JP3253820B2 - シアニン系標識色素及びその合成方法、並びにシアニン標識タンパク質及びその作製方法 - Google Patents
シアニン系標識色素及びその合成方法、並びにシアニン標識タンパク質及びその作製方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク標識やその他
の生化学実験に有用なシアニン系標識色素とその合成
法、並びに色素標識タンパク質に関する。さらに詳しく
は、タンパク質と結合可能なスクシンイミジル基を有す
るシアニン系標識色素とその合成上必要な前駆体、すな
わちカルボン酸誘導体、並びにシアニン標識タンパク質
と標識色素の作製方法に関する。
の生化学実験に有用なシアニン系標識色素とその合成
法、並びに色素標識タンパク質に関する。さらに詳しく
は、タンパク質と結合可能なスクシンイミジル基を有す
るシアニン系標識色素とその合成上必要な前駆体、すな
わちカルボン酸誘導体、並びにシアニン標識タンパク質
と標識色素の作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の標識色素は、構成する炭素数の多
さゆえに水溶性の低いものがほとんどであった。従っ
て、抗体などのタンパク質に標識した際に、標識物が析
出してしまうという課題があった。そこで、水溶性に富
むスルホニル基を有する標識色素の合成が、近年盛んに
行われてきた。スルホニル基を有するこれらの水溶性標
識色素は、例えばバイオコンジュゲートケミストリー、
１９９３年、第４巻、１０５〜１１１頁に記載されてい
るように、インドレニン環内の窒素原子に結合している
炭素鎖の長さが、比較的長いものであった。本来水溶性
に乏しいシアニン系の標識色素は、水溶性の官能基であ
るスルホニル基をその骨格内に導入することによって水
に対する溶解度を上げることができ、１分子のタンパク
質に６〜９分子の色素分子を水溶液中で標識することが
可能となった。
さゆえに水溶性の低いものがほとんどであった。従っ
て、抗体などのタンパク質に標識した際に、標識物が析
出してしまうという課題があった。そこで、水溶性に富
むスルホニル基を有する標識色素の合成が、近年盛んに
行われてきた。スルホニル基を有するこれらの水溶性標
識色素は、例えばバイオコンジュゲートケミストリー、
１９９３年、第４巻、１０５〜１１１頁に記載されてい
るように、インドレニン環内の窒素原子に結合している
炭素鎖の長さが、比較的長いものであった。本来水溶性
に乏しいシアニン系の標識色素は、水溶性の官能基であ
るスルホニル基をその骨格内に導入することによって水
に対する溶解度を上げることができ、１分子のタンパク
質に６〜９分子の色素分子を水溶液中で標識することが
可能となった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、例えば
色素標識抗体を用いた抗原の免疫的検出技術等において
は、さらなる色素標識が必要であり、これに耐えうる溶
解性を持った化合物、すなわちインドレニン環内の窒素
原子に結合している炭素鎖の長さが短い（炭素数１〜
４）標識色素が要請されていた。
色素標識抗体を用いた抗原の免疫的検出技術等において
は、さらなる色素標識が必要であり、これに耐えうる溶
解性を持った化合物、すなわちインドレニン環内の窒素
原子に結合している炭素鎖の長さが短い（炭素数１〜
４）標識色素が要請されていた。
【０００４】本発明は前記課題を解決するため、タンパ
ク質と結合可能なスクシンイミジル基を有し、インドレ
ニン環内の窒素原子に結合している炭素鎖の長さが短い
シアニン系標識色素とその合成上必要な前駆体、すなわ
ちカルボン酸誘導体、並びにシアニン標識タンパク質と
シアニン系標識色素の作製方法を提供することを目的と
する。
ク質と結合可能なスクシンイミジル基を有し、インドレ
ニン環内の窒素原子に結合している炭素鎖の長さが短い
シアニン系標識色素とその合成上必要な前駆体、すなわ
ちカルボン酸誘導体、並びにシアニン標識タンパク質と
シアニン系標識色素の作製方法を提供することを目的と
する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明のシアニン系標識色素は、前記式（化１）で
示されるスクシンイミジル誘導体からなるシアニン系標
識色素である。
め、本発明のシアニン系標識色素は、前記式（化１）で
示されるスクシンイミジル誘導体からなるシアニン系標
識色素である。
【０００６】次に本発明のカルボン酸誘導体は、前記式
（化１）で示されるスクシンイミジル誘導体からなるシ
アニン系標識色素の前駆体であって前記式（化２）で示
される。
（化１）で示されるスクシンイミジル誘導体からなるシ
アニン系標識色素の前駆体であって前記式（化２）で示
される。
【０００７】次に本発明のシアニン系標識色素の合成方
法は、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体を有
機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸イミドを
加えて撹拌することによって標識色素を得るという構成
を備えたものである。
法は、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体を有
機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸イミドを
加えて撹拌することによって標識色素を得るという構成
を備えたものである。
【０００８】次に本発明のシアニン標識タンパク質は、
前記式（化１）で示されるスクシンイミジル誘導体から
