去されるが、Ｆａｂ’−５−５−パパイン、Ｆｃ−３
−５−パパイン及び同様のパパイン会合消化生成物の形
態で存在するパパインは、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメ
ントをそのＦａｂ’及びＦｃ抗体フラグメントに還元す
るために用いられる還元剤によって再活性化される。し
たがって、かかる還元条件下においてかかるパパイン会
合消化生酸物が存在すると、所望のＦａｂ’抗体フラグ
メントが更に分解し、かつ、かかる再活性化パパインに
よってその活性が結果として低下する可能性がある。
本発明によれば、全てのパパイン会合消化生成物と結合
し、Ｆ（ａｂ’ｌｔ抗体フラグメントをＦａｂ’抗体フ
ラグメントに還元する前にそれを除去することが可能と
なる、パパインに対する抗体を用いることによって、パ
パイン会合消化生成物が存在し、その結果上記記載のよ
うな問題点が生じることが防止される。パパインに対す
る抗体は、パパインによる動物の免疫をはじめとする良
（確立された方法によって得ることもでき、また、市販
されている。
し、Ｆ（ａｂ’ｌｔ抗体フラグメントをＦａｂ’抗体フ
ラグメントに還元する前にそれを除去することが可能と
なる、パパインに対する抗体を用いることによって、パ
パイン会合消化生成物が存在し、その結果上記記載のよ
うな問題点が生じることが防止される。パパインに対す
る抗体は、パパインによる動物の免疫をはじめとする良
（確立された方法によって得ることもでき、また、市販
されている。
特に、本発明方法によれば、パパインを、好ましくは、
システィン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイ
トール、メルカプトエチルアミン及び同様の還元剤、好
ましくはシスティンのような還元剤によって活性化し、
次に、ゲルを濾過、又は、イオン交換クロマトグラフィ
ー、親和クロマトグラフィー、透析などのような当該技
術において公知の方法によりて精製し、活性化パパイン
を過剰の還元剤から分離する［ＰａｒｈａｍらのＪ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ｖａｔ、 ５３
゜ｐ、 １３３ （１９８２１参照］、所望の全ＩｇＧ
抗体を活性化パパインによって消化し、上記記載のよう
な消化抗体調製物を生成する０本発明によれば、消化抗
体調製物をパパインに対する抗体で処理する前に、消化
抗体調製物からバルクパパインを除去することも、又は
、消化抗体調製物を、バルクパパインの存在下において
、パパインに対する抗体で処理することもできると理解
すべきである。後者の場合においては、パパインに対す
る抗体を、全てのバルクパパイン及び全てのパパイン会
合消化生成物と結合させるのに十分な量、消化抗体調製
物に加える。
システィン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイ
トール、メルカプトエチルアミン及び同様の還元剤、好
ましくはシスティンのような還元剤によって活性化し、
次に、ゲルを濾過、又は、イオン交換クロマトグラフィ
ー、親和クロマトグラフィー、透析などのような当該技
術において公知の方法によりて精製し、活性化パパイン
を過剰の還元剤から分離する［ＰａｒｈａｍらのＪ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ｖａｔ、 ５３
゜ｐ、 １３３ （１９８２１参照］、所望の全ＩｇＧ
抗体を活性化パパインによって消化し、上記記載のよう
な消化抗体調製物を生成する０本発明によれば、消化抗
体調製物をパパインに対する抗体で処理する前に、消化
抗体調製物からバルクパパインを除去することも、又は
、消化抗体調製物を、バルクパパインの存在下において
、パパインに対する抗体で処理することもできると理解
すべきである。後者の場合においては、パパインに対す
る抗体を、全てのバルクパパイン及び全てのパパイン会
合消化生成物と結合させるのに十分な量、消化抗体調製
物に加える。
したがって、抗体は、バルクパパイン及び全てのパパイ
ン会合消化生成物と結合し、その抗体結合種を生成する
。
ン会合消化生成物と結合し、その抗体結合種を生成する
。
好ましくは、バルクパパインを、ゲル濾過、又は、イオ
ン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィーな
どのような当該技術において公知な他の方法を用いて調
製物から除去する０次に、生成された消化抗体調製物を
、パパインに対する抗体で処理することにより、抗体を
パパイン会合消化生成物のパパイン成分と結合させ、そ
の抗体結合種を生成せしめる。どちらの場合においても
、次に、所望のＦ（ａｂ’ｌ＊抗体フラグメントを、Ｆ
ｃ抗体フラグメント及び不純物である抗体結合種から除
去し、パパインを含まないＦ（ａｂ’）２抗体フラグメ
ント調製物を生成する。特に、Ｆｃ抗体フラグメント及
び不純物である抗体結合種は、当該技術において公知の
方法によって消化抗体生成物から除去することができる
０例えば、Ｆｃ抗体フラグメント及び抗体結合種と結合
しつる固定化結合物質をかかる目的に用いることができ
る。また、イオン交換クロマトグラフィーをかかる目的
に用いることができる。好ましくは、Ｆｃ抗体フラグメ
ント及び抗体結合種は、Ｆｃ抗体フラグメント及び抗体
結合種のパパインに対する抗体のＦｃ部分に結合しつる
、固定化形態の蛋白Ａを用いて分離される９例えば、抗
体処理混合物を、当該技術において公知の方法によって
得られる固定化形態の蛋白Ａを含む結合親和カラムを通
して溶出させることによって、Ｆｃフラグメント及び抗
体結合種を蛋白Ａに結合させ、それにより、蛋白Ａによ
って固定化し、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントをそれ
から補集することができる。
ン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィーな
どのような当該技術において公知な他の方法を用いて調
製物から除去する０次に、生成された消化抗体調製物を
、パパインに対する抗体で処理することにより、抗体を
パパイン会合消化生成物のパパイン成分と結合させ、そ
の抗体結合種を生成せしめる。どちらの場合においても
、次に、所望のＦ（ａｂ’ｌ＊抗体フラグメントを、Ｆ
ｃ抗体フラグメント及び不純物である抗体結合種から除
去し、パパインを含まないＦ（ａｂ’）２抗体フラグメ
ント調製物を生成する。特に、Ｆｃ抗体フラグメント及
び不純物である抗体結合種は、当該技術において公知の
方法によって消化抗体生成物から除去することができる
０例えば、Ｆｃ抗体フラグメント及び抗体結合種と結合
しつる固定化結合物質をかかる目的に用いることができ
る。また、イオン交換クロマトグラフィーをかかる目的
に用いることができる。好ましくは、Ｆｃ抗体フラグメ
ント及び抗体結合種は、Ｆｃ抗体フラグメント及び抗体
結合種のパパインに対する抗体のＦｃ部分に結合しつる
、固定化形態の蛋白Ａを用いて分離される９例えば、抗
体処理混合物を、当該技術において公知の方法によって
得られる固定化形態の蛋白Ａを含む結合親和カラムを通
して溶出させることによって、Ｆｃフラグメント及び抗
体結合種を蛋白Ａに結合させ、それにより、蛋白Ａによ
って固定化し、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントをそれ
から補集することができる。
本発明によって得られるＦ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメン
トは、特に、イムノアッセイにおけるｌ１ｍ試薬の使用
に関する当該技術において公知な方法によって、酵素、
蛍光体、燐光物質、化学的発光物質、生物学的発光物質
及び同様の分子；金及び銀ゾル；ラテックス粒子：並び
に同様の標識体のような種々のｍ量体をそれに結合させ
るのに有用である。好ましくは、Ｆ（ａｂ’ｌｚ抗体フ
ラグメントを、当該技術において公知の方法によって、
例えば、システィン、ジチオトレイトール、β−メルカ
プトエタノール、メルカプトエチルアミン及び同様の還
元剤、好ましくはメルカプトエチルアミンによって還元
し、最大結合活性、及び、かかる用途のためのヒンジ領
域における遊離スルフヒドリル基を有するＦａｂ’抗体
フラグメントを得る。
トは、特に、イムノアッセイにおけるｌ１ｍ試薬の使用
に関する当該技術において公知な方法によって、酵素、
蛍光体、燐光物質、化学的発光物質、生物学的発光物質
及び同様の分子；金及び銀ゾル；ラテックス粒子：並び
に同様の標識体のような種々のｍ量体をそれに結合させ
るのに有用である。好ましくは、Ｆ（ａｂ’ｌｚ抗体フ
ラグメントを、当該技術において公知の方法によって、
例えば、システィン、ジチオトレイトール、β−メルカ
プトエタノール、メルカプトエチルアミン及び同様の還
元剤、好ましくはメルカプトエチルアミンによって還元
し、最大結合活性、及び、かかる用途のためのヒンジ領
域における遊離スルフヒドリル基を有するＦａｂ’抗体
フラグメントを得る。
特に、かかるＦ（ａｂ’）、又はＦａｂ’抗体フラグメ
ントを、０−フェニレンジマレイミド、ビス（マレイミ
ド）メチルエステル及び同様の架橋剤のような架橋剤に
よって処理して、Ｆａｂ’ −又はＦｆａｂ’）ｉ−マ
レイミド活性化抗体フラグメントを得ることができる０
次に、マレイミド活性化抗体フラグメントを、当該技術
において公知の方法によって、選択された酵素と反応さ
せ、その所望の酵素標識Ｆａｂ’又はＦ （ａｂ’）、
複合体を生成することができる。また、所望の酵素成分
がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、所望の抗体成分が
Ｆａｂ“である場合には、まず、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼの表面に曝露している（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏ
ｓｅｄ）スルフヒドリル基をインドアセトアミドのよう
なアルキル化剤でブロックし１次に、アルキル化−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼと、スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシル
−１−（ＳＭＣＣ）と反応させて、反応性マレイミド基
を酵素中に導入せしめることによって結合を行なうこと
ができる。
ントを、０−フェニレンジマレイミド、ビス（マレイミ
ド）メチルエステル及び同様の架橋剤のような架橋剤に
よって処理して、Ｆａｂ’ −又はＦｆａｂ’）ｉ−マ
レイミド活性化抗体フラグメントを得ることができる０
次に、マレイミド活性化抗体フラグメントを、当該技術
において公知の方法によって、選択された酵素と反応さ
せ、その所望の酵素標識Ｆａｂ’又はＦ （ａｂ’）、
複合体を生成することができる。また、所望の酵素成分
がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、所望の抗体成分が
Ｆａｂ“である場合には、まず、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼの表面に曝露している（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏ
ｓｅｄ）スルフヒドリル基をインドアセトアミドのよう
なアルキル化剤でブロックし１次に、アルキル化−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼと、スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシル
−１−（ＳＭＣＣ）と反応させて、反応性マレイミド基
を酵素中に導入せしめることによって結合を行なうこと
ができる。
