JP4699756B2 - 親水性化学発光アクリジニウムラベル化剤 - Google Patents

Description

本発明は、アミン反応性アクリジニウムラベル化剤に関する。特定の見地としては、本発明は、１またはそれ以上の親水性置換基を有するアクリジニウムラベル化剤に関する。他の見地として、本発明は、本発明のアクリジニウムラベル化剤を含むコンジュゲート、キット、これを利用するアッセイに関する。

以下の記述における本発明の背景は、単に本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の先行技術を記載することや、本発明の先行技術を構成することを認めるものではない。

アクリジニウムラベル化を利用する化学発光イムノアッセイは、臨床的に意義のある低濃度の分析物を、ハイスループット、且つ、高い感度で分析できる点で有利である。通常は、大量の化学発光タグでラベル化された抗体を用いることが好ましく、これは高い発光カウントを生じ、それにより検出限界を低くすることができる。非特異的結合が最小化できる場合は、この考えが当てはまる。

比較的高いラベル化剤−タンパク質の比で、市販のラベル化剤により抗体をコンジュゲートする際、ラベル化されたタンパク質の回収率が低いことがしばしばある。これらのラベル化反応のほとんどにおいて、タンパク質の沈殿および／またはタンパク質凝集の形成が観察される。おそらく、沈殿と凝集は、溶液に留まっている免疫学的に活性なコンジュゲートよりも、ラベル化の度合いが高いタンパク質分子によるものである。沈殿と凝集に向かう傾向は、４つの環状芳香族のアクリジニウムエステルラベルの疎水的性質に起因するであろう。

したがって、この分野において、タンパク質の沈殿を引き起こす傾向および／またはタンパク質凝集の形成を促進する傾向を減らすアクリジニウムラベル化剤が必要とされている。

本発明によれば、親水性スルホアルキル置換基、および／または、ホモシステイン酸、システイン酸、グリシンペプチド、テトラエチレンオキサイド等由来の親水性リンカー、を導入することにより、アクリジニウム環系の疎水性が相殺され、沈殿や凝集の問題が生じる前に高い容量で抗体に結合できる、より溶解性のよいラベルを製造できることを見出した。

ここで記載されるさらなる化合物は、水分子との水素結合により水溶性を増す短鎖ペプチドおよびテトラエチレンオキサイド由来のリンカーを含む。本発明は、また、溶解性を増すために規則的な間隔でスルホン酸基を有するいくつかのアクリジニウムエステルを保持するペプチドからなる、シグナル増幅のための複数のアクリジニウムラベル化剤を包含する。

本発明の他の態様によれば、サンプル中の分析物の存在をアッセイする方法であって、分析物を本発明のコンジュゲートに接触させること、過酸化物または分子酸素の存在下で形成される中間体の消失により化学発光を誘発させること、およびその化学発光を測定して分析対象をアッセイすること、を含むアッセイ方法が提供される。

本発明のまた他の見地によれば、特異的結合物質にコンジュゲートした化学発光ラベルを用いた分析物の検出のための診断アッセイ方法において、化学発光ラベル化合物として本発明の化合物を用いることを含む、改良したアッセイ方法が提供される。

上記の本発明の概略は限定的なものではなく、本発明の他の特徴や有利な点は、特許請求の範囲とともに、以下の発明を実施するための最良の形態の記載から明らかであろう。

本発明によれば、以下の構造の化学発光化合物が提供される。

（Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＲ’を示し、Ｒ’はＨ、アルキルまたは置換基を有するアルキルであり、
Ｙは、ＯまたはＳを示し、
Ｚは、アルキル、スルホアルキル、アルケニル、またはスルホアルケニルを示し、
Ａｒは、少なくとも１つのＳＯ ₂ Ｌ置換基を有するアリールまたはヘテロアリールを示し
、ＬはハロゲンまたはＮＨＱであり、Ｑはアミン反応性基を有するリンカーであり、
Ｒは、スルホアルキルまたはスルホアルケニルを示し、
Ａ^-は、任意の適切な対イオンであり、
ｎは０〜３であり、
Ｌがハロゲンの場合は、Ｚはスルホアルキルまたはスルホアルケニルである。）

したがって、本発明の１つの見地では、１）化学発光アクリジニウムエステル、２）複数のアクリジニウムラベルを有する、スルホアルキル基のような親水性置換基、および／または、システイン酸、ホモシステイン酸等のスルホン酸化アミノ酸、ジグリシン、トリグリシン、テトラグリシン等の短鎖ペプチド、システイン酸やホモシステイン酸を含むペプチド由来のような親水性リンカー、またはテトラエチレンオキサイドを含むリンカー、３）塩化スルホン酸、サクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）、ペンタフルオロフェニルエステルのような反応性基、を含むアミン反応性アクリジニウムラベル化剤を提供する。種々の構造およびこれらに用いられる一般的名称を、従来の化学発光試薬であるＭｅＡＥとともに図１に示す。

ここで用いられる「アルキル」は、１から約２０の範囲の炭素原子を有する飽和の直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを示す。「低級アルキル」は、１から約５の範囲の炭素原子を有するアルキル基を示す。「置換基を有するアルキル」は、ヒドロキシ、（低級アルキル基の）アルコキシ、（低級アルキル基の）メルカプト、シクロアルキル、置換基を有するシクロアルキル、ヘテロサイクリック、置換基を有するヘテロサイクリック、アリール、置換基を有するアリール、ヘテロアリール、置換基を有するヘテロアリール、アリールオキシ、置換基を有するアリールオキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、ニトロン、アミノ、アミド、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アシル、オキシアシル、カルボキシル、カルバメート、ジチオカルバモイル、スルホニル、スルホンアミド、スルフリル等から選ばれる１またはそれ以上の置換基をさらに有するアルキル基を示す。

ここで用いられる「スルホアルキル」は、以下の構造を有する置換基を指す。
−（ＣＲ”₂）_q−ＳＯ₃ ^-
Ｒ”は、それぞれ独立に、Ｈ、低級アルキル、置換基を有する低級アルキル、ｑは、１〜６である。

したがって、スルホアルキルの語は、スルホメチル、スルホエチル、スルホプロピル、スルホブチル、スルホペンチル、スルホヘキシル等のような基を包含する。本発明における現に好ましいスルホアルキル基は、スルホプロピルである。

ここで用いられる「スルホアルケニル」は、以下の構造を有する置換基を指す。
−（ＣＲ”₂）_r−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ”）−（ＣＲ”₂）_r−ＳＯ₃ ^-
Ｒ”は、それぞれ独立に、Ｈ、低級アルキル、置換基を有する低級アルキル、ｒは、それぞれ独立に、０〜４である。

したがって、スルホアルケニルの語は、スルホエテニル、スルホプロペニル、スルホブテニル、スルホペンテニル、スルホヘキセニル等のような基を包含する。本発明における現に好ましいスルホアルケニル基は、スルホプロペニルである。

