JPS6222065A - 酵素免疫測定に好適な、標識酵素と免疫作用物質とからの接合体の製法 - Google Patents
酵素免疫測定に好適な、標識酵素と免疫作用物質とからの接合体の製法Info
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- JPS6222065A JPS6222065A JP61165705A JP16570586A JPS6222065A JP S6222065 A JPS6222065 A JP S6222065A JP 61165705 A JP61165705 A JP 61165705A JP 16570586 A JP16570586 A JP 16570586A JP S6222065 A JPS6222065 A JP S6222065A
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、酵素免役測定に好適な、炭水化物を含有する
標識酵素と免役作用物質とからの接合体の製法及洩＼ｈ
１含有丈亀隠菓九攬諷駕＼ＱＫ亀に関する。
標識酵素と免役作用物質とからの接合体の製法及洩＼ｈ
１含有丈亀隠菓九攬諷駕＼ＱＫ亀に関する。
従来の技術
免疫学的検出法は、多くの分析の目的、殊に臨床学的分
析の分野で、その優れた感度及び特異性に基づき、ｉｔ
性が増しており、純粋に化学的な方法を凌駕している。
析の分野で、その優れた感度及び特異性に基づき、ｉｔ
性が増しており、純粋に化学的な方法を凌駕している。
この分析法では、一般に、免疫学的結合成分の１つを標
識し、この際、特にはじめに、放射線標識（ＲＩＡ）が
、後には酵素標識（ＥＩＡ）が１要になった。酵素標識
付けの使用下における免疫学的検出法の分野では、標識
付けの目的にとっては少数の酵素が特に好適であること
が立証されており、この際立証容易性、高安定性及び免
疫反応へのできるだけ少ない影替が、特にその優遇に決
定的な特性である。既に使用されているか又は使用可能
な標識酵素（Ｍａｒｋｉｅｒｕｎｇｓｅｎｚｙｍ ）
には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ） （Ｅ、Ｃ
，１，１。
識し、この際、特にはじめに、放射線標識（ＲＩＡ）が
、後には酵素標識（ＥＩＡ）が１要になった。酵素標識
付けの使用下における免疫学的検出法の分野では、標識
付けの目的にとっては少数の酵素が特に好適であること
が立証されており、この際立証容易性、高安定性及び免
疫反応へのできるだけ少ない影替が、特にその優遇に決
定的な特性である。既に使用されているか又は使用可能
な標識酵素（Ｍａｒｋｉｅｒｕｎｇｓｅｎｚｙｍ ）
には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ） （Ｅ、Ｃ
，１，１。
３．４）、β−フラクトシダーゼ（インベルターゼ）（
Ｅ、Ｃ，３，２，１，２６）、アルカリホスファターゼ
（ＡＰ） （Ｅ、Ｃ，３、１、３，１）及びペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）（Ｅ、Ｃ，１。
Ｅ、Ｃ，３，２，１，２６）、アルカリホスファターゼ
（ＡＰ） （Ｅ、Ｃ，３、１、３，１）及びペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）（Ｅ、Ｃ，１。
１１．１．７）が属し、これらはすべて、分子内に炭水
化動弁を含有する。これらはいわゆる酵素接合体（Ｅｎ
ｚｙｍｋｏｎＪｕｇａｚｅ ） の形で使用される。
化動弁を含有する。これらはいわゆる酵素接合体（Ｅｎ
ｚｙｍｋｏｎＪｕｇａｚｅ ） の形で使用される。
これは、ｗＡ識酵素と免疫学的作用反応成分との結合生
成物であり、ここでは、一般に、標ｗｔ酵素と免疫学的
結合成分（例えば抗原、））ブテン、抗体、抗体の誘導
体又はフラグメントであってよい）との間の共有結合が
起る。
成物であり、ここでは、一般に、標ｗｔ酵素と免疫学的
結合成分（例えば抗原、））ブテン、抗体、抗体の誘導
体又はフラグメントであってよい）との間の共有結合が
起る。
ところで、このような標識酵素、殊に標識酵素としての
ＰＯＤの使用下でのＥＩＡ−法により、Ｘ要の１成分を
測定する充分に圧倒的に多数の血清においては、相応す
るＲＩＡ−系で得られる結果と比較する際に正しい結果
が得られることが明らかである。しかしながら、以後問
題血清と称される一定数の血清では、正しい値からの高
すぎる正の結果の形での明らかな偏りが現われた。
ＰＯＤの使用下でのＥＩＡ−法により、Ｘ要の１成分を
測定する充分に圧倒的に多数の血清においては、相応す
るＲＩＡ−系で得られる結果と比較する際に正しい結果
が得られることが明らかである。しかしながら、以後問
題血清と称される一定数の血清では、正しい値からの高
すぎる正の結果の形での明らかな偏りが現われた。
発明が解決しようとする間勉点
従って、本発明の課題は、この欠点を除き、酵素イムノ
アッセイ（ＥＩＡ）用の標識酵素の接合体（これはいわ
ゆる間聴血清においても正しい結果を生じる）を得るこ
とである。
アッセイ（ＥＩＡ）用の標識酵素の接合体（これはいわ
ゆる間聴血清においても正しい結果を生じる）を得るこ
とである。
問題点を解決するための手段
１この課題は、本発明により、＃素免疫測定に好適な、
炭化水素弁を含有する標ＦＩ＆酵素例えばペルオキシダ
ーゼと免役学的に作用する物質とからの接合体を、標識
酵素の蛋白買弁に作用する結合法を用いて製造する方法
により解決され、この方法は、標識酵素を、免疫作用物
質との結合の前又は後に、水性媒体中の過沃素酸又はそ
のアルカリ金属塩で酸化し、次いで、この酸化生成物を
ＮａＢＨ４で還元することよりなる。
１この課題は、本発明により、＃素免疫測定に好適な、
炭化水素弁を含有する標ＦＩ＆酵素例えばペルオキシダ
ーゼと免役学的に作用する物質とからの接合体を、標識
酵素の蛋白買弁に作用する結合法を用いて製造する方法
により解決され、この方法は、標識酵素を、免疫作用物
質との結合の前又は後に、水性媒体中の過沃素酸又はそ
のアルカリ金属塩で酸化し、次いで、この酸化生成物を
ＮａＢＨ４で還元することよりなる。
意外にも、標識酵素分子の過沃素酸酸化に引続（ＮａＢ
Ｈ４での還元により、その酵素特性は不変のまま保持す
るが、いわゆる問題血清でも、ＲＩＡ−法で得られる値
と一致する正しい値を生じる標識酵素誘導体が得られる
ことが判明した。
Ｈ４での還元により、その酵素特性は不変のまま保持す
るが、いわゆる問題血清でも、ＲＩＡ−法で得られる値
と一致する正しい値を生じる標識酵素誘導体が得られる
ことが判明した。
本発明の方法は、−一値、好適な緩衝剤の遠択及び緩衝
剤濃度に関して、当条者に公知の、＃素活性を保持する
ための条件下に実施される。
剤濃度に関して、当条者に公知の、＃素活性を保持する
ための条件下に実施される。
ＰＯＤの場合に、酸化工程を約４〜８．５の一値で緩′
ｇｉ液中で実施するのが有利である。還元は、約７．５
〜９０間の一値で有効に作用する。この場合、反応を、
冷却下、殊に１０°Ｃより低い温度特に０〜５℃で実施
するのが有利である。しかしながら、原則的には、ＰＯ
Ｄの公知の比較的良好な温度安定性を考慮して、約６７
℃までのより高い温度で操作することもできる。他の本
発明の範囲で好適な酵素には、ｐｌ（値及び温度に関し
てその公知の特性に相応する条件が通用する。
ｇｉ液中で実施するのが有利である。還元は、約７．５
〜９０間の一値で有効に作用する。この場合、反応を、
冷却下、殊に１０°Ｃより低い温度特に０〜５℃で実施
するのが有利である。しかしながら、原則的には、ＰＯ
Ｄの公知の比較的良好な温度安定性を考慮して、約６７
℃までのより高い温度で操作することもできる。他の本
発明の範囲で好適な酵素には、ｐｌ（値及び温度に関し
てその公知の特性に相応する条件が通用する。
特に、酵素と〕−ブテンが結合した接合体の場合に前記
の欠点が表われるので、標識酵素とその結合成分との間
の極端な寸法関係（即ち、後者が酵素分子に比べて非常
に小さい）である場合、１１っだ結果の危険性が特に存
在することが想像される。この典型的な例は、チロキシ
ン（Ｔ４）及ヒドリヨートチａニン（Ｔｒｉ、）ｏｄｚ
ｈｒｏｎｉｎ ）（Ｔ３）即ち結合成分としての低分子
量のホルモン作用ハプテンである。意外にも、本発明に
よれば、接合体中の双方の結合成分の寸法割合は不変の
まま残り、即ち、小さい結合成分に比べて相変らず大き
い酵素分子が立体障害作用を示すにもかかわらず、誤ま
った高すぎる結果を阻止することができる。
の欠点が表われるので、標識酵素とその結合成分との間
の極端な寸法関係（即ち、後者が酵素分子に比べて非常
に小さい）である場合、１１っだ結果の危険性が特に存
在することが想像される。この典型的な例は、チロキシ
ン（Ｔ４）及ヒドリヨートチａニン（Ｔｒｉ、）ｏｄｚ
ｈｒｏｎｉｎ ）（Ｔ３）即ち結合成分としての低分子
量のホルモン作用ハプテンである。意外にも、本発明に
よれば、接合体中の双方の結合成分の寸法割合は不変の
まま残り、即ち、小さい結合成分に比べて相変らず大き
い酵素分子が立体障害作用を示すにもかかわらず、誤ま
った高すぎる結果を阻止することができる。
この酵素の結合は、本発明の方法の範囲で本発明による
酸化−／還元処理の前又はその後に実施することができ
る。接合体の製造後の本発明による酸化−／還元処理の
実施は、特に、免疫作用結合成分自体が蛋白質例えばＴ
ＢＧ又は抗体又は抗体フラグメントである場合にも可能
である。
酸化−／還元処理の前又はその後に実施することができ
る。接合体の製造後の本発明による酸化−／還元処理の
実施は、特に、免疫作用結合成分自体が蛋白質例えばＴ
ＢＧ又は抗体又は抗体フラグメントである場合にも可能
である。
本発明による標識＃累−接合体の製造のために、それ自
体が酸化を維持しないかぎり、慣用の結合方法が好適で
ある。好適な方法は、例えば、シャーナル・オシ・イム
ノアッセイ（Ｊ。
体が酸化を維持しないかぎり、慣用の結合方法が好適で
ある。好適な方法は、例えば、シャーナル・オシ・イム
ノアッセイ（Ｊ。
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ） 第４（６）巻、
２０９〜６２７頁（１９８３年）に記載されている。二
官能性試薬（これはアミノ基又はスルフヒドリル基の結
合作用をする）の使用下における結合法が特に好適であ
ることが立証された。このような二官能性試薬の有利な
例は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレインイミ
ド−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ヒンジ法）及びゲルタールジアルデヒドである［ Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、 ８．１１７５〜１１７９（１９
７１）参照〕。カルボジイミドの使用下における直接縮
合（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ３３．３０７３１
８（１９６７））も適用できる。一般に、標識酵素とり
がンド（Ｌｉｇａｎｄ ）−との結合を得るための二官
能性架橋剤としては、西ドイツ特許（ＤＥ −Ａ ）第
２１２８７４３号及び同第２２６０１８５号明細書に記
載の化合物並びにヒドロキシスクシンイミド誘導体が好
適である。
２０９〜６２７頁（１９８３年）に記載されている。二
官能性試薬（これはアミノ基又はスルフヒドリル基の結
合作用をする）の使用下における結合法が特に好適であ
ることが立証された。このような二官能性試薬の有利な
例は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレインイミ
ド−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ヒンジ法）及びゲルタールジアルデヒドである［ Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、 ８．１１７５〜１１７９（１９
７１）参照〕。カルボジイミドの使用下における直接縮
合（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ３３．３０７３１
８（１９６７））も適用できる。一般に、標識酵素とり
がンド（Ｌｉｇａｎｄ ）−との結合を得るための二官
能性架橋剤としては、西ドイツ特許（ＤＥ −Ａ ）第
２１２８７４３号及び同第２２６０１８５号明細書に記
載の化合物並びにヒドロキシスクシンイミド誘導体が好
適である。
免疫学的に活性のすがンドとしては、本発明の範囲で、
前記のように、抗体、そのフラグメント例えば、Ｆａｂ
、 Ｆａｂ２、Ｆｃ−７ラグメント、化学的に得られ
る抗体もしくはそのフラグメントの誘導体、抗原 及び
ハプテン例えはジゴキシン、ジゴキシン測定、Ｔ３、Ｔ
４、エストラジオール、エストリオール、フロｒステロ
ン、フオレー） （Ｆｏｌａｔ、 ） 、テオフィリン
、コルテゾ 「−ル、フエノパルビタール及び類似
物がこれに該当する。
前記のように、抗体、そのフラグメント例えば、Ｆａｂ
、 Ｆａｂ２、Ｆｃ−７ラグメント、化学的に得られ
る抗体もしくはそのフラグメントの誘導体、抗原 及び
ハプテン例えはジゴキシン、ジゴキシン測定、Ｔ３、Ｔ
４、エストラジオール、エストリオール、フロｒステロ
ン、フオレー） （Ｆｏｌａｔ、 ） 、テオフィリン
、コルテゾ 「−ル、フエノパルビタール及び類似
物がこれに該当する。
次の第１表は、慣用の’ｒ３− ＰＯＤ−接合体（接合
体Ｉ）、本発明により得られた’ｒ３− ＰＯＤ−接合
体（接合体■）及び参照法としての放射能標識された’
ｒ３（ＲＩＡ） の使用下におけるＴ３−酵素免役測
定の結果を示している。
体Ｉ）、本発明により得られた’ｒ３− ＰＯＤ−接合
体（接合体■）及び参照法としての放射能標識された’
ｒ３（ＲＩＡ） の使用下におけるＴ３−酵素免役測
定の結果を示している。
１対照血清を７正常血清（ＮＳ）及び４障害血清（ＳＴ
Ｓ ：間辿血渭）と比較した。ヒト血清を用いた。
Ｓ ：間辿血渭）と比較した。ヒト血清を用いた。
第１表
ｎ、ｄ、＝実施せず
次の第…表には、同様な方法で、１例では天然ＰＯＤを
用い、他の例では本発明により処理さレタＰＯＤｋ用い
て得たゾビキシンーＰＯＤ−接合体の使用下におけるジ
ゴキシン測定の結果が示されている。比較のために、放
射能標識されたジブキシンを用いてＲＩＡ ＝テストを
実施した。
用い、他の例では本発明により処理さレタＰＯＤｋ用い
て得たゾビキシンーＰＯＤ−接合体の使用下におけるジ
ゴキシン測定の結果が示されている。比較のために、放
射能標識されたジブキシンを用いてＲＩＡ ＝テストを
実施した。
接合体■は、本発明によるものであり、接合体■は非処
理Ｐ叩を含有する。結果を、ｉ ｍｌ当りの結合したジ
ゴキシンｎｇで示す。
理Ｐ叩を含有する。結果を、ｉ ｍｌ当りの結合したジ
ゴキシンｎｇで示す。
第…表
前記の値は、本発明により製造されたＰＯＤ −接合体
で、ＲＩＡ法で得られた結果に相当する結果が得られ、
本発明により処理されなかったＰＯＤとの接合体では、
部分的に、正しい値から著るしくはずれることを示して
いる。分子内に炭水化動労を有する他の標識酵素でも類
似の結果が達成される。
で、ＲＩＡ法で得られた結果に相当する結果が得られ、
本発明により処理されなかったＰＯＤとの接合体では、
部分的に、正しい値から著るしくはずれることを示して
いる。分子内に炭水化動労を有する他の標識酵素でも類
似の結果が達成される。
本発明により、炭水化物含有標識＃素の使用下における
酵素免疫測定の精度及びイｇ頼性は明らかに改良され、
酵素標識付けにより、放射能標識付けによると同様に信
頼できる結果が得られ、従って、放射性物質との関係及
びこれに結合した安全処置を不必要にする試薬の提供が
可能である。
酵素免疫測定の精度及びイｇ頼性は明らかに改良され、
酵素標識付けにより、放射能標識付けによると同様に信
頼できる結果が得られ、従って、放射性物質との関係及
びこれに結合した安全処置を不必要にする試薬の提供が
可能である。
実施例
次の実施例につき、本発明を更に説明する。
例１
ジゴキシゲニンーＰＯＤの製造
Ａ） ＰＯＤの酸化及び還元
再蒸留水１．５ａ中の市販ｏｐｏｐ１０ＷＩ９（ｐＨ５
，０）に、０°Ｃで、０．２モル／ｌの過沃素酸ナトリ
ウム（再蒸留水中４２ｍｙ／ｒｔｔｌ ） ０．２ＩＩ
Ｌｌｔｌ−加える。
，０）に、０°Ｃで、０．２モル／ｌの過沃素酸ナトリ
ウム（再蒸留水中４２ｍｙ／ｒｔｔｌ ） ０．２ＩＩ
Ｌｌｔｌ−加える。
４０分後に、モレキュラーシーブカラム（５ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−２５） ’に通し、１０モル／ｌの酢酸塩（
ｐ！−１５，０）中で脱塩する。
ｅｘ Ｇ−２５） ’に通し、１０モル／ｌの酢酸塩（
ｐ！−１５，０）中で脱塩する。
蛋白質含有フラクションを集め、０℃まで冷却する。
１モル／ｌの炭酸塩／Ｘ炭酸塩（ｐＨ９，０）で−値を
８．０にし、直ちに攪拌下にＮａＢＨ４ｔ” ２０ｍ
モ／ｌ／ ／ ｌまで添加する（９０．７５６１１１＆
／ｄ）。
８．０にし、直ちに攪拌下にＮａＢＨ４ｔ” ２０ｍ
モ／ｌ／ ／ ｌまで添加する（９０．７５６１１１＆
／ｄ）。
３０分後にｐＨ値を８．５にする。次いで、更に０℃で
２時間攪拌する。引続き、０．１モル／ｌのＫＰＯ，（
Ｐ）（８，０）に対する透析を行なう。生成物（ＰＯＤ
（ｏｘ）） を必要に応じて、０．１モル／ｌの燐酸塩
緩衝液（ｐ）１８．０）中でセファクリル（５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ ） Ｓ −２００のクロマトグラフィ
「にかける。
２時間攪拌する。引続き、０．１モル／ｌのＫＰＯ，（
Ｐ）（８，０）に対する透析を行なう。生成物（ＰＯＤ
（ｏｘ）） を必要に応じて、０．１モル／ｌの燐酸塩
緩衝液（ｐ）１８．０）中でセファクリル（５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ ） Ｓ −２００のクロマトグラフィ
「にかける。
Ｂ） Ａ）で得た生成物（ＰＯＤ（ｏｘ）） ２００
１Ｎｉを０．２モル／ｌの燐酸カリウム（ｐ？１８．０
）２０ａ中で４０℃まで冷却する。
１Ｎｉを０．２モル／ｌの燐酸カリウム（ｐ？１８．０
）２０ａ中で４０℃まで冷却する。
ジゴキシｒニンースクシニルーＯ８ｕ （Ｏ８ｕ ＝ヒ
ドロキシスクシンイミド）７３即金無水工タノール５Ｍ
φに浴かし、４℃で、少量宛ＰＯＤ −溶液に加える。
ドロキシスクシンイミド）７３即金無水工タノール５Ｍ
φに浴かし、４℃で、少量宛ＰＯＤ −溶液に加える。
次いで、４℃で１６時間軽く攪拌する。
その後、このバッチ（殆んど活性損失なし）を０．１モ
ル／ｌ燐酸カリウム（ｐＨ８，０） １０．１５モル／
ｌ ＮａＣｊに対して透析させる。
ル／ｌ燐酸カリウム（ｐＨ８，０） １０．１５モル／
ｌ ＮａＣｊに対して透析させる。
バッチの浄化は、フェニルセファロースカラム５ＯＮを
用いて行なう。０．１モル／ｌ燐酸カリウム（ｐ）１８
．０ ） １０．１５モル／ ｌ ＮａＣＪでのカラム
の平衡化。保留物の１５０α／ｈでの流出の開始時から
、カラムの流出物を分別する。
用いて行なう。０．１モル／ｌ燐酸カリウム（ｐ）１８
．０ ） １０．１５モル／ ｌ ＮａＣＪでのカラム
の平衡化。保留物の１５０α／ｈでの流出の開始時から
、カラムの流出物を分別する。
粗製接合体の流出の後に、同じ俗剤を有する平衡化緩衝
液を用いて更に溶離させる。約５０〜５Ｑｍの流過から
、カラム溶離物を集め、５０〜５５ｒＩＬｌ量の接合体
プールを形成させる。この接合体プールは、使用したＰ
ＯＤ−活性の約５０％を保有している。このプールを超
遠心により接合体約１０ｑ／ｄ（約１０ ＫＶ／ｍＡに
相当）まで濃縮する。
液を用いて更に溶離させる。約５０〜５Ｑｍの流過から
、カラム溶離物を集め、５０〜５５ｒＩＬｌ量の接合体
プールを形成させる。この接合体プールは、使用したＰ
ＯＤ−活性の約５０％を保有している。このプールを超
遠心により接合体約１０ｑ／ｄ（約１０ ＫＶ／ｍＡに
相当）まで濃縮する。
例２
Ｔ、−ＰＯＤの製造
０．１モル／ｌ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）中の
例Ｉ Ａ）で製造したＰＯＤ（ｏｘ） １００ ｒｎ９
ＶＣ１０℃でジメチルホルムアミドＣＤＭＰ） ９．４
ｒｕｇ を添加する。ＤＭＦｏ、６ｄ中のＢＯＣ”−
Ｔ３− Ｏ８ｕ ２５ ”９を０°Ｃで加える。攪拌下
に更に１８時間反応させる。すべての工程を遮光する。
例Ｉ Ａ）で製造したＰＯＤ（ｏｘ） １００ ｒｎ９
ＶＣ１０℃でジメチルホルムアミドＣＤＭＰ） ９．４
ｒｕｇ を添加する。ＤＭＦｏ、６ｄ中のＢＯＣ”−
Ｔ３− Ｏ８ｕ ２５ ”９を０°Ｃで加える。攪拌下
に更に１８時間反応させる。すべての工程を遮光する。
４０ｍモル／ｌ）リス／ ｎｃｔ （ｐ）１７．５／
０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊ に対する透析を４℃
で実施。フェニルセファロース（φ３ｃｍ）８０ａｔで
の保留物を、４０ｍモル／ｌ）リス／ＨＣＪ （ｐ）１
７．５ ）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣＪ中で平衡化
させ、１Ｓｖ＊＊／ｈで装荷。未反応のＰＯＤは貫流す
る。
０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊ に対する透析を４℃
で実施。フェニルセファロース（φ３ｃｍ）８０ａｔで
の保留物を、４０ｍモル／ｌ）リス／ＨＣＪ （ｐ）１
７．５ ）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣＪ中で平衡化
させ、１Ｓｖ＊＊／ｈで装荷。未反応のＰＯＤは貫流す
る。
当初吸収度の達成の後に、４０ｍモル／ｌ）！Ｊス／
ＨＣＪ’ （ｐ）’ ７．５）／ ０．１５ ＮａＣｊ
−緩衝液を、５（ｌエチレングリコール４０ｍモル／ｌ
で代える。
ＨＣＪ’ （ｐ）’ ７．５）／ ０．１５ ＮａＣｊ
−緩衝液を、５（ｌエチレングリコール４０ｍモル／ｌ
で代える。
トリス（ＰＨ７．５）／１モル／ ｌ ＮａＣｊ及び電
接合体 ＼×−（＼鬼は１ ｓｖ’／ｈで溶離する。
接合体 ＼×−（＼鬼は１ ｓｖ’／ｈで溶離する。
接合体を７０−ルし、溶液に４°Ｃで、接合体量の５０
％の０．５モル／ｊ塩酸ヒドロキシルアミン溶液（ｐ）
１７．０）を加え、２時間攪拌する。
％の０．５モル／ｊ塩酸ヒドロキシルアミン溶液（ｐ）
１７．０）を加え、２時間攪拌する。
次いで、４０ｍモル／ｌ ＫＰＯ，（ｐＨ６，５）に対
する透析を遮光下、４°Ｃで実施。接合体をＣ＝１０ｒ
ｎｆＩ／酎まで濃縮し、Ｒ８Ａで、Ｃ＝５〜／ＩｒＬｌ
まで増蓋する。
する透析を遮光下、４°Ｃで実施。接合体をＣ＝１０ｒ
ｎｆＩ／酎まで濃縮し、Ｒ８Ａで、Ｃ＝５〜／ＩｒＬｌ
まで増蓋する。
＊ ＢＯＣ＝ｚ−ブトキシカルボニル＊＊Ｓｖ＝
カラム容積 例３ ’ｒ、 −ＰＯＤの製造 ０．１モル／ ｌ ＫＰＯ４（ｐ’ ８．５ ） １
ｒｌＬｌ中の例ＩＡ）で製造したＰＯＤ（ｏｘ） １０
Ｑに徐々にｎＭＦＯ，９ｄを０℃で添加する。
カラム容積 例３ ’ｒ、 −ＰＯＤの製造 ０．１モル／ ｌ ＫＰＯ４（ｐ’ ８．５ ） １
ｒｌＬｌ中の例ＩＡ）で製造したＰＯＤ（ｏｘ） １０
Ｑに徐々にｎＭＦＯ，９ｄを０℃で添加する。
ＤＭＦ （５Ｑ Ｉｌｌ中のＢＯＣ−Ｔ４− Ｏ８ｕ
２．５ ｍ９ ｆ、水冷下に加える。バッチを２５°Ｃ
で６時間攪拌する。
２．５ ｍ９ ｆ、水冷下に加える。バッチを２５°Ｃ
で６時間攪拌する。
その後４０ｍモル／ｌトリス／Ｈｃｚ （ｐ）１７．５
）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊに対して透析する
。
）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊに対して透析する
。
透析物を４０ｍモル／ｌ）リスＨＣＪ （ｐｔ４７．５
）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊ中のフェニルセファ
ローズでａ製。 。
）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊ中のフェニルセファ
ローズでａ製。 。
ＰＯＤ １０■当り力°ラムｔ４１１１Ｊを使用する。
平衡化緩１ｊ＆ＩＳＶ／ｈで溶離。溶離液の当初吸光度
に達したら、接合体を４０ｍモル／ｌトリス／ＨＣＪ（
ＰＨ７．５）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊ中の５０
チエチレングリコール１ｓＶ／ｈ’ｉ用いて溶離させる
。
に達したら、接合体を４０ｍモル／ｌトリス／ＨＣＪ（
ＰＨ７．５）１０．１５モル／ ｌ ＮａＣｊ中の５０
チエチレングリコール１ｓＶ／ｈ’ｉ用いて溶離させる
。
接合体ピークをＣ＝１０．ＩＩ？／Ｉｌｌまで濃縮し、
４０ｍモルフｉ ＫＰＯ，（Ｐｉ（６，５）に対し、４
°Ｃで迦光下に透析させる。
４０ｍモルフｉ ＫＰＯ，（Ｐｉ（６，５）に対し、４
°Ｃで迦光下に透析させる。
接合体量Ｒ８ＡでＣ＝ Ｅｌ’／ｒＬｌ’Ｅで増撤し、
４℃で貯蔵する。
４℃で貯蔵する。
例４
例１Ｂの記載と同様であるが、天然のＰＯＤを用いてゾ
ゴキシデニンーＰＯＤ−接合体ヲ裏造す てる。
ゴキシデニンーＰＯＤ−接合体ヲ裏造す てる。
この接合体を再蒸留水に対して透析させ、例Ｉ Ａ）の
記載と同様に酸化−／還元処理をするが、この際天然の
ＰＯＤの代りに当量のジゴキシデニンーＰＯＤ−接合体
を使用する。
記載と同様に酸化−／還元処理をするが、この際天然の
ＰＯＤの代りに当量のジゴキシデニンーＰＯＤ−接合体
を使用する。
得られた接合体のその試験における特性は、例１で得ら
れた接合体にまったく一致する。
れた接合体にまったく一致する。
例５
Ｔ３−テスト
１、 インキュベーション：免疫反応
抗−Ｔ３−抗体で被僅された市販のテストバッキングの
プラスチック小管［エンツイマム番テスト■Ｔ３、（Ｅ
ｎｚｙｍｕｍ Ｔｅａｓ ＲＴ３ ） （Ｉｌｌ造省：
べ−リンが−・マンハイム、整理番号 １％２０４５２８）Ｊに、標準溶液（濃度範囲Ｔ３０％
ｎ、！ｉ’ ／ Ｉｌｌ ）もしくは試料１００μＪ及
びＴ３−ＰＯＤ−接合体ピーク１１Ｌｌを加える。
プラスチック小管［エンツイマム番テスト■Ｔ３、（Ｅ
ｎｚｙｍｕｍ Ｔｅａｓ ＲＴ３ ） （Ｉｌｌ造省：
べ−リンが−・マンハイム、整理番号 １％２０４５２８）Ｊに、標準溶液（濃度範囲Ｔ３０％
ｎ、！ｉ’ ／ Ｉｌｌ ）もしくは試料１００μＪ及
びＴ３−ＰＯＤ−接合体ピーク１１Ｌｌを加える。
それぞれ、０．１２モル／ｌバルビタール緩衝液（ＰＩ
−１８，６＞中のＰＯＤ約６ｍＵ／継を有する接合体１
〜■（第１表参照）を、ＡＮＳ （８−アニリノナフタ
リンスルホン酸） ０．０４ ％と共に使用する。反応
時間は、室温で２時間である。その後、このインキュベ
ーション混合物を吸引濾過し、水と１回混合し、遅くて
も５分後に再び吸引認過する。
−１８，６＞中のＰＯＤ約６ｍＵ／継を有する接合体１
〜■（第１表参照）を、ＡＮＳ （８−アニリノナフタ
リンスルホン酸） ０．０４ ％と共に使用する。反応
時間は、室温で２時間である。その後、このインキュベ
ーション混合物を吸引濾過し、水と１回混合し、遅くて
も５分後に再び吸引認過する。
２、インキュベーション：酵素指示薬反応引続く光度測
定の時間サイクル（例えば全て１５秒）で、各管にＰＯ
Ｄ−基質溶液（０，１モル／ ｌ ｆ１４酸塩／ ｌ
ｘ−ｙ酸塩ｌｉ＆衝＊ （ｐＨ５，０）、ＡＢＴ＃ ９
．１ ｍモル／ ｌ 、 Ｈ２Ｏ２１，６ｍモル／ｌ）
ｑ！ｒ１Ｍをざペット導入し、室温で１時間インキュベ
ートする。引続き、Ｈｇ４［］５ｎｍでの吸光度を測定
し、試料製置をセットとして付随している標準曲線から
読みとる。
定の時間サイクル（例えば全て１５秒）で、各管にＰＯ
Ｄ−基質溶液（０，１モル／ ｌ ｆ１４酸塩／ ｌ
ｘ−ｙ酸塩ｌｉ＆衝＊ （ｐＨ５，０）、ＡＢＴ＃ ９
．１ ｍモル／ ｌ 、 Ｈ２Ｏ２１，６ｍモル／ｌ）
ｑ！ｒ１Ｍをざペット導入し、室温で１時間インキュベ
ートする。引続き、Ｈｇ４［］５ｎｍでの吸光度を測定
し、試料製置をセットとして付随している標準曲線から
読みとる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、標識酵素の蛋白質分に作用する結合法の使用下に、
炭水化物分を含有する標識酵素と免疫作用物質とからの
酵素免疫測定に好適な接合体を製造するために、標識酵
素を、免疫作用物質との結合の前又は後に、水性媒体中
の過沃素酸又はそのアルカリ金属塩で酸化し、次いでこ
の酸化生成物をＮａＢＨ＿４で還元することを特徴とす
る、酵素免疫測定に好適な接合体の製法。 ２、酸化を、ｐＨ４〜８．５で、緩衝液中で、冷却下に
実施する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、還元を、ＰＨ７．５〜９で、冷却下にＮａＢＨ＿４
を用いて実施する、特許請求の範囲第１項又は第２項記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853525911 DE3525911A1 (de) | 1985-07-19 | 1985-07-19 | Konjugat fuer die enzymimmunobestimmung |
| DE3525911.6 | 1985-07-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6222065A true JPS6222065A (ja) | 1987-01-30 |
| JPH0476579B2 JPH0476579B2 (ja) | 1992-12-04 |
Family
ID=6276256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61165705A Granted JPS6222065A (ja) | 1985-07-19 | 1986-07-16 | 酵素免疫測定に好適な、標識酵素と免疫作用物質とからの接合体の製法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4843001A (ja) |
| EP (1) | EP0209155B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6222065A (ja) |
| AT (1) | ATE58246T1 (ja) |
| CA (1) | CA1263601A (ja) |
| DE (2) | DE3525911A1 (ja) |
| ES (1) | ES2000089A6 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5248592A (en) * | 1987-06-04 | 1993-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Use of a derivatized alkaline phosphatase as a standard |
| US5324650A (en) * | 1990-03-20 | 1994-06-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Situ process for production of conjugates |
| DE4108748A1 (de) * | 1991-03-18 | 1992-09-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnose von bakteriellen infektionen durch nachweis von glykokonjugaten |
| DE4227102C2 (de) * | 1992-08-17 | 2002-11-14 | Dade Behring Marburg Gmbh | Immunchemisches Verfahren zum Nachweis eines Analyten |
| AU662235B2 (en) * | 1992-09-04 | 1995-08-24 | Becton Dickinson & Company | Intrinsic factor - horseradish peroxidase conjugates |
| DE4237479A1 (de) * | 1992-11-06 | 1994-05-11 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus einem spezifischen Bindungspartner und einem kohlenhydrathaltigen Protein |
| US6027874A (en) * | 1995-01-23 | 2000-02-22 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Immunoenzymatic conjugate, method for its productions, applications thereof |
| FR2734365B1 (fr) * | 1995-05-18 | 1999-04-09 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
| FR2729760B1 (fr) * | 1995-01-23 | 1997-08-14 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
| US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
| US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2923139A1 (de) * | 1979-06-07 | 1980-12-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von immunologisch aktiven enzymmarkierten konjugaten |
| US4410633A (en) * | 1980-09-25 | 1983-10-18 | Corning Glass Works | Method for the measurement of free thyroxine or 3,5,3'-triiodothyronine in a liquid sample |
| JPS58122459A (ja) * | 1982-01-14 | 1983-07-21 | Yatoron:Kk | 酵素の会合を利用した測定方法 |
-
1985
- 1985-07-19 DE DE19853525911 patent/DE3525911A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-08 CA CA000513337A patent/CA1263601A/en not_active Expired
- 1986-07-11 US US06/884,431 patent/US4843001A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-16 JP JP61165705A patent/JPS6222065A/ja active Granted
- 1986-07-18 AT AT86109900T patent/ATE58246T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 EP EP86109900A patent/EP0209155B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-18 ES ES8600379A patent/ES2000089A6/es not_active Expired
- 1986-07-18 DE DE8686109900T patent/DE3675447D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3525911A1 (de) | 1987-01-29 |
| DE3675447D1 (de) | 1990-12-13 |
| EP0209155B1 (de) | 1990-11-07 |
| ATE58246T1 (de) | 1990-11-15 |
| ES2000089A6 (es) | 1987-12-01 |
| JPH0476579B2 (ja) | 1992-12-04 |
| CA1263601A (en) | 1989-12-05 |
| EP0209155A1 (de) | 1987-01-21 |
| US4843001A (en) | 1989-06-27 |
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