なるシアニン系標識色素のスクシンイミジル基とタンパ
ク質のアミノ基とが反応することによって、シアニン系
標識色素の色素骨格とタンパク質とが共有結合を介して
結合しているタンパク質である。
前記式（化１）で示されるスクシンイミジル誘導体から
なるシアニン系標識色素のスクシンイミジル基とタンパ
ク質のアミノ基とが反応することによって、シアニン系
標識色素の色素骨格とタンパク質とが共有結合を介して
結合しているタンパク質である。
【０００９】次に本発明のシアニン標識タンパク質の作
製方法は、前記式（化１）で示されるシアニン系標識色
素の水溶液をタンパク質水溶液中に滴下し、撹拌すると
いう構成を備えたものである。
製方法は、前記式（化１）で示されるシアニン系標識色
素の水溶液をタンパク質水溶液中に滴下し、撹拌すると
いう構成を備えたものである。
【００１０】
【作用】本発明の前記式（化１）で示されるシアニン系
標識色素（以下、ＩＣ３−ＯＳｕと略称する。）によれ
ば、種々のシアニン標識化合物を達成できる。すなわ
ち、ＩＣ３−ＯＳｕは水溶液中で１級又は２級のアミノ
基と結合可能なスクシンイミジル基を有しており、さら
に、インドレニン環内の窒素原子に結合している炭素鎖
の長さが短いため、例えばタンパク質のアミノ基と反応
することにより水に不溶化することなくシアニン標識の
タンパク質を作製することができる。
標識色素（以下、ＩＣ３−ＯＳｕと略称する。）によれ
ば、種々のシアニン標識化合物を達成できる。すなわ
ち、ＩＣ３−ＯＳｕは水溶液中で１級又は２級のアミノ
基と結合可能なスクシンイミジル基を有しており、さら
に、インドレニン環内の窒素原子に結合している炭素鎖
の長さが短いため、例えばタンパク質のアミノ基と反応
することにより水に不溶化することなくシアニン標識の
タンパク質を作製することができる。
【００１１】また、本発明の前記式（化２）で示される
カルボン酸誘導体によれば、ヒドロキシコハク酸イミド
によって活性化されやすいカルボキシル基を持っている
ので、本発明の標識色素であるＩＣ３−ＯＳｕを合成す
るのに有用な前駆体を達成できる。
カルボン酸誘導体によれば、ヒドロキシコハク酸イミド
によって活性化されやすいカルボキシル基を持っている
ので、本発明の標識色素であるＩＣ３−ＯＳｕを合成す
るのに有用な前駆体を達成できる。
【００１２】また、本発明のシアニン系標識色素の合成
方法によれば、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘
導体を有機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸
イミドを加えて撹拌することによって標識色素を作製す
ることができ、ＩＣ３−ＯＳｕの新規な合成方法を提供
することができる。
方法によれば、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘
導体を有機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸
イミドを加えて撹拌することによって標識色素を作製す
ることができ、ＩＣ３−ＯＳｕの新規な合成方法を提供
することができる。
【００１３】また、本発明のシアニン標識タンパク質に
よれば、タンパク質１分子当たり１０個から５０個程度
のシアニン化合物が結合しているので、タンパク質の正
確な定量が可能となり、これを用いた検出技術において
有用である。すなわち、水溶性に富み、モル吸光係数の
高いシアニン系標識色素を用いることによって、例えば
免疫クロマト技術を用いた抗原の検出に有用となる。こ
こで、タンパク質とは、分子量５〜２０万程度の、主と
して抗体、アルブミン等をいう。
よれば、タンパク質１分子当たり１０個から５０個程度
のシアニン化合物が結合しているので、タンパク質の正
確な定量が可能となり、これを用いた検出技術において
有用である。すなわち、水溶性に富み、モル吸光係数の
高いシアニン系標識色素を用いることによって、例えば
免疫クロマト技術を用いた抗原の検出に有用となる。こ
こで、タンパク質とは、分子量５〜２０万程度の、主と
して抗体、アルブミン等をいう。
【００１４】また、本発明のシアニン標識タンパク質の
作製方法によれば、前記式（化１）で示されるシアニン
系標識色素の水溶液をタンパク質水溶液中に滴下し、撹
拌することによってシアニン標識をすることができ、シ
アニン標識タンパク質の新規な作製方法を提供すること
ができる。
作製方法によれば、前記式（化１）で示されるシアニン
系標識色素の水溶液をタンパク質水溶液中に滴下し、撹
拌することによってシアニン標識をすることができ、シ
アニン標識タンパク質の新規な作製方法を提供すること
ができる。
【００１５】
【実施例】前記式（化１）で示されるシアニン系標識色
素、および前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体
は、下記式（化３）に示した合成経路に従って作製する
ことができる。
素、および前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体
は、下記式（化３）に示した合成経路に従って作製する
ことができる。
【００１６】
【化３】
【００１７】すなわち、下記式（化５）で示されるイン
ドレニウムスルホネートは、下記式（化４）で示される
ヒドラジノベンゼンスルホン酸と０．５〜２モル比のイ
ソプロピルメチルケトンとを、酸性溶媒、例えば酢酸に
溶解し、約７０〜１３０℃で１〜５時間加熱することに
よって得ることができる。
ドレニウムスルホネートは、下記式（化４）で示される
ヒドラジノベンゼンスルホン酸と０．５〜２モル比のイ
ソプロピルメチルケトンとを、酸性溶媒、例えば酢酸に
溶解し、約７０〜１３０℃で１〜５時間加熱することに
よって得ることができる。
【００１８】
【化４】
【００１９】
【化５】
【００２０】また、下記式（化６）で示されるインドレ
ニウムスルホネートの金属塩は、例えば前記式（化５）
で示されるインドレニウムスルホネートのアルコール溶
液、例えばメタノール溶液に、例えば水酸化カリウム飽
和のイソプロピルアルコールを加えることによって、カ
リウム塩として得ることができる。
ニウムスルホネートの金属塩は、例えば前記式（化５）
で示されるインドレニウムスルホネートのアルコール溶
液、例えばメタノール溶液に、例えば水酸化カリウム飽
和のイソプロピルアルコールを加えることによって、カ
リウム塩として得ることができる。
【００２１】
【化６】
【００２２】また、下記式（化７）で示されるカルボキ
シアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩は、前
記式（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの
金属塩、例えばカリウム塩の有機溶媒溶液、例えばオル
トジクロルベンゼン溶液に、等モルのハロゲン化アルキ
ル酸、例えばヨードプロピオン酸を加え、約８０〜１３
０℃で２〜１２時間加熱することにより、カルボキシエ
チルインドレニウムスルホネートカリウム塩として得る
ことができる。ここでハロゲン化アルキル酸の炭素数
は、水に対しての溶解性を考え、２とする。炭素数２の
ヨードプロピオン酸は、水溶性およびインドレニンへの
反応性に富んでいるため有用である。
シアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩は、前
記式（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの
金属塩、例えばカリウム塩の有機溶媒溶液、例えばオル
トジクロルベンゼン溶液に、等モルのハロゲン化アルキ
ル酸、例えばヨードプロピオン酸を加え、約８０〜１３
０℃で２〜１２時間加熱することにより、カルボキシエ
チルインドレニウムスルホネートカリウム塩として得る
ことができる。ここでハロゲン化アルキル酸の炭素数
は、水に対しての溶解性を考え、２とする。炭素数２の
ヨードプロピオン酸は、水溶性およびインドレニンへの
反応性に富んでいるため有用である。
【００２３】
【化７】
【００２４】また、前記式（化２）で示されるカルボン
酸誘導体は、前記式（化７）で示されるカルボキシアル
キルインドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカル
ボキシエチルインドレニウムスルホネートのカリウム塩
と０．５〜２モル比のオルトギ酸エチルとを塩基性有機
溶媒、例えばピリジンに溶解し、約８０〜１２０℃で１
〜３時間加熱することによって、プロピオン酸誘導体と
して得ることができる。
酸誘導体は、前記式（化７）で示されるカルボキシアル
キルインドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカル
ボキシエチルインドレニウムスルホネートのカリウム塩
と０．５〜２モル比のオルトギ酸エチルとを塩基性有機
溶媒、例えばピリジンに溶解し、約８０〜１２０℃で１
〜３時間加熱することによって、プロピオン酸誘導体と
して得ることができる。
【００２５】また、前記式（化１）で示されるＩＣ３−
ＯＳｕは、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体
の有機溶媒溶液、例えばジメチルホルムアミド溶液中
に、０．５〜２モル比のヒドロキシコハク酸イミドと、
縮合剤として０．５〜２モル比のジシクロヘキシルカル
ボジイミドとを加えて、２〜１２時間撹拌することによ
り得ることができる。
ＯＳｕは、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体
の有機溶媒溶液、例えばジメチルホルムアミド溶液中
に、０．５〜２モル比のヒドロキシコハク酸イミドと、
縮合剤として０．５〜２モル比のジシクロヘキシルカル
ボジイミドとを加えて、２〜１２時間撹拌することによ
り得ることができる。
【００２６】また、シアニン標識タンパク質は、水溶性
タンパク質、例えばマウス由来免疫グロブリン（以下Ｉ
ｇＧと略称する。）のリン酸緩衝溶液（以下ＰＢＳと略
称する）に、約５０〜５００モル比のＩＣ３−ＯＳｕを
加え、約４〜３０℃で撹拌することにより得ることがで
きる。例えば、タンパク質として絨毛性性腺刺激ホルモ
ンであるゴナドトロピン（ｈＣＧ）に特異的に反応する
抗ｈＣＧモノクローナル抗体を用いた標識タンパク質
は、ｈＣＧの検出に応用することが可能となり、妊娠検
査等に有用である。
タンパク質、例えばマウス由来免疫グロブリン（以下Ｉ
ｇＧと略称する。）のリン酸緩衝溶液（以下ＰＢＳと略
称する）に、約５０〜５００モル比のＩＣ３−ＯＳｕを
加え、約４〜３０℃で撹拌することにより得ることがで
きる。例えば、タンパク質として絨毛性性腺刺激ホルモ
ンであるゴナドトロピン（ｈＣＧ）に特異的に反応する
抗ｈＣＧモノクローナル抗体を用いた標識タンパク質
は、ｈＣＧの検出に応用することが可能となり、妊娠検
査等に有用である。
【００２７】シアニン標識タンパク質の定量は、タンパ
ク質に結合したＩＣ３−ＯＳｕの吸光度を測定して行う
ものであるため、測定する波長は吸光度の高い５００〜
６００ｎｍで行うのが好ましい。なお、未知の試料がタ
ンパク質であるか否かは、タンパク質が吸収を持つ２８
０ｎｍでの吸光度を測定することによって確認できる。
ク質に結合したＩＣ３−ＯＳｕの吸光度を測定して行う
ものであるため、測定する波長は吸光度の高い５００〜
６００ｎｍで行うのが好ましい。なお、未知の試料がタ
ンパク質であるか否かは、タンパク質が吸収を持つ２８
０ｎｍでの吸光度を測定することによって確認できる。
【００２８】前記式（化１）、（化２）、および（化
７）で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、
例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。ま
た、前記式（化１）、（化２）、（化６）、および（化
７）で示される各化合物に含まれる金属塩としては、例
えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などがあげ
られる。
７）で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、
例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。ま
た、前記式（化１）、（化２）、（化６）、および（化
７）で示される各化合物に含まれる金属塩としては、例
えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などがあげ
られる。
【００２９】以下具体的実施例をあげて、本発明をさら
に詳しく説明する。なお、本実施例の前記式（化１）、
（化２）、（化６）および（化７）で示される各化合物
はＸがヨウ素、Ｍがカリウム、炭素数ｎは２の例であ
る。また、タンパク質はＩｇＧ又はウシ血清アルブミン
（以下ＢＳＡと略称する。）の例である。
に詳しく説明する。なお、本実施例の前記式（化１）、
（化２）、（化６）および（化７）で示される各化合物
はＸがヨウ素、Ｍがカリウム、炭素数ｎは２の例であ
る。また、タンパク質はＩｇＧ又はウシ血清アルブミン
（以下ＢＳＡと略称する。）の例である。
【００３０】実施例１ （インドレニウムスルホネートの合成）ヒドラジノベン
ゼンスルホン酸１０g（５３mmol）とイソプロピルメチ
ルケトン１６．８ml（160mmol）を３０mlの酢酸に溶解
し、３時間還流した。反応液を０℃に冷却し１時間放置
した後、生じた固体を濾過して取り出した。得られた固
体をエーテルで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して１
１．８gのインドレニウムスルホネートを得た。収率は
９３％であった。表１にＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカ
ルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
ゼンスルホン酸１０g（５３mmol）とイソプロピルメチ
ルケトン１６．８ml（160mmol）を３０mlの酢酸に溶解
し、３時間還流した。反応液を０℃に冷却し１時間放置
した後、生じた固体を濾過して取り出した。得られた固
体をエーテルで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して１
１．８gのインドレニウムスルホネートを得た。収率は
９３％であった。表１にＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカ
ルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】実施例２ （インドレニウムスルホネートカリウム塩の合成）実施
例１で合成した１１．８gのインドレニウムスルホネー
ト（４９mmol）を１２０mlのメタノールに溶解し、これ
に水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコール約３０
０mlを加えて撹拌した。生じた淡黄色の固体を濾過して
取り出し、イソプロピルアルコールで２回洗浄した後、
減圧下で乾燥して７．４gのインドレニウムスルホネー
トカリウム塩を得た。収率は５５％であった。表２にＤ
ＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの
帰属を示す。
例１で合成した１１．８gのインドレニウムスルホネー
ト（４９mmol）を１２０mlのメタノールに溶解し、これ
に水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコール約３０
０mlを加えて撹拌した。生じた淡黄色の固体を濾過して
取り出し、イソプロピルアルコールで２回洗浄した後、
減圧下で乾燥して７．４gのインドレニウムスルホネー
トカリウム塩を得た。収率は５５％であった。表２にＤ
ＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの
帰属を示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】実施例３ （カルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウ
ム塩の合成）実施例２で合成した５．５g（２０mmol）
のインドレニウムスルホネートカリウム塩と５g（２５m
mol）のヨードプロピオン酸とを５０mlのオルトジクロ
ルベンゼン中に懸濁し、アルゴン気流下、１１０℃で１
２時間撹拌した。反応当初の懸濁液は加熱後、約３０分
で溶解し溶液となった。１２時間後、反応液を室温まで
冷却し上澄み液を取り除いた後、残った淡赤色の固体を
イソプロピルアルコールで数回洗浄した。その後、エー
テルで２回洗浄して減圧下で乾燥し、８．９gのカルボ
キシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を得
た。収率は９３％であった。表３にＤＭＳＯ中でのＮＭ
Ｒのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
ム塩の合成）実施例２で合成した５．５g（２０mmol）
のインドレニウムスルホネートカリウム塩と５g（２５m
mol）のヨードプロピオン酸とを５０mlのオルトジクロ
ルベンゼン中に懸濁し、アルゴン気流下、１１０℃で１
２時間撹拌した。反応当初の懸濁液は加熱後、約３０分
で溶解し溶液となった。１２時間後、反応液を室温まで
冷却し上澄み液を取り除いた後、残った淡赤色の固体を
イソプロピルアルコールで数回洗浄した。その後、エー
テルで２回洗浄して減圧下で乾燥し、８．９gのカルボ
キシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を得
た。収率は９３％であった。表３にＤＭＳＯ中でのＮＭ
Ｒのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】実施例４ （カルボン酸誘導体の合成）実施例３で合成した５g
（１１mmol）のカルボキシエチルインドレニウムスルホ
ネートカリウム塩を２０mlのピリジンに溶解し、アルゴ
ン気流下で還流しながら、３．１g（２１mmol）のオル
トギ酸エチルを１５分間にわたってゆっくりと滴下し
た。滴下後、２時間還流を続け、室温まで冷却した。反
応液に８０mlのエーテルを加えて固化させた後、上澄み
液を取り除いた。得られた赤褐色の固体を１０mlのメタ
ノールに溶解し、これに約２００mlのエーテルを撹拌し
ながら加えて再び固化させた。固体を濾過して取り出
し、エーテルで洗浄した後、減圧下で乾燥して２．５ｇ
のカルボン酸誘導体を得た。収率は２９％であった。表
４にＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピ
ークの帰属を示す。
（１１mmol）のカルボキシエチルインドレニウムスルホ
ネートカリウム塩を２０mlのピリジンに溶解し、アルゴ
ン気流下で還流しながら、３．１g（２１mmol）のオル
トギ酸エチルを１５分間にわたってゆっくりと滴下し
た。滴下後、２時間還流を続け、室温まで冷却した。反
応液に８０mlのエーテルを加えて固化させた後、上澄み
液を取り除いた。得られた赤褐色の固体を１０mlのメタ
ノールに溶解し、これに約２００mlのエーテルを撹拌し
ながら加えて再び固化させた。固体を濾過して取り出
し、エーテルで洗浄した後、減圧下で乾燥して２．５ｇ
のカルボン酸誘導体を得た。収率は２９％であった。表
４にＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピ
ークの帰属を示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】実施例５ （ＩＣ３−ＯＳｕの合成）実施例４で合成した１g
（１．２mmol）のカルボン酸誘導体と０．２８g（２．
４mmol）のヒドロキシコハク酸イミドとを２０mlのジメ
チルホルムアミドに溶解し、０℃で撹拌しながら０．４
９g（２．４mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミド
のジメチルホルムアミド溶液５mlをゆっくりと滴下し
た。室温に戻して一晩撹拌した後、生じた沈殿を濾過し
て除いた。濾液に約３００mlのエーテルを加え、生じた
赤褐色の固体を濾過して取り出し、エーテルで２回洗浄
した後、減圧下で乾燥して０．６８gのＩＣ３−ＯＳｕ
を得た。収率は５５％であった。表５にＤＭＳＯ中での
ＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
（１．２mmol）のカルボン酸誘導体と０．２８g（２．
４mmol）のヒドロキシコハク酸イミドとを２０mlのジメ
チルホルムアミドに溶解し、０℃で撹拌しながら０．４
９g（２．４mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミド
のジメチルホルムアミド溶液５mlをゆっくりと滴下し
た。室温に戻して一晩撹拌した後、生じた沈殿を濾過し
て除いた。濾液に約３００mlのエーテルを加え、生じた
赤褐色の固体を濾過して取り出し、エーテルで２回洗浄
した後、減圧下で乾燥して０．６８gのＩＣ３−ＯＳｕ
を得た。収率は５５％であった。表５にＤＭＳＯ中での
ＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００３９】
【表５】
【００４０】実施例６ （シアニン標識ＩｇＧの作製）５mg（3.3×10-5mmol）
のＩｇＧを２mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら
６．９mg（6.7×10-3mmol）のＩＣ３−ＯＳｕのＰＢＳ
溶液０．１mlを滴下した。室温で１０分間撹拌した後、
４℃で一晩放置した。未反応のＩＣ３−ＯＳｕを取り除
くため、反応液をＰＢＳ１０リットルに対して一晩透析
した。その結果、約３mlのシアニン標識ＩｇＧ溶液を得
た。
のＩｇＧを２mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら
６．９mg（6.7×10-3mmol）のＩＣ３−ＯＳｕのＰＢＳ
溶液０．１mlを滴下した。室温で１０分間撹拌した後、
４℃で一晩放置した。未反応のＩＣ３−ＯＳｕを取り除
くため、反応液をＰＢＳ１０リットルに対して一晩透析
した。その結果、約３mlのシアニン標識ＩｇＧ溶液を得
た。
【００４１】実施例７ （シアニン標識ＩｇＧ溶液の濃度計算）得られた溶液の
濃度及びＩＣ３−ＯＳｕの結合分子数を次のように計算
して求めた。溶液の280nm及び550nmでの吸光度を測定し
た。吸光度はそれぞれ6.15及び38.0であった。ＩｇＧ自
体には550nmに吸収はないので、観測された550nmの吸光
はＩｇＧに結合したＩＣ３−ＯＳｕに由来するものであ
る。従ってＩＣ３−ＯＳｕの濃度［ＩＣ３］は、数式
（数１）のように求めることができる。ただし、ＩＣ３
−ＯＳｕの550nmにおけるモル吸光係数を8.55×104とす
る。
濃度及びＩＣ３−ＯＳｕの結合分子数を次のように計算
して求めた。溶液の280nm及び550nmでの吸光度を測定し
た。吸光度はそれぞれ6.15及び38.0であった。ＩｇＧ自
体には550nmに吸収はないので、観測された550nmの吸光
はＩｇＧに結合したＩＣ３−ＯＳｕに由来するものであ
る。従ってＩＣ３−ＯＳｕの濃度［ＩＣ３］は、数式
（数１）のように求めることができる。ただし、ＩＣ３
−ＯＳｕの550nmにおけるモル吸光係数を8.55×104とす
る。
【００４２】
【数１】
【００４３】また、観測された280nmの吸光はＩｇＧに
由来するものであるが、結合しているＩＣ３−ＯＳｕが
280nmにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＩｇ
Ｇの濃度［ＩｇＧ］を求めると数式（数２）のようにな
る。ただし、ＩｇＧに由来する280nmの吸光度をＡｂ
280,IgGとし、ＩＣ３−ＯＳｕの280nmにおけるモル吸光
係数を9.80×103、ＩｇＧの280nmにおけるモル吸光係数
を2.10×105とする。
由来するものであるが、結合しているＩＣ３−ＯＳｕが
280nmにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＩｇ
Ｇの濃度［ＩｇＧ］を求めると数式（数２）のようにな
る。ただし、ＩｇＧに由来する280nmの吸光度をＡｂ
280,IgGとし、ＩＣ３−ＯＳｕの280nmにおけるモル吸光
係数を9.80×103、ＩｇＧの280nmにおけるモル吸光係数
を2.10×105とする。
【００４４】
【数２】
【００４５】従って、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＩ
Ｃ３−ＯＳｕの分子数は数式（数３）のようになる。
Ｃ３−ＯＳｕの分子数は数式（数３）のようになる。
【００４６】
【数３】
【００４７】実施例８ （シアニン標識ＢＳＡの作製）500mg（0.0076mmol）の
ＢＳＡを２０mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら
390mg（0.38mmol）のＩＣ３−ＯＳｕのＰＢＳ溶液１ml
を滴下した。室温で１０分間撹拌した後、４℃で一晩放
置した。反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開
液：ＰＢＳ）して４０mlのＢＳＡ溶液を得た。
ＢＳＡを２０mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら
390mg（0.38mmol）のＩＣ３−ＯＳｕのＰＢＳ溶液１ml
を滴下した。室温で１０分間撹拌した後、４℃で一晩放
置した。反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開
液：ＰＢＳ）して４０mlのＢＳＡ溶液を得た。
【００４８】実施例９ （シアニン標識ＢＳＡ溶液の濃度計算）得られた溶液の
濃度及びＩＣ３−ＯＳｕの結合分子数を次のように計算
して求めた。溶液の280nm及び550nmでの吸光度を測定し
た。吸光度はそれぞれ33.5及び248であった。ＢＳＡ自
体には550nmに吸収はないので、観測された550nmの吸光
はＢＳＡに結合したＩＣ３−ＯＳｕに由来するものであ
る。従ってＩＣ３−ＯＳｕの濃度［ＩＣ３］は、数式
（数４）のように求めることができる。ただし、ＩＣ３
−ＯＳｕの550nmにおけるモル吸光係数を8.55×104とす
る。
濃度及びＩＣ３−ＯＳｕの結合分子数を次のように計算
して求めた。溶液の280nm及び550nmでの吸光度を測定し
た。吸光度はそれぞれ33.5及び248であった。ＢＳＡ自
体には550nmに吸収はないので、観測された550nmの吸光
はＢＳＡに結合したＩＣ３−ＯＳｕに由来するものであ
る。従ってＩＣ３−ＯＳｕの濃度［ＩＣ３］は、数式
（数４）のように求めることができる。ただし、ＩＣ３
−ＯＳｕの550nmにおけるモル吸光係数を8.55×104とす
る。
【００４９】
【数４】
【００５０】また、観測された280nmの吸光はＢＳＡに
由来するものであるが、結合しているＩＣ３−ＯＳｕが
280nmにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＢＳ
Ａの濃度［ＢＳＡ］を求めると数式（数５）のようにな
る。ただし、ＢＳＡに由来する280nmの吸光度をＡｂ
280,BSAとし、ＩＣ３−ＯＳｕの280nmにおけるモル吸光
係数を9.80×103、ＢＳＡの280nmにおけるモル吸光係数
を4.36×104とする。
由来するものであるが、結合しているＩＣ３−ＯＳｕが
280nmにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＢＳ
Ａの濃度［ＢＳＡ］を求めると数式（数５）のようにな
る。ただし、ＢＳＡに由来する280nmの吸光度をＡｂ