したがって、マレイミド活性化−〇−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼをＦａｂ’抗体フラグメントと反応させると、Ｆａ
ｂ’フラグメントのスルフヒドリル基がβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼと反応してその間に共有結合を形成し、酵素
−抗体複合体並びに未反応の酵素及び抗体成分を含む複
合反応混合物が得られる１次に、当該技術において公知
の方法によって、好ましくは、通常に壌渡されている１
９８６年１２月９日出願の米国特許出願第９３９．６４
０号において記載されている方法により、複合反応混合
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する
ことによって複合反応混合物を精製することができる。
ーゼをＦａｂ’抗体フラグメントと反応させると、Ｆａ
ｂ’フラグメントのスルフヒドリル基がβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼと反応してその間に共有結合を形成し、酵素
−抗体複合体並びに未反応の酵素及び抗体成分を含む複
合反応混合物が得られる１次に、当該技術において公知
の方法によって、好ましくは、通常に壌渡されている１
９８６年１２月９日出願の米国特許出願第９３９．６４
０号において記載されている方法により、複合反応混合
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する
ことによって複合反応混合物を精製することができる。
かかる標識化試薬を、液体試験試料中に存在する分析対
象物の量を測定するためのイムノアッセイにおいて用い
ることができる０通常、かかるイムノアッセイには、分
析対象物と標識化試薬との間の特異結合性相互作用が包
含され、二種類の形態、即ち、結合種及び遊離種の標識
試薬を含む特異結合反応系が生成される。遊離種として
得られる標識化試薬に対する、結合種として得られる標
識化試薬の相対量又は割合は、試験試料中の検出すべき
分析対象物の存在又は量の関数である。
象物の量を測定するためのイムノアッセイにおいて用い
ることができる０通常、かかるイムノアッセイには、分
析対象物と標識化試薬との間の特異結合性相互作用が包
含され、二種類の形態、即ち、結合種及び遊離種の標識
試薬を含む特異結合反応系が生成される。遊離種として
得られる標識化試薬に対する、結合種として得られる標
識化試薬の相対量又は割合は、試験試料中の検出すべき
分析対象物の存在又は量の関数である。
特に、本発明を以下の実施例によって説明するが、これ
らは例示のためのものであり、制限するためのものでは
ない。
らは例示のためのものであり、制限するためのものでは
ない。
次のようにして、全抗体を予め活性化されたパパインで
消化し、その二価抗体フラグメントを得、これをメルカ
プトエチルアミンで還元して所望の単価抗体フラグメン
ト（Ｆａｂ’）を得ることによって、抗チロキシンモノ
クローナルＩｇＧ抗体の単価抗体フラグメント（Ｆａｂ
’）を調製した− ａ ニ フラグ ント Ｆａｂ′２ の暑 Ｆ（
ａｂ’ｌｚを、Ｂ１０−Ｒａｄ ＭＡＰＳ■蛋白Ａカラ
ム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｒ
ｉｃｈｍｏｎｄ、 ＧＡ、 ＵＳＡＩ上で、腹水液（Ｍ
ｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、
Ｓｐｒｉｎｇ−ｆｉｅｌｄ、 ＶＡ、 ＵＳＡ、 Ｔ
４に対するモノクローナル抗体、 １５６／７）から単
離した抗チロキシンＩｇＧモノクローナル抗体から調製
し、腹水液１−あたり１４．５ｍｇのＩｇＧを得た。パ
パイン（Ｓ ｉ ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、
Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ，、ＵＳＡ 、タイプ■、
ＰａｒｈａｍらのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、 ｖｏｌ、 ５３゜ｐ、 １３３ （１９８
２）に記載された方法によって、０．０５Ｍ酢酸ナトリ
ウム懸濁液、ｐＨ４，５中でパパヤラテックスから２回
晶出させ、システィンでインキュベートし、次にゲル清
適することによって予め活性化して活性酵素を得た）０
．１Ｍ酢酸ナトリウム、３．０ｍＭ ＥＤＴＡ （
エチレンジアミン四酢酸）、０．６２ｍｇ／−において
ｐＨ５，５（１，０２ｄ）中の生成ＩｇＧ（５，８ｍｔ
ｌ、１ 、 ０９ ｍｇ／ｄ）に、ＩｇＧに対するパパ
インの重量比１：１０で加えた。消化を５３７°Ｃで４
０分間インキュベートし、生成物を、ＰＢＳ （リン酸
塩緩衝食塩）／ＮａＮ、緩衝剤中、１．０Ｘ８０．０ｃ
ｍゲル濾過カラム（ＡｃＡ４４Ｕｌｔｒｏｇｅ１． Ｌ
ＫＢ、 Ｓｗｅｄｅｎｌ上でりＣマドグラフィーにかけ
て、所望のＦ（ａｂ’ｌａ及びＦｃ抗体フラグメント並
びに不純物であるパパイン会合消化生成物を含む第１の
ピーク、及びバルクパパインを含む第２のピークを得た
。
消化し、その二価抗体フラグメントを得、これをメルカ
プトエチルアミンで還元して所望の単価抗体フラグメン
ト（Ｆａｂ’）を得ることによって、抗チロキシンモノ
クローナルＩｇＧ抗体の単価抗体フラグメント（Ｆａｂ
’）を調製した− ａ ニ フラグ ント Ｆａｂ′２ の暑 Ｆ（
ａｂ’ｌｚを、Ｂ１０−Ｒａｄ ＭＡＰＳ■蛋白Ａカラ
ム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｒ
ｉｃｈｍｏｎｄ、 ＧＡ、 ＵＳＡＩ上で、腹水液（Ｍ
ｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、
Ｓｐｒｉｎｇ−ｆｉｅｌｄ、 ＶＡ、 ＵＳＡ、 Ｔ
４に対するモノクローナル抗体、 １５６／７）から単
離した抗チロキシンＩｇＧモノクローナル抗体から調製
し、腹水液１−あたり１４．５ｍｇのＩｇＧを得た。パ
