JPH0476579B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、酵素免疫測定に好適な、炭水化物を
含有する標識酵素と免疫作用物質とからの接合体
を製法に関する。 従来の技術 免疫学的検出法は、多くの分析の目的、殊に臨
床学的分析の分野で、その優れた感度及び特異性
に基づき、重要性が増しており、純粋に化学的な
方法を凌駕している。この分析法では、一般に、
免疫学的結合成分の１つを標識し、この際、特に
はじめに、放射線標識（RIA）が、後には酵素標
識（EIA）が重要になつた。酵素標識付けの使用
下における免疫学的検出法の分野では、標識付け
の目的にとつては少数の酵素が特に好適であるこ
とが立証されており、この際立証容易性、高安定
性及び免疫反応へのできるだけ少ない影響が、特
にその優遇に決定的な特性である。既に使用され
ているか又は使用可能な標識酵素
（Markierungsenzym）には、グルコースオキシ
ダーゼ（GOD）（E.C.1.1.3.4）、β−フラクトシダ
ーゼ（インベルターゼ）（E.C.3.2.1.26）、アルカ
リホスフアターゼ（AP）（E.C.3.1.3.1）及びペル
オキシダーゼ（POD）（E.C.1.11.1.7）が属し、こ
れらはすべて、分子内に炭水化物分を含有する。
これらはいわゆる酵素接合体
（Enzymkonjugate）の形で使用される。これは、
標識酵素と免疫学的作用反応成分との結合生成物
であり、ここでは、一般に、標識酵素と免疫学的
結合成分（即ち免疫作用物質）（例えば抗原、ハ
プテン、抗体、抗体の誘導体又はフラグメントで
あつてよい）との間の共有結合が起る。 ところで、このような標識酵素、殊に標識酵素
としてのPODの使用下でのEIA−法により、重
要の１成分を測定する充分に圧倒的に多数の血清
においては、相応するRIA−系で得られる結果と
比較する際に正しい結果が得られることが明らか
である。しかしながら、以後問題血清と称される
一定数の血清では、正しい値からの高すぎる正の
結果の形での明らかな偏りが現われた。 発明が解決しようとする問題点 従つて、本発明の課題は、この欠点を除き、酵
素イムノアツセイ（EIA）用の標識酵素の接合体
（これはいわゆる問題血清においても正しい結果
を生じる）を得ることである。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明により、酵素免疫測定に好
適な、炭化水素分を含有する標識酵素例えばペル
オキシダーゼと免疫作用物質とからの接合体を、
標識酵素の蛋白質分に作用する結合法を用いて製
造する方法により解決され、この方法は、標識酵
素を、免疫作用物質との結合の前又は後に、水性
媒体中の過沃素酸又はそのアルカリ金属塩で酸化
し、次いで、この酸化生成物をNaBH₄で還元す
ることよりなる。 意外にも、標識酵素分子の過沃素酸酸化に引続
くNaBH₄での還元により、その酵素特性は不変
のまま保持するが、いわゆる問題血清でも、RIA
−法で得られる値と一致する正しい値を生じる標
識酵素誘導体が得られることが判明した。 本発明の方法は、PH−値、好適な緩衝剤の選択
及び緩衝剤濃度に関して、当業者に公知の、酵素
活性を保持するための条件下に実施される。
PODの場合に、酸化工程を約４〜8.5のPH値で緩
衝液中で実施するのが有利である。還元は、約
7.5〜９の間のPH値で有効に作用する。この場合、
反応を、冷却下、殊に10℃より低い温度特に０〜
５℃で実施するのが有利である。しかしながら、
原則的には、PODの公知の比較的良好な温度安
定性を考慮して、約37℃までのより高い温度で操
作することもできる。他の本発明の範囲で好適な
酵素には、PH値及び温度に関してその公知の特性
に相応する条件が通用する。 特に、酵素とハプテンが結合した接合体の場合
に前記の欠点が表われるので、標識酵素とその結
合成分との間の極端な寸法関係（即ち、後者が酵
素分子に比べて非常に小さい）である場合、誤ま
つた結果の危険性が特に存在することが想像され
る。この典型的な例は、チロキシン（T₄）及び
トリヨードチロニン（Trijodthyronin）（T₃）即
ち結合成分としての低分子量のホルモン作用ハプ
テンである。意外にも、本発明によれば、接合体
中の双方の結合成分の寸法割合は不変のまま残
り、即ち、小さい結合成分に比べて相変らず大き
い酵素分子が立体障害作用を示すにもかかわら
ず、誤つた高すぎる結果を阻止することができ
る。 この酵素の結合は、本発明の方法の範囲で、本
発明による酸化−／還元処理の前又はその後に実
施することができる。接合体の製造後の本発明に
よる酸化−／還元処理の実施は、特に、免疫作用
結合成分（即ち免疫作用物質）自体が蛋白質例え
ばTBG又は抗体又は抗体フラグメントである場
合にも可能である。 本発明による標識酵素−接合体の製造のため
に、それ自体が酸化を維持しないかぎり、慣用の
結合方法が好適である。好適な方法は、例えば、
ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ（J.of
Immunoassay）第４（３）巻、209〜327頁（1983
年）に記載されている。二官能性試薬（これはア
ミノ基又はスルフヒドリル基の結合作用をする）
の使用下における結合法が特に好適であることが
立証された。このような二官能性試薬の有利な例
は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイン
イミド−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ヒンジ法）及びグルタールジアルデ
ヒドである〔Immunochem.８、1175〜1179
（1971）参照〕。カルボジイミドの使用下における
直接縮合（J.Cell.Biol.33、307318（1967））も適
用できる。一般に、標識酵素とリガンド
（Ligand）との結合を得るための二官能性架橋剤
としては、西ドイツ特許（DE−Ａ）第2128743号
及び同第2260185号明細書に記載の化合物並びに
ヒドロキシスクインイミド誘導体が好適である。 免疫学的に活性のリガンド（即ち免疫作用物
質）としては、本発明の範囲で、前記のように、
抗体、そのフラグメント例えば、Fab、Fab₂、
Fc−フラグメント、化学的に得られる抗体もし
くはそのフラグメントの誘導体、抗原、及びハプ
テン例えばジゴキシン、ジゴキシゲニン、T₃、
T₄、エストラジオール、エストリオール、プロ
ゲステロン、フオレート（Folat）、テオフイリ
ン、コルチゾール、フエノバルビタール及び類似
物がこれに該当する。 次の第表は、慣用のT₃−POD−接合体（接
合体）、本発明により得られたT₃−POD−接合
体（接合体）及び参照法としての放射能標識さ
れたT₃（RIA）の使用下におけるT₃酵素免疫測定
の結果を示している。 １対照血清を７正常血清（NS）及び４障害血
清（STS：問題血清）と比較した。ヒト血清を
用いた。

【表】 次の第表には、同様な方法で、１例では天然
PODを用い、他の例では本発明により処理され
たPODを用いて得たジゴキシン−POD−接合体
の使用下におけるジゴキシン測定の結果が示され
ている。比較のために、放射能標識されたジゴキ
シンを用いてRIA＝テストを実施した。接合体
は、本発明によるものであり、接合体は非処理
PODを含有する。結果を、１ml当りの結合した
ジゴキシンngで示す。

【表】 前記の値は、本発明により製造されたPOD−
接合体で、RIA法で得られた結果に相当する結果
が得られ、本発明により処理されなかつたPOD
との接合体では、部分的に、正しい値から著るし
くはずれることを示している。分子内に炭水化物
分を有する他の標識酵素でも類似の結果が達成さ
れる。 本発明により、炭水化物含有標識酵素の使用下
における酵素免疫測定の精度及び信頼性は明らか
に改良され、酵素標識付けにより、放射能標識付
けによると同様に信頼できる結果が得られ、従つ
て、放射性物質との関係及びこれに結合した安全
処置を不必要にする試薬の提供が可能である。 実施例 次の実施例につき、本発明を更に説明する。 例 １ ジゴキシゲニン−PODの製造 Ａ PODの酸化及び還元 再蒸留水1.5ml中の市販のPOD10mg（PH5.0）
に、０℃で、0.2モル／の過沃素酸ナトリウム
（再蒸留水中42mg／ml）0.2mlを加える。 40分後に、モレキユラーシーブカラム
（Sephadex Ｇ−25）を通し、10モル／の酢酸
塩（PH5.0）中で脱塩する。 蛋白質含有フラクシヨンを集め、０℃まで冷却
する。 １モル／の炭酸塩／重炭酸塩（PH9.0）でPH
値を8.0にし、直ちに攪拌下にNaBH₄を20ｍモ
ル／まで添加する（∧＝0.756mg／ml）。 30分後にPH値を8.5にする。次いで、更に０℃
で２時間攪拌する。引続き、0.1モル／のKPO₄
（PH8.0）に対する透析を行なう。生成物（POD
（ox））を必要に応じて、0.1モル／の燐酸塩緩
衝液（PH8.0）中でセフアクリル（Sephacryl）Ｓ
−200のクロマトグラフイにかける。 Ｂ Ａで得た生成物（POD（ox））200mgを0.2モ
ル／の燐酸カリウム（PH8.0）200ml中で40℃ま
で冷却する。 ジゴキシゲニン−スクシニル−OSu−（OSu＝
ヒドロキシスクシンイミド）73mgを無水エタノー
ル５ml中に溶かし、４℃で、少量宛POD−溶液
に加える。次いで、４℃で16時間軽く攪拌する。 その後、このバツチ（殆んど活性損失なし）を
0.1モル／燐酸カリウム（PH8.0）／0.15モル／
NaClに対して透析させる。 バツチの浄化は、フエニルセフアロースカラム
50mlを用いて行なう。0.1モル／燐酸カリウム
（PH8.0）／0.15モル／NaClでのカラムの平衡
化。保留物の150ml／ｈでの流出の開始時から、
カラムの流出物を分別する。粗製接合体の流出の
後に、同じ溶剤を有する平衡化緩衝液を用いて更
に溶離させる。約50〜50mlの流過から、カラム溶
離剤を集め、50〜50ml量の接合体プールを形成さ
せる。この接合体プールは、使用したPOD−活
性の約50％を保有している。このプールを超遠心
により接合体約10mg／ml（約10KV／mlに相当）
まで濃縮する。 例 ２ T₃−PODの製法 0.1モル／の燐酸カリウム緩衝液（PH8.0）中
の例1A）で製造したPOD（ox））100mgに、０℃
でジメチルホルムアミド（DMF）9.4mlを添加す
る。DMF）0.6ml中のBOC^*−T₃−OSu25mgを０
℃で加える。攪拌下に更に18時間反応させる。す
べての工程を遮光する。 40ｍモル／トリス／HCl（PH7.5／0.15モル／
NaClに対する透析を４℃で実施。フエニルセ
フアロース（3cm）80mlでの保留物を、40ｍモ
ル／トリス／HCl（PH7.5）／0.15モル／NaCl
中で平衡化させ、１ SV^**／ｈで装荷。未反応
のPODは貫流する。当初吸収度の達成の後に、
40ｍモル／トリス／HCl（PH7.5）／0.15NaCl−
緩衝液を、50％エチレングリコール40ｍモル／
で代える。 トリス（PH7.5）／１モル／NaCl及び接合体
は1SV／ｈで溶離する。 接合体をプールし、溶液に４℃で、接合体量の
50％の0.5モル／塩酸ヒドロキシルアミン溶液
（PH7.0）を加え、２時間攪拌する。 次いで、40ｍモル／KPO₄（PH6.5）に対する
透析を遮光下、４℃で実施。接合体をＣ＝10mg／
mlまで濃縮し、RSAで、Ｃ＝５mg／mlまで増量
する。 ＊ BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル ＊＊ SV＝カラム容積 例 ３ T₄−PODの製法 0.1モル／KPO₄（PH8.5）１ml中の例1A）で製
造したPOD（ox））10mgに徐々にDMF0.9mlを０
℃で添加する。 DMF60μ中のBOC−T₄−OSu2.5mgを氷冷下
に加える。バツチを25℃で６時間攪拌する。その
後40ｍモル／トリス／HCl（PH7.5）／0.15モ
ル／NaClに対して透析する。 透析物を40ｍモル／トリスHCl（PH7.5）／
0.15モル／NaCl中のフエニルセフアロースで
精製。 POD10mg当りカラム量４mlを使用する。平衡
化緩衝液1SV／ｈで溶離。溶離液の当初吸光度に
達したら、接合体を40ｍモル／トリス／HCl
（PH7.5）／0.15モル／NaCl中の50％エチレング
リコール1SV／ｈを用いてで溶離させる。 接合体ピークをＣ＝10mg／mlまで濃縮し、40モ
ル／KPO₄（PH6.5）に対し、４℃で遮光下に透
析させる。 接合体をRSAでＣ＝５mg／mlまで増量し、４
℃で貯蔵する。 例 ４ 例1Bの記載と同様であるが、天然のPODを用
いてジゴキシゲニン−POD−接合体を製造する。
この接合体を再蒸留水に対して透析させ、例1A
の記載と同様に酸化−／還元処理をするが、この
際天然のPODの代りに当量のジゴキシゲニン−
POD−接合体を使用する。 得られた接合体のその試験における特性は、例
１で得られた接合体にまつたく一致する。 例 ５ T₃−テスト １ インキユベーシヨン：免疫反応 抗−T₃−抗体で被覆された市販のテストパツ
キングのプラスチツク小管「エンツマイム・テス
ト T₃（Enzymum Test ^R T₃）（製造者：ベ
ーリンガー・マンハイム、整理番号No.204528）」
に、標準溶液（濃度範囲T₃０〜6nｇ／ml）もし
くは試料100μ及びT₃−POD−接合体溶液各１
mlを加える。 それぞれ、０／12モル／バルビタール緩衝液
（PH8.6）中のPOD約6mU／mlを有する接合体
〜（第表参照）を、ANS（８−アニリノナフ
タリンスルホン酸）0.04％と共に使用する。反応
時間は、室温で２時間である。その後、このイン
キユベーシヨン混合物を吸引濾過し、水と１回混
合し、遅くても５分後に再び吸引濾過する。 ２ インキユベーシヨン：酵素指示薬反応 引続く光度測定の時間サイクル（例えば全て15
秒）で、各管にPOD−基質溶液（0.1モル／燐
酸塩／クエン酸塩緩衝液（PH5.9）、ABTS 9.1
ｍモル／、H₂O₂1.6ｍモル／）各１mlをピペ
ツト導入し、室温で１時間インキユベートする。
引続き、Hg405nmでの吸光度を測定し、試料濃
度をセツトとして不随している標準曲線から読み
とる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 標識酵素の蛋白質分に作用する結合法の使用
   下に、炭水化物分を含有する標識酵素と免疫作用
   物質とからの酵素免疫測定に好適な接合体を製造
   する方法において、標識酵素を、免疫作用物質と
   の結合の前又は後に、水性媒体中の過沃素酸又は
   そのアルカリ金属塩で酸化し、次いでこの酸化生
   成物をNaBH₄で還元することを特徴とする、酵
   素免疫測定に好適な接合体の製法。 ２ 酸化を、PH４〜8.5で、緩衝液中で、冷却下
   に実施する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 還元を、PH7.5〜９で、冷却下にNaBH₄を用
   いて実施する、特許請求の範囲第２項記載の方
   法。