JP3388907B2 - メロシアニン系標識色素、その前駆体化合物及びメロシアニン系標識色素の合成方法、並びにメロシアニン標識タンパク質 - Google Patents
メロシアニン系標識色素、その前駆体化合物及びメロシアニン系標識色素の合成方法、並びにメロシアニン標識タンパク質Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク標識やその他
の生化学実験に有用なメロシアニン系標識色素とその前
駆体化合物およびこれらの合成法、並びに色素標識タン
パク質に関する。さらに詳しくは、タンパク質と結合可
能なイソチオシアニル基を有するメロシアニン系標識色
素とその合成上必要な前駆体、すなわちアミノ誘導体、
フタルイミド誘導体、およびトリメチルインドレニウム
塩、並びにメロシアニン標識タンパク質と標識色素の合
成方法に関する。
の生化学実験に有用なメロシアニン系標識色素とその前
駆体化合物およびこれらの合成法、並びに色素標識タン
パク質に関する。さらに詳しくは、タンパク質と結合可
能なイソチオシアニル基を有するメロシアニン系標識色
素とその合成上必要な前駆体、すなわちアミノ誘導体、
フタルイミド誘導体、およびトリメチルインドレニウム
塩、並びにメロシアニン標識タンパク質と標識色素の合
成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の標識色素は、例えばダンシルクロ
リドのように、比較的短波長の領域（５００ｎｍ付近）
に蛍光を持ち、アミノ基と反応することによってタンパ
ク質と結合する。そして、タンパク質１分子当たりに結
合しているダンシルの分子数がわかっていれば、励起波
長335ｎｍで510ｎｍの蛍光強度を測定することによって
タンパク質の定量分析をすることができる。
リドのように、比較的短波長の領域（５００ｎｍ付近）
に蛍光を持ち、アミノ基と反応することによってタンパ
ク質と結合する。そして、タンパク質１分子当たりに結
合しているダンシルの分子数がわかっていれば、励起波
長335ｎｍで510ｎｍの蛍光強度を測定することによって
タンパク質の定量分析をすることができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、長波長
領域（590ｎｍ付近）に蛍光を持つメロシアニン系の標
識色素においては、タンパク質と結合可能な官能基を持
った化合物は前例がない。長波長領域の蛍光を利用すれ
ば、不純物の影響を受けにくく、正確なタンパク定量が
可能である。したがって、長波長領域に蛍光を持ち、さ
らにタンパク質と結合可能な官能基を持ったメロシアニ
ン系標識色素が要請されていた。
領域（590ｎｍ付近）に蛍光を持つメロシアニン系の標
識色素においては、タンパク質と結合可能な官能基を持
った化合物は前例がない。長波長領域の蛍光を利用すれ
ば、不純物の影響を受けにくく、正確なタンパク定量が
可能である。したがって、長波長領域に蛍光を持ち、さ
らにタンパク質と結合可能な官能基を持ったメロシアニ
ン系標識色素が要請されていた。
【０００４】本発明は前記課題を解決するため、タンパ
ク質と結合可能なイソチオシアニル基を有するメロシア
ニン系標識色素とその合成上必要な前駆体、すなわちア
ミノ誘導体、フタルイミド誘導体、およびトリメチルイ
ンドレニウム塩、並びにメロシアニン標識タンパク質と
メロシアニン系標識色素の合成方法を提供することを目
的とする。
ク質と結合可能なイソチオシアニル基を有するメロシア
ニン系標識色素とその合成上必要な前駆体、すなわちア
ミノ誘導体、フタルイミド誘導体、およびトリメチルイ
ンドレニウム塩、並びにメロシアニン標識タンパク質と
メロシアニン系標識色素の合成方法を提供することを目
的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明のメロシアニン系標識色素は、前記式（化
１）で示されるイソチオシアナート誘導体からなるメロ
シアニン系標識色素である。
め、本発明のメロシアニン系標識色素は、前記式（化
１）で示されるイソチオシアナート誘導体からなるメロ
シアニン系標識色素である。
【０００６】次に本発明のアミノ誘導体は、前記式（化
１）で示されるイソシアナート誘導体からなるメロシア
ニン系標識色素の前駆体であって前記式（化２）で示さ
れる。
１）で示されるイソシアナート誘導体からなるメロシア
ニン系標識色素の前駆体であって前記式（化２）で示さ
れる。
【０００７】次に本発明のフタルイミド誘導体は、前記
式（化２）で示されるアミノ誘導体の前駆体であって前
記式（化３）で示される。前記式（化３）で示されるフ