パイン（Ｓ ｉ ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、
Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ，、ＵＳＡ 、タイプ■、
ＰａｒｈａｍらのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、 ｖｏｌ、 ５３゜ｐ、 １３３ （１９８
２）に記載された方法によって、０．０５Ｍ酢酸ナトリ
ウム懸濁液、ｐＨ４，５中でパパヤラテックスから２回
晶出させ、システィンでインキュベートし、次にゲル清
適することによって予め活性化して活性酵素を得た）０
．１Ｍ酢酸ナトリウム、３．０ｍＭ ＥＤＴＡ （
エチレンジアミン四酢酸）、０．６２ｍｇ／−において
ｐＨ５，５（１，０２ｄ）中の生成ＩｇＧ（５，８ｍｔ
ｌ、１ 、 ０９ ｍｇ／ｄ）に、ＩｇＧに対するパパ
インの重量比１：１０で加えた。消化を５３７°Ｃで４
０分間インキュベートし、生成物を、ＰＢＳ （リン酸
塩緩衝食塩）／ＮａＮ、緩衝剤中、１．０Ｘ８０．０ｃ
ｍゲル濾過カラム（ＡｃＡ４４Ｕｌｔｒｏｇｅ１． Ｌ
ＫＢ、 Ｓｗｅｄｅｎｌ上でりＣマドグラフィーにかけ
て、所望のＦ（ａｂ’ｌａ及びＦｃ抗体フラグメント並
びに不純物であるパパイン会合消化生成物を含む第１の
ピーク、及びバルクパパインを含む第２のピークを得た
。
ｂ パパインＡＡ：゛′ の７、パパイン不純物
を、錯体形成させ、所望の抗体フラグメント： Ｆ （
ａｂ’１．から連続的に単離するために、本実施例の工
程（ａｔの第１のフラクションを、ポリクローナル抗パ
パインＩ ｇ Ｇ （Ｃａｐｐｅｌ。
を、錯体形成させ、所望の抗体フラグメント： Ｆ （
ａｂ’１．から連続的に単離するために、本実施例の工
程（ａｔの第１のフラクションを、ポリクローナル抗パ
パインＩ ｇ Ｇ （Ｃａｐｐｅｌ。
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｐｐｅｒ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ、 Ｃｏｃｈｒａｎ−ｖｉｌｌｅ、 ＰＡ、
ＵＳＡ、 Ｌｏｔ Ｎｏ、 ２３６５５． Ｃａｔ、
Ｎｏ。
ｓｔｉｃｓ、 Ｃｏｃｈｒａｎ−ｖｉｌｌｅ、 ＰＡ、
ＵＳＡ、 Ｌｏｔ Ｎｏ、 ２３６５５． Ｃａｔ、
Ｎｏ。
０１００−１２０２１で処理した。第１のゲル濾過フラ
クション（４，０ｙｄ、２ 、５２ ｍｇ／ｍ）に、Ｐ
ＢＳ中、抗パパインＩｇＧ （１，０８＋ａｌ’、１．
８５ｍｇ／ｄ）を加え、４℃で一晩インキユベートした
。次に、溶液をＢｉｏ−Ｒａｄ■蛋白Ａカラム上でクロ
マトグラフィーにかけ、消化物からの元のＦｃフラグメ
ント及びパパイン会合消化生成物とコンプレックス形成
している抗パパインＩｇＧの両方を保持した。生成され
たＦ（ａｂ’）ａを、適用緩衝剤中のカラムを通過させ
た。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ
って、この方法で生成されたＦ （ａｂ’）ｘが、パパ
イン不純物を含まず、高純度のものであることが示され
た。’１．４８（ｃｍ−ｍｇ／Ｍｌｌ−’の吸光係数及
び９２．０００ダルトンの分子量を用いて、２８０ｎｍ
における吸光度からＦ（ａｂ’）ｇの濃度を測定すると
０．４４ｍｇ／Ｊ（８，６１１ｄｌ、３．７７Ｂ）であ
った。Ｆｆａｂ’ｌｚをＰ Ｂ Ｓ ／ Ｎ ａ Ｎ
＊緩衝剤中において、４℃で保存した。
クション（４，０ｙｄ、２ 、５２ ｍｇ／ｍ）に、Ｐ
ＢＳ中、抗パパインＩｇＧ （１，０８＋ａｌ’、１．
８５ｍｇ／ｄ）を加え、４℃で一晩インキユベートした
。次に、溶液をＢｉｏ−Ｒａｄ■蛋白Ａカラム上でクロ
マトグラフィーにかけ、消化物からの元のＦｃフラグメ
ント及びパパイン会合消化生成物とコンプレックス形成
している抗パパインＩｇＧの両方を保持した。生成され
たＦ（ａｂ’）ａを、適用緩衝剤中のカラムを通過させ
た。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ
って、この方法で生成されたＦ （ａｂ’）ｘが、パパ
イン不純物を含まず、高純度のものであることが示され
た。’１．４８（ｃｍ−ｍｇ／Ｍｌｌ−’の吸光係数及
び９２．０００ダルトンの分子量を用いて、２８０ｎｍ
における吸光度からＦ（ａｂ’）ｇの濃度を測定すると
０．４４ｍｇ／Ｊ（８，６１１ｄｌ、３．７７Ｂ）であ
った。Ｆｆａｂ’ｌｚをＰ Ｂ Ｓ ／ Ｎ ａ Ｎ
＊緩衝剤中において、４℃で保存した。
ｃ Ｆａｂ°２のＦａｂ’への還−
本実施例の工程（ｂｌによって得られたＦ（ａｂ’）ｚ
溶液（８，２ｍｔ’、０．４４ｍｇ／Ｊ）を、０．１Ｍ
リン酸ナトリウム、５．０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝剤（ｐ
Ｈ６，０）中に入れ、０．６７ｍｇ／ｄ（５，１ｄ）の
濃度にした０次に、メルカプトエチルアミンを１０ｍＭ
の濃度になるまで加え、３７℃で６０分間インキュベー
トした。撹拌されている限外濾過セル（Ａｍｉｏｎ Ｃ
ｏｒｐ、、 Ｄａｎｖｅｒｓ。
溶液（８，２ｍｔ’、０．４４ｍｇ／Ｊ）を、０．１Ｍ
リン酸ナトリウム、５．０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝剤（ｐ
Ｈ６，０）中に入れ、０．６７ｍｇ／ｄ（５，１ｄ）の
濃度にした０次に、メルカプトエチルアミンを１０ｍＭ
の濃度になるまで加え、３７℃で６０分間インキュベー
トした。撹拌されている限外濾過セル（Ａｍｉｏｎ Ｃ
ｏｒｐ、、 Ｄａｎｖｅｒｓ。
ＭＡ、 ＵＳＡＩ中において、５．０ｍＭ Ｅ Ｄ
Ｔ Ａを用いてＰＢＳに対して透析した。１．４
８（ｃｍ−ｍｇ／ ｄｌ−’の吸光係数及び４６，００
０ダルトンの分子量を用いて、２８０ｎｍにおける吸光
度からＦａｂ’の濃度を測定した（０．６３ｍｇ／ＮＪ
ｌ、５、 ．３ｎＡｌ） 、 Ｆａｂ’のスルフヒドリ
ル含有量を４．４°−ジチオピリジンを用いて測定する
と［ＧｒａｓｓｅｔｔｉらのＡｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、。
Ｔ Ａを用いてＰＢＳに対して透析した。１．４
８（ｃｍ−ｍｇ／ ｄｌ−’の吸光係数及び４６，００
０ダルトンの分子量を用いて、２８０ｎｍにおける吸光
度からＦａｂ’の濃度を測定した（０．６３ｍｇ／ＮＪ
ｌ、５、 ．３ｎＡｌ） 、 Ｆａｂ’のスルフヒドリ
ル含有量を４．４°−ジチオピリジンを用いて測定する
と［ＧｒａｓｓｅｔｔｉらのＡｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、。
ｖｏｌ、 １１９． ｐ、 ４１ （１９６７） ］
、 Ｆａｂ’あたり３個のスルフヒドリル基があること
が測定された。
、 Ｆａｂ’あたり３個のスルフヒドリル基があること
が測定された。
Ｅ、 ｃｏｌｉ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを、濃度１
４ｍｇ／−の、０．０２％Ｎ ａ Ｎ ｓを有する（Ｎ
Ｈ，）２ Ｓｏ、懸濁液として保存した。このβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ懸濁液（１，８Ｍ１）を遠心分離して
ペレットを形成し、これを、ＰＢＳ中に溶解して、１１
．８ｍｇ／−又は５４ナノモル（２、４３（ｃｍ−ｍｇ
／ ｄｌ−’の吸光係数及び４６５，０００ダルトンの
分子量を用いて２８０ｎｍにおける吸光度から測定した
）を有する２、 １ｙｄ （２５ｍｇ） （酵素活
性１００％）の容量にした。暗所において、２０モル倍
過剰のインドアセトアミドと、室温で３０分間反応させ
ることによってβ−Ｄ−ガラクトシダーゼにおける全て
のスルフヒドリル基（通常はスルフヒドリル基３個以下
である）をアルキル化した０反応混合物を、ＰＢＳ緩衝
液中、１．０ｘ４０．０ｃｍ脱塩カラム（ＢｉｏＧｅｌ
■Ｐ−６ＤＧ、 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ。
４ｍｇ／−の、０．０２％Ｎ ａ Ｎ ｓを有する（Ｎ
Ｈ，）２ Ｓｏ、懸濁液として保存した。このβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ懸濁液（１，８Ｍ１）を遠心分離して
ペレットを形成し、これを、ＰＢＳ中に溶解して、１１
．８ｍｇ／−又は５４ナノモル（２、４３（ｃｍ−ｍｇ
／ ｄｌ−’の吸光係数及び４６５，０００ダルトンの
分子量を用いて２８０ｎｍにおける吸光度から測定した
）を有する２、 １ｙｄ （２５ｍｇ） （酵素活
性１００％）の容量にした。暗所において、２０モル倍
過剰のインドアセトアミドと、室温で３０分間反応させ
ることによってβ−Ｄ−ガラクトシダーゼにおける全て
のスルフヒドリル基（通常はスルフヒドリル基３個以下
である）をアルキル化した０反応混合物を、ＰＢＳ緩衝
液中、１．０ｘ４０．０ｃｍ脱塩カラム（ＢｉｏＧｅｌ
■Ｐ−６ＤＧ、 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ。
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 ＣＡ、 ＵＳＡＩ上でクロマトグ
ラフィーにかけた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼのピーク
を、撹拌されている限外濾過セル＋ＡＭＩＣ：ＯＮ）で
３．１ｍｇ／ｘｉ’ （７，２Ｍ１．２２ｍｇ、酵素活
性１０５％）に濃縮し、２０モル倍量のスクシンイミジ
ル−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ
ｅｍｉ−ｃａｌ （：ｏ、、 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、 Ｉ
Ｌ、 ＵＳＡＩ を加え、反応を、穏やかに撹拌しなが
ら室温で１．０時間行なった。ＳＭＣＣ反応混合物を、
３．０ｍｇ／ｙｄ （酵素活性９２％）において７．２
−の容量において、１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢ
Ｓ中、１．０×４０．０ｃｍ脱塩カラム（ＢｉｏＧｅｌ
■Ｐ−６ＤＧｌ上で脱塩した。カラムから溶出した活性
化β−Ｄ−ガラクトシダーゼのマレイミド含有量を、活
性化β−Ｄ−ガラクトシダーゼの不存在下及び存在下に
おける還元されたグルタチオンのスルフヒドリル含有量
（４，４’ −ジチオピリジンとして測定）の差から計
算すると、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１モルあたりマレ
イミド５．４個と測定された。
ラフィーにかけた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼのピーク
を、撹拌されている限外濾過セル＋ＡＭＩＣ：ＯＮ）で
３．１ｍｇ／ｘｉ’ （７，２Ｍ１．２２ｍｇ、酵素活
性１０５％）に濃縮し、２０モル倍量のスクシンイミジ
ル−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ
ｅｍｉ−ｃａｌ （：ｏ、、 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、 Ｉ
Ｌ、 ＵＳＡＩ を加え、反応を、穏やかに撹拌しなが
ら室温で１．０時間行なった。ＳＭＣＣ反応混合物を、
３．０ｍｇ／ｙｄ （酵素活性９２％）において７．２
−の容量において、１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢ
Ｓ中、１．０×４０．０ｃｍ脱塩カラム（ＢｉｏＧｅｌ
■Ｐ−６ＤＧｌ上で脱塩した。カラムから溶出した活性
化β−Ｄ−ガラクトシダーゼのマレイミド含有量を、活
性化β−Ｄ−ガラクトシダーゼの不存在下及び存在下に
おける還元されたグルタチオンのスルフヒドリル含有量
（４，４’ −ジチオピリジンとして測定）の差から計
