JP3547284B2 - 色素標識重合抗体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シアニン系色素で標識された重合抗体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、色素標識抗体は、その反応特異性を利用して免疫クロマトグラフィー等の分析に使用されている。抗体を標識する色素としては、反応性に富む官能基を有するシアニン系色素がしばしば使用されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＶＯＬ．４ Ｎｏ．２ ｐｐ１０５−１１１ １９９３）。このようなシアニン系色素は、その官能基が抗体のアミノ基あるいはカルボキシル基と反応して共有結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色素が結合する。このようにして作製された色素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば、免疫クロマトグラフィーに適用され、妊婦の尿中にのみ存在するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）等の微量成分の検出が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の色素標識抗体では検出レベルに限界があり、検出対象物が低濃度である場合は、その検出が困難であった。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、検出対象物が低濃度であっても、その検出が可能な高感度の色素標識重合抗体を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の色素標識重合抗体は、多官能性試薬により抗体が重合され、この重合抗体がシアニン系色素により標識されている。
【０００６】
すなわち、従来の色素標識抗体は、抗原に結合する部位が２か所しかないため、その感度に限度があった。しかし、本発明の色素標識重合抗体は、抗体が重合しているため、抗原に結合する部位も多数有し、感度が極めて優れるものである。したがって、本発明の色素標識重合抗体を、例えば、免疫クロマトグラフィーに用いれば、低濃度であっても、分析対象物を高感度で検出できる。また、その高感度から、本発明の色素標識重合抗体は、バイオセンサーにも適用可能である。
【０００７】
本発明において用いる抗体は、特に制限されず、その由来やサブクラス等に関係なく使用できる。例えば、本発明に用いることができる抗体（イムノグロブリン、Ｉｇ）としては、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ラビットＩｇＧ、ラビットＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ，ヒツジＩｇＭ等があげられる。これらの抗体は、市販品として入手しても、直接その動物から採取してもよい。
【０００８】
前記多官能性試薬としては、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）［ＤＴＳＳＰ］が好ましい。
【０００９】
前記シアニン系色素は、前記式（化１）で示されるシアニン系色素が好ましい。この色素は、肉眼で確認することが容易な赤色系統の色素だからである。しかし、機械で確認するセンサー等の場合は、他の色系統の色素であってもよい。
【００１０】
前記式（化１）において、Ｘで示されるハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、Ｍで示される金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウムがあげられる。
【００１１】
そして、本発明の色素標識重合抗体では、重合抗体と前記式（化１）で示されるシアニン系色素の色素骨格とが、共有結合により結合していることが好ましい。前記共有結合は、前記シアニン系色素のスクシンイミジル基と抗体のアミノ基との反応による共有結合が一般的である。
【００１２】
本発明の色素標識重合抗体において、抗体の重合度は、通常、２〜５０の範囲である。
【００１３】
つぎに、本発明の色素標識重合抗体の製造方法は、ｐＨが中性または弱アルカリ領域の緩衝液中で多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程と、この緩衝液中にシアニン系色素を添加して前記重合された抗体を標識する工程とを含む方法である。
【００１４】
前記緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）が好ましい。前記緩衝液のｐＨは、通常、７．０〜８．０の範囲である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
前記シアニン系色素は、例えば、下記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体を有機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸イミドを加えて撹拌することによって作製できる。
【００１６】
【化２】
【００１７】
下記式（化３）に、前記式（化１）で示されるシアニン系色素の合成経路の一例を示し、以下にその各合成反応について説明する。
【００１８】
【化３】
【００１９】
まず、下記式（化５）で示されるインドレニウムスルホネートは、下記式（化４）で示されるヒドラジノベンゼンスルホン酸と０．５〜２モル比のイソプロピルメチルケトンとを、酸性溶媒、例えば酢酸に溶解し、約７０〜１３０℃で１〜５時間加熱することによって得ることができる。
【００２０】
【化４】
【００２１】
【化５】
【００２２】
下記式（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの金属塩は、例えば前記式（化５）で示されるインドレニウムスルホネートのアルコール溶液、例えばメタノール溶液に、例えば水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコールを加えることによって、カリウム塩として得ることができる。