タルイミド誘導体の前駆体の一例としては、下記式（化
４）で示されるトリメチルインドレニウム塩が挙げられ
る。
式（化２）で示されるアミノ誘導体の前駆体であって前
記式（化３）で示される。前記式（化３）で示されるフ
タルイミド誘導体の前駆体の一例としては、下記式（化
４）で示されるトリメチルインドレニウム塩が挙げられ
る。
【化４】
【０００８】次に本発明のメロシアニン標識タンパク質
は、前記式（化１）で示されるイソチオシアナート誘導
体からなるメロシアニン系標識色素のイソチオシアニル
基とタンパク質のアミノ基とが反応することによって、
メロシアニン系標識色素の色素骨格とタンパク質とが共
有結合を介して結合しているタンパク質である。
は、前記式（化１）で示されるイソチオシアナート誘導
体からなるメロシアニン系標識色素のイソチオシアニル
基とタンパク質のアミノ基とが反応することによって、
メロシアニン系標識色素の色素骨格とタンパク質とが共
有結合を介して結合しているタンパク質である。
【０００９】次に本発明のメロシアニン系標識色素の合
成方法は、前記式（化２）で示されるアミノ誘導体と前
記式（化５）で示されるチオカルボニルジイミダゾール
とを混合極性有機溶媒中で撹拌し、これを非極性溶媒中
に添加することによって標識色素を得るという構成を備
えたものである。
成方法は、前記式（化２）で示されるアミノ誘導体と前
記式（化５）で示されるチオカルボニルジイミダゾール
とを混合極性有機溶媒中で撹拌し、これを非極性溶媒中
に添加することによって標識色素を得るという構成を備
えたものである。
【００１０】
【作用】本発明の前記式（化１）で示されるメロシアニ
ン系標識色素（以下、ＩＭＣＩＴＣと略称する。）によ
れば、種々のメロシアニン標識化合物を達成できる。す
なわち、ＩＭＣＩＴＣは水溶液中で１級及び２級のアミ
ノ基と結合可能なイソチオシアニル基を有しており、例
えばタンパク質のアミノ基と反応することによりメロシ
アニン標識のタンパク質を作製することができる。
ン系標識色素（以下、ＩＭＣＩＴＣと略称する。）によ
れば、種々のメロシアニン標識化合物を達成できる。す
なわち、ＩＭＣＩＴＣは水溶液中で１級及び２級のアミ
ノ基と結合可能なイソチオシアニル基を有しており、例
えばタンパク質のアミノ基と反応することによりメロシ
アニン標識のタンパク質を作製することができる。
【００１１】また、本発明の前記式（化２）で示される
アミノ誘導体によれば、前記化学式（化５）で示される
チオカルボニルジイミダゾールと反応する１級アミノ基
を持っているので、本発明の標識色素であるＩＭＣＩＴ
Ｃを合成するのに有用な前駆体（中間体）を達成でき
る。
アミノ誘導体によれば、前記化学式（化５）で示される
チオカルボニルジイミダゾールと反応する１級アミノ基
を持っているので、本発明の標識色素であるＩＭＣＩＴ
Ｃを合成するのに有用な前駆体（中間体）を達成でき
る。
【００１２】また、本発明の前記式（化３）で示される
フタルイミド誘導体によれば、ヒドラジンによってのみ
脱保護することのできるフタルイミジル基を持っている
ので、本発明の中間体であるアミノ誘導体を合成するの
に有用な前駆体（中間体）を達成できる。
フタルイミド誘導体によれば、ヒドラジンによってのみ
脱保護することのできるフタルイミジル基を持っている
ので、本発明の中間体であるアミノ誘導体を合成するの
に有用な前駆体（中間体）を達成できる。
【００１３】また、前記式（化４）で示されるトリメチ
ルインドレニウム塩によれば、４級窒素に隣接する活性
メチル基を持っているので、本発明の中間体であるフタ
ルイミド誘導体を合成するのに有用な前駆体（中間体）
を達成できる。
ルインドレニウム塩によれば、４級窒素に隣接する活性
メチル基を持っているので、本発明の中間体であるフタ
ルイミド誘導体を合成するのに有用な前駆体（中間体）
を達成できる。
【００１４】また、本発明のメロシアニン標識タンパク
質によれば、タンパク質１分子当たり５個から３０個程
度のメロシアニン化合物が結合しているので、タンパク
質の正確な定量が可能となる。すなわち、モル吸光係数
の高いメロシアニン系標識色素を用い、しかも不純物の
影響を受けにくい長波長領域の蛍光強度を測定すること
により、微量のタンパク質も正確に定量することができ
る。ここで、タンパク質とは、分子量約１５万程度の、
主として抗体、血液中のアルブミン等をいう。
質によれば、タンパク質１分子当たり５個から３０個程
度のメロシアニン化合物が結合しているので、タンパク
質の正確な定量が可能となる。すなわち、モル吸光係数
の高いメロシアニン系標識色素を用い、しかも不純物の