算すると、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１モルあたりマレ
イミド５．４個と測定された。
ＰＨ３３，５ｍｊ’中の活性化β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（２３，６ナノモル）を、ＰＨ１０，３−１５ｍＭ
ＥＤＴＡ中の抗チロキシンＦａｂ’ （実施例１と
同様に調製）５９．０ナノモルと配合した。反応溶液を
５℃で２０時間インキュベートした。得られたＦａｂ’
−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体調製物を、ＰＢＳ／
ＮａＮ。
ゼ（２３，６ナノモル）を、ＰＨ１０，３−１５ｍＭ
ＥＤＴＡ中の抗チロキシンＦａｂ’ （実施例１と
同様に調製）５９．０ナノモルと配合した。反応溶液を
５℃で２０時間インキュベートした。得られたＦａｂ’
−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体調製物を、ＰＢＳ／
ＮａＮ。
緩衝剤中に移し、４℃で保存した。
Claims (11)
- （１）パパインで消化された全ＩｇＧ抗体から誘導され
るパパインを含まないＦ（ａｂ’）＿２抗体フラグメン
ト調製物の製造方法であって、 （ａ）該全ＩｇＧ抗体をパパインで消化して、Ｆ（ａｂ
’）＿２抗体フラグメント、Ｆｃ抗体フラグメント、パ
パイン会合消化生成物、及びバルク（ｂｕｌｋ）パパイ
ンを含む、その消化抗体調製物を製造し； （ｂ）該消化抗体調製物からバルクパパインを除去し、
かつ、これを、パパインに対する抗体で処理して、該抗
体を該パパイン会合消化生成物と結合せしめてその抗体
結合種を生成させ； （ｃ）該Ｆ（ａｂ’）＿２抗体フラグメントを、該Ｆｃ
抗体フラグメント及び該抗体結合種から分離する工程を
含むことを特徴とする方法。 - （２）該バルクパパインをパパインに対する該抗体に結
合させ、その抗体結合種を生成させることによって除去
する請求項１記載の方法。 - （３）該バルクパパインを、該消化抗体調製物をパパイ
ンに対する該抗体によって処理する前に除去する請求項
１記載の方法。 - （４）該バルクパパインをゲルろ過によって除去する請
求項３記載の方法。 - （５）該パパインを、システイン、β−メルカプトエタ
ノール、ジチオトレイトール及びメルカプトエチルアミ
ンからなる群より選択される還元剤によって活性化する
請求項１記載の方法。 - （６）更に、該Ｆ（ａｂ’）＿２抗体フラグメントをそ
のＦａｂ’抗体フラグメントに還元する工程を含む請求
項１記載の方法。 - （７）還元剤が、システイン、ジチオトレイトール、β
−メルカプトエタノール及びメルカプトエチルアミンか
らなる群より選択される請求項６記載の方法。 - （８）工程（ｂ）の該抗体結合種及び該Ｆｃ抗体フラグ
メントを、該パパイン抗体及び該Ｆｃ抗体フラグメント
に特異な固定化形態の結合物質によって分離することに
よって、該抗体結合種及び該Ｆｃフラグメントをそれに
固定化する請求項１記載の方法。 - （９）パパインに対する該抗体及び該Ｆｃ抗体フラグメ
ントに特異な固定化形態の結合物質が蛋白Ａである請求
項８記載の方法。 - （１０）該全ＩｇＧ抗体がモノクローナルＩｇＧ抗体で
ある請求項１記載の方法。 - （１１）請求項１記載の方法によって得られる、パパイ
ンを含まないＦ（ａｂ’）＿２二価抗体フラグメント調
製物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US097115 | 1987-09-16 | ||
| US07/097,115 US4814433A (en) | 1987-09-16 | 1987-09-16 | Method for obtaining a papain-free antibody fragment preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01114758A true JPH01114758A (ja) | 1989-05-08 |
Family
ID=22261199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63228924A Pending JPH01114758A (ja) | 1987-09-16 | 1988-09-14 | パパインを含まない抗体フラグメント調製物の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4814433A (ja) |
| EP (1) | EP0307754A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01114758A (ja) |
| AU (1) | AU600386B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009531401A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-03 | ラボラトイレ フランケイス デュ フラクションネメント イーティー デス バイオテクノロジース ソシエテ アノニメ | 医薬品としてのチクングニヤ特異性免疫グロブリンの濃縮物、濃縮物の利用及び濃縮物を調整する方法 |
| CN102286609A (zh) * | 2011-06-22 | 2011-12-21 | 北京工商大学 | 一种利用木瓜蛋白酶检测重金属污染的方法 |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4937183A (en) * | 1988-02-03 | 1990-06-26 | Cytogen Corporation | Method for the preparation of antibody-fragment conjugates |