280,BSAとし、ＩＣ３−ＯＳｕの280nmにおけるモル吸光
係数を9.80×103、ＢＳＡの280nmにおけるモル吸光係数
を4.36×104とする。
【００５１】
【数５】
【００５２】従って、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＩ
Ｃ３−ＯＳｕの分子数は数式（数６）のようになる。
Ｃ３−ＯＳｕの分子数は数式（数６）のようになる。
【００５３】
【数６】
【００５４】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明の前記式（化
１）で示されるＩＣ３−ＯＳｕは水溶液中で１級又は２
級のアミノ基と結合可能なスクシンイミジル基を有して
おり、さらに、インドレニン環内の窒素原子に結合して
いる炭素鎖の長さが短いため、タンパク質のアミノ基と
反応することにより水に不溶化することなくタンパク質
を標識することができる。
１）で示されるＩＣ３−ＯＳｕは水溶液中で１級又は２
級のアミノ基と結合可能なスクシンイミジル基を有して
おり、さらに、インドレニン環内の窒素原子に結合して
いる炭素鎖の長さが短いため、タンパク質のアミノ基と
反応することにより水に不溶化することなくタンパク質
を標識することができる。
【００５５】また、本発明の前記式（化２）で示される
カルボン酸誘導体は、ヒドロキシコハク酸イミドによっ
て活性化されやすいカルボキシル基を持っているので、
本発明の標識色素であるＩＣ３−ＯＳｕを合成するのに
有用な前駆体を提供できる。
カルボン酸誘導体は、ヒドロキシコハク酸イミドによっ
て活性化されやすいカルボキシル基を持っているので、
本発明の標識色素であるＩＣ３−ＯＳｕを合成するのに
有用な前駆体を提供できる。
【００５６】また、本発明のシアニン系標識色素の合成
方法によれば、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘
導体を有機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸
イミドを加えて撹拌することによって標識色素を合成す
ることができ、ＩＣ３−ＯＳｕの新規な合成方法を提供
することができる。
方法によれば、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘
導体を有機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸
イミドを加えて撹拌することによって標識色素を合成す
ることができ、ＩＣ３−ＯＳｕの新規な合成方法を提供
することができる。
【００５７】また、本発明のシアニン標識タンパク質に
よれば、タンパク質１分子当たり１０個から５０個程度
のシアニン化合物が結合しているので、タンパク質の正
確な定量が可能となり、これを用いた検出技術において
有用である。すなわち、水溶性に富み、モル吸光係数の
高いシアニン系標識色素を用いることによって、例えば
免疫クロマト技術を用いた抗原の検出に有用となる。
よれば、タンパク質１分子当たり１０個から５０個程度
のシアニン化合物が結合しているので、タンパク質の正
確な定量が可能となり、これを用いた検出技術において
有用である。すなわち、水溶性に富み、モル吸光係数の
高いシアニン系標識色素を用いることによって、例えば
免疫クロマト技術を用いた抗原の検出に有用となる。
【００５８】また、本発明のシアニン標識タンパク質の
作製方法によれば、前記式（化１）で示されるシアニン
系標識色素の水溶液をタンパク質水溶液中に滴下し、撹
拌することによってシアニン標識をすることができ、シ
アニン標識タンパク質の新規な作製方法を提供すること
ができる。
作製方法によれば、前記式（化１）で示されるシアニン
系標識色素の水溶液をタンパク質水溶液中に滴下し、撹
拌することによってシアニン標識をすることができ、シ
アニン標識タンパク質の新規な作製方法を提供すること
ができる。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−191674（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−358143（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−145148（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−132725（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，４（２），105−11（1993) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C09B 23/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 下記式（化１）で示されるスクシンイミ
ジル誘導体からなるシアニン系標識色素。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１に記載のシアニン系標識色素の
前駆体であって、下記式（化２）で示されるカルボン酸
誘導体。 【化２】 - 【請求項３】 請求項２に記載のカルボン酸誘導体を有
機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸イミドを
加えて撹拌する請求項１に記載のシアニン系標識色素の
合成方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載のシアニン系標識色素の
スクシンイミジル基とタンパク質のアミノ基とが反応す
ることによって、シアニン系標識色素の色素骨格とタン
パク質とが共有結合を介して結合しているシアニン標識
タンパク質。 - 【請求項５】 請求項１に記載のシアニン系標識色素の
水溶液をタンパク質水溶液中に滴下し撹拌するシアニン
標識タンパク質の作製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06827395A JP3253820B2 (ja) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | シアニン系標識色素及びその合成方法、並びにシアニン標識タンパク質及びその作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06827395A JP3253820B2 (ja) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | シアニン系標識色素及びその合成方法、並びにシアニン標識タンパク質及びその作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08259826A JPH08259826A (ja) | 1996-10-08 |
| JP3253820B2 true JP3253820B2 (ja) | 2002-02-04 |
Family
ID=13368995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06827395A Expired - Fee Related JP3253820B2 (ja) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | シアニン系標識色素及びその合成方法、並びにシアニン標識タンパク質及びその作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3253820B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3292007B2 (ja) * | 1995-11-09 | 2002-06-17 | 松下電器産業株式会社 | 色素標識タンパク質複合体及びその作製方法 |
| US6303759B1 (en) * | 1996-11-08 | 2001-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled and polymerized antibody and method for preparing the same |
| US6303758B1 (en) * | 1996-11-08 | 2001-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled and polymerized antibody and method for preparing the same |
| US6303757B1 (en) * | 1996-11-08 | 2001-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Indirect polymerized and labelled antibody and method for manufacturing the same |
| JPH11322800A (ja) * | 1998-05-14 | 1999-11-24 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 色素標識タンパク質複合体およびその製造方法 |
| US6307029B1 (en) | 1996-11-08 | 2001-10-23 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same |
| JP3625250B2 (ja) * | 1998-05-14 | 2005-03-02 | 松下電器産業株式会社 | 色素標識重合抗体およびその製造方法 |
| US6300480B1 (en) * | 1996-11-08 | 2001-10-09 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same |
| JP5388004B2 (ja) * | 2008-03-07 | 2014-01-15 | 国立大学法人三重大学 | 近赤外光発光化合物およびその発光法 |
| JP2011046662A (ja) * | 2009-08-28 | 2011-03-10 | Fujifilm Corp | 近赤外蛍光造影剤 |
-
1995
- 1995-03-27 JP JP06827395A patent/JP3253820B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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| Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４（２），１０５−１１（１９９３） |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08259826A (ja) | 1996-10-08 |
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