JP3292007B2 - 色素標識タンパク質複合体及びその作製方法 - Google Patents
色素標識タンパク質複合体及びその作製方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シアニン系標識色
素で標識されたタンパク質の複合体に関する。さらに詳
しくは、タンパク質複合体のアミノ基とシアニン系標識
色素のスクシンイミジル基とが反応することによって作
製される色素標識タンパク質複合体に関する。
素で標識されたタンパク質の複合体に関する。さらに詳
しくは、タンパク質複合体のアミノ基とシアニン系標識
色素のスクシンイミジル基とが反応することによって作
製される色素標識タンパク質複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】前記式（化１）で示される化合物のよう
に、反応性に富む官能基を有するシアニン系標識色素
は、タンパク質の標識にしばしば利用されている。この
際、標識色素の官能基はタンパク質のアミノ基あるいは
カルボキシル基と反応し、１分子のタンパク質に対して
20〜50分子の標識色素が結合する。通常、タンパク質に
は数百から数千個のアミノ基あるいはカルボキシル基が
存在するが、タンパク質は３次元の立体構造を有するた
め、これらの中で反応に関与できるものは50個程度であ
ると考えられる。したがって、従来の技術では、１分子
のタンパク質に対して色素50分子の標識が限界であっ
た。
に、反応性に富む官能基を有するシアニン系標識色素
は、タンパク質の標識にしばしば利用されている。この
際、標識色素の官能基はタンパク質のアミノ基あるいは
カルボキシル基と反応し、１分子のタンパク質に対して
20〜50分子の標識色素が結合する。通常、タンパク質に
は数百から数千個のアミノ基あるいはカルボキシル基が
存在するが、タンパク質は３次元の立体構造を有するた
め、これらの中で反応に関与できるものは50個程度であ
ると考えられる。したがって、従来の技術では、１分子
のタンパク質に対して色素50分子の標識が限界であっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな標識タンパク質を抗原抗体反応を利用した免疫クロ
マトに用いるには、さらなる色素標識が必要であり、こ
れを可能にする技術およびその技術によって作製された
標識物、すなわち、色素標識タンパク質複合体が要請さ
れていた。
うな標識タンパク質を抗原抗体反応を利用した免疫クロ
マトに用いるには、さらなる色素標識が必要であり、こ
れを可能にする技術およびその技術によって作製された
標識物、すなわち、色素標識タンパク質複合体が要請さ
れていた。
【０００４】本発明は前記課題を解決するため、第１の
タンパク質と第２のタンパク質とが共有結合を介して結
合しているタンパク質複合体に、前記式（化１）で示さ
れるシアニン系標識色素（ただし、Ｘはハロゲン、Ｍは
水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
が結合した色素標識タンパク質複合体と、その作製方法
を提供することを目的とする。
タンパク質と第２のタンパク質とが共有結合を介して結
合しているタンパク質複合体に、前記式（化１）で示さ
れるシアニン系標識色素（ただし、Ｘはハロゲン、Ｍは
水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
が結合した色素標識タンパク質複合体と、その作製方法
を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明の色素標識タンパク質複合体は、第１のタン
パク質と第２のタンパク質とが共有結合を介して結合し
ているタンパク質複合体に、前記式（化１）で示される
シアニン系標識色素（ただし、Ｘはハロゲン、Ｍは水素
またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）が結
合した化合物である。
め、本発明の色素標識タンパク質複合体は、第１のタン
パク質と第２のタンパク質とが共有結合を介して結合し
ているタンパク質複合体に、前記式（化１）で示される
シアニン系標識色素（ただし、Ｘはハロゲン、Ｍは水素
またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）が結
合した化合物である。
【０００６】また、本発明の色素標識タンパク質複合体
の作製方法は、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称す
る。）中で、スクシンイミジルピリジルジチオプロピオ
ネート（以下ＳＰＤＰと略称する。）を用いてタンパク
質複合体を作製した後、前記式（化１）で示されるシア
ニン系標識色素を加えて撹拌することによって色素標識
タンパク質複合体を得るという構成、もしくは、ＰＢＳ
中で、第２のタンパク質と前記式（化１）で示されるシ
アニン系標識色素とを混合して色素標識タンパク質を作
製した後、ＳＰＤＰを用いることによって色素標識タン
パク質複合体を得るという構成を備えたものである。
の作製方法は、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称す