ここで用いられる「アリール」は、６から１４の範囲の炭素原子を有する芳香族基を示し、「置換基を有するアリール」は、１またはそれ以上の上述した置換基をさらに有するアリール基を示す。本発明の１つの見地において、アリールは、例えば２，６−ジメチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル等の様な、２，６−ジアルキル置換フェニルである。本発明の実施への使用を企図された現に好ましいアリールは、以下の構造を有する基である。

本発明の他の好ましい見地において、Ａｒは、以下の構造を有する。

Ｑは、ポリオキシアルキレン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−（リジン−ホモシステイン酸）、ポリ−（リジン−システイン酸）、ポリグリシン、アミノデキストラン等である。

ここで用いられる「ヘテロアリール」は、４から約１３の範囲の炭素原子を有する芳香族基を示し、少なくとも１つのヘテロ原子が、Ｏ、Ｎ、Ｓ等から選択される。「置換基を有するヘテロアリール」は、１またはそれ以上の上述した置換基をさらに有するヘテロアリール基を示す。本発明の実施への使用を企図された例示的なヘテロアリール化合物には、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル等が含まれる。

ここで用いられる「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を示す。

ここで用いられる「適切な対イオン」、Ａ^-は、ハロゲンイオン、硫酸イオン、硝酸イオン、カルボン酸イオン、トリフレートイオン、フルオロスルホン酸イオン、ジフルオロスルホン酸イオン等を示す。対イオンの使用は任意であり、この場合、特定の分子を、内的な「対イオン」として用いてもよい。例えば、Ｚがスルホアルキルまたはスルホアルケニルの場合、スルホ−部位は、適切な対イオンを提供することとなる。

本発明の実施への使用を企図したアミン反応性基Ｑを有するリンカーには、サクシンイミジルエステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、またはＮＨＳエステル）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、ジクロロトリアジン、イソチオシアネート等が含まれる。

本発明の１つの見地において、ＸがＯである化合物が、現に好ましい。本発明の他の見地において、ＹがＯである化合物も、好ましい。本発明の特に好ましい見地において、ＸとＹの両方がＯである。

本発明によって企図された例示的な化合物には、ＸがＯ、ＹがＯ、Ｚがスルホアルキル、Ａｒが２，６−ジメチル−３−または４−クロロスルホフェニル、Ｒが存在せず、Ａ^-が存在せず、ｎが０である化合物が含まれる。

特に好ましい化合物は、上述の置換パターンを有し、Ｚがスルホプロピルであるものである。さらに好ましい化合物は、Ａｒが２，６−ジメチル−３−クロロスルホフェニルまたは２，６−ジメチル−４−クロロスルホフェニルである。

本発明による他の例示的な化合物は、図６に示されており、例えば、２，６−（ジメチル）−３−クロロスルホフェニル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート（「ＳＰＡＥ」）、ＳＰＡＥ−（ポリエチレンオキサイド）₄−ペンタフルオロフェニルエステル（「ＳＰＡＥ−ＰＥＯ４−ＰＥＰ」）、２，６−（ジメチル）−３−クロロスルホフェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートトリフレート（「ＭｅＡＥ」）、およびＭｅＡＥ−（ポリエチレンオキサイド）₄−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（「ＭｅＡＥ−ＰＥＯ４−ＮＨＳ」）である。

本発明の他の見地によれば、特異的結合物質にコンジュゲートした、ここに記載された化学発光化合物を含む化学発光コンジュゲートが提供される。

ここで「特異的結合物質」は、免疫反応、タンパク質結合反応、核酸のハイブリダイゼーション反応、その他の生物学的、生化学的若しくは化学的な種の制限されたクラスと特異的に物質が反応するその他の反応により、特異的に結合するすべての物質を意味する。本発明の実施への使用に企図された特異的結合物質には、抗体、酵素およびその基質、抗体およびその抗原、アビジン−ビオチン、核酸等が含まれる。

本発明の化学発光化合物は、サンプル中の分析物の存在についての特異的結合アッセイに幅広く用いることができる。ここで「存在」は、分析物の定性的および／または定量的検出を意味する。このようなアッセイは、特異的結合反応を伴ってその上に部位を形成する改良された化学発光化合物を用いることにより検出できる、いずれの分析物にも指向できる。これらのアッセイには、限定されないが、イムノアッセイ、タンパク質結合アッセイ、および核酸ハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。

典型的なイムノアッセイにおいて、分析物は免疫反応性があり、サンプル中におけるその存在は、アッセイ試薬との免疫反応を利用して測定できる。典型的なタンパク質結合アッセイでは、サンプル中の分析物の存在は、反応性が免疫反応性以外であるアッセイ試薬と分析物との特異的結合反応性により測定される。アッセイに使用される他の特異的結合反応の例としては、酵素−基質認識およびビオチンへのアビジンの結合アフィニティが挙げられる。典型的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、サンプル中の分析物の存在は、分析物とアッセイ試薬とのハイブリダイゼーション反応により測定される。分析物の核酸（通常は、ＤＮＡまたはＲＮＡの２本鎖として存在する）は、通常１本鎖の形状に転換され、担体上（例えばニトロセルロース紙）に固定化される。分析物の核酸は、あるいはゲルマトリックス中で電気泳動される。そして、固定化された分析物は、核酸の相補的配列によりハイブリダイズされることとなる（即ち、特異的に結合する）。

前述の特異的結合アッセイは、幅広いアッセイ形式で実行できる。これらのアッセイ形式は、２つの広いカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーとして、このアッセイは、特異的結合物質に結合した本発明の化学発光部位を含む本発明の化学発光コンジュゲートを用いる。このカテゴリーのアッセイにおいて、本発明の化学発光コンジュゲートは特異的結合反応に関係し、サンプル中の分析物の存在は、本発明の化学発光コンジュゲートを含む１またはそれ以上の特異的結合反応産物の形成に比例する。このアッセイは、必要な特異的結合反応が適切な反応条件下で起こるようにすることにより実行される。本発明の化学発光コンジュゲートを含む特異的結合反応産物の形成は、本発明の化学発光コンジュゲートを含む産物のような化学発光を測定すること、あるいは、このような産物を含まない未反応の若しくは部分的に反応した本発明の化学発光コンジュゲートの化学発光を測定することにより、測定される。

この第１のカテゴリーのアッセイ形式は、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、表面抗原アッセイ、連続飽和アッセイ、競合置換アッセイ、およびクエンチングアッセイにより例示される。

サンドイッチ形式では、化学発光部位が結合する特異的結合物質は、目的とする分析物に特異的に結合することができる。このアッセイは、分析物に特異的に結合して反応物−分析物−化学発光コンジュゲート複合体を形成できる反応物をさらに利用する。反応物は、限定ではないが、ディップスティック、ビーズ、管、紙、高分子シート等を含む固相に結合してもよい。このような場合、サンプル中の分析物の存在は、特異的結合反応の完了後固相の化学発光に比例することとなる。このようなアッセイ形式は、さらに、米国特許番号４，６５２，５３３、４，３８３，０３１、４，３８０，５８０および４，２２６，９９３にて議論されており、これらは、参照することによりすべての図面、表、および特許請求の範囲を含むその全体を、本明細書に取り込むものとする。