影響を受けにくい長波長領域の蛍光強度を測定すること
により、微量のタンパク質も正確に定量することができ
る。ここで、タンパク質とは、分子量約１５万程度の、
主として抗体、血液中のアルブミン等をいう。
【００１５】また、本発明のメロシアニン系標識色素の
合成方法によれば、前記式（化２）で示されるアミノ誘
導体と前記式（化５）で示されるチオカルボニルジイミ
ダゾールとを混合極性有機溶媒中で撹拌し、これを非極
性溶媒中に添加することによってＩＭＣＩＴＣを合成す
ることができ、ＩＭＣＩＴＣの新規な合成方法を提供で
きる。
合成方法によれば、前記式（化２）で示されるアミノ誘
導体と前記式（化５）で示されるチオカルボニルジイミ
ダゾールとを混合極性有機溶媒中で撹拌し、これを非極
性溶媒中に添加することによってＩＭＣＩＴＣを合成す
ることができ、ＩＭＣＩＴＣの新規な合成方法を提供で
きる。
【００１６】
【実施例】前記式（化４）で示されるトリメチルインド
レニウム塩は、例えば、ブロモプロピルフタルイミド
と、約0.5〜２等量モルのトリメチルインドレニンとを
混合し、約80〜130℃で約１〜５時間加熱することによ
って得ることができる。
レニウム塩は、例えば、ブロモプロピルフタルイミド
と、約0.5〜２等量モルのトリメチルインドレニンとを
混合し、約80〜130℃で約１〜５時間加熱することによ
って得ることができる。
【００１７】また、前記式（化３）で示されるフタルイ
ミド誘導体は、例えば前記式（化４）で示されるトリメ
チルインドレニウム塩の有機溶媒溶液、例えばエタノー
ル溶液に、等モルのジメチルアミノベンズアルデヒドを
加え、約60〜100℃に加熱することにより、短時間で得
ることができる。
ミド誘導体は、例えば前記式（化４）で示されるトリメ
チルインドレニウム塩の有機溶媒溶液、例えばエタノー
ル溶液に、等モルのジメチルアミノベンズアルデヒドを
加え、約60〜100℃に加熱することにより、短時間で得
ることができる。
【００１８】また、前記化学式（化２）で示されるアミ
ノ誘導体は、例えば前記化学式（化３）で示されるフタ
ルイミド誘導体の有機溶媒溶液、例えばエタノール溶液
に、等モルのヒドラジン一水和物を加え、約70〜90℃に
加熱することにより、短時間で得ることができる。
ノ誘導体は、例えば前記化学式（化３）で示されるフタ
ルイミド誘導体の有機溶媒溶液、例えばエタノール溶液
に、等モルのヒドラジン一水和物を加え、約70〜90℃に
加熱することにより、短時間で得ることができる。
【００１９】また、前記化学式（化１）で示されるＩＭ
ＣＩＴＣは、例えば前記化学式（化２）で示されるアミ
ノ誘導体の有機溶媒溶液、例えばクロロホルムとジメチ
ルホルムアミドとの混合溶媒溶液に、等モルのチオカル
ボニルジイミダゾールを加え、約20〜30℃で撹拌するこ
とにより合成することができる。
ＣＩＴＣは、例えば前記化学式（化２）で示されるアミ
ノ誘導体の有機溶媒溶液、例えばクロロホルムとジメチ
ルホルムアミドとの混合溶媒溶液に、等モルのチオカル
ボニルジイミダゾールを加え、約20〜30℃で撹拌するこ
とにより合成することができる。
【００２０】また、メロシアニン標識タンパク質は、例
えばウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称する。）の
リン酸緩衝溶液に、例えば約0.5〜100倍モルのＩＭＣＩ
ＴＣを加え、約4〜30℃で撹拌することにより得ること
ができる。そしてメロシアニン標識タンパク質の定量
は、タンパク質に結合したＩＭＣＩＴＣの蛍光強度を測
定して行うものであるため、測定する蛍光の波長は強度
の強い550〜640ｎｍで行うのが好ましい。なお、未知の
試料がタンパク質であるか否かは、タンパク質が吸収を
持つ２８０ｎｍでの吸収スペクトルを測定することによ
って確認できる。
えばウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称する。）の
リン酸緩衝溶液に、例えば約0.5〜100倍モルのＩＭＣＩ
ＴＣを加え、約4〜30℃で撹拌することにより得ること
ができる。そしてメロシアニン標識タンパク質の定量
は、タンパク質に結合したＩＭＣＩＴＣの蛍光強度を測
定して行うものであるため、測定する蛍光の波長は強度
の強い550〜640ｎｍで行うのが好ましい。なお、未知の
試料がタンパク質であるか否かは、タンパク質が吸収を
持つ２８０ｎｍでの吸収スペクトルを測定することによ
って確認できる。
【００２１】前記式（化１）、（化２）、（化３）およ
び（化４）で示される各化合物に含まれるハロゲンとし