る。）中で、スクシンイミジルピリジルジチオプロピオ
ネート（以下ＳＰＤＰと略称する。）を用いてタンパク
質複合体を作製した後、前記式（化１）で示されるシア
ニン系標識色素を加えて撹拌することによって色素標識
タンパク質複合体を得るという構成、もしくは、ＰＢＳ
中で、第２のタンパク質と前記式（化１）で示されるシ
アニン系標識色素とを混合して色素標識タンパク質を作
製した後、ＳＰＤＰを用いることによって色素標識タン
パク質複合体を得るという構成を備えたものである。
【０００７】本発明の色素標識タンパク質複合体によれ
ば、第１のタンパク質１分子あたりに結合している色素
分子数が擬似的に従来法の約１０倍になっているため、
これを免疫クロマトを利用したセンサーに導入すること
によって、従来法で作製した標識タンパク質を用いたと
きよりもはるかに高感度のセンサーを作製することがで
きる。
ば、第１のタンパク質１分子あたりに結合している色素
分子数が擬似的に従来法の約１０倍になっているため、
これを免疫クロマトを利用したセンサーに導入すること
によって、従来法で作製した標識タンパク質を用いたと
きよりもはるかに高感度のセンサーを作製することがで
きる。
【０００８】また、本発明の色素標識タンパク質複合体
の作製方法によれば、通常の方法では不可能である、タ
ンパク質１分子あたり数百分子の色素標識を擬似的に行
うことができ、色素標識タンパク質複合体の新規作製方
法を提供することができる。
の作製方法によれば、通常の方法では不可能である、タ
ンパク質１分子あたり数百分子の色素標識を擬似的に行
うことができ、色素標識タンパク質複合体の新規作製方
法を提供することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】色素標識タンパク質複合体は、第
１のタンパク質、例えばマウスＩｇＧのＰＢＳ中にＳＰ
ＤＰを加えてピリジルジチオ標識し、この溶液に、あら
かじめジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略称する。）
で還元した別の第２のタンパク質、例えばウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡと略称する。）を２〜１００等量モ
ル加えて、およそ４〜３０℃で一晩撹拌した後、これに
前記式（化１）で示されるシアニン系標識色素のＰＢＳ
溶液を加え、４〜３０℃でさらに一晩撹拌することによ
って得ることができる。
１のタンパク質、例えばマウスＩｇＧのＰＢＳ中にＳＰ
ＤＰを加えてピリジルジチオ標識し、この溶液に、あら
かじめジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略称する。）
で還元した別の第２のタンパク質、例えばウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡと略称する。）を２〜１００等量モ
ル加えて、およそ４〜３０℃で一晩撹拌した後、これに
前記式（化１）で示されるシアニン系標識色素のＰＢＳ
溶液を加え、４〜３０℃でさらに一晩撹拌することによ
って得ることができる。
【００１０】また、色素標識タンパク質複合体は、第２
のタンパク質、例えばＢＳＡのＰＢＳ溶液に前記式（化
１）で示されるシアニン系標識色素のＰＢＳ溶液を加
え、４〜３０℃で一晩撹拌した後、これをＤＴＴで還元
し、これにあらかじめピリジルジチオ標識した第１のタ
ンパク質、例えばマウスＩｇＧを加えて、４〜３０℃で
撹拌することによっても得ることができる。
のタンパク質、例えばＢＳＡのＰＢＳ溶液に前記式（化
１）で示されるシアニン系標識色素のＰＢＳ溶液を加
え、４〜３０℃で一晩撹拌した後、これをＤＴＴで還元
し、これにあらかじめピリジルジチオ標識した第１のタ
ンパク質、例えばマウスＩｇＧを加えて、４〜３０℃で
撹拌することによっても得ることができる。
【００１１】前記式（化１）で示される化合物に含まれ
るハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ
素があげられる。また、前記式（化１）で示される化合
物に含まれる金属塩としては、例えば水素、リチウム
塩、ナトリウム塩、カリウム塩があげられる。
るハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ
素があげられる。また、前記式（化１）で示される化合
物に含まれる金属塩としては、例えば水素、リチウム
塩、ナトリウム塩、カリウム塩があげられる。
【００１２】以下具体的実施例をあげて、本発明をさら
に詳しく説明する。なお、本実施例の前記式（化１）で
示される化合物はＸがヨウ素、Ｍがカリウムの例であ
り、炭素数ｎは２の例である。また、第１のタンパク質
がＩｇＧ、第２のタンパク質がＢＳＡの例である。
に詳しく説明する。なお、本実施例の前記式（化１）で
示される化合物はＸがヨウ素、Ｍがカリウムの例であ
り、炭素数ｎは２の例である。また、第１のタンパク質
がＩｇＧ、第２のタンパク質がＢＳＡの例である。
【００１３】（実施例１） ・ＩｇＧのＳＰＤＰ標識 ５ｍｇ（3.3×10-5mmol）のＩｇＧを２ｍｌのＰＢＳに
溶解し、室温で撹拌しながら0.52ｍｇ（1.67×10-3mmo
l）のＳＰＤＰのエタノール溶液0.1ｍｌを滴下した。室
