JPH09325147A - 色素標識重合抗体およびその製造方法 - Google Patents
色素標識重合抗体およびその製造方法Info
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- JPH09325147A JPH09325147A JP9078104A JP7810497A JPH09325147A JP H09325147 A JPH09325147 A JP H09325147A JP 9078104 A JP9078104 A JP 9078104A JP 7810497 A JP7810497 A JP 7810497A JP H09325147 A JPH09325147 A JP H09325147A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多官能性試薬により抗体を重合し、この重合
抗体をシアニン系色素で標識することにより、高い感度
の色素標識重合抗体を提供する。 【解決手段】 ＰＢＳ中で、ＤＴＳＳＰを用いて抗体
（マウスＩｇＧ等）を重合して重合抗体を調製し、これ
に、下記式（化１）で示されるシアニン系色素を加えて
撹拌することによって色素標識重合抗体が得られる。こ
の色素標識重合抗体は、抗原との反応部位が多数あるた
め、従来の色素標識抗体に比べ高感度である。 【化１】
抗体をシアニン系色素で標識することにより、高い感度
の色素標識重合抗体を提供する。 【解決手段】 ＰＢＳ中で、ＤＴＳＳＰを用いて抗体
（マウスＩｇＧ等）を重合して重合抗体を調製し、これ
に、下記式（化１）で示されるシアニン系色素を加えて
撹拌することによって色素標識重合抗体が得られる。こ
の色素標識重合抗体は、抗原との反応部位が多数あるた
め、従来の色素標識抗体に比べ高感度である。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シアニン系色素で
標識された重合抗体およびその製造方法に関する。
標識された重合抗体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、色素標識抗体は、その反応特
異性を利用して免疫クロマトグラフィー等の分析に使用
されている。抗体を標識する色素としては、反応性に富
む官能基を有するシアニン系色素がしばしば使用されて
いる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ＶＯＬ．４ Ｎｏ．２ ｐｐ１０５−１１１ １９９
３）。このようなシアニン系色素は、その官能基が抗体
のアミノ基あるいはカルボキシル基と反応して共有結合
し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色素が
結合する。このようにして作製された色素標識抗体は、
一般に視認性がよく、例えば、免疫クロマトグラフィー
に適用され、妊婦の尿中にのみ存在するヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（ｈＣＧ）等の微量成分の検出が行われてい
る。
異性を利用して免疫クロマトグラフィー等の分析に使用
されている。抗体を標識する色素としては、反応性に富
む官能基を有するシアニン系色素がしばしば使用されて
いる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ＶＯＬ．４ Ｎｏ．２ ｐｐ１０５−１１１ １９９
３）。このようなシアニン系色素は、その官能基が抗体
のアミノ基あるいはカルボキシル基と反応して共有結合
し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色素が
結合する。このようにして作製された色素標識抗体は、
一般に視認性がよく、例えば、免疫クロマトグラフィー
に適用され、妊婦の尿中にのみ存在するヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（ｈＣＧ）等の微量成分の検出が行われてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の色素標
識抗体では検出レベルに限界があり、検出対象物が低濃
度である場合は、その検出が困難であった。
識抗体では検出レベルに限界があり、検出対象物が低濃
度である場合は、その検出が困難であった。
【０００４】したがって、本発明の目的は、検出対象物
が低濃度であっても、その検出が可能な高感度の色素標
識重合抗体を提供することである。
が低濃度であっても、その検出が可能な高感度の色素標
識重合抗体を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の色素標識重合抗体は、多官能性試薬により
抗体が重合され、この重合抗体がシアニン系色素により
標識されている。
に、本発明の色素標識重合抗体は、多官能性試薬により
抗体が重合され、この重合抗体がシアニン系色素により
標識されている。
【０００６】すなわち、従来の色素標識抗体は、抗原に
結合する部位が２か所しかないため、その感度に限度が
あった。しかし、本発明の色素標識重合抗体は、抗体が
重合しているため、抗原に結合する部位も多数有し、感
度が極めて優れるものである。したがって、本発明の色
素標識重合抗体を、例えば、免疫クロマトグラフィーに
用いれば、低濃度であっても、分析対象物を高感度で検
出できる。また、その高感度から、本発明の色素標識重
合抗体は、バイオセンサーにも適用可能である。
結合する部位が２か所しかないため、その感度に限度が
あった。しかし、本発明の色素標識重合抗体は、抗体が
重合しているため、抗原に結合する部位も多数有し、感
度が極めて優れるものである。したがって、本発明の色
素標識重合抗体を、例えば、免疫クロマトグラフィーに
用いれば、低濃度であっても、分析対象物を高感度で検
出できる。また、その高感度から、本発明の色素標識重
合抗体は、バイオセンサーにも適用可能である。
【０００７】本発明において用いる抗体は、特に制限さ
れず、その由来やサブクラス等に関係なく使用できる。
例えば、本発明に用いることができる抗体（イムノグロ
ブリン、Ｉｇ）としては、マウスＩｇＧ、マウスＩｇ
Ｍ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラッ
トＩｇＭ、ラビットＩｇＧ、ラビットＩｇＭ、ヤギＩｇ
Ｇ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ，ヒツジＩｇＭ等があげ
られる。これらの抗体は、市販品として入手しても、直
接その動物から採取してもよい。
れず、その由来やサブクラス等に関係なく使用できる。
例えば、本発明に用いることができる抗体（イムノグロ
ブリン、Ｉｇ）としては、マウスＩｇＧ、マウスＩｇ
Ｍ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラッ
トＩｇＭ、ラビットＩｇＧ、ラビットＩｇＭ、ヤギＩｇ
Ｇ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ，ヒツジＩｇＭ等があげ
られる。これらの抗体は、市販品として入手しても、直
接その動物から採取してもよい。
【０００８】前記多官能性試薬としては、ジチオビス
（スルホスクシンイミジルプロピオネート）［ＤＴＳＳ
Ｐ］が好ましい。
（スルホスクシンイミジルプロピオネート）［ＤＴＳＳ
Ｐ］が好ましい。
【０００９】前記シアニン系色素は、前記式（化１）で
示されるシアニン系色素が好ましい。この色素は、肉眼
で確認することが容易な赤色系統の色素だからである。
しかし、機械で確認するセンサー等の場合は、他の色系
統の色素であってもよい。
示されるシアニン系色素が好ましい。この色素は、肉眼
で確認することが容易な赤色系統の色素だからである。
しかし、機械で確認するセンサー等の場合は、他の色系
統の色素であってもよい。
【００１０】前記式（化１）において、Ｘで示されるハ
ロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素
があげられる。また、Ｍで示される金属としては、リチ
ウム、ナトリウム、カリウムがあげられる。
ロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素
があげられる。また、Ｍで示される金属としては、リチ
ウム、ナトリウム、カリウムがあげられる。
【００１１】そして、本発明の色素標識重合抗体では、
重合抗体と前記式（化１）で示されるシアニン系色素の
色素骨格とが、共有結合により結合していることが好ま
しい。前記共有結合は、前記シアニン系色素のスクシン
イミジル基と抗体のアミノ基との反応による共有結合が
一般的である。
重合抗体と前記式（化１）で示されるシアニン系色素の
色素骨格とが、共有結合により結合していることが好ま
しい。前記共有結合は、前記シアニン系色素のスクシン
イミジル基と抗体のアミノ基との反応による共有結合が
一般的である。
【００１２】本発明の色素標識重合抗体において、抗体
の重合度は、通常、２〜５０の範囲である。
の重合度は、通常、２〜５０の範囲である。
【００１３】つぎに、本発明の色素標識重合抗体の製造
方法は、ｐＨが中性または弱アルカリ領域の緩衝液中で
多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程と、この緩衝
液中にシアニン系色素を添加して前記重合された抗体を
標識する工程とを含む方法である。
方法は、ｐＨが中性または弱アルカリ領域の緩衝液中で
多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程と、この緩衝
液中にシアニン系色素を添加して前記重合された抗体を
標識する工程とを含む方法である。
【００１４】前記緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）が好ましい。前記緩衝液のｐＨは、通常、７．０〜
８．０の範囲である。
Ｓ）が好ましい。前記緩衝液のｐＨは、通常、７．０〜
８．０の範囲である。
【００１５】
【発明の実施の形態】前記シアニン系色素は、例えば、
下記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体を有機溶媒
中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸イミドを加えて
撹拌することによって作製できる。
下記式（化２）で示されるカルボン酸誘導体を有機溶媒
中に溶解し、これにヒドロキシコハク酸イミドを加えて
撹拌することによって作製できる。
【００１６】
【化２】
【００１７】下記式（化３）に、前記式（化１）で示さ
れるシアニン系色素の合成経路の一例を示し、以下にそ
の各合成反応について説明する。
れるシアニン系色素の合成経路の一例を示し、以下にそ
の各合成反応について説明する。
【００１８】
【化３】
【００１９】まず、下記式（化５）で示されるインドレ
ニウムスルホネートは、下記式（化４）で示されるヒド
ラジノベンゼンスルホン酸と０．５〜２モル比のイソプ
ロピルメチルケトンとを、酸性溶媒、例えば酢酸に溶解
し、約７０〜１３０℃で１〜５時間加熱することによっ
て得ることができる。
ニウムスルホネートは、下記式（化４）で示されるヒド
ラジノベンゼンスルホン酸と０．５〜２モル比のイソプ
ロピルメチルケトンとを、酸性溶媒、例えば酢酸に溶解
し、約７０〜１３０℃で１〜５時間加熱することによっ
て得ることができる。
【００２０】
【化４】
【００２１】
【化５】
【００２２】下記式（化６）で示されるインドレニウム
スルホネートの金属塩は、例えば前記式（化５）で示さ
れるインドレニウムスルホネートのアルコール溶液、例
えばメタノール溶液に、例えば水酸化カリウム飽和のイ
ソプロピルアルコールを加えることによって、カリウム
塩として得ることができる。
スルホネートの金属塩は、例えば前記式（化５）で示さ
れるインドレニウムスルホネートのアルコール溶液、例
えばメタノール溶液に、例えば水酸化カリウム飽和のイ
ソプロピルアルコールを加えることによって、カリウム
塩として得ることができる。
【００２３】
【化６】
【００２４】下記式（化７）で示されるカルボキシアル
キルインドレニウムスルホネートの金属塩は、前記式
（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの金属
塩、例えばカリウム塩の有機溶媒溶液、例えばオルトジ
クロルベンゼン溶液に、等モルのハロゲン化アルキル
酸、例えばヨードプロピオン酸を加え、約８０〜１３０
℃で２〜１２時間加熱することにより、カルボキシエチ
ルインドレニウムスルホネートカリウム塩として得るこ
とができる。ここでハロゲン化アルキル酸の炭素数は、
水に対しての溶解性を考え、１〜４が好ましい。特に炭
素数３のヨードプロピオン酸は、水溶性およびインドレ
ニンへの反応性に富んでいるため有用である。
キルインドレニウムスルホネートの金属塩は、前記式
（化６）で示されるインドレニウムスルホネートの金属
塩、例えばカリウム塩の有機溶媒溶液、例えばオルトジ
クロルベンゼン溶液に、等モルのハロゲン化アルキル
酸、例えばヨードプロピオン酸を加え、約８０〜１３０
℃で２〜１２時間加熱することにより、カルボキシエチ
ルインドレニウムスルホネートカリウム塩として得るこ
とができる。ここでハロゲン化アルキル酸の炭素数は、
水に対しての溶解性を考え、１〜４が好ましい。特に炭
素数３のヨードプロピオン酸は、水溶性およびインドレ
ニンへの反応性に富んでいるため有用である。
【００２５】
【化７】
【００２６】前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導
体は、前記式（化７）で示されるカルボキシアルキルイ
ンドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカルボキシ
エチルインドレニウムスルホネートのカリウム塩と０．
５〜２モル比のオルトギ酸エチルとを塩基性有機溶媒、
例えばピリジンに溶解し、約８０〜１２０℃で１〜３時
間加熱することによって、プロピオン酸誘導体として得
ることができる。
体は、前記式（化７）で示されるカルボキシアルキルイ
ンドレニウムスルホネートの金属塩、例えばカルボキシ
エチルインドレニウムスルホネートのカリウム塩と０．
５〜２モル比のオルトギ酸エチルとを塩基性有機溶媒、
例えばピリジンに溶解し、約８０〜１２０℃で１〜３時
間加熱することによって、プロピオン酸誘導体として得
ることができる。
【００２７】そして、前記式（化１）で示されるシアニ
ン系色素は、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導
体の有機溶媒溶液、例えばジメチルホルムアミド溶液中
に、０．５〜２モル比のヒドロキシコハク酸イミドと、
縮合剤として０．５〜２モル比のジシクロヘキシルカル
ボジイミドとを加えて、２〜１２時間撹拌することによ
り得ることができる。
ン系色素は、前記式（化２）で示されるカルボン酸誘導
体の有機溶媒溶液、例えばジメチルホルムアミド溶液中
に、０．５〜２モル比のヒドロキシコハク酸イミドと、
縮合剤として０．５〜２モル比のジシクロヘキシルカル
ボジイミドとを加えて、２〜１２時間撹拌することによ
り得ることができる。
【００２８】なお、前記式（化１）、前記式（化２）お
よび前記式（化７）で示される各化合物に含まれるハロ
ゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があ
げられる。また、前記式（化１）、前記式（化２）、前
記式（化６）および前記式（化７）で示される各化合物
に含まれる金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリ
ウム塩、カリウム塩などがあげられる。
よび前記式（化７）で示される各化合物に含まれるハロ
ゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があ
げられる。また、前記式（化１）、前記式（化２）、前
記式（化６）および前記式（化７）で示される各化合物
に含まれる金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリ
ウム塩、カリウム塩などがあげられる。
【００２９】つぎに、本発明において使用される多官能
性試薬は、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、ス
クシンイミジルエステル基）を同一分子内に２つ以上有
する試薬があげられる。例えば、前記ＤＴＳＳＰの他
に、下記式（化８）に示すビス（スルホスクシンイミジ
ル）スベレート［ＢＳ3 ］、下記式（化９）に示すジス
クシンイミジルタートレート［ＤＳＴ］、下記式（化１
０）に示すエチレングリコールビス（スクシンイミジル
スクシネート）［ＥＧＳ］、下記式（化１１）に示すＮ
−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピレート［ＳＰＤＰ］などがあげられる。
性試薬は、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、ス
クシンイミジルエステル基）を同一分子内に２つ以上有
する試薬があげられる。例えば、前記ＤＴＳＳＰの他
に、下記式（化８）に示すビス（スルホスクシンイミジ
ル）スベレート［ＢＳ3 ］、下記式（化９）に示すジス
クシンイミジルタートレート［ＤＳＴ］、下記式（化１
０）に示すエチレングリコールビス（スクシンイミジル
スクシネート）［ＥＧＳ］、下記式（化１１）に示すＮ
−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピレート［ＳＰＤＰ］などがあげられる。
【００３０】
【化８】
【００３１】
【化９】
【００３２】
【化１０】
【００３３】
【化１１】
【００３４】このようなスクシンイミジルエステル基を
２つ以上有する試薬による抗体の重合のメカニズムを、
下記式（化１２）から下記式（化１５）に基づき説明す
る。
２つ以上有する試薬による抗体の重合のメカニズムを、
下記式（化１２）から下記式（化１５）に基づき説明す
る。
【００３５】まず、下記式（化１２）に示すように、抗
体に対し、スクシンイミジルエステル基を２つ以上有す
る試薬を配合すると、下記式（化１３）に示すように、
前記試薬の一つのスクシンイミジルエステル基のエステ
ル結合部分に、抗体のアミノ基が接近する。
体に対し、スクシンイミジルエステル基を２つ以上有す
る試薬を配合すると、下記式（化１３）に示すように、
前記試薬の一つのスクシンイミジルエステル基のエステ
ル結合部分に、抗体のアミノ基が接近する。
【００３６】
【化１２】
【００３７】
【化１３】
【００３８】そして、下記式（化１４）に示すように、
前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応し、前記
アミノ基から水素原子が一個奪われて前記スクシンイミ
ジルエステル基からスクシンイミドがヒドロキシスクシ
ンイミドとなって脱離する。これと同時に、前記スクシ
ンイミジルエステル基の残りの部分と前記水素原子が一
個奪われたアミノ基とがアミド結合を形成し、このアミ
ド結合によって前記試薬と前記抗体とが結合する。
前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応し、前記
アミノ基から水素原子が一個奪われて前記スクシンイミ
ジルエステル基からスクシンイミドがヒドロキシスクシ
ンイミドとなって脱離する。これと同時に、前記スクシ
ンイミジルエステル基の残りの部分と前記水素原子が一
個奪われたアミノ基とがアミド結合を形成し、このアミ
ド結合によって前記試薬と前記抗体とが結合する。
【００３９】
【化１４】
【００４０】そして、前記試薬の他のスクシンイミジル
エステル基においても前記と同様の反応が起き、下記式
（化１５）に示すように、前記試薬と他の抗体とがアミ
ド結合により結合する。この反応を繰り返すことにより
抗体が重合される。
エステル基においても前記と同様の反応が起き、下記式
（化１５）に示すように、前記試薬と他の抗体とがアミ
ド結合により結合する。この反応を繰り返すことにより
抗体が重合される。
【００４１】
【化１５】
【００４２】本発明の色素標識重合抗体は、例えば、Ｐ
ＢＳ中にマウスＩｇＧを溶解させ、これに１００等量モ
ルのＤＴＳＳＰを加えて前記マウスＩｇＧを重合し、こ
の溶液に、前記式（化１）で示されるシアニン系色素の
ＰＢＳ溶液を加え、４〜３０℃で一晩撹拌することによ
って得ることができる。
ＢＳ中にマウスＩｇＧを溶解させ、これに１００等量モ
ルのＤＴＳＳＰを加えて前記マウスＩｇＧを重合し、こ
の溶液に、前記式（化１）で示されるシアニン系色素の
ＰＢＳ溶液を加え、４〜３０℃で一晩撹拌することによ
って得ることができる。
【００４３】
【実施例】つぎに、本発明の実施例について説明する。
なお、この実施例での前記式（化１）、前記式（化
２）、前記式（化６）および前記式（化７）において、
Ｘはヨウ素、Ｍはカリウム、ｎは２である。また、抗体
としてマウスＩｇＧを用いた。
なお、この実施例での前記式（化１）、前記式（化
２）、前記式（化６）および前記式（化７）において、
Ｘはヨウ素、Ｍはカリウム、ｎは２である。また、抗体
としてマウスＩｇＧを用いた。
【００４４】（１） シアニン系色素の合成 まず、前記式（化３）に示す合成経路により前記式（化
１）に示すシアニン系色素を以下に示すようにして合成
した。
１）に示すシアニン系色素を以下に示すようにして合成
した。
【００４５】 （インドレニウムスルホネートの合
成） ヒドラジノベンゼンスルホン酸１０ｇ（５３ｍｍｏｌ）
とイソプロピルメチルケトン１６．８ｍｌ（１６０ｍｍ
ｏｌ）を３０ｍｌの酢酸に溶解し、３時間還流した。反
応液を０℃に冷却し１時間放置した後、生じた固体を濾
過して取り出した。得られた固体をエーテルで２回洗浄
した後、減圧下で乾燥して１１．８ｇのインドレニウム
スルホネートを得た。収率は９３％であった。下記表１
に、インドレニウムスルホネートのジメチルスルフォオ
キシド（ＤＭＳＯ）中での核磁気共鳴（ＮＭＲ）のケミ
カルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
成） ヒドラジノベンゼンスルホン酸１０ｇ（５３ｍｍｏｌ）
とイソプロピルメチルケトン１６．８ｍｌ（１６０ｍｍ
ｏｌ）を３０ｍｌの酢酸に溶解し、３時間還流した。反
応液を０℃に冷却し１時間放置した後、生じた固体を濾
過して取り出した。得られた固体をエーテルで２回洗浄
した後、減圧下で乾燥して１１．８ｇのインドレニウム
スルホネートを得た。収率は９３％であった。下記表１
に、インドレニウムスルホネートのジメチルスルフォオ
キシド（ＤＭＳＯ）中での核磁気共鳴（ＮＭＲ）のケミ
カルシフトおよび各ピークの帰属を示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】 （インドレニウムスルホネートカリウ
ム塩の合成） 前記で合成した１１．８ｇのインドレニウムスルホネ
ート（４９ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのメタノールに溶解
し、これに水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコー
ル約３００ｍｌを加えて撹拌した。生じた淡黄色の固体
を濾過して取り出し、イソプロピルアルコールで２回洗
浄した後、減圧下で乾燥して７．４ｇのインドレニウム
スルホネートカリウム塩を得た。収率は５５％であっ
た。下記表２に、インドレニウムスルホネートカリウム
塩のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピ
ークの帰属を示す。
ム塩の合成） 前記で合成した１１．８ｇのインドレニウムスルホネ
ート（４９ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのメタノールに溶解
し、これに水酸化カリウム飽和のイソプロピルアルコー
ル約３００ｍｌを加えて撹拌した。生じた淡黄色の固体
を濾過して取り出し、イソプロピルアルコールで２回洗
浄した後、減圧下で乾燥して７．４ｇのインドレニウム
スルホネートカリウム塩を得た。収率は５５％であっ
た。下記表２に、インドレニウムスルホネートカリウム
塩のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピ
ークの帰属を示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】 （カルボキシエチルインドレニウムス
ルホネートカリウム塩の合成） 前記で合成した５．５ｇ（２０ｍｍｏｌ）のインドレ
ニウムスルホネートカリウム塩と５ｇ（２５ｍｍｏｌ）
のヨードプロピオン酸とを５０ｍｌのオルトジクロルベ
ンゼン中に懸濁し、アルゴン気流下、１１０℃で１２時
間撹拌した。反応当初の懸濁液は加熱後、約３０分で溶
解し溶液となった。１２時間後、反応液を室温まで冷却
し上澄み液を取り除いた後、残った淡赤色の固体をイソ
プロピルアルコールで数回洗浄した。その後、エーテル
で２回洗浄して減圧下で乾燥し、８．９ｇのカルボキシ
エチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を得た。
収率は９３％であった。下記表３に、カルボキシエチル
インドレニウムスルホネートカリウム塩のＤＭＳＯ中で
のＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示
す。
ルホネートカリウム塩の合成） 前記で合成した５．５ｇ（２０ｍｍｏｌ）のインドレ
ニウムスルホネートカリウム塩と５ｇ（２５ｍｍｏｌ）
のヨードプロピオン酸とを５０ｍｌのオルトジクロルベ
ンゼン中に懸濁し、アルゴン気流下、１１０℃で１２時
間撹拌した。反応当初の懸濁液は加熱後、約３０分で溶
解し溶液となった。１２時間後、反応液を室温まで冷却
し上澄み液を取り除いた後、残った淡赤色の固体をイソ
プロピルアルコールで数回洗浄した。その後、エーテル
で２回洗浄して減圧下で乾燥し、８．９ｇのカルボキシ
エチルインドレニウムスルホネートカリウム塩を得た。
収率は９３％であった。下記表３に、カルボキシエチル
インドレニウムスルホネートカリウム塩のＤＭＳＯ中で
のＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属を示
す。
【００５０】
【表３】
【００５１】 （カルボン酸誘導体の合成） 前記で合成した５ｇ（１１ｍｍｏｌ）のカルボキシエ
チルインドレニウムスルホネートカリウム塩を２０ｍｌ
のピリジンに溶解し、アルゴン気流下で還流しながら、
３．１ｇ（２１ｍｍｏｌ）のオルトギ酸エチルを１５分
間にわたってゆっくりと滴下した。滴下後、２時間還流
を続け、室温まで冷却した。反応液に８０ｍｌのエーテ
ルを加えて固化させた後、上澄み液を取り除いた。得ら
れた赤褐色の固体を１０ｍｌのメタノールに溶解し、こ
れに約２００ｍｌのエーテルを撹拌しながら加えて再び
固化させた。固体を濾過して取り出し、エーテルで洗浄
した後、減圧下で乾燥して２．５ｇのカルボン酸誘導体
を得た。収率は２９％であった。下記表４に、カルボン
酸誘導体のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよ
び各ピークの帰属を示す。
チルインドレニウムスルホネートカリウム塩を２０ｍｌ
のピリジンに溶解し、アルゴン気流下で還流しながら、
３．１ｇ（２１ｍｍｏｌ）のオルトギ酸エチルを１５分
間にわたってゆっくりと滴下した。滴下後、２時間還流
を続け、室温まで冷却した。反応液に８０ｍｌのエーテ
ルを加えて固化させた後、上澄み液を取り除いた。得ら
れた赤褐色の固体を１０ｍｌのメタノールに溶解し、こ
れに約２００ｍｌのエーテルを撹拌しながら加えて再び
固化させた。固体を濾過して取り出し、エーテルで洗浄
した後、減圧下で乾燥して２．５ｇのカルボン酸誘導体
を得た。収率は２９％であった。下記表４に、カルボン
酸誘導体のＤＭＳＯ中でのＮＭＲのケミカルシフトおよ
び各ピークの帰属を示す。
【００５２】
【表４】
【００５３】 （シアニン系色素の合成） 前記で合成した１ｇ（１．２ｍｍｏｌ）のカルボン酸
誘導体と０．２８ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のヒドロキシコ
ハク酸イミドとを２０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶
解し、０℃で撹拌しながら０．４９ｇ（２．４ｍｍｏ
ｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドのジメチルホル
ムアミド溶液５ｍｌをゆっくりと滴下した。室温に戻し
て一晩撹拌した後、生じた沈殿を濾過して除いた。濾液
に約３００ｍｌのエーテルを加え、生じた赤褐色の固体
を濾過して取り出し、エーテルで２回洗浄した後、減圧
下で乾燥して０．６８ｇの前記式（１）で示されるシア
ニン系色素（以下「ＩＣ３−ＯＳｕ」という）を得た。
収率は５５％であった。表５にＤＭＳＯ中でのＩＣ３−
ＯＳｕのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属
を示す。
誘導体と０．２８ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のヒドロキシコ
ハク酸イミドとを２０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶
解し、０℃で撹拌しながら０．４９ｇ（２．４ｍｍｏ
ｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドのジメチルホル
ムアミド溶液５ｍｌをゆっくりと滴下した。室温に戻し
て一晩撹拌した後、生じた沈殿を濾過して除いた。濾液
に約３００ｍｌのエーテルを加え、生じた赤褐色の固体
を濾過して取り出し、エーテルで２回洗浄した後、減圧
下で乾燥して０．６８ｇの前記式（１）で示されるシア
ニン系色素（以下「ＩＣ３−ＯＳｕ」という）を得た。
収率は５５％であった。表５にＤＭＳＯ中でのＩＣ３−
ＯＳｕのＮＭＲのケミカルシフトおよび各ピークの帰属
を示す。
【００５４】
【表５】
【００５５】（２） マウスＩｇＧの重合 １０ｍｇ（６．６６７×１０-5ｍｍｏｌ）のマウスＩｇ
Ｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら４．
０５７ｍｇ（０．００６６６７ｍｍｏｌ、１００等量）
のＤＴＳＳＰ（ピアス社製）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを
滴下した。３５℃で３０分間撹拌した後、セファデック
スＧ２５Ｍカラム（ファルマシア社製）を用いてゲル濾
過し約６ｍｌの多量化ＩｇＧ（ＩｇＧａｇｇ．）のＰＢ
Ｓ溶液を得た。得られた溶液の濃度を、つぎのようにし
て求めた。
Ｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら４．
０５７ｍｇ（０．００６６６７ｍｍｏｌ、１００等量）
のＤＴＳＳＰ（ピアス社製）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを
滴下した。３５℃で３０分間撹拌した後、セファデック
スＧ２５Ｍカラム（ファルマシア社製）を用いてゲル濾
過し約６ｍｌの多量化ＩｇＧ（ＩｇＧａｇｇ．）のＰＢ
Ｓ溶液を得た。得られた溶液の濃度を、つぎのようにし
て求めた。
【００５６】得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２８０ｎ
ｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は２．４３であっ
た。観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するも
のであるので、ＩｇＧの濃度［ＩｇＧａｇｇ．］は、下
記式（数１）に示すようにして求めることができる。た
だし、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．
０９９×１０5 とした。 （数１）
ｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は２．４３であっ
た。観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するも
のであるので、ＩｇＧの濃度［ＩｇＧａｇｇ．］は、下
記式（数１）に示すようにして求めることができる。た
だし、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．
０９９×１０5 とした。 （数１）
【００５７】（３） 重合抗体の色素標識 （１）で得られたＩＣ３−ＯＳｕを０．２ｍｌのＰＢＳ
に溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液
（以下「ＳＬＩＣ３」という）２７．５ｍｇを調製し
た。そして、ＳＬＩＣ３を、（１）で得られたＩｇＧａ
ｇｇ．溶液（総抗体量を１０ｍｇとする）にゆっくりと
滴下した。その後、これを４℃で２０時間静置した後、
未反応の色素分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａ
ｚに対して透析して、約６ｍｌのＳＬＩＣ３標識重合抗
体のＰＢＳ溶液を得た。
に溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液
（以下「ＳＬＩＣ３」という）２７．５ｍｇを調製し
た。そして、ＳＬＩＣ３を、（１）で得られたＩｇＧａ
ｇｇ．溶液（総抗体量を１０ｍｇとする）にゆっくりと
滴下した。その後、これを４℃で２０時間静置した後、
未反応の色素分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａ
ｚに対して透析して、約６ｍｌのＳＬＩＣ３標識重合抗
体のＰＢＳ溶液を得た。
【００５８】得られたＳＬＩＣ３標識重合抗体の、Ｉｇ
Ｇ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を、つぎのように
して求めた。まず、得られた溶液の２８０ｎｍ及び５５
０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、吸光度はそれぞ
れ６．７８および３８．１であった。重合抗体は550ｎ
ｍに吸収を持たないので、観測された吸光は結合したＳ
ＬＩＣ３に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ
３の濃度［ＳＬＩＣ３］は、下記式（数２）に示す通り
である。ただし、ＳＬＩＣ３の５５０ｎｍにおけるモル
吸光係数を８．５５×１０4 とした。 （数２）
Ｇ１分子あたりのＳＬＩＣ３の分子数を、つぎのように
して求めた。まず、得られた溶液の２８０ｎｍ及び５５
０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、吸光度はそれぞ
れ６．７８および３８．１であった。重合抗体は550ｎ
ｍに吸収を持たないので、観測された吸光は結合したＳ
ＬＩＣ３に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ
３の濃度［ＳＬＩＣ３］は、下記式（数２）に示す通り
である。ただし、ＳＬＩＣ３の５５０ｎｍにおけるモル
吸光係数を８．５５×１０4 とした。 （数２）
【００５９】また、観測された２８０ｎｍの吸光は重合
抗体に由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ３
が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引い
て重合抗体の濃度［ＩｇＧａｇｇ．］を求めると下記式
（数３）および（数４）に示すようになる。ただし、重
合抗体に由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，Ｉ
ｇＧとし、ＳＬＩＣ３の２８０ｎｍにおけるモル吸光係
数を９．８×１０3 、重合抗体の２８０ｎｍにおけるモ
ル吸光係数を２．０９９×１０5 とする。 （数３） Ａｂ２８０，ＩｇＧ＝６．７８−(４．４６×１０-4×９．８×１０3 ) ＝２．４１ （数４）
抗体に由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ３
が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引い
て重合抗体の濃度［ＩｇＧａｇｇ．］を求めると下記式
（数３）および（数４）に示すようになる。ただし、重
合抗体に由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，Ｉ
ｇＧとし、ＳＬＩＣ３の２８０ｎｍにおけるモル吸光係
数を９．８×１０3 、重合抗体の２８０ｎｍにおけるモ
ル吸光係数を２．０９９×１０5 とする。 （数３） Ａｂ２８０，ＩｇＧ＝６．７８−(４．４６×１０-4×９．８×１０3 ) ＝２．４１ （数４）
【００６０】従って、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳ
ＬＩＣ３の分子数は、下記式（数５）に示すようにな
る。 （数５） ［ＳＬＩＣ３］／［ＩｇＧａｇｇ．］＝４．４６×１０-4／１．１５０×１０-5 ＝２５．８（個）
ＬＩＣ３の分子数は、下記式（数５）に示すようにな
る。 （数５） ［ＳＬＩＣ３］／［ＩｇＧａｇｇ．］＝４．４６×１０-4／１．１５０×１０-5 ＝２５．８（個）
【００６１】（４） 色素標識重合マウスＩｇＧの評価 得られた色素標識重合マウスＩｇＧを免疫クロマトセン
サーに用い、色素標識重合抗体の凝集による発色度（感
度）を５５０ｎｍにおける吸光度の測定により調べた。
なお、比較例として、抗体を重合しなかった以外は、前
記と同様の方法により、色素標識抗体を作製し、これに
ついて、その凝集による発色度（感度）を５５０ｎｍに
おける吸光度の測定により調べた。その結果、本発明の
実施例の色素標識重合抗体の吸光度は約０．８であり、
比較例の色素標識抗体の吸光度は約０．０７であった。
この結果から、本発明の実施例の色素標識重合抗体の感
度は、比較例の感度の約１０倍であるといえる。なお、
この評価において、免疫クロマトセンサーの構成および
前記吸光度の測定はつぎのとおりである。
サーに用い、色素標識重合抗体の凝集による発色度（感
度）を５５０ｎｍにおける吸光度の測定により調べた。
なお、比較例として、抗体を重合しなかった以外は、前
記と同様の方法により、色素標識抗体を作製し、これに
ついて、その凝集による発色度（感度）を５５０ｎｍに
おける吸光度の測定により調べた。その結果、本発明の
実施例の色素標識重合抗体の吸光度は約０．８であり、
比較例の色素標識抗体の吸光度は約０．０７であった。
この結果から、本発明の実施例の色素標識重合抗体の感
度は、比較例の感度の約１０倍であるといえる。なお、
この評価において、免疫クロマトセンサーの構成および
前記吸光度の測定はつぎのとおりである。
【００６２】（免疫クロマトセンサーの構成）免疫クロ
マトセンサーの構成の概略を、図１の斜視図に示す。図
示のように、この免疫クロマトセンサー１は、プラスチ
ック（例えば、ポリ塩化ビニル）製の板状支持体２の上
に、第１のガラスろ紙、ニトロセルロース製の抗体固定
用膜６、第２のガラスろ紙が、この順序で、配置されて
いる。そして、前記第１のガラスろ紙の前記抗体固定用
膜６に接しない側の端部（図において左側端部）が採水
部３であり、前記抗体固定用膜６に接する側の端部には
色素標識重合抗体を含浸させてあり、この部分が標識抗
体部４となっている。なお、比較例では、前記標識抗体
部４に、重合していない色素標識抗体を用いている。そ
して、前記抗体固定用膜６の所定の場所に、前記標識抗
体と同じ抗原と反応する抗体が吸着により固定化され抗
体固定化部５となっている。また、第２のガラスろ紙は
吸水部７となっている。
マトセンサーの構成の概略を、図１の斜視図に示す。図
示のように、この免疫クロマトセンサー１は、プラスチ
ック（例えば、ポリ塩化ビニル）製の板状支持体２の上
に、第１のガラスろ紙、ニトロセルロース製の抗体固定
用膜６、第２のガラスろ紙が、この順序で、配置されて
いる。そして、前記第１のガラスろ紙の前記抗体固定用
膜６に接しない側の端部（図において左側端部）が採水
部３であり、前記抗体固定用膜６に接する側の端部には
色素標識重合抗体を含浸させてあり、この部分が標識抗
体部４となっている。なお、比較例では、前記標識抗体
部４に、重合していない色素標識抗体を用いている。そ
して、前記抗体固定用膜６の所定の場所に、前記標識抗
体と同じ抗原と反応する抗体が吸着により固定化され抗
体固定化部５となっている。また、第２のガラスろ紙は
吸水部７となっている。
【００６３】（吸光度の測定）この、センサー１を用い
ての吸光度の測定は、例えば、つぎのようにして行われ
る。採水部３に、尿等のサンプルを供給すると、クロマ
トグラフィーの原理により、同図中の矢印Ａで示すよう
に、前記サンプルが、吸水部７に向かって移動する。そ
して、このサンプルの移動の際に、まず、標識抗体部４
において、サンプル中の抗原に標識抗体が結合する。そ
して、この標識抗体が結合した抗原は、サンプルととも
に抗体固定化部５に移動し、ここで固定化抗体と結合
し、ここに固定される。そして、前記抗体固定化部５
に、所定波長（例えば、５５０ｎｍ）の光Ｌ１を照射
し、その反射光Ｌ２を測定することにより、吸光度が測
定できる。
ての吸光度の測定は、例えば、つぎのようにして行われ
る。採水部３に、尿等のサンプルを供給すると、クロマ
トグラフィーの原理により、同図中の矢印Ａで示すよう
に、前記サンプルが、吸水部７に向かって移動する。そ
して、このサンプルの移動の際に、まず、標識抗体部４
において、サンプル中の抗原に標識抗体が結合する。そ
して、この標識抗体が結合した抗原は、サンプルととも
に抗体固定化部５に移動し、ここで固定化抗体と結合
し、ここに固定される。そして、前記抗体固定化部５
に、所定波長（例えば、５５０ｎｍ）の光Ｌ１を照射
し、その反射光Ｌ２を測定することにより、吸光度が測
定できる。
【００６４】
【発明の効果】以上のように、本発明の色素標識重合抗
体は、抗原との反応部位を多数有しているため、高感度
のものである。したがって、例えば、本発明の色素標識
重合抗体を免疫クロマトグラフィーを利用したセンサー
に導入することによって、従来法で作製した標識抗体を
用いたときよりも高感度のセンサーを作製することがで
きる。
体は、抗原との反応部位を多数有しているため、高感度
のものである。したがって、例えば、本発明の色素標識
重合抗体を免疫クロマトグラフィーを利用したセンサー
に導入することによって、従来法で作製した標識抗体を
用いたときよりも高感度のセンサーを作製することがで
きる。
【図１】本発明の一実施例における免疫クロマトセンサ
ーの構成の概略を示す斜視図である。
ーの構成の概略を示す斜視図である。
１ 免疫クロマトセンサー ２ 板状支持体 ３ 採水部 ４ 標識抗体部 ５ 抗体固定化部 ６ 抗体固定化用膜 ７ 吸水部 Ａ サンプルの移動方向 Ｌ１ 照射光 Ｌ２ 反射光
Claims (8)
- 【請求項１】 多官能性試薬により抗体が重合され、こ
の重合抗体がシアニン系色素により標識された色素標識
重合抗体。 - 【請求項２】 多官能性試薬が、ジチオビス（スルホス
クシンイミジルプロピオネート）である請求項１記載の
色素標識重合抗体。 - 【請求項３】 シアニン系色素が、下記式（化１）で示
されるシアニン系色素である請求項１記載の色素標識重
合抗体。 【化１】 - 【請求項４】 重合抗体とシアニン系色素の色素骨格と
が共有結合により結合している請求項３記載の色素標識
重合抗体。 - 【請求項５】 ｐＨが中性または弱アルカリ性領域の緩
衝液中で多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程と、
この緩衝液中にシアニン系色素を添加して前記重合され
た抗体を標識する工程とを含む色素標識重合抗体の製造
方法。 - 【請求項６】 多官能性試薬が、ジチオビス（スルホス
クシンイミジルプロピオネート）である請求項５記載の
色素標識重合抗体の製造方法。 - 【請求項７】 シアニン系色素が、前記式（化１）で示
されるシアニン系色素である請求項５記載の色素標識重
合抗体の製造方法。 - 【請求項８】 緩衝液がリン酸緩衝液である請求項５記
載の色素標識重合抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07810497A JP3547284B2 (ja) | 1996-04-03 | 1997-03-28 | 色素標識重合抗体およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-81246 | 1996-04-03 | ||
| JP8124696 | 1996-04-03 | ||
| JP07810497A JP3547284B2 (ja) | 1996-04-03 | 1997-03-28 | 色素標識重合抗体およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09325147A true JPH09325147A (ja) | 1997-12-16 |
| JP3547284B2 JP3547284B2 (ja) | 2004-07-28 |
Family
ID=26419178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07810497A Expired - Fee Related JP3547284B2 (ja) | 1996-04-03 | 1997-03-28 | 色素標識重合抗体およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3547284B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100332426B1 (ko) * | 1998-05-14 | 2002-04-13 | 모리시타 요이찌 | 색소표식중합항체 및 그 제조방법 |
-
1997
- 1997-03-28 JP JP07810497A patent/JP3547284B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100332426B1 (ko) * | 1998-05-14 | 2002-04-13 | 모리시타 요이찌 | 색소표식중합항체 및 그 제조방법 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3547284B2 (ja) | 2004-07-28 |
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