ては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられ
る。以下具体的実施例をあげて、本発明をさらに詳しく
説明する。なお、本実施例の前記式（化１）、（化
２）、（化３）および（化４）で示される各化合物はＸ
が臭素の例であり、タンパク質はＢＳＡ及びチキンγ-
グロブリン（以下ＣＧＧと略称する。）の例である。
び（化４）で示される各化合物に含まれるハロゲンとし
ては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられ
る。以下具体的実施例をあげて、本発明をさらに詳しく
説明する。なお、本実施例の前記式（化１）、（化
２）、（化３）および（化４）で示される各化合物はＸ
が臭素の例であり、タンパク質はＢＳＡ及びチキンγ-
グロブリン（以下ＣＧＧと略称する。）の例である。
【００２２】実施例１
（トリメチルインドレニウム塩の合成）トリメチルイン
ドレニン10g (MW=159.2、0.063mol)とブロモプロピルフ
タルイミド16.8g (MW=268.1、0.063mol)をベンゼン20ml
を用いて混合し、窒素気流下で120℃、３時間加熱し
た。ベンゼンは反応時間中に蒸発した。反応物を冷却
し、ジエチルエーテルで繰返し洗浄することにより、淡
赤色の粉末が得られた。生成物はＮＭＲにより1-(3-フ
タルイミジル)-2,3,3-トリメチルインドレニウム ブロ
ミド (MW=427.3)と同定された。収量は26.5g (99％)で
あった。
ドレニン10g (MW=159.2、0.063mol)とブロモプロピルフ
タルイミド16.8g (MW=268.1、0.063mol)をベンゼン20ml
を用いて混合し、窒素気流下で120℃、３時間加熱し
た。ベンゼンは反応時間中に蒸発した。反応物を冷却
し、ジエチルエーテルで繰返し洗浄することにより、淡
赤色の粉末が得られた。生成物はＮＭＲにより1-(3-フ
タルイミジル)-2,3,3-トリメチルインドレニウム ブロ
ミド (MW=427.3)と同定された。収量は26.5g (99％)で
あった。
【００２３】表１に重クロロホルム中での1Ｈ-ＮＭＲの
ケミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
ケミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】実施例２
（フタルイミド誘導体の合成）26g（0.061mol）のトリ
メチルインドレニウム塩を200mlのエタノールに溶解
し、これに9.08g（0.061mol）のジメチルアミノベンズ
アルデヒドを加えて、２時間還流した。減圧下でエタノ
ールを留去した後、エーテルで洗浄して粗精製のフタル
イミド誘導体を33.0g（MW=558、97％）得た。
メチルインドレニウム塩を200mlのエタノールに溶解
し、これに9.08g（0.061mol）のジメチルアミノベンズ
アルデヒドを加えて、２時間還流した。減圧下でエタノ
ールを留去した後、エーテルで洗浄して粗精製のフタル
イミド誘導体を33.0g（MW=558、97％）得た。
【００２６】表２にＤＭＳＯd-6中での1Ｈ-ＮＭＲのケ
ミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
ミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】実施例３
（アミノ誘導体の合成）1.12ｇ（2.01mmol）のフタルイ
ミド誘導体を10ｍｌの90％エタノールに溶解し、これに
100.5mg（2.01mmol）のヒドラジン一水和物を加えて２
時間還流した。反応液を室温まで冷却した後、約50mlの
１Ｎ塩酸を加えてクロロホルムで３回洗浄した。水層に
水酸化ナトリウム水溶液を加えてアルカリ性とした後、
クロロホルムで３回抽出した。クロロホルム層に無水硫
酸ナトリウムを加えて乾燥した後、クロロホルムを減圧
下で留去して粗製のアミノ誘導体を得た。これをシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィー（Ｃ−１８タイプ、展開溶
媒：メタノール／0.1Ｎ塩酸＝２／１）を用いて精製
し、807mg（ＭＷ＝428、94％）のアミノ誘導体を得た。
ミド誘導体を10ｍｌの90％エタノールに溶解し、これに
100.5mg（2.01mmol）のヒドラジン一水和物を加えて２
時間還流した。反応液を室温まで冷却した後、約50mlの
１Ｎ塩酸を加えてクロロホルムで３回洗浄した。水層に
水酸化ナトリウム水溶液を加えてアルカリ性とした後、