温で３０分間撹拌した後、セファデックスＧ２５Ｍカラ
ムを用いてゲル濾過し約６ｍｌのＳＰＤＰ標識ＩｇＧ
（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ）のＰＢＳ溶液を得た。得られた溶
液の濃度及びＳＰＤＰの結合分子数を次のように計算し
て求めた。得られた溶液を0.5ｍｌ取り、280ｎｍでの吸
光度を測定した。吸光度は1.25であった。
溶解し、室温で撹拌しながら0.52ｍｇ（1.67×10-3mmo
l）のＳＰＤＰのエタノール溶液0.1ｍｌを滴下した。室
温で３０分間撹拌した後、セファデックスＧ２５Ｍカラ
ムを用いてゲル濾過し約６ｍｌのＳＰＤＰ標識ＩｇＧ
（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ）のＰＢＳ溶液を得た。得られた溶
液の濃度及びＳＰＤＰの結合分子数を次のように計算し
て求めた。得られた溶液を0.5ｍｌ取り、280ｎｍでの吸
光度を測定した。吸光度は1.25であった。
【００１４】次にこの溶液に0.025ｍｌの100ｍＭＤＴＴ
水溶液を加え、１分間静置した後343ｎｍでの吸光度を
測定した。吸光度は0.39であった。ＩｇＧには343ｎｍ
に吸収がないので、観測された343ｎｍの吸光はＤＴＴ
還元によって放出されたチオピリドンに由来するもので
ある。この放出チオピリドンはＳＰＤＰのピリジルジチ
オ基が還元されたもので、この濃度は抗体に結合してい
るＳＰＤＰの濃度に等しい。従ってＳＰＤＰの濃度［Ｓ
ＰＤＰ］は、次のように求めることができる。ただし、
チオピリドンの343ｎｍにおけるモル吸光係数を8.08×1
03とする。
水溶液を加え、１分間静置した後343ｎｍでの吸光度を
測定した。吸光度は0.39であった。ＩｇＧには343ｎｍ
に吸収がないので、観測された343ｎｍの吸光はＤＴＴ
還元によって放出されたチオピリドンに由来するもので
ある。この放出チオピリドンはＳＰＤＰのピリジルジチ
オ基が還元されたもので、この濃度は抗体に結合してい
るＳＰＤＰの濃度に等しい。従ってＳＰＤＰの濃度［Ｓ
ＰＤＰ］は、次のように求めることができる。ただし、
チオピリドンの343ｎｍにおけるモル吸光係数を8.08×1
03とする。
【００１５】［ＳＰＤＰ］ ＝ 0.39／(8.08×103)
＝ 4.83×10-5（Ｍ） また、観測された280ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するも
のであるが、結合しているＳＰＤＰが280nmにも吸収を
持つので、この影響を差し引いてＩｇＧの濃度［Ｉｇ
Ｇ］を求めると次のようになる。ただし、ＩｇＧに由来
する280ｎｍの吸光度をAb280,IgGとし、ＳＰＤＰの280
ｎｍにおけるモル吸光係数を5.1×103、ＩｇＧの280ｎ
ｍにおけるモル吸光係数を2.10×105とする。
＝ 4.83×10-5（Ｍ） また、観測された280ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するも
のであるが、結合しているＳＰＤＰが280nmにも吸収を
持つので、この影響を差し引いてＩｇＧの濃度［Ｉｇ
Ｇ］を求めると次のようになる。ただし、ＩｇＧに由来
する280ｎｍの吸光度をAb280,IgGとし、ＳＰＤＰの280
ｎｍにおけるモル吸光係数を5.1×103、ＩｇＧの280ｎ
ｍにおけるモル吸光係数を2.10×105とする。
【００１６】 Ab280,IgG ＝ 1.25−(4.83×10-5×5.1×103) ＝ 1.00 ［ＩｇＧ］ ＝ 1.00／(2.10×105）＝ 4.78×10-6 Ｍ したがって、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＰＤＰの
分子数は次のようになる。
分子数は次のようになる。
【００１７】［ＳＰＤＰ］／［ＩｇＧ］ ＝ 4.83×10
-5／4.78×10-6 ＝ 10.1（個） ・ＢＳＡのＤＴＴ還元 110ｍｇのＢＳＡを10ｍｌのＰＢＳに溶解し、これに１
ｍｌのＰＢＳに溶解した77ｍｇのＤＴＴを加えて室温で
15分間撹拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラ
ムを用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ（ＳＨｆｒ
ｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。 ・タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の作
製 得られたＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）溶液は、速やかに上記
で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（６ｍｌ）と
混合し、４℃で２０時間静置した。未反応のＢＳＡを除
くため、２０Ｌ（５Ｌ×４）のＰＢＳ・Ａｚに対して透
析し、約２５ｍｌのＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡのＰＢＳ
溶液を得た。 ・タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の色