【００２３】
【化６】
【００２４】
下記式（化７）で示されるカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩は、前記式（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカリウム塩の有機溶媒溶液、例えばオルトジクロルベンゼン溶液に、等モルのハロゲン化アルキル酸、例えばヨードプロピオン酸を加え、約８０〜１３０℃で２〜１２時間加熱することにより、カルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩として得ることができる。ここでハロゲン化アルキル酸の炭素数は、水に対しての溶解性を考え、１〜４が好ましい。特に炭素数３のヨードプロピオン酸は、水溶性およびインドレニンへの反応性に富んでいるため有用である。
【００２５】
【化７】
【００２６】
前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体は、前記式（化７）で示されるカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカルボキシエチルインドレニウムスルホネートのカリウム塩と０．５〜２モル比のオルトギ酸エチルとを塩基性有機溶媒、例えばピリジンに溶解し、約８０〜１２０℃で１〜３時間加熱することによって、プロピオン酸誘導体として得ることができる。
【００２７】
そして、前記式（化１）で示されるシアニン系色素は、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体の有機溶媒溶液、例えばジメチルホルムアミド溶液中に、０．５〜２モル比のヒドロキシコハク酸イミドと、縮合剤として０．５〜２モル比のジシクロヘキシルカルボジイミドとを加えて、２〜１２時間撹拌することにより得ることができる。
【００２８】
なお、前記式（化１）、前記式（化２）および前記式（化７）で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、前記式（化１）、前記式（化２）、前記式（化６）および前記式（化７）で示される各化合物に含まれる金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などがあげられる。
【００２９】
つぎに、本発明において使用される多官能性試薬は、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、スクシンイミジルエステル基）を同一分子内に２つ以上有する試薬があげられる。例えば、前記ＤＴＳＳＰの他に、下記式（化８）に示すビス（スルホスクシンイミジル）スベレート［ＢＳ３ ］、下記式（化９）に示すジスクシンイミジルタートレート［ＤＳＴ］、下記式（化１０）に示すエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）［ＥＧＳ］、下記式（化１１）に示すＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピレート［ＳＰＤＰ］などがあげられる。
【００３０】
【化８】
【００３１】
【化９】
【００３２】
【化１０】
【００３３】
【化１１】
【００３４】
このようなスクシンイミジルエステル基を２つ以上有する試薬による抗体の重合のメカニズムを、下記式（化１２）から下記式（化１５）に基づき説明する。
【００３５】
まず、下記式（化１２）に示すように、抗体に対し、スクシンイミジルエステル基を２つ以上有する試薬を配合すると、下記式（化１３）に示すように、前記試薬の一つのスクシンイミジルエステル基のエステル結合部分に、抗体のアミノ基が接近する。
【００３６】
【化１２】
【００３７】
【化１３】
【００３８】
そして、下記式（化１４）に示すように、前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応し、前記アミノ基から水素原子が一個奪われて前記スクシンイミジルエステル基からスクシンイミドがヒドロキシスクシンイミドとなって脱離する。これと同時に、前記スクシンイミジルエステル基の残りの部分と前記水素原子が一個奪われたアミノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によって前記試薬と前記抗体とが結合する。
【００３９】
【化１４】
【００４０】
そして、前記試薬の他のスクシンイミジルエステル基においても前記と同様の反応が起き、下記式（化１５）に示すように、前記試薬と他の抗体とがアミド結合により結合する。この反応を繰り返すことにより抗体が重合される。
【００４１】
【化１５】
【００４２】
本発明の色素標識重合抗体は、例えば、ＰＢＳ中にマウスＩｇＧを溶解させ、これに１００等量モルのＤＴＳＳＰを加えて前記マウスＩｇＧを重合し、この溶液に、前記式（化１）で示されるシアニン系色素のＰＢＳ溶液を加え、４〜３０℃で一晩撹拌することによって得ることができる。
【００４３】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、この実施例での前記式（化１）、前記式（化２）、前記式（化６）および前記式（化７）において、Ｘはヨウ素、Ｍはカリウム、ｎは２である。また、抗体としてマウスＩｇＧを用いた。
【００４４】
（１） シアニン系色素の合成
まず、前記式（化３）に示す合成経路により前記式（化１）に示すシアニン系色素を以下に示すようにして合成した。
【００４５】
▲１▼ （インドレニウムスルホネートの合成）
ヒドラジノベンゼンスルホン酸１０ｇ（５３ｍｍｏｌ）とイソプロピルメチルケトン１６．８ｍｌ（１６０ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの酢酸に溶解し、３時間還流した。反応液を０℃に冷却し１時間放置した後、生じた固体を濾過して取り出した。得られた固体をエーテルで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して１１．８ｇのインドレニウムスルホネートを得た。収率は９３％であった。下記表１に、インドレニウムスルホネートのジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）中での核磁気共鳴（ＮＭＲ）のケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
▲２▼ （インドレニウムスルホネートカリウム塩の合成）
前記▲１▼で合成した１１．８ｇのインドレニウムスルホネート（４９ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのメタノールに溶解し、これに水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコール約３００ｍｌを加えて撹拌した。生じた淡黄色の固体を濾過して取り出し、イソプロピルアルコールで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して７．４ｇのインドレニウムスルホネートカリウム塩を得た。収率は５５％であった。下記表２に、インドレニウムスルホネートカリウム塩のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
▲３▼ （カルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩の合成）
前記▲２▼で合成した５．５ｇ（２０ｍｍｏｌ）のインドレニウムスルホネートカリウム塩と５ｇ（２５ｍｍｏｌ）のヨードプロピオン酸とを５０ｍｌのオルトジクロルベンゼン中に懸濁し、アルゴン気流下、１１０℃で１２時間撹拌した。反応当初の懸濁液は加熱後、約３０分で溶解し溶液となった。１２時間後、反応液を室温まで冷却し上澄み液を取り除いた後、残った淡赤色の固体をイソプロピルアルコールで数回洗浄した。その後、エーテルで２回洗浄して減圧下で乾燥し、８．９ｇのカルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を得た。収率は９３％であった。下記表３に、カルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
▲４▼ （カルボン酸誘導体の合成）
前記▲３▼で合成した５ｇ（１１ｍｍｏｌ）のカルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を２０ｍｌのピリジンに溶解し、アルゴン気流下で還流しながら、３．１ｇ（２１ｍｍｏｌ）のオルトギ酸エチルを１５分間にわたってゆっくりと滴下した。滴下後、２時間還流を続け、室温まで冷却した。反応液に８０ｍｌのエーテルを加えて固化させた後、上澄み液を取り除いた。得られた赤褐色の固体を１０ｍｌのメタノールに溶解し、これに約２００ｍｌのエーテルを撹拌しながら加えて再び固化させた。固体を濾過して取り出し、エーテルで洗浄した後、減圧下で乾燥して２．５ｇのカルボン酸誘導体を得た。収率は２９％であった。下記表４に、カルボン酸誘導体のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００５２】
【表４】
【００５３】
▲５▼ （シアニン系色素の合成）
前記▲４▼で合成した１ｇ（１．２ｍｍｏｌ）のカルボン酸誘導体と０．２８ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のヒドロキシコハク酸イミドとを２０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、０℃で撹拌しながら０．４９ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドのジメチルホルムアミド溶液５ｍｌをゆっくりと滴下した。室温に戻して一晩撹拌した後、生じた沈殿を濾過して除いた。濾液に約３００ｍｌのエーテルを加え、生じた赤褐色の固体を濾過して取り出し、エーテルで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して０．６８ｇの前記式（１）で示されるシアニン系色素（以下「ＩＣ３−ＯＳｕ」という）を得た。収率は５５％であった。表５にＤＭＳＯ中でのＩＣ３−ＯＳｕのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００５４】
【表５】
【００５５】
（２） マウスＩｇＧの重合
１０ｍｇ（６．６６７×１０−５ｍｍｏｌ）のマウスＩｇＧを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら４．０５７ｍｇ（０．００６６６７ｍｍｏｌ、１００等量）のＤＴＳＳＰ（ピアス社製）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを滴下した。３５℃で３０分間撹拌した後、セファデックスＧ２５Ｍカラム（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過し約６ｍｌの多量化ＩｇＧ（ＩｇＧａｇｇ．）のＰＢＳ溶液を得た。得られた溶液の濃度を、つぎのようにして求めた。
【００５６】
得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２８０ｎｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は２．４３であった。観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するものであるので、ＩｇＧの濃度［ＩｇＧａｇｇ．］は、下記式（数１）に示すようにして求めることができる。ただし、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．０９９×１０５ とした。
【００５７】
（３） 重合抗体の色素標識
（１）で得られたＩＣ３−ＯＳｕを０．２ｍｌのＰＢＳに溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以下「ＳＬＩＣ３」という）２７．５ｍｇを調製した。そして、ＳＬＩＣ３を、（１）で得られたＩｇＧａｇｇ．溶液（総抗体量を１０ｍｇとする）にゆっくりと滴下した。その後、これを４℃で２０時間静置した後、未反応の色素分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析して、約６ｍｌのＳＬＩＣ３標識重合抗体のＰＢＳ溶液を得た。
【００５８】
得られたＳＬＩＣ３標識重合抗体の、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を、つぎのようにして求めた。まず、得られた溶液の２８０ｎｍ及び５５０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、吸光度はそれぞれ６．７８および３８．１であった。重合抗体は５５０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光は結合したＳＬＩＣ３に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は、下記式（数２）に示す通りである。ただし、ＳＬＩＣ３の５５０ｎｍにおけるモル吸光係数を８．５５×１０４ とした。
【００５９】
また、観測された２８０ｎｍの吸光は重合抗体に由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ３が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いて重合抗体の濃度［ＩｇＧａｇｇ．］を求めると下記式（数３）および（数４）に示すようになる。ただし、重合抗体に由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，ＩｇＧとし、ＳＬＩＣ３の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を９．８×１０３ 、重合抗体の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．０９９×１０５ とする。
【００６０】
従って、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ３の分子数は、下記式（数５）に示すようになる。
【００６１】
（４） 色素標識重合マウスＩｇＧの評価
得られた色素標識重合マウスＩｇＧを免疫クロマトセンサーに用い、色素標識重合抗体の凝集による発色度（感度）を５５０ｎｍにおける吸光度の測定により調べた。なお、比較例として、抗体を重合しなかった以外は、前記と同様の方法により、色素標識抗体を作製し、これについて、その凝集による発色度（感度）を５５０ｎｍにおける吸光度の測定により調べた。その結果、本発明の実施例の色素標識重合抗体の吸光度は約０．８であり、比較例の色素標識抗体の吸光度は約０．０７であった。この結果から、本発明の実施例の色素標識重合抗体の感度は、比較例の感度の約１０倍であるといえる。なお、この評価において、免疫クロマトセンサーの構成および前記吸光度の測定はつぎのとおりである。
【００６２】
（免疫クロマトセンサーの構成）
免疫クロマトセンサーの構成の概略を、図１の斜視図に示す。図示のように、この免疫クロマトセンサー１は、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニル）製の板状支持体２の上に、第１のガラスろ紙、ニトロセルロース製の抗体固定用膜６、第２のガラスろ紙が、この順序で、配置されている。そして、前記第１のガラスろ紙の前記抗体固定用膜６に接しない側の端部（図において左側端部）が採水部３であり、前記抗体固定用膜６に接する側の端部には色素標識重合抗体を含浸させてあり、この部分が標識抗体部４となっている。なお、比較例では、前記標識抗体部４に、重合していない色素標識抗体を用いている。そして、前記抗体固定用膜６の所定の場所に、前記標識抗体と同じ抗原と反応する抗体が吸着により固定化され抗体固定化部５となっている。また、第２のガラスろ紙は吸水部７となっている。
【００６３】
（吸光度の測定）
この、センサー１を用いての吸光度の測定は、例えば、つぎのようにして行われる。採水部３に、尿等のサンプルを供給すると、クロマトグラフィーの原理により、同図中の矢印Ａで示すように、前記サンプルが、吸水部７に向かって移動する。そして、このサンプルの移動の際に、まず、標識抗体部４において、サンプル中の抗原に標識抗体が結合する。そして、この標識抗体が結合した抗原は、サンプルとともに抗体固定化部５に移動し、ここで固定化抗体と結合し、ここに固定される。そして、前記抗体固定化部５に、所定波長（例えば、５５０ｎｍ）の光Ｌ１を照射し、その反射光Ｌ２を測定することにより、吸光度が測定できる。
【００６４】
【発明の効果】
以上のように、本発明の色素標識重合抗体は、抗原との反応部位を多数有しているため、高感度のものである。したがって、例えば、本発明の色素標識重合抗体を免疫クロマトグラフィーを利用したセンサーに導入することによって、従来法で作製した標識抗体を用いたときよりも高感度のセンサーを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例における免疫クロマトセンサーの構成の概略を示す斜視図である。
【符号の説明】
１ 免疫クロマトセンサー
２ 板状支持体
３ 採水部
４ 標識抗体部
５ 抗体固定化部
６ 抗体固定化用膜
７ 吸水部
Ａ サンプルの移動方向
Ｌ１ 照射光
Ｌ２ 反射光
【発明の属する技術分野】
本発明は、シアニン系色素で標識された重合抗体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、色素標識抗体は、その反応特異性を利用して免疫クロマトグラフィー等の分析に使用されている。抗体を標識する色素としては、反応性に富む官能基を有するシアニン系色素がしばしば使用されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＶＯＬ．４ Ｎｏ．２ ｐｐ１０５−１１１ １９９３）。このようなシアニン系色素は、その官能基が抗体のアミノ基あるいはカルボキシル基と反応して共有結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色素が結合する。このようにして作製された色素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば、免疫クロマトグラフィーに適用され、妊婦の尿中にのみ存在するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）等の微量成分の検出が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の色素標識抗体では検出レベルに限界があり、検出対象物が低濃度である場合は、その検出が困難であった。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、検出対象物が低濃度であっても、その検出が可能な高感度の色素標識重合抗体を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の色素標識重合抗体は、多官能性試薬により抗体が重合され、この重合抗体がシアニン系色素により標識されている。
【０００６】
すなわち、従来の色素標識抗体は、抗原に結合する部位が２か所しかないため、その感度に限度があった。しかし、本発明の色素標識重合抗体は、抗体が重合しているため、抗原に結合する部位も多数有し、感度が極めて優れるものである。したがって、本発明の色素標識重合抗体を、例えば、免疫クロマトグラフィーに用いれば、低濃度であっても、分析対象物を高感度で検出できる。また、その高感度から、本発明の色素標識重合抗体は、バイオセンサーにも適用可能である。
【０００７】
本発明において用いる抗体は、特に制限されず、その由来やサブクラス等に関係なく使用できる。例えば、本発明に用いることができる抗体（イムノグロブリン、Ｉｇ）としては、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ラビットＩｇＧ、ラビットＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ，ヒツジＩｇＭ等があげられる。これらの抗体は、市販品として入手しても、直接その動物から採取してもよい。
【０００８】
前記多官能性試薬としては、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）［ＤＴＳＳＰ］が好ましい。
【０００９】
前記シアニン系色素は、前記式（化１）で示されるシアニン系色素が好ましい。この色素は、肉眼で確認することが容易な赤色系統の色素だからである。しかし、機械で確認するセンサー等の場合は、他の色系統の色素であってもよい。
【００１０】
前記式（化１）において、Ｘで示されるハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、Ｍで示される金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウムがあげられる。
【００１１】
そして、本発明の色素標識重合抗体では、重合抗体と前記式（化１）で示されるシアニン系色素の色素骨格とが、共有結合により結合していることが好ましい。前記共有結合は、前記シアニン系色素のスクシンイミジル基と抗体のアミノ基との反応による共有結合が一般的である。
【００１２】
本発明の色素標識重合抗体において、抗体の重合度は、通常、２〜５０の範囲である。
【００１３】
つぎに、本発明の色素標識重合抗体の製造方法は、ｐＨが中性または弱アルカリ領域の緩衝液中で多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程と、この緩衝液中にシアニン系色素を添加して前記重合された抗体を標識する工程とを含む方法である。
【００１４】
前記緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）が好ましい。前記緩衝液のｐＨは、通常、７．０〜８．０の範囲である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
前記シアニン系色素は、例えば、下記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体を有機溶媒中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸イミドを加えて撹拌することによって作製できる。
【００１６】
【化２】
下記式（化３）に、前記式（化１）で示されるシアニン系色素の合成経路の一例を示し、以下にその各合成反応について説明する。
【００１８】
【化３】
まず、下記式（化５）で示されるインドレニウムスルホネートは、下記式（化４）で示されるヒドラジノベンゼンスルホン酸と０．５〜２モル比のイソプロピルメチルケトンとを、酸性溶媒、例えば酢酸に溶解し、約７０〜１３０℃で１〜５時間加熱することによって得ることができる。
【００２０】
【化４】
【化５】
下記式（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの金属塩は、例えば前記式（化５）で示されるインドレニウムスルホネートのアルコール溶液、例えばメタノール溶液に、例えば水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコールを加えることによって、カリウム塩として得ることができる。
【００２３】
【化６】
下記式（化７）で示されるカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩は、前記式（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカリウム塩の有機溶媒溶液、例えばオルトジクロルベンゼン溶液に、等モルのハロゲン化アルキル酸、例えばヨードプロピオン酸を加え、約８０〜１３０℃で２〜１２時間加熱することにより、カルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩として得ることができる。ここでハロゲン化アルキル酸の炭素数は、水に対しての溶解性を考え、１〜４が好ましい。特に炭素数３のヨードプロピオン酸は、水溶性およびインドレニンへの反応性に富んでいるため有用である。
【００２５】
【化７】
前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体は、前記式（化７）で示されるカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカルボキシエチルインドレニウムスルホネートのカリウム塩と０．５〜２モル比のオルトギ酸エチルとを塩基性有機溶媒、例えばピリジンに溶解し、約８０〜１２０℃で１〜３時間加熱することによって、プロピオン酸誘導体として得ることができる。
【００２７】
そして、前記式（化１）で示されるシアニン系色素は、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体の有機溶媒溶液、例えばジメチルホルムアミド溶液中に、０．５〜２モル比のヒドロキシコハク酸イミドと、縮合剤として０．５〜２モル比のジシクロヘキシルカルボジイミドとを加えて、２〜１２時間撹拌することにより得ることができる。
【００２８】
なお、前記式（化１）、前記式（化２）および前記式（化７）で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、前記式（化１）、前記式（化２）、前記式（化６）および前記式（化７）で示される各化合物に含まれる金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などがあげられる。
【００２９】
つぎに、本発明において使用される多官能性試薬は、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、スクシンイミジルエステル基）を同一分子内に２つ以上有する試薬があげられる。例えば、前記ＤＴＳＳＰの他に、下記式（化８）に示すビス（スルホスクシンイミジル）スベレート［ＢＳ３ ］、下記式（化９）に示すジスクシンイミジルタートレート［ＤＳＴ］、下記式（化１０）に示すエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）［ＥＧＳ］、下記式（化１１）に示すＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピレート［ＳＰＤＰ］などがあげられる。
【００３０】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
このようなスクシンイミジルエステル基を２つ以上有する試薬による抗体の重合のメカニズムを、下記式（化１２）から下記式（化１５）に基づき説明する。
【００３５】
まず、下記式（化１２）に示すように、抗体に対し、スクシンイミジルエステル基を２つ以上有する試薬を配合すると、下記式（化１３）に示すように、前記試薬の一つのスクシンイミジルエステル基のエステル結合部分に、抗体のアミノ基が接近する。
【００３６】
【化１２】
【化１３】
そして、下記式（化１４）に示すように、前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応し、前記アミノ基から水素原子が一個奪われて前記スクシンイミジルエステル基からスクシンイミドがヒドロキシスクシンイミドとなって脱離する。これと同時に、前記スクシンイミジルエステル基の残りの部分と前記水素原子が一個奪われたアミノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によって前記試薬と前記抗体とが結合する。
【００３９】
【化１４】
そして、前記試薬の他のスクシンイミジルエステル基においても前記と同様の反応が起き、下記式（化１５）に示すように、前記試薬と他の抗体とがアミド結合により結合する。この反応を繰り返すことにより抗体が重合される。
【００４１】
【化１５】
本発明の色素標識重合抗体は、例えば、ＰＢＳ中にマウスＩｇＧを溶解させ、これに１００等量モルのＤＴＳＳＰを加えて前記マウスＩｇＧを重合し、この溶液に、前記式（化１）で示されるシアニン系色素のＰＢＳ溶液を加え、４〜３０℃で一晩撹拌することによって得ることができる。
【００４３】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、この実施例での前記式（化１）、前記式（化２）、前記式（化６）および前記式（化７）において、Ｘはヨウ素、Ｍはカリウム、ｎは２である。また、抗体としてマウスＩｇＧを用いた。
【００４４】
（１） シアニン系色素の合成
まず、前記式（化３）に示す合成経路により前記式（化１）に示すシアニン系色素を以下に示すようにして合成した。
【００４５】
▲１▼ （インドレニウムスルホネートの合成）
ヒドラジノベンゼンスルホン酸１０ｇ（５３ｍｍｏｌ）とイソプロピルメチルケトン１６．８ｍｌ（１６０ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの酢酸に溶解し、３時間還流した。反応液を０℃に冷却し１時間放置した後、生じた固体を濾過して取り出した。得られた固体をエーテルで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して１１．８ｇのインドレニウムスルホネートを得た。収率は９３％であった。下記表１に、インドレニウムスルホネートのジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）中での核磁気共鳴（ＮＭＲ）のケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００４６】
【表１】
▲２▼ （インドレニウムスルホネートカリウム塩の合成）
前記▲１▼で合成した１１．８ｇのインドレニウムスルホネート（４９ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのメタノールに溶解し、これに水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコール約３００ｍｌを加えて撹拌した。生じた淡黄色の固体を濾過して取り出し、イソプロピルアルコールで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して７．４ｇのインドレニウムスルホネートカリウム塩を得た。収率は５５％であった。下記表２に、インドレニウムスルホネートカリウム塩のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００４８】
【表２】
▲３▼ （カルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩の合成）
前記▲２▼で合成した５．５ｇ（２０ｍｍｏｌ）のインドレニウムスルホネートカリウム塩と５ｇ（２５ｍｍｏｌ）のヨードプロピオン酸とを５０ｍｌのオルトジクロルベンゼン中に懸濁し、アルゴン気流下、１１０℃で１２時間撹拌した。反応当初の懸濁液は加熱後、約３０分で溶解し溶液となった。１２時間後、反応液を室温まで冷却し上澄み液を取り除いた後、残った淡赤色の固体をイソプロピルアルコールで数回洗浄した。その後、エーテルで２回洗浄して減圧下で乾燥し、８．９ｇのカルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を得た。収率は９３％であった。下記表３に、カルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００５０】
【表３】
▲４▼ （カルボン酸誘導体の合成）
前記▲３▼で合成した５ｇ（１１ｍｍｏｌ）のカルボキシエチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を２０ｍｌのピリジンに溶解し、アルゴン気流下で還流しながら、３．１ｇ（２１ｍｍｏｌ）のオルトギ酸エチルを１５分間にわたってゆっくりと滴下した。滴下後、２時間還流を続け、室温まで冷却した。反応液に８０ｍｌのエーテルを加えて固化させた後、上澄み液を取り除いた。得られた赤褐色の固体を１０ｍｌのメタノールに溶解し、これに約２００ｍｌのエーテルを撹拌しながら加えて再び固化させた。固体を濾過して取り出し、エーテルで洗浄した後、減圧下で乾燥して２．５ｇのカルボン酸誘導体を得た。収率は２９％であった。下記表４に、カルボン酸誘導体のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００５２】
【表４】
▲５▼ （シアニン系色素の合成）
前記▲４▼で合成した１ｇ（１．２ｍｍｏｌ）のカルボン酸誘導体と０．２８ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のヒドロキシコハク酸イミドとを２０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、０℃で撹拌しながら０．４９ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドのジメチルホルムアミド溶液５ｍｌをゆっくりと滴下した。室温に戻して一晩撹拌した後、生じた沈殿を濾過して除いた。濾液に約３００ｍｌのエーテルを加え、生じた赤褐色の固体を濾過して取り出し、エーテルで２回洗浄した後、減圧下で乾燥して０．６８ｇの前記式（１）で示されるシアニン系色素（以下「ＩＣ３−ＯＳｕ」という）を得た。収率は５５％であった。表５にＤＭＳＯ中でのＩＣ３−ＯＳｕのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００５４】
【表５】
（２） マウスＩｇＧの重合
１０ｍｇ（６．６６７×１０−５ｍｍｏｌ）のマウスＩｇＧを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら４．０５７ｍｇ（０．００６６６７ｍｍｏｌ、１００等量）のＤＴＳＳＰ（ピアス社製）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを滴下した。３５℃で３０分間撹拌した後、セファデックスＧ２５Ｍカラム（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過し約６ｍｌの多量化ＩｇＧ（ＩｇＧａｇｇ．）のＰＢＳ溶液を得た。得られた溶液の濃度を、つぎのようにして求めた。
【００５６】
得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２８０ｎｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は２．４３であった。観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するものであるので、ＩｇＧの濃度［ＩｇＧａｇｇ．］は、下記式（数１）に示すようにして求めることができる。ただし、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．０９９×１０５ とした。
（３） 重合抗体の色素標識
（１）で得られたＩＣ３−ＯＳｕを０．２ｍｌのＰＢＳに溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以下「ＳＬＩＣ３」という）２７．５ｍｇを調製した。そして、ＳＬＩＣ３を、（１）で得られたＩｇＧａｇｇ．溶液（総抗体量を１０ｍｇとする）にゆっくりと滴下した。その後、これを４℃で２０時間静置した後、未反応の色素分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析して、約６ｍｌのＳＬＩＣ３標識重合抗体のＰＢＳ溶液を得た。
【００５８】
得られたＳＬＩＣ３標識重合抗体の、ＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を、つぎのようにして求めた。まず、得られた溶液の２８０ｎｍ及び５５０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、吸光度はそれぞれ６．７８および３８．１であった。重合抗体は５５０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光は結合したＳＬＩＣ３に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ３の濃度［ＳＬＩＣ３］は、下記式（数２）に示す通りである。ただし、ＳＬＩＣ３の５５０ｎｍにおけるモル吸光係数を８．５５×１０４ とした。
また、観測された２８０ｎｍの吸光は重合抗体に由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ３が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いて重合抗体の濃度［ＩｇＧａｇｇ．］を求めると下記式（数３）および（数４）に示すようになる。ただし、重合抗体に由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，ＩｇＧとし、ＳＬＩＣ３の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を９．８×１０３ 、重合抗体の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．０９９×１０５ とする。
従って、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ３の分子数は、下記式（数５）に示すようになる。
（４） 色素標識重合マウスＩｇＧの評価
得られた色素標識重合マウスＩｇＧを免疫クロマトセンサーに用い、色素標識重合抗体の凝集による発色度（感度）を５５０ｎｍにおける吸光度の測定により調べた。なお、比較例として、抗体を重合しなかった以外は、前記と同様の方法により、色素標識抗体を作製し、これについて、その凝集による発色度（感度）を５５０ｎｍにおける吸光度の測定により調べた。その結果、本発明の実施例の色素標識重合抗体の吸光度は約０．８であり、比較例の色素標識抗体の吸光度は約０．０７であった。この結果から、本発明の実施例の色素標識重合抗体の感度は、比較例の感度の約１０倍であるといえる。なお、この評価において、免疫クロマトセンサーの構成および前記吸光度の測定はつぎのとおりである。
【００６２】
（免疫クロマトセンサーの構成）
免疫クロマトセンサーの構成の概略を、図１の斜視図に示す。図示のように、この免疫クロマトセンサー１は、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニル）製の板状支持体２の上に、第１のガラスろ紙、ニトロセルロース製の抗体固定用膜６、第２のガラスろ紙が、この順序で、配置されている。そして、前記第１のガラスろ紙の前記抗体固定用膜６に接しない側の端部（図において左側端部）が採水部３であり、前記抗体固定用膜６に接する側の端部には色素標識重合抗体を含浸させてあり、この部分が標識抗体部４となっている。なお、比較例では、前記標識抗体部４に、重合していない色素標識抗体を用いている。そして、前記抗体固定用膜６の所定の場所に、前記標識抗体と同じ抗原と反応する抗体が吸着により固定化され抗体固定化部５となっている。また、第２のガラスろ紙は吸水部７となっている。
【００６３】
（吸光度の測定）
この、センサー１を用いての吸光度の測定は、例えば、つぎのようにして行われる。採水部３に、尿等のサンプルを供給すると、クロマトグラフィーの原理により、同図中の矢印Ａで示すように、前記サンプルが、吸水部７に向かって移動する。そして、このサンプルの移動の際に、まず、標識抗体部４において、サンプル中の抗原に標識抗体が結合する。そして、この標識抗体が結合した抗原は、サンプルとともに抗体固定化部５に移動し、ここで固定化抗体と結合し、ここに固定される。そして、前記抗体固定化部５に、所定波長（例えば、５５０ｎｍ）の光Ｌ１を照射し、その反射光Ｌ２を測定することにより、吸光度が測定できる。
【００６４】
【発明の効果】
以上のように、本発明の色素標識重合抗体は、抗原との反応部位を多数有しているため、高感度のものである。したがって、例えば、本発明の色素標識重合抗体を免疫クロマトグラフィーを利用したセンサーに導入することによって、従来法で作製した標識抗体を用いたときよりも高感度のセンサーを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例における免疫クロマトセンサーの構成の概略を示す斜視図である。
【符号の説明】
１ 免疫クロマトセンサー
２ 板状支持体
３ 採水部
４ 標識抗体部
５ 抗体固定化部
６ 抗体固定化用膜
７ 吸水部
Ａ サンプルの移動方向
Ｌ１ 照射光
Ｌ２ 反射光
Claims (8)
- 多官能性試薬により抗体が重合され、この重合抗体がシアニン系色素により標識された色素標識重合抗体。
- 多官能性試薬が、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）である請求項１記載の色素標識重合抗体。
- シアニン系色素が、下記式（化１）で示されるシアニン系色素である請求項１記載の色素標識重合抗体。
- 重合抗体とシアニン系色素の色素骨格とが共有結合により結合している請求項３記載の色素標識重合抗体。
- ｐＨが中性または弱アルカリ性領域の緩衝液中で多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程と、この緩衝液中にシアニン系色素を添加して前記重合された抗体を標識する工程とを含む色素標識重合抗体の製造方法。
- 多官能性試薬が、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）である請求項５記載の色素標識重合抗体の製造方法。
- シアニン系色素が、前記式（化１）で示されるシアニン系色素である請求項５記載の色素標識重合抗体の製造方法。
- 緩衝液がリン酸緩衝液である請求項５記載の色素標識重合抗体の製造方法。
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