クロロホルムで３回抽出した。クロロホルム層に無水硫
酸ナトリウムを加えて乾燥した後、クロロホルムを減圧
下で留去して粗製のアミノ誘導体を得た。これをシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィー（Ｃ−１８タイプ、展開溶
媒：メタノール／0.1Ｎ塩酸＝２／１）を用いて精製
し、807mg（ＭＷ＝428、94％）のアミノ誘導体を得た。
【００２９】表３にＤＭＳＯd-6中での1Ｈ-ＮＭＲのケ
ミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
ミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
【００３０】
【表３】
【００３１】実施例４
（ＩＭＣＩＴＣの合成）285.7mg（1.60mmol）のチオカ
ルボニルジイミダゾールを５mlのクロロホルムに溶解
し、窒素気流下０℃で撹拌しながら、３mlのジメチルホ
ルムアミドに溶解した686mg（1.60mmol）のアミノ誘導
体をゆっくり滴下した。滴下終了後、室温に戻し２時間
撹拌した。クロロホルムを減圧留去した後、残った反応
液を約800mlのジエチルエーテル中に滴下し、生じた固
体を濾過して取り出した。得られた固体を約３mlのメタ
ノールに溶解し、これを再び400mlのジエチルエーテル
中に滴下した後、生じた固体を濾過して638mg（ＭＷ＝4
70、85％）のＩＭＣＩＴＣを得た。
ルボニルジイミダゾールを５mlのクロロホルムに溶解
し、窒素気流下０℃で撹拌しながら、３mlのジメチルホ
ルムアミドに溶解した686mg（1.60mmol）のアミノ誘導
体をゆっくり滴下した。滴下終了後、室温に戻し２時間
撹拌した。クロロホルムを減圧留去した後、残った反応
液を約800mlのジエチルエーテル中に滴下し、生じた固
体を濾過して取り出した。得られた固体を約３mlのメタ
ノールに溶解し、これを再び400mlのジエチルエーテル
中に滴下した後、生じた固体を濾過して638mg（ＭＷ＝4
70、85％）のＩＭＣＩＴＣを得た。
【００３２】表４に重クロロホルム中での1Ｈ-ＮＭＲの
ケミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
ケミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】実施例５
（メロシアニン標識ＢＳＡの作製）50mg（0.00076mmo
l）のＢＳＡを３mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しな
がら０．５mlのエタノールに溶解した17.8mg（0.038mmo
l）のＩＭＣＩＴＣを滴下した。室温で12時間撹拌した
後、反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開液：Ｐ
ＢＳ）して24mlのＢＳＡ溶液を得た。
l）のＢＳＡを３mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しな
がら０．５mlのエタノールに溶解した17.8mg（0.038mmo
l）のＩＭＣＩＴＣを滴下した。室温で12時間撹拌した
後、反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開液：Ｐ
ＢＳ）して24mlのＢＳＡ溶液を得た。
【００３５】実施例６
（メロシアニン標識ＢＳＡ溶液の濃度計算）得られた溶
液の濃度及びＩＭＣＩＴＣの結合分子数を次のように計
算して求めた。溶液の280nm及び553nmでの吸光度を測定
した。吸光度はそれぞれ1.995及び6.260であった。ＢＳ
Ａ自体には553nmに吸収はないので、観測された553nmの
吸光はＢＳＡに結合したＩＭＣＩＴＣに由来するもので
ある。従ってＩＭＣＩＴＣの濃度［ＩＭＣ］は、次のよ
うに求めることができる。ただし、ＩＭＣＩＴＣの553n
mのモル吸光係数を2.196×104とする。
液の濃度及びＩＭＣＩＴＣの結合分子数を次のように計
算して求めた。溶液の280nm及び553nmでの吸光度を測定
した。吸光度はそれぞれ1.995及び6.260であった。ＢＳ
Ａ自体には553nmに吸収はないので、観測された553nmの
吸光はＢＳＡに結合したＩＭＣＩＴＣに由来するもので
ある。従ってＩＭＣＩＴＣの濃度［ＩＭＣ］は、次のよ
うに求めることができる。ただし、ＩＭＣＩＴＣの553n
mのモル吸光係数を2.196×104とする。
【００３６】［ＩＭＣ］＝ 6.260／(2.196×104) ＝ 2.