| US5081030A (en) * | 1989-04-25 | 1992-01-14 | The Johns Hopkins University | Release of cells from affinity matrices |
| US5328834A (en) * | 1989-09-08 | 1994-07-12 | Unisyn Technologies, Inc. | Method for preparing immunoglobulin fragments |
| US6274325B1 (en) | 1990-06-25 | 2001-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for carrying out a homogeneous-immunoassay based on agglutination |
| DE4020204A1 (de) * | 1990-06-25 | 1992-01-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Durchfuehrung eines homogenen immunoassays nach dem agglutinationsprinzip |
| US5099005A (en) * | 1990-09-28 | 1992-03-24 | Neorx Corporation | Method of enhancing immunoglobulin fragment production |
| US7060450B1 (en) * | 1993-12-30 | 2006-06-13 | President And Fellows Of Harvard College | Screening assays for agonists and antagonists of the hedgehog signaling pathway |
| US6709655B2 (en) | 2001-02-28 | 2004-03-23 | Instituto Bioclon, S.A. De C.V. | Pharmaceutical composition of F(ab1)2 antibody fragments and a process for the preparation thereof |
| US8323903B2 (en) | 2001-10-12 | 2012-12-04 | Life Technologies Corporation | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| US20050069962A1 (en) | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| US7335759B2 (en) * | 2002-12-02 | 2008-02-26 | Universidad Nacional Autónoma de Méxica (UNAM) | Recombinant immunogens for the generation of antivenoms to the venom of scorpions of the genus Centruroides |
| WO2005009464A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-03 | Lopez De Silanes Juan | Administration of anti-cytokine f(ab')2 antibody fragments |
| US7381802B2 (en) * | 2005-04-15 | 2008-06-03 | Universidad Nacional Autónoma De México (UNAM) | Human antibodies that specifically recognize the toxin Cn2 from Centruroides noxius scorpion venom |
| WO2019070108A1 (es) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Laboratorios Silanes S.A. De C.V. | Proceso de alto rendimiento para la producción de antivenenos de fragmentos f (ab') 2 de anticuerpos |
| CN113049811A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-29 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒 |
| CN113777312B (zh) * | 2021-09-03 | 2024-02-02 | 普十生物科技(北京)有限公司 | 乙肝抗体片段的制备方法、乙肝抗体片段、试剂盒及应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CS162953B1 (ja) * | 1972-05-10 | 1975-07-31 | ||
| DE2853453A1 (de) * | 1978-12-11 | 1980-06-19 | Behringwerke Ag | Mittel zur therapie von immunkomplexerkrankungen |
| DE3342870A1 (de) * | 1983-11-26 | 1985-06-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Digitalis-antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur therapie von digitalis-intoxikationen |