競合形式では、アッセイは、分析物に特異的に結合して分析物−反応物複合体を形成できる反応物、および本発明の化学発光部位が結合する特異的結合物質に結合して化学発光コンジュゲート−反応物複合体を形成できる反応物を利用する。反応物は固相に結合し、あるいは、反応物を含む反応産物は、第２の抗体を用いて若しくは他の既知の手段により沈殿させてもよい。この競合形式では、分析物の存在は「比例的」であり、即ち、固相若しくは沈殿の化学発光に反比例する。このアッセイ形式のさらなる議論は、直近の上述の米国特許に見出される。

他のアッセイ形式において、分析物は、大きな生物学的、生化学的、または化学的な種の上に存在し、または、それらに結合している。この型の形式は、表面抗原アッセイにより例示される。この形式では、特異的結合物質は、分析物に特異的に結合でき、分析物の存在は、反応産物として形成した分析物−化学発光コンジュゲート複合体に比例する。これは、細胞の表面抗原に特異的な抗体に、本発明の化学発光部位が結合することにより例示される。細胞表面抗原の存在は、反応の完了後の細胞の化学発光により示されることとなる。細胞自身は、濾過システムを伴って用いられ、細胞表面に形成される分析物−化学発光コンジュゲート複合体を未反応の化学発光コンジュゲートから分離することができる。これは、米国特許番号４，６５２，５３３でさらに議論されている。

本発明の化学発光部位は、限定されないが、連続飽和および競合置換等の既知の他のアッセイ形式に使用してもよく、この両者は、（１）その部位に結合する特異的結合物質、および（２）反応物に特異的に結合する分析物の両方の化学発光コンジュゲートを利用する。連続飽和の場合は、分析物は、まず反応物と反応し、次に残った未反応の反応物と化学発光コンジュゲートとの反応が起こる。競合置換の場合は、化学発光コンジュゲートは、既に反応物に結合している分析物を競合的に置換する。

クエンチング形式において、このアッセイは、（ｉ）分析物−反応物複合体を形成する分析物、および（ｉｉ）化学発光部位が結合して化学発光コンジュゲート−反応物複合体を形成する特異的結合物質、に特異的に結合できる反応物を利用する。クエンチング部位は、反応物に結合する。化学発光部位の近接に至った場合、クエンチング部位は、化学発光部位の化学発光を減少または消失させる。このクエンチング形式では、分析物の存在は、化学発光部位の化学発光に比例する。この形式のさらなる議論は、米国特許番号４，２２０，４５０および４，２７７，４３７に見出され、これらは参照することにより、すべての図面、表、および特許請求の範囲を含むそのすべてが、本明細書に取り込まれる。

上で議論したアッセイ形式および以下で議論する形式を考慮すると、アッセイ試薬が添加され反応する順序は、既知の技術と同様に大きく変化しうる。例えば、サンドイッチアッセイでは、固相に結合した反応物は、サンプル中に含まれる分析物と反応し、この反応の後、複合体化した分析物を含む固相が、残ったサンプルから分離される。この分離工程の後、化学発光コンジュゲートは、固相の複合体と反応することとなる。あるいは、固相、サンプル、および化学発光コンジュゲートは、同時に併せて添加され、分離に先立って反応させてもよい。またさらなる代替としては、サンプル中の分析物および化学発光コンジュゲートは、固相の反応物の添加に先立って反応させてもよい。混合および反応工程における同様の変法が、競合アッセイ形式およびこの分野で既知の他の形式に可能である。特異的結合反応産物の「実質的な形成を適切な条件下で行うこと」には、アッセイ試薬の添加と反応の順序について、多くの異なった変法が含まれる。

アッセイ形式の第２のカテゴリーにおいて、このアッセイは、本発明のコンジュゲートしていない化学発光化合物を利用する。サンプル中の分析物の存在は、それ自身は化学発光部位を含まない１またはそれ以上の特異的結合反応産物の形成に比例する。その代わりに、化学発光化合物は、このような反応産物の形成に比例して化学発光する。

この第２のアッセイカテゴリーの１例において、このアッセイは、分析物に結合して、化学発光する化学発光化合物を生じる分析物−反応物複合体を形成させることができる反応物を利用する。これは、分析物が基質グルコースであり反応物がグルコースオキシダーゼ酵素である、単純な酵素−基質アッセイにより例示される。酵素−基質複合体の形成は、化学発光化合物の引き金となる。このようなグルコースの酵素−基質アッセイは、米国特許番号３，９６４，８７０および４，４２７，７７０に開示されており、これらは参照することによりすべての図面、表、および特許請求の範囲を含むそのすべてが、本明細書に取り込まれるものとする。この酵素−基質アッセイは、抗原が抗体に結合するのと同じ方法で、基質が特異的に酵素の活性部位に結合する意味において、特異的結合アッセイである。このアッセイにおいて、酵素は、基質に特異的に結合して過酸化物の生成をもたらし、これにより、化学発光する化学発光化合物が生じる。

第２のアッセイカテゴリーには、反応産物の形成が化学発光化合物により直接的でなくても化学発光を促進または阻害する形式のアッセイも含まれる。このアッセイにおいて、分析物と交差反応性の第１の反応物は、グルコースオキシダーゼのような酵素の活性部位の近傍に結合する。分析物および免疫反応性物質の両方に特異的な第２の反応物がサンプルに添加され、基質（即ち、グルコース）の存在下で酵素が変化する。第２の反応物が酵素の活性部位近傍に位置する第１の反応物に結合すると、第２の反応物は、基質が活性部位で酵素に結合できないような方法で、または活性部位における基質の結合が顕著に低下するような方法で、活性部位を遮断する。この方法で酵素を遮断する第２の反応物は、過酸化物の生成から酵素を阻害し、これにより、化学発光部位の引き金となる。しかし、サンプル中の分析物は、第２の反応物に結合し、これにより第２の反応物が過酸化物の生成を阻害することを阻止する。分析物の存在は、化合物の化学発光に比例することとなる。

上記の２つのカテゴリーのアッセイ形式に含まれるアッセイは、不均一系でも均一系でもよい。不均一アッセイでは、サンプル中の分析物の存在に比例して形成する反応産物は、反応の他の産物から分離される。分離は、限定しないが、濾過、精密濾過、２重抗体沈殿、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、サンプル溶液からの固相の除去（例えば、ディップスティック）または電気泳動による、固相からの液相の分離によるすべての方法により、実行されうる。例えば、サンドイッチアッセイでは、反応物−分析物−化学発光コンジュゲート複合体が、未反応の化学発光コンジュゲートから分離される。表面抗原アッセイでは、分析物−化学発光コンジュゲート複合体が、未反応の化学発光コンジュゲートから分離される。競合アッセイでは、反応物−化学発光コンジュゲート複合体が、未反応の化学発光コンジュゲートから分離される。連続飽和アッセイおよび競合置換アッセイでは、反応物−化学発光コンジュゲート複合体が、未反応の化学発光コンジュゲートから分離される。あるいは、均一アッセイでは、反応産物は、分離されない。アッセイ試薬が反応した後、化学発光はアッセイ混合物全体から測定でき、このような混合物が溶液中、固相上、または、ディップスティックや他の固体担体の種々の膜層間に分散したものであっても測定できる。グルコースオキシダーゼと化学発光部位を用いるグルコースアッセイは、分離が不要の単純な均一アッセイとして例示される。クエンチングアッセイは、分離が不要なより複雑な均一アッセイとして例示される。

最後に、「化学発光を測定すること」には、関連する、その形成がサンプル中の分析物の存在に比例する、これらの特異的結合反応産物を他の反応産物から分離する操作を含んでもよい。また、これは、関連する、（ｉ）化学発光部位を酸で処理してその部位から酸不安定基を開裂される操作、および／または（ｉｉ）反応産物の形成そのものが化学発光部位のきっかけとならないアッセイ形式の場合に、化学発光部位が化学発光するきっかけとなる操作を、含んでもよい。

本発明のさらに他の見地によれば、ここで記載されたコンジュゲートを含む化学発光アッセイキットが提供される。このようなキットは、好ましくは本発明の化学発光部位を含む少なくとも１つの化学発光アッセイ成分等の上述の１またはそれ以上のアッセイ成分を含み、また１またはそれ以上の、検出を実行するための指示書；検出の実行に使用するバッファーのような試薬；液体を移すためのピペット等、を含んでもよい。

本発明は、非限定の以下の実施例を参照することにより、より詳細に記述される。

親水性化学発光アクリジニウムラベル化剤の製造
比較的疎水性の化合物ＭｅＡＥ［２，６−（ジメチル）−３−クロロスルホフェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートトリフタレート］は、２，６−（ジメチル）フェニルアクリジン−９−カルボキシレートからメチルトリフタレートによるＮ−メチル化の後、スルホニルクロライドを生成する反応により製造した（ＵＳ５，２８４，９５２）。この化合物は、親水性アミノ酸またはペプチドとの反応により親水性アクリジニウムエステルに転換した後、図１のスキームにしたがってＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）またはペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステルを製造した。例示化合物の合成は、以下にさらに詳細に記述する。

ＭｅＡＥ−ＰＥＯ４−ＮＨＳ
４ｍｌ乾燥アセトニトリル中、１３０ｍｇ（０．３４ミリモル）のテトラエチレングリコールアミノプロピオン酸、ＴＦＡおよび１９０ｍｇ（１．４ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンの撹拌溶液に、乾燥ＤＭＦ（全量＝１．５ｍｌ中１００ｍｇ（０．１７ミリモル））中ＭｅＡＥの３つの分注を添加した。混合物をアルゴン下室温暗所で２．５時間撹拌した。混合物に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加えて、ぬれたｐＨ試験紙上でｐＨ３となるように酸性にした。揮発分をロータリーエバポレーターで除去し、残さを１０％アセトニトリル−９０％５０ｍＭ酢酸水溶液で再溶解した。混合物を、１０％アセトニトリル／９０％５０ｍＭ酢酸水溶液を溶出液としてセファデックスＧ１０ゲル濾過カラムに通した。生成物の量は、ＵＶ可視吸収から４７．５マイクロモル（収率２８％）であることを確認した。ゲル濾過から回収した溶液に２Ｍメタンスルホン酸水溶液を添加して、ｐＨ２の酸性にした。揮発分を減圧除去し、黄色固体ＭｅＡＥ−ＰＥＯ４−ＣＯＯＨを得た。ＥＳＩマススペクトルで、ポジティブモードｍ／ｚ＝６６９（アクリジニウムイオンカルボン酸）、ｍ／ｚ＝６９１（ナトリウム塩）。ネガティブモードｍ／ｚ＝７８１（アクリジニウムトリフルオロ酢酸カルボキシレート）。

ＭｅＡＥ−ＰＥＯ４−ＣＯＯＨを１ｍｌのピリジンを用いた共沸蒸発後に真空デシケーターにより乾燥させた。０．５ｍｌ乾燥ＤＭＦ中４８マイクロモルのＭｅＡＥ−ＰＥＯ−ＣＯＯＨおよび０．５２ミリモルのピリジンの溶液に、６１ｍｇ（０．２４ミリモル）の固体のジサクシンイミジルカーボネートを添加した。アルゴン下で室温で６時間撹拌しながら反応を進行させた。乾燥エーテル（５ｍｌ）を加えてＭｅＡＥ−ＰＥＯ４−ＮＨＳ産物を沈殿させた。吸引により上清を除去して固体をＤＭＦに再溶解し、エーテルを加えて再沈殿させ、エーテルで洗浄後乾燥した。ＥＳＩマススペクトルで、ポジティブモードｍ／ｚ＝７６６（アクリジニウムイオンＮＨＳエステル）。

ＭｅＡＥ−ＨＣＡ−ＮＨＳ
２９３ｍｇ（１．６ミリモル）のホモシステイン酸、０．５ｍｌの水、２．８ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍｌの０．２Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．３および１ｍｌのＤＭＦから成る混合物を、氷浴で外部から冷却した。新たに調製した０．５ｍｌＤＭＦ中４０ｍｇ（０．２ミリモル）ＭｅＡＥ溶液を加えて、撹拌した。さらに炭酸バッファーｐＨ９．３（３ｍｌの０．２Ｍ）を添加した。新たに調製したＭｅＡＥ（０．５ｍｌＤＭＦ中４０ｍｇ（０．２ミリモル））の他の分注を、冷却撹拌した混合物に添加した。炭酸バッファーｐＨ９．３（０．５ｍｌの０．２Ｍ）とＤＭＦを撹拌した混合物に添加した。混合物を氷浴中で３０分間、その後室温で３０分間撹拌した。混合物に、１Ｍメタンスルホン酸水溶液を添加してｐＨ２の酸性とした。ロータリーエバポレーターで揮発分を除去し、固体残さから生成物を２０ｍｌづつ３つに分けた熱メタノール中に抽出した。メタノール抽出物を濾過し、濃縮乾燥し、黄色固体を得た。固体を熱メタノールに溶解して２回再結晶させ、酢酸エチルを添加して９２ｍｇ（収率７８％）のＭｅＡＥ−ＨＣＡ生成物を得た。ＤＭＳＯ／ＭｅＣＮを溶媒として用いたＥＳＩのネガティブモードで、ｍ／ｚ＝６０３（シュードベーススルホネートアニオン）。ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏを溶媒として用いたネガティブモードで、ｍ／ｚ＝６１７（メトキシアダクトスルホネートアニオン）、ｍ／ｚ＝３０８（メトキシアダクトスルホネートカルボキシレートジアニオン）。

アセトニトリル中トリフルオロ酢酸（２ｍｌの２Ｍ溶液）を固体のＭｅＡＥ−ＨＣＡ（２５ｍｇ、４３マイクロモル）に加え、シュードベースをアクリジニウムに変換した。揮発分を減圧除去し、黄色固体を減圧下で２時間乾燥させた。乾燥ＭｅＡＥ−ＨＣＡ、４１μｌのピリジン（０．５１ミリモル）および６６ｍｇ（０．２６ミリモル）のジサクシンイミジルカーボネートの混合物を、アルゴン下室温で５時間撹拌した。エーテル（１０ｍｌ）を添加して生成物を沈殿させ、上清を吸引により除去した。生成物を減圧下で乾燥させ、１．５ｍｌのＤＭＦに再溶解後、６ｍｌのエーテルで再沈殿させて回収し、減圧下で乾燥させた。エーテルによる沈殿を繰り返し、３１．７ｍｇ（１００％）のＭｅＡＥ−ＨＣＡ−ＮＨＳ生成物を得た。ＥＳＩマススペクトルのポジティブモードでｍ／ｚ＝６８４（アクリジニウムＮＨＳエステルスルホン酸）、ｍ／ｚ＝７０６（アクリジニウムＮＨＳエステルスルホン酸ナトリウム）。

Ｃ．ＭｅＡＥ−Ｇｌｙ２−ＮＨＳ
グリシルグリシン（２６４ｍｇ、２ミリモル）、水（１ｍｌ）、１．８ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍｌの０．２Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．３および１ｍｌのＤＭＦの混合物を、氷浴で外部から冷却した。新たに調製したＭｅＡＥ（全量＝３ｍｌＤＭＦ中１２０ｍｇ（０．２０ミリモル））の３つの分注を添加して撹拌した。氷浴で３０分間撹拌後、１Ｍメタンスルホン酸水溶液を添加して、混合物をｐＨ２．５の酸性とした。揮発分を減圧除去し、熱２−プロパノールの１５ｍｌ分注３つによる処理により黄色固体から生成物を抽出した。溶液を濾過して濃縮乾燥し、１２３ｍｇの黄色固体を得た。固体を熱２−プロパノール−酢酸エチルで再結晶し、３２ｍｇ（収率２５％）のＭｅＡＥ−Ｇｌｙ２生成物を得た。ＥＳＩマススペクトルのポジティブモードでｍ／ｚ＝５３６（アクリジニウムカルボン酸）、ｍ／ｚ＝５５８（アクリジニウムカルボン酸ナトリウム）、ｍ／ｚ＝５９０（アクリジニウムカルボン酸カリウム）。

０．８ｍｌの乾燥ＤＭＦ中２０ｍｇ（３２マイクロモル）のＭｅＡＥ−Ｇｌｙ２、３０μｌ（０．３ミリモル）のピリジンおよび４９ｍｇ（０．１９ミリモル）のジサクシンイミジルカーボネートの混合物を、アルゴン下室温暗所で一晩撹拌した。揮発分を減圧除去して残さを０．５ｍｌの乾燥ＤＭＦに再溶解し、３ｍｌの乾燥エーテルを添加して生成物を沈殿させた。減圧乾燥後、ＤＭＦへの溶解、エーテルによる沈殿、減圧乾燥の工程を３回繰り返し、８．７ｍｇ（収率３７％）のＭｅＡＥ−Ｇｌｙ２−ＮＨＳ生成物を得た。ＥＳＩマススペクトルのポジティブモードでｍ／ｚ＝６３３（ＮＨＳアクリジニウムイオン）。

ＭｅＡＥ−Ｇｌｙ３−ＮＨＳ
９６ｍｇ（０．５１ミリモル）のトリグリシン、４ｍｌの０．５Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．５および１ｍｌのＤＭＦから成る混合物を、氷浴で外部から冷却した。新たに調製したＤＭＦ中ＭｅＡＥ溶液（全量＝１．５ｍｌ中１００ｍｇ（０．１７ミリモル））の３つの分注を５分間隔で撹拌しながら添加した。混合物を冷却しながら１５分間、室温で３０分間撹拌した。混合物を２Ｍメタンスルホン酸水溶液を添加してｐＨ２．５の酸性とし、濃縮乾燥して、黄色固体を得た。生成物を２−プロパノールの４０ｍｌ分注３つで抽出し、濾過後、濃縮乾燥した。２−プロパノール抽出を繰り返し、９６ｍｇ（収率８０％）の黄色固体のＭｅＡＥ−Ｇｌｙ３生成物を得た。ＥＳＩマススペクトルのポジティブモードでｍ／ｚ＝５９３（アクリジニウムカルボン酸）。

２ｍｌの乾燥ＤＭＦ中４７ｍｇ（６７マイクロモル）のＭｅＡＥ−Ｇｌｙ３、６４μｌ（０．７９ミリモル）のピリジンおよび１０３ｍｇ（０．４０ミリモル）のジサクシンイミジルカーボネートから成る混合物を、アルゴン下室温暗所で５時間撹拌した。生成物をエーテル沈殿により単離した後、ＭｅＡＥ−Ｇｌｙ２−ＮＨＳの製造と同様の操作を行い、２３．９ｍｇ（収率４５％）のＭｅＡＥ−Ｇｌｙ３−ＮＨＳ生成物を得た。ＥＳＩマススペクトルのポジティブモードでｍ／ｚ＝６９０（アクリジニウムＮＨＳエステル）。

ＳＰＡＥ
化合物ＳＰＡＥ［２，６−（ジメチル）−３−クロロスルホフェニル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート］は、親水性アクリジニウムエステルであり、以下の構造を有する。

この化合物は、図２のスキームにしたがって、２，６−（ジメチル）フェニルアクリジン−９−カルボキシレートから合成された。この化合物の合成は、さらに以下に詳細に記載される。

２，６−ジメチルフェニルアクリジン−９−アクリジンカルボキシレート（０．６５４ｇ、２．０ミリモル）および融解した９９＋％１，３−プロパンスルトン（２．４ｇ、２０ミリモル）を、オーブンで乾燥した２０ｍｌのガラスビンに入れた。混合物をサンヨーカルーセルモデルＲ−２３０−ＢＫ電子レンジで出力７０％で１５秒間加熱した後、次の電子レンジ加熱までの間１０秒間旋回させ、全電子レンジ時間＝４０秒間とした。加水分解スルホン酸エステル基に、５ｍｌの５０％メタノール、０．２Ｍ塩酸５０％水溶液を添加し、黒色混合物を油浴中８０℃５時間、マグネチックスターラーで撹拌しながら加熱した。６０％のＡと４０％のＢの定組成移動相を用いて流速８ｍｌ／ｍｉｎで、２５０ｍｍ×２１．２ｍｍフェノメネックスルナ５ミクロンＣ１８（２）カラムを通して、予備的ＨＰＬＣにより生成物を精製した。（溶媒Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、溶媒Ｂ＝アセトニトリル）。３０回のクロマトグラフィー操作の各々において、２００マイクロリットルのサンプルを注入した。４３０ｎｍにおける吸光度が０．２以上のとき、１４から１５分の保持時間を有する生成物を回収した。１４−１５分の分画を回収混合し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾燥して０．４９ｇの黄色固体を得た。２，６−（ジメチル）フェニル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート生成物を、熱１：１アセトニトリル／メタノールから、酢酸エチルを添加して再結晶させ、４０１ｍｇの結晶を得た。母液を濃縮し、第２の収分（７６ｍｇ）を得た。収率＝５３％。メタノール中のＥＳＩマススペクトルは、ポジティブモードでｍ／ｚ＝４５０（アクリジニウムスルホン酸）および４７２（アクリジニウムスルホン酸ナトリウム）、ネガティブモードでｍ／ｚ＝４８０（メトキシアダクトスルホネートアニオン）および４６６（シュードベーススルホネートアニオン）。１００ｍＭリン酸ｐＨ２．０におけるＵＶ可視スペクトル：λ_max＝３７０および４３０ｎｍであった。

オーブンで乾燥した２５ｍｌフラスコでアルゴン下、１２ｍｌの乾燥ジクロロメタン中２，６−（ジメチル）フェニル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジン−９−カルボキシレート（１８０ｍｇ、０．４０ミリモル）の撹拌サスペンジョンに、４００マイクロリットルの９９＋％クロロスルホン酸（０．７０ｇ、６．０ミリモル）を添加した。アルゴン下室温で一晩、クロロスルホン酸化を行った。少量の不溶性の茶色固体を静沈させ、アルゴン下で撹拌した１００ｍｌの無水エーテルを含むフラスコに、パスツールピペットで黄色の上清を滴下した。反転させた大きな漏斗によるアルゴン保護下で焼結ガラス漏斗上に生成物を集め、約３０ｍｌの乾燥エーテルで洗浄した。黄色固体ＳＰＡＥ生成物（２１２ｍｇ、収率９７％）を５酸化リン上で一晩減圧乾燥した。メタノール中のＥＳＩマススペクトルのポジティブモードでｍ／ｚ＝５４８および５５０（アクリジニウムスルホニルクロライド）、ネガティブモードでｍ／ｚ＝５７８および５８０（スルホニルクロライドメトキシアダクトスルホネートアニオン）。１００ｍＭリン酸ｐＨ２．０におけるＵＶ可視スペクトル：λ_max＝３７１および４３１ｎｍであった（アクリジニウムイオン）。１００ｍＭ炭酸ｐＨ９．６におけるＵＶ可視スペクトル：λ_max＝２８７および３２０ｎｍであった（シュードベース）。バートホールド化学発光メータを用いたリン酸バッファーｐＨ６．０における０．４％ＢＳＡ中の特異的化学発光活性＝３．８×１０¹⁹（１モルあたりの相対発光単位）。

Ｆ．ＳＰＡＥ−ＰＥＯ４−ＰＦＰ
ＳＰＡＥの親水性は、親水性のアミノ酸やペプチドのようなリンカーに結合することによりさらに増強でき、その後ＮＨＳやＰＦＰエステルに変換される。例えば、以下の構造を有するＳＰＡＥ−ＰＥＯ４−ＰＦＰを製造した。

０．５ｍｌの無水メタノール中５．８ｍｇ（１０．６マイクロモル）のＳＰＡＥの新たに調製した溶液を、０．２ｍｌのメタノール中３２ｍｇ（８２マイクロモル）のテトラエチレングリコールアミノプロピオン酸および３２μｌ（０．１８ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンの撹拌溶液に添加した。アルゴン下室温暗所で１時間反応させた。混合物を２０μｌの氷酢酸を添加して酸性とし、０．２ｍｌに濃縮した。水（０．４ｍｌ）を添加し、アセトニトリルの線形グラジエントを用いて３６０ｎｍで吸光度を監視しながら、１０ｍｍ×２５０ｍｍフェノメネックスルナＣ１８（２）カラムを通してＨＰＬＣにより生成物を精製した。グラジエントプログラムは、１０％Ｂを２分間、１０％から９０％Ｂを１６分間、９０％Ｂを３分間、９０％Ｂから１０％Ｂを１分間、１０％Ｂを２分間。（溶媒Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸、溶媒Ｂ＝アセトニトリル）。保持時間１６分の分画は、ＳＰＡＥ−テトラエチレングリコールプロピオン酸（ＵＶ可視スペクトルに基づき３．２マイクロモル（収率３０％））を含んでいた。ＥＳＩマススペクトルのポジティブモードでｍ／ｚ＝７７７（アクリジニウムスルホン酸カルボン酸）、ｍ／ｚ＝７９９（アクリジニウムカルボン酸スルホン酸ナトリウム）、ネガティブモードでｍ／ｚ＝８０７（メトキシアダクトスルホネートアニオン）、ｍ／ｚ＝４０３（メトキシアダクトスルホネートカルボキシレートジアニオン）。

０．２乾燥ＤＭＦ中ＳＰＡＥ−テトラエチレングリコールプロピオン酸（０．７７マイクロモル）、２．６６μｌ（１５．５マイクロモル）のペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸および１．３μｌ（１６マイクロモル）ピリジンの混合物を、アルゴン下室温暗所で１時間撹拌した。反応混合物を４つのビンに分注し、揮発分を減圧除去してＳＰＡＥ−ＰＥＯ４−ＰＦＰを得た。ＥＳＩマススペクトルは、ポジティブモードでｍ／ｚ＝９４３（アクリジニウムＰＦＰエステルスルホン酸）、ｍ／ｚ＝９６５（アクリジニウムＰＦＰエステルスルホン酸ナトリウム）、ネガティブモードでｍ／ｚ＝９７３（ＰＦＰエステルメトキシアダクトスルホネートアニオン）。

ＳＰＡＥ−（Ｌｙｓ−ＨＣＡ）₅−ＰＦＰ
ペプチド骨格のペンダント基に結合したいくつかのアクリジニウムラベルを保持できる親水性ペプチドリンカーを用いることにより、シグナルの増幅が達成できる。このペプチド増幅剤は、水溶性を向上させるように規則的な間隔でいくつかのスルホン酸基も保持でき、また、タンパク質への共有結合による結合基となるアミン反応性官能基も保持できる。このようなラベル化戦略による１つの有利な点は、ほとんどのリジンが無傷で免疫親和性を保持したまま、高度に特異的な化学発光活性を達成できることにある。このような増幅剤の例としては、ＳＰＡＥ−（Ｌｙｓ−ＨＣＡ）₅−ＰＦＰがある。この例示的分子の合成は、図３に模式的に提供され、以下にさらに詳細を示す。

増幅剤ペプチドＳＰＡＥ−（Ｌｙｓ−ＨＣＡ）₅は、ジイソプロピルエチルアミンのような塩基の存在下で、合成ペプチドＬｙｓ−ＨＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣＡ（ＨＣＡ＝ホモシステイン酸）と過剰のＳＰＡＥ（ペプチド１モル当たり＞１０モルのＳＰＡＥ）とを反応させることにより得られた。得られた複数のアクリジニウムペプチドカルボン酸をゲル濾過により精製し、過剰のペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸で処理してアミン反応性ＰＦＰエステルを得た。

アクリジニウム−タンパク質コンジュゲートの製造
本発明の化学発光化合物は、抗体、抗体フラグメント、アビジン若しくはストレプトアビジン、Ａタンパク質若しくはＧタンパク質、オリゴヌクレオチド、リガンド、またはハプテンのような特異的結合パートナーと反応しうる。塩化スルホニル基は、水溶液または水溶液／有機バッファー混合溶液中でタンパク質のリジン若しくは末端アミノ基と容易に反応し、典型的にはｐＨ＞９で、図４のスキームに示すような安定なスルホンアミド結合を生じる。抗−ＴＳＨをＳＰＡＥでラベル化するのに用いられる以下の例示工程は、一般的に塩化スルホニル試薬を用いてアクリジニウム−抗体コンジュゲートを製造するのに適用できる。

ＳＰＡＥを用いたコンジュゲートの製造において、１ｍｇ（６．７ナノモル）のヤギ抗−ＴＳＨタグ抗体を、アミコンセントリコン濃縮カートリッジ（分子量カットオフ＝３０，０００）中でバッファー交換し、４００μｌの１００ｍＭ炭酸ｐＨ９．６中１ｍｇの抗体の溶液を得た。典型的なコンジュゲートでは、３６８ｎｍにおけるＵＶ可視吸収を測定した乾燥ＤＭＦ中ラベル化剤（７μｌの新たに調製した２２．８ｍＭのＳＰＡＥ（分子量＝５４７））を加え、混合物を振盪した。室温で３０分間時々振盪しながら、コンジュゲート反応を進行させた。床体積２：１のセファデックスＧ−７５およびセファロース６Ｂを含む２７ｃｍ×１ｃｍのカラムを通したゲル濾過により、コンジュゲートを精製した。カラムは、２８０ｎｍでＵＶ吸収を監視しながら１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸ｐＨ６．０で溶出させた。１２分、１８分及び３２分の溶出時間を有する分画は、それぞれ、抗体凝集物、抗体−ＳＰＡＥコンジュゲートおよび加水分解した過剰のラベル化剤を含んでいた。クマシーブルー色測定タンパク質アッセイに基づくタンパク質の回収率は、７３％であった。ｐＨ２に酸性化されたコンジュゲート分画分注のＵＶ可視スペクトルを記録し、ＩｇＧ１分子当たりのアクリジニウムラベル数を測定した。それぞれ、３６８ｎｍ（ε＝１５，７００Ｍ^-1ｃｍ^-1）および２８０ｎｍ（１ｍｇ／ｍｌ溶液における消滅係数＝１．３５Ｏ．Ｄ．）におけるアクリジニウムおよびタンパク質の吸収に基づいて、コンジュゲートはＩｇＧ１分子当たり２．６のラベルを含むと見積もられた。バートホールド化学発光計を用いて測定されたこのコンジュゲートの特異的化学発光活性は、７４３ＲＬＵ／ｐｇであった。

ＮＨＳエステル活性化アクリジニウム化合物は、ｐＨ７〜９の範囲の水溶液中でタンパク質のアミノ基と反応して、図５ａのスキームに示すような安定なアミド結合を生じる。同様の様式で、ペンタフルオロフェニルエステル基は、水溶性バッファー溶液中でタンパク質のアミノ基と反応し、典型的にはｐＨ７〜８で、図５ｂのスキームに示すような安定なアミド結合を介して結合したラベルを有するバイオコンジュゲートを生じる。以下の工程を用いて、ＮＨＳまたはＰＦＰ活性アクリジニウム誘導体を有する例示的コンジュゲートを製造した。

アクリジニウム−ＮＨＳ試薬を用いたコンジュゲートの製造
典型的なコンジュゲート反応において、１．５ｍｇのヤギポリクローナル抗−ＴＳＨ抗体を、分子量３０，０００カットオフアミコンセントリコン濃縮器で２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．８により２度バッファー交換して、６００μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ抗体溶液を得た。ＭｅＡＧｌｙ２−ＮＨＳ（ＵＶ可視吸収に基づいて６６μｌの２．２７ｍＭ溶液）を添加して、１５Ｘの試薬／抗体モル比を得た。室温で１時間時々混合しながら、コンジュゲーションを進行させた。ＳＰＡＥコンジュゲートと同様の方法により、混合床カラムを通してゲル濾過により、コンジュゲートを精製した。ＵＶ吸収に基づく回収率は、８７％であった。コンジュゲートは、ＵＶ可視吸収に基づいて、抗体当たり１．４のアクリジニウムラベルを含んでいることを確認した。

アクリジニウム−ＰＦＰ試薬を用いたコンジュゲートの製造
ヤギポリクローナル抗−ＴＳＨ抗体（１．１２ｍｇ）を２度バッファー交換して、１００ｍＭリン酸ｐＨ７．４中４５０μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ抗体溶液を得た。新たに調製した乾燥アセトニトリル中ＳＰＡＥ−ＰＥＯ−ＰＦＰ（ＵＶ可視吸収に基づき４０μｌの４．２ｍＭ溶液）を混合しながら添加して２２Ｘの試薬／抗体モル比を得、室温暗所で１時間コンジュゲーションを進行させた。１０μｌの水中１Ｍグリシンを添加することにより反応を終え、ＳＰＡＥコンジュゲートと同様の方法で、混合床ゲル濾過カラムを通して混合物をクロマトグラフィーにかけた。特異的化学発光活性は、３３２ＲＬＵ／ｐｇであった。

コンジュゲートの分析
抗−ＴＳＨおよび抗−ＡＣＴＨを種々のモル比で親水性アクリジニウム化合物にラベル化した。タンパク質の回収率は、クマシーブルー色測定タンパク質アッセイにより測定した。結果を以下に要約する。比較的疎水性のＭｅＡＥ化合物と比較すると、親水性ラベルは、とても高いタンパク質回収率がある。非常に高濃度のアクリジニウムラベルが、親水性ラベルにより達成された。

アッセイ結果
アッセイは、ニコルスアドバンテージスペシャルティシステムのニコルスアドバンテージアッセイの洗浄剤および誘導剤を用いて行った。アッセイ結果は、市販のニコルスアドバンテージイムノアッセイキットの磁気粒子、ビオンチン化抗体、バッファーおよび標準試薬を用いて得た。

ＴＳＨアッセイプロトコル
１．ビオンチン化モノクローナル抗−ＴＳＨおよびアクリジニウムラベル化ポリクローナルヤギ抗−ＴＳＨを含む溶液２５μｌをピペット分注する。
２．患者のサンプル２００μｌをピペット分注する。
３．３７度で２０分間インキュベートする。
４．アッセイバッファー５０μｌおよびストレプトアビジン被覆磁気粒子１３μｌをピペット分注する。
５．３７度で１０分間インキュベートする。
６．アッセイ洗浄液で３回洗浄する。
７．誘導およびカウントを行う（２秒間）。

ＡＣＴＨアッセイプロトコル
１．ビオンチン化モノクローナル抗−ＴＳＨ７０μｌをピペット分注する。
２．アクリジニウムラベル化モノクローナル抗−ＴＳＨ２０μｌをピペット分注する。
３．患者のサンプルまたは標準液１５０μｌをピペット分注する。
４．３７度で２０分間インキュベートする。
５．ストレプトアビジン被覆磁気粒子２０μｌおよびバッファー１５０μｌをピペット分注する。
６．３７度で１０分間インキュベートする。
７．アッセイ洗浄液で３回洗浄する。
８．誘導およびカウントを行う（２秒間）。

高いアクリジニウムラベルが親水性アクリジニウムエステルで達成されたので、アッセイにおいて少量の抗体しか必要とされなかった。使用したトレーサー抗体の量は、ＴＳＨアッセイでは１／２に減少し、ＡＣＴＨアッセイでは１／３に減少した。非常に少ない抗体でさえ、親水性アクリジニウムエステルでラベル化された抗体は、すべての標準濃度においてノイズに対して高いシグナル比を有する、改良された標準曲線を示した。

分析感度（検出限界）を、標準曲線のゼロ標準のｎ＝２０の繰り返し測定からの＋２ＳＤ応答を読むことにより測定した。新規親水性アクリジニウムラベル化抗体を用いることにより、相対的に疎水性のアクリジニウム（ＭｅＡＥ）ラベル化抗体に比べ低い抗体の濃度において、ＴＳＨおよびＡＣＴＨの両アッセイの分析感度は、顕著に改善された。

他に規定されるほか、ここで用いられるすべての技術および化学用語は、この発明が属する分野における通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。ここで記載されるのと類似のまたは等価の方法および物質が本発明の実施や試験に用いることができるが、適切な方法および物質は、以下に記載される。ここで言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照することによりその全体を本明細書に取り込むものとする。抵触する場合、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、物質、方法および実施例は、例示のためのみであり、限定する意図ではない。

本発明は、その好ましい態様を明確にしてこれらを参照して詳細に記載したが、修飾や変更が、ここに記載され特許請求の範囲に示された精神および範囲内にあることが理解される。

図１は、ラベル化剤として有用な本発明の親水性化学発光化合物の製造例を示す反応スキームである。 図２は、２，６−（ジメチル）−３−クロロスルホニルフェニル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート（「ＳＰＡＥ」）の製造を示す反応スキームである。 図３は、ＳＰＡＥ−（Ｌｙｓ−ＨＣＡ）₅−ＰＦＰの製造を示す反応スキームである。 図４は、本発明のアクリジニウム−タンパク質コンジュゲートの製造例を示す反応スキームである。 図５は、本発明のＮＨＳエステル（図５ａ）およびペンタフルオロフェニルエステル（図５ｂ）を用いたアクリジニウム−タンパク質コンジュゲートの製造例を示す反応スキームである。 図５は、本発明のＮＨＳエステル（図５ａ）およびペンタフルオロフェニルエステル（図５ｂ）を用いたアクリジニウム−タンパク質コンジュゲートの製造例を示す反応スキームである。 図６は、いくつかのアクリジニウムラベル化剤（例えばＭｅＡＥおよびＳＰＡＥ誘導体）の化学構造を示す。

Claims (22)

1. 以下の構造を有する化学発光化合物。
   （Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＲ’を示し、Ｒ’はＨ、アルキルまたは置換基を有するアルキルであり、
   Ｙは、ＯまたはＳを示し、
   Ｚは、スルホアルキル、またはスルホアルケニルを示し、
   Ａｒは、少なくとも１つのＳＯ₂Ｌ置換基を有するアリールまたはヘテロアリールを示し、
   Ｌは、ＮＨＱであり、
   Ｑは、アミン反応性基を有するリンカーであって、ポリオキシアルキレン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（リジン−ホモシステイン酸）、ポリ（リジン−システイン酸）、ポリグリシンまたはアミノデキストランであり、
   Ｒは、スルホアルキルまたはスルホアルケニルを示し、
   ｎは０〜３である。）
2. ＸがＯである、請求項１に記載の化合物。
3. ＹがＯである、請求項１に記載の化合物。
4. Ｚが以下の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
   −（ＣＲ”₂）_q−ＳＯ₃ ^-
   Ｒ”は、それぞれ独立にＨ、低級アルキルまたは置換基を有する低級アルキルを示し、ｑは１〜６を示す。
5. Ｚがスルホプロピルである、請求項４に記載の化合物。
6. Ｚが以下の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
   −（ＣＲ”₂）_r−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ”）−（ＣＲ”₂）_r−ＳＯ₃ ^-
   Ｒ”は、それぞれ独立にＨ、低級アルキルまたは置換基を有する低級アルキルを示し、ｒはそれぞれ独立に０〜４を示す。
7. Ａｒがアリールである、請求項１に記載の化合物。
8. 前記アリールが２，６−ジアルキル置換されている、請求項７に記載の化合物。
9. Ａｒが以下の構造を有する、請求項８に記載の化合物。
   
10. Ａｒがヘテロアリールである、請求項１に記載の化合物。
11. 前記ヘテロアリールが、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、イソチオアゾリル、またはイミダゾリルである、請求項１０に記載の化合物。
12. アミン反応性基が、サクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、ジクロロトリアジンまたはイソチオシアネートである、請求項１に記載の化合物。
13. ２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニルオキシ−１−カルボニル−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデシル−（１５−アミノ）−３’−スルホニル−２’，６’−ジメチルフェニル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート、または、
    ［２，５−ジオキソ−（１−ピロリジニル）オキシ］−１−カルボニル−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデシル−（１５−アミノ）−３’−スルホニル−２’，６’−ジメチルフェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートである、請求項１に記載の化合物。
14. 以下の構造を有する化学発光化合物。
    （Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＲ’を示し、Ｒ’はＨ、アルキルまたは置換基を有するアルキルであり、
    Ｙは、ＯまたはＳを示し、
    Ｚは、アルキル、スルホアルキル、アルケニル、またはスルホアルケニルを示し、
    Ａｒは、少なくとも１つのＳＯ₂Ｌ置換基を有するアリールまたはヘテロアリールを示し、
    ＬはＮＨＱであり、
    Ｑは、ポリオキシアルキレン、ポリ（リジン−ホモシステイン酸）、またはポリ（リジン−システイン酸）のアミン反応性基を有するリンカーであり、
    Ｒは、スルホアルキルまたはスルホアルケニルを示し、
    Ｚがアルキルまたはアルケニルの時は、Ａ^-が適切な対イオンとして存在し、Ｚがスルホアルキルまたはスルホアルケニルの時は、Ａ^-は存在せず、
    ｎは０〜３である。）
15. ＸがＯである、請求項１４に記載の化合物。
16. ＹがＯである、請求項１４に記載の化合物。
17. Ｚがスルホプロピルである、請求項１４に記載の化合物。
18. 特異的結合物質にコンジュゲートした請求項１または１４に記載の化学発光化合物を含む、化学発光コンジュゲート。
19. 前記特異的結合物質が抗体である、請求項１８に記載のコンジュゲート。
20. 請求項１８に記載のコンジュゲートを含む、化学発光アッセイキット。
21. サンプル中の分析物の存在をアッセイする方法であって、分析物を請求項１８に記載のコンジュゲートに接触させること、過酸化物または分子酸素の存在下で形成される中間体の消失により化学発光を誘発させること、および化学発光を測定して分析対象をアッセイすること、を含むアッセイ方法。
22. 特異的結合物質にコンジュゲートした化学発光ラベルを用いた分析物の検出のための診断アッセイ方法において、化学発光ラベル化合物として請求項１または１４に記載の化合物を用いることを含む、改良したアッセイ方法。