851×10-4（Ｍ） また、観測された280nmの吸光はＢＳＡに由来するもの
であるが、結合しているＩＭＣＩＴＣが280nmにも吸収
を持つので、この影響を差し引いてＢＳＡの濃度［ＢＳ
Ａ］を求めると次のようになる。ただし、ＢＳＡに由来
する280nmの吸光度をAb280,BSAとし、ＩＭＣＩＴＣの28
0nmにおけるモル吸光係数を2.285×103、ＢＳＡの280nm
におけるモル吸光係数を4.360×104とする。
851×10-4（Ｍ） また、観測された280nmの吸光はＢＳＡに由来するもの
であるが、結合しているＩＭＣＩＴＣが280nmにも吸収
を持つので、この影響を差し引いてＢＳＡの濃度［ＢＳ
Ａ］を求めると次のようになる。ただし、ＢＳＡに由来
する280nmの吸光度をAb280,BSAとし、ＩＭＣＩＴＣの28
0nmにおけるモル吸光係数を2.285×103、ＢＳＡの280nm
におけるモル吸光係数を4.360×104とする。
【００３７】Ab280,BSA ＝ 1.995−(2.851×10-4×2.28
5×103）＝ 1.344 ［ＢＳＡ］＝ 1.344／(4.360×104）＝ 3.082×10-5Ｍ 従って、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＩＭＣＩＴＣの
分子数は次のようになる。
5×103）＝ 1.344 ［ＢＳＡ］＝ 1.344／(4.360×104）＝ 3.082×10-5Ｍ 従って、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＩＭＣＩＴＣの
分子数は次のようになる。
【００３８】［ＩＭＣ］／［ＢＳＡ］＝ 2.851×10-4／
3.082×10-5 ＝ 9.25 実施例７ （メロシアニン標識ＣＧＧの作製）100mg（0.00067mmo
l）のＣＧＧを30mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しな
がら0.5mlのエタノールに溶解した15.7mg（0.033mmol）
のＩＭＣＩＴＣを滴下した。室温で12時間撹拌した後、
反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開液：ＰＢ
Ｓ）して24mlのＣＧＧ溶液を得た。
3.082×10-5 ＝ 9.25 実施例７ （メロシアニン標識ＣＧＧの作製）100mg（0.00067mmo
l）のＣＧＧを30mlのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しな
がら0.5mlのエタノールに溶解した15.7mg（0.033mmol）
のＩＭＣＩＴＣを滴下した。室温で12時間撹拌した後、
反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開液：ＰＢ
Ｓ）して24mlのＣＧＧ溶液を得た。
【００３９】実施例８
（メロシアニン標識ＣＧＧ溶液の濃度計算）得られた溶
液の濃度及びＩＭＣＩＴＣの結合分子数をＢＳＡの場合
と同様に計算して求めた。すなわち、溶液の280nm及び5
53nmでの吸光度を測定した。吸光度はそれぞれ8.350及
び20.55であった。ＣＧＧ自体には553nmに吸収はないの
で、観測された553nmの吸光はＣＧＧに結合したＩＭＣ
ＩＴＣに由来するものである。従ってＩＭＣＩＴＣの濃
度［ＩＭＣ］は、次のように求めることができる。ただ
し、ＩＭＣＩＴＣの553nmのモル吸光係数を2.196×104
とする。
液の濃度及びＩＭＣＩＴＣの結合分子数をＢＳＡの場合
と同様に計算して求めた。すなわち、溶液の280nm及び5
53nmでの吸光度を測定した。吸光度はそれぞれ8.350及
び20.55であった。ＣＧＧ自体には553nmに吸収はないの
で、観測された553nmの吸光はＣＧＧに結合したＩＭＣ
ＩＴＣに由来するものである。従ってＩＭＣＩＴＣの濃
度［ＩＭＣ］は、次のように求めることができる。ただ
し、ＩＭＣＩＴＣの553nmのモル吸光係数を2.196×104
とする。
【００４０】［ＩＭＣ］＝ 20.55／（2.196×104）＝
9.360×10-4（Ｍ） また、観測された280nmの吸光はＣＧＧに由来するもの
であるが、結合しているＩＭＣＩＴＣが280nmにも吸収
を持つので、この影響を差し引いてＣＧＧの濃度［ＣＧ
Ｇ］を求めると次のようになる。ただし、ＣＧＧに由来
する280nmの吸光度をAb280,CGGとし、ＩＭＣＩＴＣの28
0nmにおけるモル吸光係数を2.285×103、ＣＧＧの280nm
におけるモル吸光係数を1.990×105とする。
9.360×10-4（Ｍ） また、観測された280nmの吸光はＣＧＧに由来するもの