素標識 得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ溶液（総タンパク量
を3.18×10-4mmolとする）に、１ｍｌのＰＢＳに溶解し
た131.1ｍｇ（総タンパク量の400倍等量）の色素溶液
（以下ＳＬＩＣ３と略称する）をゆっくりと滴下した。
４℃で２０時間静置した後、未反応の色素分子を除くた
め２０ＬのＰＢＳ・Ａｚに対して透析して、約２６ｍｌ
のＳＬＩＣ３標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得
た。
-5／4.78×10-6 ＝ 10.1（個） ・ＢＳＡのＤＴＴ還元 110ｍｇのＢＳＡを10ｍｌのＰＢＳに溶解し、これに１
ｍｌのＰＢＳに溶解した77ｍｇのＤＴＴを加えて室温で
15分間撹拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラ
ムを用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ（ＳＨｆｒ
ｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。 ・タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の作
製 得られたＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）溶液は、速やかに上記
で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（６ｍｌ）と
混合し、４℃で２０時間静置した。未反応のＢＳＡを除
くため、２０Ｌ（５Ｌ×４）のＰＢＳ・Ａｚに対して透
析し、約２５ｍｌのＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡのＰＢＳ
溶液を得た。 ・タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の色
素標識 得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ溶液（総タンパク量
を3.18×10-4mmolとする）に、１ｍｌのＰＢＳに溶解し
た131.1ｍｇ（総タンパク量の400倍等量）の色素溶液
（以下ＳＬＩＣ３と略称する）をゆっくりと滴下した。
４℃で２０時間静置した後、未反応の色素分子を除くた
め２０ＬのＰＢＳ・Ａｚに対して透析して、約２６ｍｌ
のＳＬＩＣ３標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得
た。
【００１８】得られたＳＬＩＣ３標識タンパク質複合体
の、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を次のよ
うに計算して求めた。得られた溶液の550ｎｍにおける
吸光度を測定した。吸光度は77.1であった。ＩｇＧ−Ｓ
ＰＤＰ−ＢＳＡは550ｎｍに吸収を持たないので、観測
された吸光は結合したＳＬＩＣ３に由来するものであ
る。したがって、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は次
のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ３の55
0ｎｍにおけるモル吸光係数を8.55×104とする。
の、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を次のよ
うに計算して求めた。得られた溶液の550ｎｍにおける
吸光度を測定した。吸光度は77.1であった。ＩｇＧ−Ｓ
ＰＤＰ−ＢＳＡは550ｎｍに吸収を持たないので、観測
された吸光は結合したＳＬＩＣ３に由来するものであ
る。したがって、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は次
のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ３の55
0ｎｍにおけるモル吸光係数を8.55×104とする。
【００１９】［ＳＬＩＣ３］ = 77.1／8.55×104 =
9.02×10-4（Ｍ） 溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を1.06×10-6Ｍ（ＳＰ
ＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないもの
とする。）として、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の
分子数を求めると次のようになる。
9.02×10-4（Ｍ） 溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を1.06×10-6Ｍ（ＳＰ
ＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないもの
とする。）として、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の
分子数を求めると次のようになる。
【００２０】［ＳＬＩＣ３］／［ＩｇＧ］＝ 9.02×10
-4／1.06×10-6 ＝ 850.9（個） （実施例２） ・ＩｇＧのＳＰＤＰ標識 実施例１で示した方法に従って、ＩｇＧのＳＰＤＰ標識
を行った。全体量は６ｍｌ、ＩｇＧ濃度は4.10×10
-6Ｍ、そしてＩｇＧ１分子あたりのＳＰＤＰの分子数は
11.5個であった。 ・ＢＳＡ−ＳＬＩＣ３の作製 110ｍｇ（1.62×10-3mmol）のＢＳＡを10ｍｌのＰＢＳ
に溶解し、室温で撹拌しながら１ｍｌのＰＢＳに溶解し
た171.7ｍｇ（0.162mmol、100等量）のＳＬＩＣ３をゆ
っくり滴下した。４℃で一晩撹拌した後、２０Ｌ（５Ｌ
×４）のＰＢＳ・Ａｚに対して透析し、１３ｍｌのＳＬ
ＩＣ３標識ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。溶液の濃度、お
よびＢＳＡ１分子あたりに結合しているＳＬＩＣ３の分
子数を次のように計算して求めた。得られた溶液の280
ｎｍ、および550ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光
度はそれぞれ9.7、および55.3であった。ＢＳＡは550ｎ
ｍに吸収を持たないので、観測された550ｎｍの吸光は
ＢＳＡに結合したＳＬＩＣ３に起因するものである。し
たがって、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は次のよう
に求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ３の550ｎｍ
におけるモル吸光係数を8.55×104とする。
-4／1.06×10-6 ＝ 850.9（個） （実施例２） ・ＩｇＧのＳＰＤＰ標識 実施例１で示した方法に従って、ＩｇＧのＳＰＤＰ標識
を行った。全体量は６ｍｌ、ＩｇＧ濃度は4.10×10
-6Ｍ、そしてＩｇＧ１分子あたりのＳＰＤＰの分子数は
11.5個であった。 ・ＢＳＡ−ＳＬＩＣ３の作製 110ｍｇ（1.62×10-3mmol）のＢＳＡを10ｍｌのＰＢＳ
に溶解し、室温で撹拌しながら１ｍｌのＰＢＳに溶解し
た171.7ｍｇ（0.162mmol、100等量）のＳＬＩＣ３をゆ
っくり滴下した。４℃で一晩撹拌した後、２０Ｌ（５Ｌ
×４）のＰＢＳ・Ａｚに対して透析し、１３ｍｌのＳＬ
ＩＣ３標識ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。溶液の濃度、お
よびＢＳＡ１分子あたりに結合しているＳＬＩＣ３の分
子数を次のように計算して求めた。得られた溶液の280
ｎｍ、および550ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光
度はそれぞれ9.7、および55.3であった。ＢＳＡは550ｎ
ｍに吸収を持たないので、観測された550ｎｍの吸光は
ＢＳＡに結合したＳＬＩＣ３に起因するものである。し
たがって、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は次のよう
に求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ３の550ｎｍ
におけるモル吸光係数を8.55×104とする。
【００２１】［ＳＬＩＣ３］ = 55.3／8.55×104 =
6.46×10-4（Ｍ） また、観測された280ｎｍの吸光はＢＳＡに由来するも
のであるが、結合しているＳＬＩＣ３が280ｎｍにも吸
収を持つので、この影響を差し引いてＢＳＡの濃度［Ｂ
ＳＡ］を求めると次のようになる。ただし、ＢＳＡに由
来する280ｎｍの吸光度をAb280,BSAとし、ＳＬＩＣ３の
280ｎｍにおけるモル吸光係数を9.8×103、ＢＳＡの280
ｎｍにおけるモル吸光係数を4.36×104とする。
6.46×10-4（Ｍ） また、観測された280ｎｍの吸光はＢＳＡに由来するも
のであるが、結合しているＳＬＩＣ３が280ｎｍにも吸
収を持つので、この影響を差し引いてＢＳＡの濃度［Ｂ
ＳＡ］を求めると次のようになる。ただし、ＢＳＡに由
来する280ｎｍの吸光度をAb280,BSAとし、ＳＬＩＣ３の
280ｎｍにおけるモル吸光係数を9.8×103、ＢＳＡの280
ｎｍにおけるモル吸光係数を4.36×104とする。
【００２２】 Ab280,BSA ＝ 9.7−(6.46×10-4×9.8×103) ＝ 3.37 ［ＢＳＡ］＝ 3.37／4.36×104 ＝ 7.72×10-5（Ｍ） したがって、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ３
の分子数は次のようになる。
の分子数は次のようになる。
【００２３】［ＳＬＩＣ３］／［ＢＳＡ］ ＝ 6.46×
10-4／7.72×10-5 ＝ 8.4（個） ・ＢＳＡ−ＳＬＩＣ３のＤＴＴ還元 前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ３溶液（110ｍｇ、13ｍｌ）
に、１ｍｌのＰＢＳに溶解した100ｍｇのＤＴＴ（最終
濃度50ｍＭ）を加えて室温で15分間撹拌した。速やかに
セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲル濾過し、約
２４ｍｌのＢＳＡ−ＳＬＩＣ３（ＳＨｆｒｅｅ）のＰＢ