| FR2556219B1 (fr) * | 1983-12-07 | 1987-06-26 | Merieux Inst | Nouveau medicament immunomodulateur, a base de fragments fc d'igg humaines |
-
1987
- 1987-09-16 US US07/097,115 patent/US4814433A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-09-05 EP EP88114481A patent/EP0307754A3/en not_active Withdrawn
- 1988-09-13 AU AU22127/88A patent/AU600386B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-14 JP JP63228924A patent/JPH01114758A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009531401A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-03 | ラボラトイレ フランケイス デュ フラクションネメント イーティー デス バイオテクノロジース ソシエテ アノニメ | 医薬品としてのチクングニヤ特異性免疫グロブリンの濃縮物、濃縮物の利用及び濃縮物を調整する方法 |
| CN102286609A (zh) * | 2011-06-22 | 2011-12-21 | 北京工商大学 | 一种利用木瓜蛋白酶检测重金属污染的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2212788A (en) | 1989-03-16 |
| EP0307754A2 (en) | 1989-03-22 |
| EP0307754A3 (en) | 1990-04-04 |
| AU600386B2 (en) | 1990-08-09 |
| US4814433A (en) | 1989-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH01114758A (ja) | パパインを含まない抗体フラグメント調製物の製造方法 | |
| US4470925A (en) | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies | |
| CA1216231A (en) | Bispecific antibody determinants | |
| RU2032906C1 (ru) | Способ определения поливалентного антигена в биологической жидкости | |
| US4479895A (en) | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies | |
| EP0119736A2 (en) | Two-site immunoassays using monoclonal antibodies of different classes or subclasses and test kits for performing same | |
| JP3524401B2 (ja) | 酵素抗体複合体およびその製造方法 | |
| JPS61502417A (ja) | ポリクロナ−ル抗体、製法と用途 | |
| KR100249752B1 (ko) | 항체의특정클래스에특이적인간섭억제시약 | |
| AU595159B2 (en) | Bispecific antibody determinants | |
| EP0096463B1 (en) | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies | |
| JPH0476579B2 (ja) | ||
| US5856106A (en) | Determination of antibody production against administered therapeutic glycoproteins, especially monoclonal antibodies | |
| EP0322813A2 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz | |
| CA1306427C (en) | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor | |
| Elliott et al. | Development of a dual label time‐resolved fluoroimmunoassay for the detection of (β‐agonists in cattle urine | |
| JPS58149700A (ja) | ペルオキシダ−ゼ含有複合体，その製造法および試薬 | |
| JPH04211396A (ja) | 非Ａ１ｃ糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体 | |
| JPH11507014A (ja) | 標識として用いる酵素の反応生成物に向けられた抗体を使用する免疫学的検定 | |
| JPS587560A (ja) | 銅，亜鉛−ス−パ−オキシドディスムタ−ゼ測定用試薬 | |
| JPH08313530A (ja) | 総ヘモグロビン測定方法及び測定キット | |
| JPH02141665A (ja) | 糞便中のヘモグロビンの検出方法 | |
| JP3501381B2 (ja) | リウマチ因子測定試薬 | |
| JPS6082966A (ja) | 抗原の定量法 | |
| JPS62258399A (ja) | Ｃ−反応性蛋白質の精製方法 |