であるが、結合しているＩＭＣＩＴＣが280nmにも吸収
を持つので、この影響を差し引いてＣＧＧの濃度［ＣＧ
Ｇ］を求めると次のようになる。ただし、ＣＧＧに由来
する280nmの吸光度をAb280,CGGとし、ＩＭＣＩＴＣの28
0nmにおけるモル吸光係数を2.285×103、ＣＧＧの280nm
におけるモル吸光係数を1.990×105とする。
【００４１】Ab280,CGG ＝ 8.350−(9.360×10-4×2.28
5×103）＝ 6.212 ［ＣＧＧ］＝ 6.212／(1.990×105）＝ 3.121×10-5Ｍ 従って、ＣＧＧ１分子当たりに結合したＩＭＣＩＴＣの
分子数は次のようになる。
5×103）＝ 6.212 ［ＣＧＧ］＝ 6.212／(1.990×105）＝ 3.121×10-5Ｍ 従って、ＣＧＧ１分子当たりに結合したＩＭＣＩＴＣの
分子数は次のようになる。
【００４２】［ＩＭＣ］／［ＣＧＧ］＝ 9.360×10-4／
3.121×10-5 ＝ 29.99
3.121×10-5 ＝ 29.99
【００４３】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明の前記式（化
１）で示されるＩＭＣＩＴＣは水溶液中で１級及び２級
のアミノ基と結合可能なイソチオシアニル基を有してお
り、タンパク質のアミノ基と反応することによりメロシ
アニン標識のタンパク質を作製することができる。
１）で示されるＩＭＣＩＴＣは水溶液中で１級及び２級
のアミノ基と結合可能なイソチオシアニル基を有してお
り、タンパク質のアミノ基と反応することによりメロシ
アニン標識のタンパク質を作製することができる。
【００４４】また、本発明の前記式（化２）で示される
アミノ誘導体によれば、前記式（化５）で示されるチオ
カルボニルジイミダゾールと反応する１級アミノ基を持
っているので、本発明の標識色素であるＩＭＣＩＴＣを
合成するのに有用な前駆体（中間体）を提供できる。
アミノ誘導体によれば、前記式（化５）で示されるチオ
カルボニルジイミダゾールと反応する１級アミノ基を持
っているので、本発明の標識色素であるＩＭＣＩＴＣを
合成するのに有用な前駆体（中間体）を提供できる。
【００４５】また、本発明の前記式（化３）で示される
フタルイミド誘導体によれば、ヒドラジンによってのみ
脱保護することのできるフタルイミジル基を持っている
ので、本発明の中間体であるアミノ誘導体を合成するの
に有用な前駆体（中間体）を提供できる。
フタルイミド誘導体によれば、ヒドラジンによってのみ
脱保護することのできるフタルイミジル基を持っている
ので、本発明の中間体であるアミノ誘導体を合成するの
に有用な前駆体（中間体）を提供できる。
【００４６】また、本発明のメロシアニン標識タンパク
質によれば、タンパク質１分子当たり５個から３０個程
度のメロシアニン化合物が結合しているので、タンパク
質の正確な定量が可能となる。
質によれば、タンパク質１分子当たり５個から３０個程
度のメロシアニン化合物が結合しているので、タンパク
質の正確な定量が可能となる。
【００４７】すなわち、モル吸光係数の高いメロシアニ
ン系標識色素を用い、しかも不純物の影響を受けにくい
長波長領域の蛍光強度を測定することにより、微量のタ
ンパク質も正確に定量することができる。
ン系標識色素を用い、しかも不純物の影響を受けにくい
長波長領域の蛍光強度を測定することにより、微量のタ
ンパク質も正確に定量することができる。
【００４８】また、本発明のメロシアニン系標識色素の
合成方法によれば、前記式（化２）で示されるアミノ誘
導体と前記式（化５）で示されるチオカルボニルジイミ
ダゾールとを混合極性有機溶媒中で撹拌し、これを非極
性溶媒中に添加することによってＩＭＣＩＴＣを合成す
ることができ、ＩＭＣＩＴＣの新規な合成方法を提供で
きる。
合成方法によれば、前記式（化２）で示されるアミノ誘
導体と前記式（化５）で示されるチオカルボニルジイミ
ダゾールとを混合極性有機溶媒中で撹拌し、これを非極
性溶媒中に添加することによってＩＭＣＩＴＣを合成す
ることができ、ＩＭＣＩＴＣの新規な合成方法を提供で
きる。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
// Ｃ０７Ｍ 5:00 Ｃ０７Ｄ 209/48 Ｚ
(56)参考文献 特開 平５−232119（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−223825（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−157926（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−63654（ＪＰ，Ａ)