Ｓ溶液を得た。 ・色素標識タンパク質複合体の作製 前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ３（ＳＨｆｒｅｅ）溶液と、前
述のＳＰＤＰ標識ＩｇＧ溶液とを混合し、４℃で一晩撹
拌した後、２０ＬのＰＢＳ・Ａｚに対して透析し未反応
のＢＳＡ−ＳＬＩＣ３を除いた。約３０ｍｌの色素標識
タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。
10-4／7.72×10-5 ＝ 8.4（個） ・ＢＳＡ−ＳＬＩＣ３のＤＴＴ還元 前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ３溶液（110ｍｇ、13ｍｌ）
に、１ｍｌのＰＢＳに溶解した100ｍｇのＤＴＴ（最終
濃度50ｍＭ）を加えて室温で15分間撹拌した。速やかに
セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲル濾過し、約
２４ｍｌのＢＳＡ−ＳＬＩＣ３（ＳＨｆｒｅｅ）のＰＢ
Ｓ溶液を得た。 ・色素標識タンパク質複合体の作製 前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ３（ＳＨｆｒｅｅ）溶液と、前
述のＳＰＤＰ標識ＩｇＧ溶液とを混合し、４℃で一晩撹
拌した後、２０ＬのＰＢＳ・Ａｚに対して透析し未反応
のＢＳＡ−ＳＬＩＣ３を除いた。約３０ｍｌの色素標識
タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。
【００２４】得られたＳＬＩＣ３標識タンパク質複合体
の、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を次のよ
うに計算して求めた。得られた溶液の550ｎｍにおける
吸光度を測定した。吸光度は29.5であった。ＩｇＧは55
0ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光はＢＳＡ
に結合したＳＬＩＣ３に由来するものである。したがっ
て、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は次のように求め
ることができる。ただし、ＳＬＩＣ３の550ｎｍにおけ
るモル吸光係数を8.55×104とする。
の、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を次のよ
うに計算して求めた。得られた溶液の550ｎｍにおける
吸光度を測定した。吸光度は29.5であった。ＩｇＧは55
0ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光はＢＳＡ
に結合したＳＬＩＣ３に由来するものである。したがっ
て、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は次のように求め
ることができる。ただし、ＳＬＩＣ３の550ｎｍにおけ
るモル吸光係数を8.55×104とする。
【００２５】［ＳＬＩＣ３］ = 29.5／8.55×104 =
3.45×10-4（Ｍ） 溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を8.20×10-7Ｍ（ＳＰ
ＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないもの
とする。）として、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の
分子数を求めると次のようになる。
3.45×10-4（Ｍ） 溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を8.20×10-7Ｍ（ＳＰ
ＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないもの
とする。）として、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の
分子数を求めると次のようになる。
【００２６】［ＳＬＩＣ３］／［ＩｇＧ］＝ 3.45×10
-4／8.20×10-7 ＝ 420.7（個）
-4／8.20×10-7 ＝ 420.7（個）
【００２７】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明の色素標識タ
ンパク質複合体は、タンパク質１分子あたりに結合して
いる色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍になってい
るため、これを免疫クロマトを利用したセンサーに導入
することによって、従来法で作製した標識タンパク質を
用いたときよりもはるかに高感度のセンサーを作製する
ことができる。
ンパク質複合体は、タンパク質１分子あたりに結合して
いる色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍になってい
るため、これを免疫クロマトを利用したセンサーに導入
することによって、従来法で作製した標識タンパク質を
用いたときよりもはるかに高感度のセンサーを作製する
ことができる。
【００２８】また、本発明の色素標識タンパク質複合体
の作製方法によれば、ＰＢＳ中で、ＳＰＤＰを用いてタ
ンパク質複合体を作製した後、前記式（化１）で示され
るシアニン系標識色素を加えて撹拌すること、もしくは
ＰＢＳ中で、タンパク質と前記式（化１）で示されるシ
アニン系標識色素とを混合して色素標識タンパク質を作
製した後、ＳＰＤＰを用いることによって、色素標識物
を作製することができ、色素標識タンパク質複合体の新
規な作製方法を提供することができる。
の作製方法によれば、ＰＢＳ中で、ＳＰＤＰを用いてタ
ンパク質複合体を作製した後、前記式（化１）で示され
るシアニン系標識色素を加えて撹拌すること、もしくは
ＰＢＳ中で、タンパク質と前記式（化１）で示されるシ
アニン系標識色素とを混合して色素標識タンパク質を作
製した後、ＳＰＤＰを用いることによって、色素標識物
を作製することができ、色素標識タンパク質複合体の新
規な作製方法を提供することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−63756（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−123740（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−157926（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−66725（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−313116（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−151839（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−124599（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−127115（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−191674（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−145148（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−358143（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−259826（ＪＰ，Ａ) 特表 平11−511558（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C09B 23/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】 第１のタンパク質と第２のタンパク質と
が共有結合を介して結合しているタンパク質複合体のア
ミノ基と、下記式（化１）で示されるシアニン系標識色
素（ただし、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金
属、ｎは１〜４の整数を示す。）のスクシンイミジル基
とが反応することによって、前記シアニン系標識色素の
色素骨格と前記タンパク質複合体とが共有結合を介して
結合していることを特徴とする色素標識タンパク質複合
体。 【化１】 - 【請求項２】 前記式（化１）で示されるシアニン系標
識色素においてｎが２であることを特徴とする、請求項
１記載の色素標識タンパク質複合体。 - 【請求項３】 第１のタンパク質が抗体であることを特
徴とする、請求項１または２記載の色素標識タンパク質
複合体。 - 【請求項４】 第１のタンパク質がＩｇＧであることを
特徴とする、請求項１または２記載の色素標識タンパク
質複合体。 - 【請求項５】 第２のタンパク質がウシ血清アルブミン
であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記
載の色素標識タンパク質複合体。 - 【請求項６】 リン酸緩衝液中で、スクシンイミジルピ
リジルジチオプロピオネートを用いてタンパク質複合体
を作製した後、前記式（化１）で示されるシアニン系標
識色素を加えて撹拌することを特徴とする、請求項１〜
５のいずれかに記載の色素標識タンパク質複合体の作製
方法。 - 【請求項７】 リン酸緩衝液中で、第２のタンパク質と
前記式（化１）で示されるシアニン系標識色素とを混合
して色素標識タンパク質を作製した後、スクシンイミジ
ルピリジルジチオプロピオネートを用いることを特徴と
する、請求項１〜５のいずれかに記載の色素標識タンパ
ク質複合体の作製方法。
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|---|---|---|---|
| JP29098495A JP3292007B2 (ja) | 1995-11-09 | 1995-11-09 | 色素標識タンパク質複合体及びその作製方法 |
| US08/745,337 US5965713A (en) | 1995-11-09 | 1996-11-08 | Dye labeled protein conjugate its preparing method and sensor using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29098495A JP3292007B2 (ja) | 1995-11-09 | 1995-11-09 | 色素標識タンパク質複合体及びその作製方法 |
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|---|---|
| JPH09132725A JPH09132725A (ja) | 1997-05-20 |
| JP3292007B2 true JP3292007B2 (ja) | 2002-06-17 |
Family
ID=17762963
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29098495A Expired - Fee Related JP3292007B2 (ja) | 1995-11-09 | 1995-11-09 | 色素標識タンパク質複合体及びその作製方法 |
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| US6303759B1 (en) | 1996-11-08 | 2001-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled and polymerized antibody and method for preparing the same |
| US6307029B1 (en) | 1996-11-08 | 2001-10-23 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same |
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| US6300480B1 (en) | 1996-11-08 | 2001-10-09 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same |
| CA2423806C (en) * | 2000-09-29 | 2009-12-22 | Molecular Probes, Inc. | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
| GB0117193D0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-09-05 | Adprotech Ltd | Protein modification reagents |
| US20040132092A1 (en) * | 2003-01-03 | 2004-07-08 | Stetson Christopher M. | Determining the density of functional moieties on polymer reagents |
| US20070123646A1 (en) * | 2005-09-13 | 2007-05-31 | Lele Bhalchandra S | Protein-polymer conjugates and synthesis thereof |
| US20100291706A1 (en) * | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Millipore Corporation | Dye conjugates and methods of use |
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|---|---|---|---|---|
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| JP3253820B2 (ja) * | 1995-03-27 | 2002-02-04 | 松下電器産業株式会社 | シアニン系標識色素及びその合成方法、並びにシアニン標識タンパク質及びその作製方法 |
| US5922618A (en) * | 1996-03-04 | 1999-07-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled antibody conjugate and preparation method thereof |
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- 1995-11-09 JP JP29098495A patent/JP3292007B2/ja not_active Expired - Fee Related
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1996
- 1996-11-08 US US08/745,337 patent/US5965713A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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