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．10，Ｎ
ｏ．１，ｐ．３−10
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C09B 23/00
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 下記式（化１）で示されるイソチオシア
ナート誘導体からなるメロシアニン系標識色素。 【化１】 - 【請求項２】 前記式（化１）で示されるイソチオシア
ナート誘導体からなるメロシアニン系標識色素の前駆体
であって、下記式（化２）で示されるアミノ誘導体。 【化２】 - 【請求項３】 前記式（化２）で示されるアミノ誘導体
の前駆体であって、下記式（化３）で示されるフタルイ
ミド誘導体。 【化３】 - 【請求項４】 前記式（化１）で示されるイソチオシア
ナート誘導体からなるメロシアニン系標識色素のイソチ
オシアニル基とタンパク質のアミノ基とが反応すること
によって、メロシアニン系標識色素の色素骨格とタンパ
ク質とが共有結合を介して結合していることを特徴とす
るメロシアニン標識タンパク質。 - 【請求項５】 前記式（化２）で示されるアミノ誘導体
と下記式（化５）で示されるチオカルボニルジイミダゾ
ールとを混合極性有機溶媒中で撹拌し、これを非極性溶
媒中に添加することを特徴とする前記式（化１）で示さ
れるイソチオシアナート誘導体からなるメロシアニン系
標識色素の合成方法。 【化５】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23695194A JP3388907B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | メロシアニン系標識色素、その前駆体化合物及びメロシアニン系標識色素の合成方法、並びにメロシアニン標識タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23695194A JP3388907B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | メロシアニン系標識色素、その前駆体化合物及びメロシアニン系標識色素の合成方法、並びにメロシアニン標識タンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08100129A JPH08100129A (ja) | 1996-04-16 |
| JP3388907B2 true JP3388907B2 (ja) | 2003-03-24 |
Family
ID=17008182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23695194A Expired - Fee Related JP3388907B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | メロシアニン系標識色素、その前駆体化合物及びメロシアニン系標識色素の合成方法、並びにメロシアニン標識タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3388907B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2066813A2 (en) * | 2006-09-28 | 2009-06-10 | Ensemble Discovery Corporation | Compositions and methods for biodetection by nucleic acid-templated chemistry |
| CN105572095B (zh) * | 2016-03-18 | 2018-12-18 | 南京微瑞莱电子科技有限公司 | 一种人血清白蛋白的检测试剂及定量检测方法 |
-
1994
- 1994-09-30 JP JP23695194A patent/JP3388907B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐ．３−１０ |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08100129A (ja) | 1996-04-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |