JP2003050204A - 親水性修飾剤を有するアクリジニウムエステル標識 - Google Patents
親水性修飾剤を有するアクリジニウムエステル標識Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 親水性修飾剤を有する検出可能な化学発光ア
クリジニウムエステル標識、そのような標識を含む組成
物、錯体、および／またはコンジュゲート、ならびにそ
のような標識を使用する標的分析物の生物分析アッセイ
の実施方法を提供すること。 【解決手段】 フォレート、テオフィリン、およびトブ
ラマイシンのアッセイ（そのような標識を非イオン性ポ
リエチレングリコール、ポリイオン性スペルミンジスル
ホナート、およびポリイオン性スペルミンジカルボキシ
ラートなどの親水性修飾剤と共に用いる）が詳述されて
いる。
クリジニウムエステル標識、そのような標識を含む組成
物、錯体、および／またはコンジュゲート、ならびにそ
のような標識を使用する標的分析物の生物分析アッセイ
の実施方法を提供すること。 【解決手段】 フォレート、テオフィリン、およびトブ
ラマイシンのアッセイ（そのような標識を非イオン性ポ
リエチレングリコール、ポリイオン性スペルミンジスル
ホナート、およびポリイオン性スペルミンジカルボキシ
ラートなどの親水性修飾剤と共に用いる）が詳述されて
いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物分析の応用分
野で有用であり、一般に、親水性修飾剤を有する検出可
能な化学発光アクリジニウムエステル標識、そのような
標識を含む組成物、錯体、および／またはコンジュゲー
ト、ならびにそのような標識を使用する標的分析物の生
物分析アッセイを行うための方法に関する。
野で有用であり、一般に、親水性修飾剤を有する検出可
能な化学発光アクリジニウムエステル標識、そのような
標識を含む組成物、錯体、および／またはコンジュゲー
ト、ならびにそのような標識を使用する標的分析物の生
物分析アッセイを行うための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アクリジニウムエステルは、イムノアッ
セイおよび核酸アッセイの分野で広範に使用されてきた
非常に有用な化学発光標識である。以下の各特許文書
は、（ａ）それぞれの全体が参照により本明細書に合体
され、かつ（ｂ）アクリジニウムエステル化合物の生物
分析への応用例の様々な態様に関する。ＥＰ０２６３６
５７、ＵＳ４７４５１８１、ＥＰ０３５３９７１、ＥＰ
０３６１８１７、ＵＳ４９１８１９２、ＵＳ５１１０９
３２、ＵＳ５２２７４８９、ＵＳ５２４１０７０、ＥＰ
０６１７２８８、ＷＯ９４２１８２３、ＵＳ５３９５７
５２、ＥＰ０６６１２７０、ＵＳ５４４９５５６、ＷＯ
９５２７７０２、ＵＳ５５３８９０１、ＵＳ５５９５８
７５、ＥＰ０７５４１７８、ＵＳ５６５６４２６、ＵＳ
５６５６５００、ＵＳ５６６３０７４、ＵＳ５７０２８
８７、ＷＯ９８５４５７４、ＵＳ５８７９８９４、ＷＯ
９９１１８１３、ＷＯ０００９４８７、ＥＰ０９８２２
９８、ＥＰ０９８８５５１、ＷＯ００３１５４３、ＥＰ
１００９８５２、ＵＳ６０８０５９１、ＥＰ１０４９９
３３、ＵＳ６１６５８００、ＷＯ０１０９３７２、およ
びＥＰ１１０４４０５。
セイおよび核酸アッセイの分野で広範に使用されてきた
非常に有用な化学発光標識である。以下の各特許文書
は、（ａ）それぞれの全体が参照により本明細書に合体
され、かつ（ｂ）アクリジニウムエステル化合物の生物
分析への応用例の様々な態様に関する。ＥＰ０２６３６
５７、ＵＳ４７４５１８１、ＥＰ０３５３９７１、ＥＰ
０３６１８１７、ＵＳ４９１８１９２、ＵＳ５１１０９
３２、ＵＳ５２２７４８９、ＵＳ５２４１０７０、ＥＰ
０６１７２８８、ＷＯ９４２１８２３、ＵＳ５３９５７
５２、ＥＰ０６６１２７０、ＵＳ５４４９５５６、ＷＯ
９５２７７０２、ＵＳ５５３８９０１、ＵＳ５５９５８
７５、ＥＰ０７５４１７８、ＵＳ５６５６４２６、ＵＳ
５６５６５００、ＵＳ５６６３０７４、ＵＳ５７０２８
８７、ＷＯ９８５４５７４、ＵＳ５８７９８９４、ＷＯ
９９１１８１３、ＷＯ０００９４８７、ＥＰ０９８２２
９８、ＥＰ０９８８５５１、ＷＯ００３１５４３、ＥＰ
１００９８５２、ＵＳ６０８０５９１、ＥＰ１０４９９
３３、ＵＳ６１６５８００、ＷＯ０１０９３７２、およ
びＥＰ１１０４４０５。
【０００３】親水性修飾剤を欠く、いくつかの特定の検
出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識が、当該
技術分野で既知であり、例えば、２’，６’−ジメチル
−４’−［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル］フ
ェニル−１０−メチル−９−アクリジンカルボキシラー
トおよび２’，６’−ジメチル−４’−［Ｎ−スクシン
イミジルオキシカルボニル］フェニル−１０−スルホプ
ロピル−９−アクリジンカルボキシラート（各標識を、
以下それぞれ「ＤＭＡＥ−ＮＨＳ」および「ＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＮＨＳ」と呼ぶ）であり、それらはＢａｙｅｒ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｇｒｏ
ｕｐ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、５１１Ｂｅｎｅｄｉｃ
ｔ Ａｖｅｎｕｅ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ１０５９１−５０９７からイムノアッセイ機器シス
テム用に市販されている。読者の便宜のため、これらの
化合物の各構造を下記に示す。
出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識が、当該
技術分野で既知であり、例えば、２’，６’−ジメチル
−４’−［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル］フ
ェニル−１０−メチル−９−アクリジンカルボキシラー
トおよび２’，６’−ジメチル−４’−［Ｎ−スクシン
イミジルオキシカルボニル］フェニル−１０−スルホプ
ロピル−９−アクリジンカルボキシラート（各標識を、
以下それぞれ「ＤＭＡＥ−ＮＨＳ」および「ＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＮＨＳ」と呼ぶ）であり、それらはＢａｙｅｒ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｇｒｏ
ｕｐ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、５１１Ｂｅｎｅｄｉｃ
ｔ Ａｖｅｎｕｅ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ１０５９１−５０９７からイムノアッセイ機器シス
テム用に市販されている。読者の便宜のため、これらの
化合物の各構造を下記に示す。
【化１】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述のとおり、本発明
は、広く親水性修飾剤を有する検出可能な化学発光アク
リジニウムエステル標識を対象とする。本発明の標識の
いくつかの好ましい実施形態において、本発明者等は、
ＮＳＰ−ＤＭＡＥに２種類の構造要素を組み込み、これ
らの修飾がイムノアッセイにおいて向上した性能を示す
ユニークなハプテントレーサーの調製を可能にすること
を見出した。３種類の異なる臨床的に関連する分析物、
すなわち、ビタミンである葉酸塩、喘息薬であるテオフ
ィリン、およびアミノグリコシド抗生物質であるトブラ
マイシンを用いて、本発明者等の発見の普遍性を明らか
にする。
は、広く親水性修飾剤を有する検出可能な化学発光アク
リジニウムエステル標識を対象とする。本発明の標識の
いくつかの好ましい実施形態において、本発明者等は、
ＮＳＰ−ＤＭＡＥに２種類の構造要素を組み込み、これ
らの修飾がイムノアッセイにおいて向上した性能を示す
ユニークなハプテントレーサーの調製を可能にすること
を見出した。３種類の異なる臨床的に関連する分析物、
すなわち、ビタミンである葉酸塩、喘息薬であるテオフ
ィリン、およびアミノグリコシド抗生物質であるトブラ
マイシンを用いて、本発明者等の発見の普遍性を明らか
にする。
【０００５】本発明の標識を深く考察する前に、アッセ
イフォーマットの簡単な概観を下記に示す。競合イムノ
アッセイは、共通して、（ａ）問題の分析物を蛍光また
は化学発光標識したコンジュゲートが、アッセイ中でト
レーサーとして使用されているフォーマットを用い、
（ｂ）固体支持体を利用している。そのような競合アッ
セイの典型的な構成は、３種の要素、すなわち、トレー
サー、問題の分析物を含むサンプル、および結合した分
析物と結合していない分析物の分離方法からなる。（た
だし、均一イムノアッセイでは分離は行われないことに
注意されたい。）例えば、常磁性粒子などの固体支持体
上への葉酸結合タンパク質の固定化（以下、「ＰＭＰ」
と呼ぶ）は、遊離した分析物と結合した分析物（この場
合の分析物は、葉酸である）のそのような分離（磁気）
を実施するための手段を提供する。トレーサーがアッセ
イに含まれるとき、固定化タンパク質に結合するために
サンプルからの分析物と競合する。アッセイ中の分析物
のレベルが上昇すると、結果として固定化タンパク質に
結合するトレーサーが減少する。
イフォーマットの簡単な概観を下記に示す。競合イムノ
アッセイは、共通して、（ａ）問題の分析物を蛍光また
は化学発光標識したコンジュゲートが、アッセイ中でト
レーサーとして使用されているフォーマットを用い、
（ｂ）固体支持体を利用している。そのような競合アッ
セイの典型的な構成は、３種の要素、すなわち、トレー
サー、問題の分析物を含むサンプル、および結合した分
析物と結合していない分析物の分離方法からなる。（た
だし、均一イムノアッセイでは分離は行われないことに
注意されたい。）例えば、常磁性粒子などの固体支持体
上への葉酸結合タンパク質の固定化（以下、「ＰＭＰ」
と呼ぶ）は、遊離した分析物と結合した分析物（この場
合の分析物は、葉酸である）のそのような分離（磁気）
を実施するための手段を提供する。トレーサーがアッセ
イに含まれるとき、固定化タンパク質に結合するために
サンプルからの分析物と競合する。アッセイ中の分析物
のレベルが上昇すると、結果として固定化タンパク質に
結合するトレーサーが減少する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】以下に詳述するとおり、
（また後でさらに例示するように）ハプテントレーサー
の分離に特に有用な２種のスペーサー、（ａ）非イオン
性ポリエチレングリコール、ならびに（ｂ）ポリイオン
性スペルミンジスルホナートおよびポリイオン性スペル
ミンジカルボキシラートが開発された。
（また後でさらに例示するように）ハプテントレーサー
の分離に特に有用な２種のスペーサー、（ａ）非イオン
性ポリエチレングリコール、ならびに（ｂ）ポリイオン
性スペルミンジスルホナートおよびポリイオン性スペル
ミンジカルボキシラートが開発された。
【０００７】ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥ
Ｇ」と呼ぶ）は、よく知られたポリマーである。それ
は、生体適合性であり、水性溶媒および有機溶媒のどち
らにも可溶性であり、無毒性であり、非免疫原性であ
る。従来技術では、低分子量の薬から大きなタンパク質
まで、さらにはリポソームなどの大きな集塊にいたるま
での様々な分子の修飾剤として広範に使用されている。
薬剤のＰＥＧコンジュゲートは、向上した可溶性を示
し、血流中でより長く生存する。タンパク質とペプチド
のＰＥＧ修飾は、溶解性を向上させ、タンパク質分解に
対する抵抗性を与え、免疫原性を低下させる。オリゴヌ
クレオチドのＰＥＧ修飾は、溶解性を高め、ヌクレアー
ゼ安定性を与える。脂質のＰＥＧ修飾により、立体的に
安定で、向上した血液循環時間を示すＰＥＧグラフトさ
れたリポソームの調製が可能となる。ＰＥＧの使用に関
する従来技術の優れた考案が、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９
９５、６、ｐｐ．１５０〜１６５に記載されており、そ
の全体を参照により本明細書中に合体する。ＰＥＧを使
用して蛍光染料の性質を修飾することも従来技術に記載
されている。ＰＥＧ修飾された蛍光ポルフィリンおよび
フタロシアニン染料は、水溶液中で凝集挙動の減少、な
らびにＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）などのヒト血清の
成分への非特異的結合の低減を示すことが証明された。
これらのコンジュゲートはまた、長い蛍光減衰時間を示
す（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４２４およびＰＣＴ／ＵＳ
９１／０３４２６）。そのようなコンジュゲートの蛍光
イムノアッセイへの応用例、ｉｎ ｖｉｖｏイメージン
グ、およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍療法が、同じ著者によっ
て提案されている。
Ｇ」と呼ぶ）は、よく知られたポリマーである。それ
は、生体適合性であり、水性溶媒および有機溶媒のどち
らにも可溶性であり、無毒性であり、非免疫原性であ
る。従来技術では、低分子量の薬から大きなタンパク質
まで、さらにはリポソームなどの大きな集塊にいたるま
での様々な分子の修飾剤として広範に使用されている。
薬剤のＰＥＧコンジュゲートは、向上した可溶性を示
し、血流中でより長く生存する。タンパク質とペプチド
のＰＥＧ修飾は、溶解性を向上させ、タンパク質分解に
対する抵抗性を与え、免疫原性を低下させる。オリゴヌ
クレオチドのＰＥＧ修飾は、溶解性を高め、ヌクレアー
ゼ安定性を与える。脂質のＰＥＧ修飾により、立体的に
安定で、向上した血液循環時間を示すＰＥＧグラフトさ
れたリポソームの調製が可能となる。ＰＥＧの使用に関
する従来技術の優れた考案が、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９
９５、６、ｐｐ．１５０〜１６５に記載されており、そ
の全体を参照により本明細書中に合体する。ＰＥＧを使
用して蛍光染料の性質を修飾することも従来技術に記載
されている。ＰＥＧ修飾された蛍光ポルフィリンおよび
フタロシアニン染料は、水溶液中で凝集挙動の減少、な
らびにＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）などのヒト血清の
成分への非特異的結合の低減を示すことが証明された。
これらのコンジュゲートはまた、長い蛍光減衰時間を示
す（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４２４およびＰＣＴ／ＵＳ
９１／０３４２６）。そのようなコンジュゲートの蛍光
イムノアッセイへの応用例、ｉｎ ｖｉｖｏイメージン
グ、およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍療法が、同じ著者によっ
て提案されている。
【０００８】ＰＥＧの上記の使用にもかかわらず、ポリ
エチレングリコールによるアクリジニウムエステルの修
飾はこれまで記載されていない。同様に、イオン性官能
基を導入するための足場としてポリアミンであるスペル
ミンを用いて考案されたポリイオン性スペーサーも報告
されていない。本発明者等は、これらの後者の分子もア
クリジニウムエステルの修飾に非常に有用であることを
見出した。これらの修飾アクリジニウムエステルの合成
および応用例は、次のとおりである。
エチレングリコールによるアクリジニウムエステルの修
飾はこれまで記載されていない。同様に、イオン性官能
基を導入するための足場としてポリアミンであるスペル
ミンを用いて考案されたポリイオン性スペーサーも報告
されていない。本発明者等は、これらの後者の分子もア
クリジニウムエステルの修飾に非常に有用であることを
見出した。これらの修飾アクリジニウムエステルの合成
および応用例は、次のとおりである。
【０００９】上述したとおり、ビタミンである葉酸は、
臨床的に重要な分析物であり、一般にイムノアッセイ技
術を用いて測定される。密接に関連した化合物として、
プテロイン酸は、葉酸の単純化された構造変異体であ
り、これは葉酸に通常見られるグルタミン酸部分を欠い
ている。本発明者等は、プテロイン酸の２種の異なるＮ
ＳＰ−ＤＭＡＥコンジュゲートを調製した。一方は、疎
水性脂肪族（ヘキサメチレン）スペーサーを含み、他方
は、親水性ヘキサエチレングリコールスペーサーを含む
（図１および図２参照）。最初のトレーサーの合成は、
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳを１，６−ヘキサンジアミン
と反応させることによって実施された（以下、「ＨＤ」
と呼ぶ）。次いで、得られたアクリジニウムエステル誘
導体（以下、「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ」と呼ぶ）をＮ
10−トリフルオロアセチルプテロイン酸と縮合させ、次
いでコンジュゲートからトリフルオロアセチル保護基を
除去した。ＰＥＧスペーサーをもつ類似のトレーサーを
調製するために、短いジアミノヘキサエチレングリコー
ルを市販のヘキサエチレングリコールから合成した。ヘ
キサエチレングリコール中の２個のヒドロキシル基を、
メタンスルホン酸エステルに変換し、これを続いてアジ
ドで置き換えた。ジアジドヘキサエチレングリコールを
還元するとジアミノヘキサエチレングリコールが得ら
れ、次いで、これをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳと縮合さ
せた。得られたアクリジニウムエステル誘導体（以下、
「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ」と呼ぶ）を上記で議論し
たとおりプテロイン酸と結合させた。
臨床的に重要な分析物であり、一般にイムノアッセイ技
術を用いて測定される。密接に関連した化合物として、
プテロイン酸は、葉酸の単純化された構造変異体であ
り、これは葉酸に通常見られるグルタミン酸部分を欠い
ている。本発明者等は、プテロイン酸の２種の異なるＮ
ＳＰ−ＤＭＡＥコンジュゲートを調製した。一方は、疎
水性脂肪族（ヘキサメチレン）スペーサーを含み、他方
は、親水性ヘキサエチレングリコールスペーサーを含む
（図１および図２参照）。最初のトレーサーの合成は、
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳを１，６−ヘキサンジアミン
と反応させることによって実施された（以下、「ＨＤ」
と呼ぶ）。次いで、得られたアクリジニウムエステル誘
導体（以下、「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ」と呼ぶ）をＮ
10−トリフルオロアセチルプテロイン酸と縮合させ、次
いでコンジュゲートからトリフルオロアセチル保護基を
除去した。ＰＥＧスペーサーをもつ類似のトレーサーを
調製するために、短いジアミノヘキサエチレングリコー
ルを市販のヘキサエチレングリコールから合成した。ヘ
キサエチレングリコール中の２個のヒドロキシル基を、
メタンスルホン酸エステルに変換し、これを続いてアジ
ドで置き換えた。ジアジドヘキサエチレングリコールを
還元するとジアミノヘキサエチレングリコールが得ら
れ、次いで、これをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳと縮合さ
せた。得られたアクリジニウムエステル誘導体（以下、
「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ」と呼ぶ）を上記で議論し
たとおりプテロイン酸と結合させた。
【００１０】次に、この２種の異なるＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−プテロアート（ｐｔｅｒｏａｔｅ）コンジュゲートを
フォレート（ｆｏｌａｔｅ）イムノアッセイで評価した
（実施例５、表１〜３、および図３）。このアッセイフ
ォーマットにおいて、フォレート結合タンパク質は、Ｐ
ＭＰ上に固定化され、２種のトレーサーは、分析物であ
る葉酸と競合する。用量応答曲線を図３に示す。アッセ
イデータを得るために使用した方法および種々のアッセ
イパラメータの定義は、実施例５で説明する。表１〜３
は、アッセイの精度、アッセイの確度、およびアッセイ
の感度を要約したものである。アクリジニウムエステル
部分とプテロアート部分との間にヘキサエチレングリコ
ールスペーサーを導入すると、トレーサーの結合は２倍
を超える。それにより、Ｂ／Ｔと定義された結合したト
レーサーの画分は、ＰＥＧスペーサーをもつトレーサー
の場合、０．５３％から１．１５％に増加する（表
３）。明らかに、ポリエチレングリコールスペーサー
は、ＰＥＧ含有トレーサーの結合に対する任意の立体干
渉を緩和する。次に、本発明者等は、これもまたヘキサ
エチレングリコールスペーサーを含むＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−フォレートコンジュゲートを合成した（図４）。葉酸
中のα−カルボキシラートがフォレート結合タンパク質
によく結合するためには遊離したままでなければならな
いことは、従来技術で知られているので（Ｗａｎｇ，
Ｓ．等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９
６、７、ｐｐ．５６〜６２）、本発明者等は、まず特異
的ガンマリンクフォレートトレーサーを合成した。具体
的には、これは、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグ
ルタミン酸α−ｔｅｒｔ−ブチルエステルとＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧを縮合させることによって実施した（図
４）。得られたコンジュゲートから保護基を除去し、Ｎ
10−トリフルオロアセチルプテロイン酸とカップリング
させ、その後トリフルオロアセチル基を除去することに
より、短いポリエチレングリコールスペーサーを導入し
たガンマリンクフォレート−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサ
ーを得た。フォレートイムノアッセイでこのトレーサー
を評価すると、プテロアートトレーサーと比較して予想
していたよりも良好な結合（Ｂ／Ｔ １．８８％）が確
かに示された。本発明者等はまた、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブト
キシカルボニルグルタミン酸γ−ｔｅｒｔ−ブチルエス
テルから出発し、上記の反応と同じシーケンスに従って
特異的アルファリンクフォレートトレーサーを調製した
（図５）。得られたアルファリンクフォレートトレーサ
ーをフォレートイムノアッセイで評価すると、遊離のα
−カルボキシル基が欠如しているために結合は減少して
いた。様々なトレーサー間にはアッセイの精度またはア
ッセイの確度に差異が認められないので、ＨＥＧ含有ト
レーサーは、より低い非特異的結合を示した（表３）。
したがって、親水性修飾剤をもたないＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−ＨＤ−プテロアートは、最も高い非特異的結合を有す
る。親水性スペーサーをもつ類似のＨＥＧ含有トレーサ
ーは、非特異的結合が２倍以上低かった。２種のフォレ
ートトレーサーは、親水性ＨＥＧスペーサーを有するた
めに、より低い非特異的結合も有する。ＨＥＧ含有トレ
ーサーの非特異的結合がより少ない結合の増加はまた、
フォレートアッセイの動的範囲を拡大し、アッセイの感
度を向上させた（表３）。
−プテロアート（ｐｔｅｒｏａｔｅ）コンジュゲートを
フォレート（ｆｏｌａｔｅ）イムノアッセイで評価した
（実施例５、表１〜３、および図３）。このアッセイフ
ォーマットにおいて、フォレート結合タンパク質は、Ｐ
ＭＰ上に固定化され、２種のトレーサーは、分析物であ
る葉酸と競合する。用量応答曲線を図３に示す。アッセ
イデータを得るために使用した方法および種々のアッセ
イパラメータの定義は、実施例５で説明する。表１〜３
は、アッセイの精度、アッセイの確度、およびアッセイ
の感度を要約したものである。アクリジニウムエステル
部分とプテロアート部分との間にヘキサエチレングリコ
ールスペーサーを導入すると、トレーサーの結合は２倍
を超える。それにより、Ｂ／Ｔと定義された結合したト
レーサーの画分は、ＰＥＧスペーサーをもつトレーサー
の場合、０．５３％から１．１５％に増加する（表
３）。明らかに、ポリエチレングリコールスペーサー
は、ＰＥＧ含有トレーサーの結合に対する任意の立体干
渉を緩和する。次に、本発明者等は、これもまたヘキサ
エチレングリコールスペーサーを含むＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−フォレートコンジュゲートを合成した（図４）。葉酸
中のα−カルボキシラートがフォレート結合タンパク質
によく結合するためには遊離したままでなければならな
いことは、従来技術で知られているので（Ｗａｎｇ，
Ｓ．等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９
６、７、ｐｐ．５６〜６２）、本発明者等は、まず特異
的ガンマリンクフォレートトレーサーを合成した。具体
的には、これは、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグ
ルタミン酸α−ｔｅｒｔ−ブチルエステルとＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧを縮合させることによって実施した（図
４）。得られたコンジュゲートから保護基を除去し、Ｎ
10−トリフルオロアセチルプテロイン酸とカップリング
させ、その後トリフルオロアセチル基を除去することに
より、短いポリエチレングリコールスペーサーを導入し
たガンマリンクフォレート−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサ
ーを得た。フォレートイムノアッセイでこのトレーサー
を評価すると、プテロアートトレーサーと比較して予想
していたよりも良好な結合（Ｂ／Ｔ １．８８％）が確
かに示された。本発明者等はまた、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブト
キシカルボニルグルタミン酸γ−ｔｅｒｔ−ブチルエス
テルから出発し、上記の反応と同じシーケンスに従って
特異的アルファリンクフォレートトレーサーを調製した
（図５）。得られたアルファリンクフォレートトレーサ
ーをフォレートイムノアッセイで評価すると、遊離のα
−カルボキシル基が欠如しているために結合は減少して
いた。様々なトレーサー間にはアッセイの精度またはア
ッセイの確度に差異が認められないので、ＨＥＧ含有ト
レーサーは、より低い非特異的結合を示した（表３）。
したがって、親水性修飾剤をもたないＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−ＨＤ−プテロアートは、最も高い非特異的結合を有す
る。親水性スペーサーをもつ類似のＨＥＧ含有トレーサ
ーは、非特異的結合が２倍以上低かった。２種のフォレ
ートトレーサーは、親水性ＨＥＧスペーサーを有するた
めに、より低い非特異的結合も有する。ＨＥＧ含有トレ
ーサーの非特異的結合がより少ない結合の増加はまた、
フォレートアッセイの動的範囲を拡大し、アッセイの感
度を向上させた（表３）。
【００１１】アミノグリコシド抗生物質であるトブラマ
イシンのイムノアッセイで、本発明者等は、２種のトブ
ラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーのアッセイ性
能を比較した。そのうちの一方は（親水性）ヘキサエチ
レングリコールスペーサーを含み、他方は含まない。ト
ブラマイシンの抗体を生成する手順と、トブラマイシン
を他の小分子で部位特異的に修飾する手順は、以前に記
載されている（Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．等、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈ
ｅｍ．、１９８４、６２、ｐｐ．２４７１〜２４７
７）。トブラマイシンでは、６’−アミンが最も反応性
である（図６）。したがって、アミノグリコシドを１当
量のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳで処理すると、１：１ト
ブラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーを与える。
第２のトレーサーは、グルタル酸無水物と縮合させるこ
とによりＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧをグルタル酸誘導体
に変換することによって調製された。次いで、得られた
付加物（以下、「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラ
ート」と呼ぶ）中のカルボン酸をＮＨＳエステルに変換
し、トブラマイシン１当量とカップリングさせるとトレ
ーサーが得られた。
イシンのイムノアッセイで、本発明者等は、２種のトブ
ラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーのアッセイ性
能を比較した。そのうちの一方は（親水性）ヘキサエチ
レングリコールスペーサーを含み、他方は含まない。ト
ブラマイシンの抗体を生成する手順と、トブラマイシン
を他の小分子で部位特異的に修飾する手順は、以前に記
載されている（Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．等、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈ
ｅｍ．、１９８４、６２、ｐｐ．２４７１〜２４７
７）。トブラマイシンでは、６’−アミンが最も反応性
である（図６）。したがって、アミノグリコシドを１当
量のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳで処理すると、１：１ト
ブラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーを与える。
第２のトレーサーは、グルタル酸無水物と縮合させるこ
とによりＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧをグルタル酸誘導体
に変換することによって調製された。次いで、得られた
付加物（以下、「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラ
ート」と呼ぶ）中のカルボン酸をＮＨＳエステルに変換
し、トブラマイシン１当量とカップリングさせるとトレ
ーサーが得られた。
【００１２】トブラマイシンのイムノアッセイで２種の
トレーサーを検査すると、その２種のトレーサーのＰＭ
Ｐ上のトブラマイシン抗体への全体的な結合は同様であ
るが、親水性ＰＥＧ含有トレーサーの非特異的結合は通
常のトレーサーよりも２．５倍超低いことが明らかにな
った（実施例８の表４〜６、図７）。非特異的結合の増
加は、多くの場合疎水性と結びつき、それはトブラマイ
シンなどの高度に水溶性の分析物であっても顕著なの
で、トレーサー中にポリエチレングリコール修飾剤を導
入することは非常に有益である。２種のトレーサーに対
するアッセイの精度とアッセイの確度は同様であるが、
トブラマイシンアッセイの感度はＨＥＧ含有トレーサー
についてかなり良好であった（１．７倍低い、表６）。
トレーサーを検査すると、その２種のトレーサーのＰＭ
Ｐ上のトブラマイシン抗体への全体的な結合は同様であ
るが、親水性ＰＥＧ含有トレーサーの非特異的結合は通
常のトレーサーよりも２．５倍超低いことが明らかにな
った（実施例８の表４〜６、図７）。非特異的結合の増
加は、多くの場合疎水性と結びつき、それはトブラマイ
シンなどの高度に水溶性の分析物であっても顕著なの
で、トレーサー中にポリエチレングリコール修飾剤を導
入することは非常に有益である。２種のトレーサーに対
するアッセイの精度とアッセイの確度は同様であるが、
トブラマイシンアッセイの感度はＨＥＧ含有トレーサー
についてかなり良好であった（１．７倍低い、表６）。
【００１３】喘息薬分析物テオフィリンの場合、炭素６
個のスペーサーとヘキサエチレングリコールスペーサー
を含む２種のＮＳＰ−ＤＭＡＥテオフィリントレーサー
（図８および図９）に加え、本発明者等は、ポリイオン
性スペーサーを含む２種の新規なトレーサーを調製し
た。最初の２種のトレーサーは、８−カルボキシプロピ
ルテオフィリンのＮＨＳエステルをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−
ＨＤまたはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧのいずれかと縮合
させて簡単に調製した。ポリイオン性スペーサーをポリ
アミンであるスペルミンから誘導し、最初にその２種の
第１級アミンをフタルイミド基に変換して調製した。得
られた化合物、ビス（フタルイミド）スペルミンをニー
トな１，３−プロパンスルトン中で加熱することにより
２個の第２級アミンでアルキル化し、または無水コハク
酸でアシル化した（図８）。ヒドラジンでフタルイミド
保護基を除去すると、スペルミンジスルホナート（以
下、「ＳＰＤＳ」と呼ぶ）およびスペルミンジカルボキ
シラート（以下、「ＳＰＤＣ」と呼ぶ）が得られた。こ
れらの新しいスペーサーをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳと
カップリングさせ、得られたＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体を
８−カルボキシテオフィリンとカップリングさせた（図
９）。次いで、４種のテオフィリントレーサーをすべて
テオフィリンイムノアッセイで評価した（実施例１３、
表７〜９、図１０）。親水性ＰＥＧスペーサーを含むテ
オフィリントレーサーは、非親水性の炭素６個のスペー
サーをもつトレーサーと比べて、低い（２倍）非特異的
結合を示した。ＳＰＤＳスペーサーとＳＰＤＣスペーサ
ーを含むトレーサーは、さらにより低い非特異的結合を
有する（それぞれ疎水性ＨＤスペーサーより３．７倍お
よび３．１倍低い）。結合している間、４種のトレーサ
ーのアッセイの精度、およびアッセイの確度は同様であ
ったが、ポリカルボキシラートスペーサーＳＰＤＣを含
むトレーサーは、アッセイの感度を３倍以上高めた。ど
ちらのスペーサーもより低い非特異的結合を示したが、
その他の親水性スペーサーは、この特異的アッセイでそ
のような向上は示さなかった。
個のスペーサーとヘキサエチレングリコールスペーサー
を含む２種のＮＳＰ−ＤＭＡＥテオフィリントレーサー
（図８および図９）に加え、本発明者等は、ポリイオン
性スペーサーを含む２種の新規なトレーサーを調製し
た。最初の２種のトレーサーは、８−カルボキシプロピ
ルテオフィリンのＮＨＳエステルをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−
ＨＤまたはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧのいずれかと縮合
させて簡単に調製した。ポリイオン性スペーサーをポリ
アミンであるスペルミンから誘導し、最初にその２種の
第１級アミンをフタルイミド基に変換して調製した。得
られた化合物、ビス（フタルイミド）スペルミンをニー
トな１，３−プロパンスルトン中で加熱することにより
２個の第２級アミンでアルキル化し、または無水コハク
酸でアシル化した（図８）。ヒドラジンでフタルイミド
保護基を除去すると、スペルミンジスルホナート（以
下、「ＳＰＤＳ」と呼ぶ）およびスペルミンジカルボキ
シラート（以下、「ＳＰＤＣ」と呼ぶ）が得られた。こ
れらの新しいスペーサーをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳと
カップリングさせ、得られたＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体を
８−カルボキシテオフィリンとカップリングさせた（図
９）。次いで、４種のテオフィリントレーサーをすべて
テオフィリンイムノアッセイで評価した（実施例１３、
表７〜９、図１０）。親水性ＰＥＧスペーサーを含むテ
オフィリントレーサーは、非親水性の炭素６個のスペー
サーをもつトレーサーと比べて、低い（２倍）非特異的
結合を示した。ＳＰＤＳスペーサーとＳＰＤＣスペーサ
ーを含むトレーサーは、さらにより低い非特異的結合を
有する（それぞれ疎水性ＨＤスペーサーより３．７倍お
よび３．１倍低い）。結合している間、４種のトレーサ
ーのアッセイの精度、およびアッセイの確度は同様であ
ったが、ポリカルボキシラートスペーサーＳＰＤＣを含
むトレーサーは、アッセイの感度を３倍以上高めた。ど
ちらのスペーサーもより低い非特異的結合を示したが、
その他の親水性スペーサーは、この特異的アッセイでそ
のような向上は示さなかった。
【００１４】上記の一連の結果は、アクリジニウムエス
テル−ハプテンコンジュゲート中の親水性スペーサーの
有用性を明らかに示す。すべてのアッセイで有益なスペ
ーサーはないが、選択により、アッセイ性能に関してト
レーサーに最大の利益を与える親水性スペーサーは容易
に識別される。本発明者等は、この点に関して有用な２
つのタイプ（非イオン性およびポリイオン性）のスペー
サーを開示した。本発明により提供された方法から、当
業者は、異なる分析物と異なる標識を用いる様々なトレ
ーサーの調製に同方法を応用できることも明らかであ
る。したがって、本発明は、下記の一般構造のトレーサ
ーを開示している。 Ａ−Ｂ−Ｃ 式中、Ａは、プテロイン酸、葉酸、ステロイドなど問題
の分析物、テオフィリン、フェニトイン、ジゴキシンな
どの治療薬、トブラマイシン、フェノバルビタールなど
のアミノグリコシドであり、Ｂは、（ａ）分子量１５０
〜５０００のポリエチレングリコール、または（ｂ）ス
ペルミンまたは任意のポリアミン（必ずしもすべてでは
ないが、内部のアミンが、スルトン、無水物などの親水
性分子で修飾されている）から誘導されたポリイオン性
スペーサーであり、Ｃは、化学発光または蛍光標識であ
る。
テル−ハプテンコンジュゲート中の親水性スペーサーの
有用性を明らかに示す。すべてのアッセイで有益なスペ
ーサーはないが、選択により、アッセイ性能に関してト
レーサーに最大の利益を与える親水性スペーサーは容易
に識別される。本発明者等は、この点に関して有用な２
つのタイプ（非イオン性およびポリイオン性）のスペー
サーを開示した。本発明により提供された方法から、当
業者は、異なる分析物と異なる標識を用いる様々なトレ
ーサーの調製に同方法を応用できることも明らかであ
る。したがって、本発明は、下記の一般構造のトレーサ
ーを開示している。 Ａ−Ｂ−Ｃ 式中、Ａは、プテロイン酸、葉酸、ステロイドなど問題
の分析物、テオフィリン、フェニトイン、ジゴキシンな
どの治療薬、トブラマイシン、フェノバルビタールなど
のアミノグリコシドであり、Ｂは、（ａ）分子量１５０
〜５０００のポリエチレングリコール、または（ｂ）ス
ペルミンまたは任意のポリアミン（必ずしもすべてでは
ないが、内部のアミンが、スルトン、無水物などの親水
性分子で修飾されている）から誘導されたポリイオン性
スペーサーであり、Ｃは、化学発光または蛍光標識であ
る。
【００１５】親水性修飾剤の好ましいアクリジニウムエ
ステルコンジュゲートは、下記式の化合物を含む。
ステルコンジュゲートは、下記式の化合物を含む。
【化２】
式中、Ｒ1は、２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、
リン、および硫黄からなる群から選択された２０個まで
のヘテロ原子を有する、アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アリール、スルホエチル、スルホプロピル、スル
ホブチル、またはアラルキルであり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、
Ｒ7は、水素、アミノ、ヒドロキシル、ハライド、ニト
ロ、−ＣＮ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、ＮＨＣＯ
Ｒ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、または−ＣＯＮＨＲであ
り、Ｒは、２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、リ
ン、および硫黄からなる群から選択された２０個までの
ヘテロ原子を有するアルキル、アルケニル、アルキニ
ル、アリール、アラルキルであり、Ｒ4およびＲ8は、８
個までの炭素を有し、側鎖基が２個を超える炭素をもつ
分枝は有しないアルキル、アルケニル、アルキニル、ア
ラルキル、またはアルコキシルであり、Ｒ6は、置換Ｒ6
＝Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｒ10を表し、式中、Ｒは、場合により、
２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、リン、および硫
黄からなる群から選択された２０個までのヘテロ原子を
有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
アラルキルであり、Ｌは、エーテル、チオエーテル、ア
ミド、エステル、またはカルバマート結合であり、Ｓ
は、分子量３００〜５０００のポリエチレングリコール
であり、または以下の構造であり、
リン、および硫黄からなる群から選択された２０個まで
のヘテロ原子を有する、アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アリール、スルホエチル、スルホプロピル、スル
ホブチル、またはアラルキルであり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、
Ｒ7は、水素、アミノ、ヒドロキシル、ハライド、ニト
ロ、−ＣＮ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、ＮＨＣＯ
Ｒ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、または−ＣＯＮＨＲであ
り、Ｒは、２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、リ
ン、および硫黄からなる群から選択された２０個までの
ヘテロ原子を有するアルキル、アルケニル、アルキニ
ル、アリール、アラルキルであり、Ｒ4およびＲ8は、８
個までの炭素を有し、側鎖基が２個を超える炭素をもつ
分枝は有しないアルキル、アルケニル、アルキニル、ア
ラルキル、またはアルコキシルであり、Ｒ6は、置換Ｒ6
＝Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｒ10を表し、式中、Ｒは、場合により、
２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、リン、および硫
黄からなる群から選択された２０個までのヘテロ原子を
有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
アラルキルであり、Ｌは、エーテル、チオエーテル、ア
ミド、エステル、またはカルバマート結合であり、Ｓ
は、分子量３００〜５０００のポリエチレングリコール
であり、または以下の構造であり、
【化３】
あるいは、Ｒ6は、エステル結合にメタ位であるフェノ
キシ環の位置で結合することができ（この場合、Ｒ5ま
たはＲ7は、エステル結合にパラ位に結合している）、
Ｒ10は、求電子基、脱離基、または求核基である。
キシ環の位置で結合することができ（この場合、Ｒ5ま
たはＲ7は、エステル結合にパラ位に結合している）、
Ｒ10は、求電子基、脱離基、または求核基である。
【００１６】プテロアートトレーサーとフォレートトレ
ーサーの好ましい実施形態は、以下の構造で示される。
ーサーの好ましい実施形態は、以下の構造で示される。
【化４】
式中、Ｍは、Ｒ6が場合により、２４個までの炭素、な
らびに窒素、酸素、リン、および硫黄からなる群から選
択された２０個までのヘテロ原子を有するアルキル、ア
ルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルであるこ
とを除いて、上記で定義したとおりのアクリジニウムま
たはベンズアクリジニウムエステル誘導体であり、Ｌ
は、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、また
はカルバマート結合であり、Ｓは、上記で定義したとお
りのスペーサーある。
らびに窒素、酸素、リン、および硫黄からなる群から選
択された２０個までのヘテロ原子を有するアルキル、ア
ルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルであるこ
とを除いて、上記で定義したとおりのアクリジニウムま
たはベンズアクリジニウムエステル誘導体であり、Ｌ
は、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、また
はカルバマート結合であり、Ｓは、上記で定義したとお
りのスペーサーある。
【００１７】トブラマイシントレーサーおよびテオフィ
リントレーサーの好ましい実施形態は、以下の構造で示
す。
リントレーサーの好ましい実施形態は、以下の構造で示
す。
【化５】
式中、Ｓ、Ｌ、およびＭは、上記で定義したとおりであ
る。
る。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下の非限定的、典型的実施例
は、例示のためのものにすぎず、本発明が受ける権利の
ある特許保護の範囲を制限する意味はなく、その保護
は、頭記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
は、例示のためのものにすぎず、本発明が受ける権利の
ある特許保護の範囲を制限する意味はなく、その保護
は、頭記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００１９】実施例１
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤの合成を下記のとおり実施した
（図１）。ＤＭＦ（１ｍＬ）と０．１Ｍカルボナートｐ
Ｈ９（１ｍＬ）中の１，６−ジアミノヘキサン（４９ｍ
ｇ、０．４２ミリモル）をＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮＳＰ
−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（２５ｍｇ、０．０４２ミリモル）
で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いでＣ
１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用し、それぞれ
０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＭｅＣＮ
／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いる調製
用ＨＰＬＣで直接精製し、生成物を約２１分で溶離し
た。生成物を含むＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮し、次い
で、凍結乾燥させて黄色の固形物を得た。収量２５ｍｇ
（定量的）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ５９１測定値
（５９１．７３計算値）。
（図１）。ＤＭＦ（１ｍＬ）と０．１Ｍカルボナートｐ
Ｈ９（１ｍＬ）中の１，６−ジアミノヘキサン（４９ｍ
ｇ、０．４２ミリモル）をＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮＳＰ
−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（２５ｍｇ、０．０４２ミリモル）
で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いでＣ
１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用し、それぞれ
０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＭｅＣＮ
／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いる調製
用ＨＰＬＣで直接精製し、生成物を約２１分で溶離し
た。生成物を含むＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮し、次い
で、凍結乾燥させて黄色の固形物を得た。収量２５ｍｇ
（定量的）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ５９１測定値
（５９１．７３計算値）。
【００２０】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロア
ートの合成を下記のとおり実施した（図１）。次に、Ｄ
ＭＦ（４００μＬ）中のＮ10−トリフルオロアセチルプ
テロイン酸（２．５ｍｇ、６．１３マイクロモル）をク
ロロギ酸エチル（３μＬ、５当量）およびジイソプロピ
ルエチルアミン（５．４μＬ、５当量）で処理した。反
応物を室温で１時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で
除去し、残留物をＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ（１．４ｍ
ｇ、２．３７マイクロモル）とジイソプロピルエチルア
ミン（２μＬ、１１．３マイクロモル）で処理した。得
られた反応物を室温で４時間攪拌し、次いで濃縮した。
残留物をメタノールに溶解し、濾過した。Ｃ１８カラム
（７．８ｍｍ×２５ｃｍ）を使用し、それぞれ０．０５
％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から６０％の勾配
（４０分）を用いるＨＰＬＣで精製した。Ｒｔ（生成
物）＝約２７分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥
させて、黄色の固形物を得た。収量０．６ｍｇ（２６
％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ９８３．４７測定値
（９８２．０１計算値）。
ートの合成を下記のとおり実施した（図１）。次に、Ｄ
ＭＦ（４００μＬ）中のＮ10−トリフルオロアセチルプ
テロイン酸（２．５ｍｇ、６．１３マイクロモル）をク
ロロギ酸エチル（３μＬ、５当量）およびジイソプロピ
ルエチルアミン（５．４μＬ、５当量）で処理した。反
応物を室温で１時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で
除去し、残留物をＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ（１．４ｍ
ｇ、２．３７マイクロモル）とジイソプロピルエチルア
ミン（２μＬ、１１．３マイクロモル）で処理した。得
られた反応物を室温で４時間攪拌し、次いで濃縮した。
残留物をメタノールに溶解し、濾過した。Ｃ１８カラム
（７．８ｍｍ×２５ｃｍ）を使用し、それぞれ０．０５
％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から６０％の勾配
（４０分）を用いるＨＰＬＣで精製した。Ｒｔ（生成
物）＝約２７分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥
させて、黄色の固形物を得た。収量０．６ｍｇ（２６
％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ９８３．４７測定値
（９８２．０１計算値）。
【００２１】上記の材料を０．１Ｍピペリジン（５００
μＬ）中、室温で４時間攪拌し、次いで、生成物を上記
のとおりＨＰＬＣで直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約
２６分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて黄
色の固形物を得た。収量約０．２ｍｇ、ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳ ８８９．４８測定値（８８６計算値）。
μＬ）中、室温で４時間攪拌し、次いで、生成物を上記
のとおりＨＰＬＣで直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約
２６分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて黄
色の固形物を得た。収量約０．２ｍｇ、ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳ ８８９．４８測定値（８８６計算値）。
【００２２】実施例２
ヘキサエチレングリコールジメタンスルホナートの合成
を下記のとおり実施した。ヘキサエチレングリコール
（１ｇ、３．５４ミリモル）のクロロホルム（１０ｍ
Ｌ）溶液を氷浴中の窒素下で冷却し、塩化メタンスルホ
ニル（６０３μＬ、２．２当量）とジイソプロピルエチ
ルアミン（１．５６ｍＬ、２．５当量）で処理した。反
応物を室温まで加温し、窒素下で攪拌した。２時間後、
追加の塩化メタンスルホニル（２７４μＬ、１．０当
量）とジイソプロピルエチルアミン（７４９μＬ、１．
２当量）を加えた。室温でさらに２時間後、反応物をク
ロロホルムで希釈し、得られた溶液を水性塩化アンモニ
ウム、次いでブラインで２回洗浄した。次いで、クロロ
ホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減
圧下で濃縮した。淡黄色の油状物が得られた。収量１．
３８ｇ（８９％）。ＴＬＣ（１０％メタノール、９０％
クロロホルム）Ｒｆ（生成物）＝０．６４、Ｒｆ（出発
材料）＝０．４２。
を下記のとおり実施した。ヘキサエチレングリコール
（１ｇ、３．５４ミリモル）のクロロホルム（１０ｍ
Ｌ）溶液を氷浴中の窒素下で冷却し、塩化メタンスルホ
ニル（６０３μＬ、２．２当量）とジイソプロピルエチ
ルアミン（１．５６ｍＬ、２．５当量）で処理した。反
応物を室温まで加温し、窒素下で攪拌した。２時間後、
追加の塩化メタンスルホニル（２７４μＬ、１．０当
量）とジイソプロピルエチルアミン（７４９μＬ、１．
２当量）を加えた。室温でさらに２時間後、反応物をク
ロロホルムで希釈し、得られた溶液を水性塩化アンモニ
ウム、次いでブラインで２回洗浄した。次いで、クロロ
ホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減
圧下で濃縮した。淡黄色の油状物が得られた。収量１．
３８ｇ（８９％）。ＴＬＣ（１０％メタノール、９０％
クロロホルム）Ｒｆ（生成物）＝０．６４、Ｒｆ（出発
材料）＝０．４２。
【００２３】次に、ジアジドヘキサエチレングリコール
の合成を下記のとおり実施した。ヘキサエチレングリコ
ールジメタンスルホナート（０．５ｇ、１．１４ミリモ
ル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液をアジ化ナトリウム（０．
３１ｇ、４．７６ミリモル）で処理した。反応物を油浴
中１１０℃、窒素雰囲気下で８時間加熱した。次いで、
反応物を室温に冷却し、さらに１６時間攪拌した。次い
で、ＤＭＦを減圧下で除去し、残留物をクロロホルムと
ブラインの間で分配した。クロロホルム層を分離し、硫
酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して
油状物を得た。収量０．４４２ｇ（定量的）、ＴＬＣ
（５％メタノール、９５％クロロホルム）Ｒｆ（生成
物）＝０．５９、Ｒｆ（出発材料）＝０．３５。
の合成を下記のとおり実施した。ヘキサエチレングリコ
ールジメタンスルホナート（０．５ｇ、１．１４ミリモ
ル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液をアジ化ナトリウム（０．
３１ｇ、４．７６ミリモル）で処理した。反応物を油浴
中１１０℃、窒素雰囲気下で８時間加熱した。次いで、
反応物を室温に冷却し、さらに１６時間攪拌した。次い
で、ＤＭＦを減圧下で除去し、残留物をクロロホルムと
ブラインの間で分配した。クロロホルム層を分離し、硫
酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して
油状物を得た。収量０．４４２ｇ（定量的）、ＴＬＣ
（５％メタノール、９５％クロロホルム）Ｒｆ（生成
物）＝０．５９、Ｒｆ（出発材料）＝０．３５。
【００２４】次に、ジアミノヘキサエチレングリコール
（以下、「ジアミノＨＥＧ」と呼ぶ）の合成を下記のと
おり実施した（図２）。次に、ジアジドヘキサエチレン
グリコール（０．４４ｇ、１．３２ミリモル）の酢酸エ
チル（１５ｍＬ）溶液を、活性炭素（９５ｍｇ）に担持
させた１０％Ｐｄで処理し、黒色の反応混合物を室温で
水素化した。室温で１６時間後、反応物を濾過し、濾液
を減圧下で濃縮して油状物を得た。収量０．２６ｇ（７
０％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ２８０測定値 ２
８０計算値、ＴＬＣ（４５％メタノール、５０％クロロ
ホルム、５％水酸化アンモニウム）Ｒｆ＝０．２９。
（以下、「ジアミノＨＥＧ」と呼ぶ）の合成を下記のと
おり実施した（図２）。次に、ジアジドヘキサエチレン
グリコール（０．４４ｇ、１．３２ミリモル）の酢酸エ
チル（１５ｍＬ）溶液を、活性炭素（９５ｍｇ）に担持
させた１０％Ｐｄで処理し、黒色の反応混合物を室温で
水素化した。室温で１６時間後、反応物を濾過し、濾液
を減圧下で濃縮して油状物を得た。収量０．２６ｇ（７
０％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ２８０測定値 ２
８０計算値、ＴＬＣ（４５％メタノール、５０％クロロ
ホルム、５％水酸化アンモニウム）Ｒｆ＝０．２９。
【００２５】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧの合成を
下記のとおり実施した（図２）。次に、１：１のＤＭＦ
と０．１ＭカルボナートｐＨ９（２ｍＬ）中のジアミノ
ＨＥＧ（３３ｍｇ、０．１２ミリモル）の溶液をＮＳＰ
−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（１０ｍｇ、１７マイクロモル）で
処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。生成物を
Ｃ１８カラム（２０ｍｍ×３００ｃｍ）を使用し、それ
ぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から６
０％の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣで直接精
製した。Ｒｔ（生成物）＝約２１分。生成物を含むＨＰ
ＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量
１０．６ｍｇ（８３％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
７５７．３９測定値（７５５．８９計算値）。
下記のとおり実施した（図２）。次に、１：１のＤＭＦ
と０．１ＭカルボナートｐＨ９（２ｍＬ）中のジアミノ
ＨＥＧ（３３ｍｇ、０．１２ミリモル）の溶液をＮＳＰ
−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（１０ｍｇ、１７マイクロモル）で
処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。生成物を
Ｃ１８カラム（２０ｍｍ×３００ｃｍ）を使用し、それ
ぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から６
０％の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣで直接精
製した。Ｒｔ（生成物）＝約２１分。生成物を含むＨＰ
ＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量
１０．６ｍｇ（８３％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
７５７．３９測定値（７５５．８９計算値）。
【００２６】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロ
アートの合成を下記のとおり実施した（図２のステップ
（ＩＩＩ）参照）。次に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＮ
10−トリフルオロアセチルプテロイン酸（５．４ｍｇ、
１３．２マイクロモル）をＮＨＳ（７．６ｍｇ、５当
量）とＤＣＣ（１３．６ｍｇ、５当量）で処理した。反
応物を室温の窒素雰囲気下で攪拌した。２時間後、ＮＳ
Ｐ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ（３．５ｍｇ、４．６マイクロモ
ル）のＤＭＦ（４００μＬ）溶液とジイソプロピルエチ
ルアミン（２μＬ、１１．３マイクロモル）で反応物を
処理した。得られた溶液を室温の窒素雰囲気下で１６時
間攪拌した。次いで、反応混合物を上記で記載のとおり
Ｃ１８カラム（７．８ｍｍ×３００ｃｍ）の調製用ＨＰ
ＬＣで直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２４分。ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１４８．７１．９２測定値
（１１４６．１７計算値）。
アートの合成を下記のとおり実施した（図２のステップ
（ＩＩＩ）参照）。次に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＮ
10−トリフルオロアセチルプテロイン酸（５．４ｍｇ、
１３．２マイクロモル）をＮＨＳ（７．６ｍｇ、５当
量）とＤＣＣ（１３．６ｍｇ、５当量）で処理した。反
応物を室温の窒素雰囲気下で攪拌した。２時間後、ＮＳ
Ｐ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ（３．５ｍｇ、４．６マイクロモ
ル）のＤＭＦ（４００μＬ）溶液とジイソプロピルエチ
ルアミン（２μＬ、１１．３マイクロモル）で反応物を
処理した。得られた溶液を室温の窒素雰囲気下で１６時
間攪拌した。次いで、反応混合物を上記で記載のとおり
Ｃ１８カラム（７．８ｍｍ×３００ｃｍ）の調製用ＨＰ
ＬＣで直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２４分。ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１４８．７１．９２測定値
（１１４６．１７計算値）。
【００２７】次に、上記のコンジュゲートを０．１Ｍピ
ペリジン４００μＬ中、室温で１時間攪拌した。次い
で、反応物を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。Ｈ
ＰＬＣＲｔ＝約２１分、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １
０５１．９２測定値、（１０５０．１６計算値）。
ペリジン４００μＬ中、室温で１時間攪拌した。次い
で、反応物を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。Ｈ
ＰＬＣＲｔ＝約２１分、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １
０５１．９２測定値、（１０５０．１６計算値）。
【００２８】実施例３
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲ
ートの合成を下記のとおり実施した。Ｎ−ｔｅｒｔ−ブ
トキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸α−ｔｅｒｔ−ブ
チルエステル（２５ｍｇ、０．０８２ミリモル）をＭｅ
ＣＮ（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨＳ（１４．２ｍｇ、
１．５当量）とＤＣＣ（２５．５ｍｇ、１．５当量）で
処理した。反応物を室温で１．５時間攪拌した。この溶
液（０．５４ｍＬ）をジイソプロピルエチルアミン（５
μＬ、１．５当量）を含むＤＭＦ（５００μＬ）中のＮ
ＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ（１４ｍｇ、１８．５４マイク
ロモル）の溶液に加えた。２〜３時間後、追加のジイソ
プロピルエチルアミン（２．５μＬ）を上記からの追加
の活性エステル溶液５４０μＬと一緒に加えた。得られ
た反応物を室温で１６時間攪拌した。次いで、溶媒を減
圧下で除去し、残留物をＭｅＣＮ２ｍＬに溶解した。こ
れをガラスウールで濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。
粗生成物を酢酸中の３０％ＨＢｒ１ｍＬ中で２時間攪拌
することによりデブロックした。エーテル（１０ｍＬ）
の添加により生成物を沈殿させた。エーテルを傾瀉し、
残留物を上記と同じ溶媒系を用いてＨＰＬＣにより直接
精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２０．５分。生成物を含
むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物として
生成物２．８ｍｇ（２０％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
ＦＭＳ ８８８．６７測定値（８８５．０計算値）。
ートの合成を下記のとおり実施した。Ｎ−ｔｅｒｔ−ブ
トキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸α−ｔｅｒｔ−ブ
チルエステル（２５ｍｇ、０．０８２ミリモル）をＭｅ
ＣＮ（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨＳ（１４．２ｍｇ、
１．５当量）とＤＣＣ（２５．５ｍｇ、１．５当量）で
処理した。反応物を室温で１．５時間攪拌した。この溶
液（０．５４ｍＬ）をジイソプロピルエチルアミン（５
μＬ、１．５当量）を含むＤＭＦ（５００μＬ）中のＮ
ＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ（１４ｍｇ、１８．５４マイク
ロモル）の溶液に加えた。２〜３時間後、追加のジイソ
プロピルエチルアミン（２．５μＬ）を上記からの追加
の活性エステル溶液５４０μＬと一緒に加えた。得られ
た反応物を室温で１６時間攪拌した。次いで、溶媒を減
圧下で除去し、残留物をＭｅＣＮ２ｍＬに溶解した。こ
れをガラスウールで濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。
粗生成物を酢酸中の３０％ＨＢｒ１ｍＬ中で２時間攪拌
することによりデブロックした。エーテル（１０ｍＬ）
の添加により生成物を沈殿させた。エーテルを傾瀉し、
残留物を上記と同じ溶媒系を用いてＨＰＬＣにより直接
精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２０．５分。生成物を含
むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物として
生成物２．８ｍｇ（２０％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
ＦＭＳ ８８８．６７測定値（８８５．０計算値）。
【００２９】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フ
ォレートの合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（１ｍ
Ｌ）中のＮ10−トリフルオロアセチルプテロイン酸（５
ｍｇ、１２．２５マイクロモル）をクロロギ酸イソブチ
ル（４．７μＬ、３当量）およびジイソプロピルエチル
アミン（８μＬ、４当量）で処理した。反応物を室温で
１時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残留物をＤ
ＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、この溶液１７０μＬをジ
イソプロピルエチルアミン（１μＬ）と一緒にＮＳＰ−
ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−γ−グルタマート（１．８ｍｇ、
２．０３マイクロモル）に加えた。反応物を室温で１６
時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留物をＤＭＦ
（１ｍＬ）に溶解し、上記と同じ条件を用いてＨＰＬＣ
により精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２５．５分。生成
物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物
を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １２７６．３４測
定値、（１２７５．２８計算値）。
ォレートの合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（１ｍ
Ｌ）中のＮ10−トリフルオロアセチルプテロイン酸（５
ｍｇ、１２．２５マイクロモル）をクロロギ酸イソブチ
ル（４．７μＬ、３当量）およびジイソプロピルエチル
アミン（８μＬ、４当量）で処理した。反応物を室温で
１時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残留物をＤ
ＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、この溶液１７０μＬをジ
イソプロピルエチルアミン（１μＬ）と一緒にＮＳＰ−
ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−γ−グルタマート（１．８ｍｇ、
２．０３マイクロモル）に加えた。反応物を室温で１６
時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留物をＤＭＦ
（１ｍＬ）に溶解し、上記と同じ条件を用いてＨＰＬＣ
により精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２５．５分。生成
物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物
を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １２７６．３４測
定値、（１２７５．２８計算値）。
【００３０】次に、コンジュゲート中のトリフルオロア
セチル基を、水とＤＭＦ（２００μＬ）中の０．１Ｍピ
ペリジン（４００μＬ）の混合物中室温で攪拌して除去
した。６時間後、生成物を上記と同じ条件を用いてＨＰ
ＬＣにより直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２２．５
分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて黄色の
固形物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１８２．
９５測定値（１１７９．２７）。
セチル基を、水とＤＭＦ（２００μＬ）中の０．１Ｍピ
ペリジン（４００μＬ）の混合物中室温で攪拌して除去
した。６時間後、生成物を上記と同じ条件を用いてＨＰ
ＬＣにより直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２２．５
分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて黄色の
固形物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１８２．
９５測定値（１１７９．２７）。
【００３１】実施例４
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートコンジュゲ
ートの合成を下記のとおり実施した。Ｎ−ｔｅｒｔ−ブ
トキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ｇ−ｔｅｒｔ−ブ
チルエステル（２０ｍｇ、０．０６５ミリモル）をＭｅ
ＣＮ（約２ｍＬ）に溶解し、氷中窒素雰囲気下で冷却し
た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１．４ｍｇ、
１．５当量）およびジシクロヘキシルカルボジイミド
（２０．３ｍｇ、０．０９８５ミリモル）を加え、反応
物を室温に加温し、１時間攪拌した。ＤＭＦ（０．５ｍ
Ｌ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ（１４ｍｇ、０．０
１８５ミリモル）をジイソプロピルエチルアミン（７μ
Ｌ、約２当量）、次いで上記のＭｅＣＮ溶液１．２ｍＬ
で処理した。得られた溶液を室温、窒素下で２４時間攪
拌した。次いで、反応物を減圧下で濃縮した。残留物を
酢酸中の３０％ＨＢｒ２ｍＬで処理した。室温で３時間
攪拌した後、エーテルを加えて生成物を沈殿させ、それ
を濾過により集め、追加のエーテルですすぎ、風乾し
た。粗生成物（２８ｍｇ）を上記のとおり調製用ＨＰＬ
Ｃにかけた。生成物を含むＨＰＬＣ画分（Ｒｔ＝約１８
分）を凍結乾燥させた。収量４．７ｍｇ（２９％）。Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ９１０．１４（Ｍ＋Ｎａ+）
測定値（８８５計算値）。
ートの合成を下記のとおり実施した。Ｎ−ｔｅｒｔ−ブ
トキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ｇ−ｔｅｒｔ−ブ
チルエステル（２０ｍｇ、０．０６５ミリモル）をＭｅ
ＣＮ（約２ｍＬ）に溶解し、氷中窒素雰囲気下で冷却し
た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１．４ｍｇ、
１．５当量）およびジシクロヘキシルカルボジイミド
（２０．３ｍｇ、０．０９８５ミリモル）を加え、反応
物を室温に加温し、１時間攪拌した。ＤＭＦ（０．５ｍ
Ｌ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ（１４ｍｇ、０．０
１８５ミリモル）をジイソプロピルエチルアミン（７μ
Ｌ、約２当量）、次いで上記のＭｅＣＮ溶液１．２ｍＬ
で処理した。得られた溶液を室温、窒素下で２４時間攪
拌した。次いで、反応物を減圧下で濃縮した。残留物を
酢酸中の３０％ＨＢｒ２ｍＬで処理した。室温で３時間
攪拌した後、エーテルを加えて生成物を沈殿させ、それ
を濾過により集め、追加のエーテルですすぎ、風乾し
た。粗生成物（２８ｍｇ）を上記のとおり調製用ＨＰＬ
Ｃにかけた。生成物を含むＨＰＬＣ画分（Ｒｔ＝約１８
分）を凍結乾燥させた。収量４．７ｍｇ（２９％）。Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ９１０．１４（Ｍ＋Ｎａ+）
測定値（８８５計算値）。
【００３２】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フ
ォレートの合成を下記のとおり実施した。次に、ＤＭＦ
（１ｍＬ）中のＮ10−トリフルオロアセチルプテロイン
酸（５ｍｇ、１２．２５マイクロモル）をイソブチルク
ロロホルマート（４．７μＬ、３当量）とジイソプロピ
ルエチルアミン（８μＬ、４当量）で処理した。反応物
を室温で１時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留
物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、再び蒸発乾固し
た。このように得られた化合物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）
に溶解し、この溶液の一部（０．２ｍＬ）をＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧ−α−グルタマート（２ｍｇ、０．００
２３ミリモル）と混合した。反応物を室温で１６時間攪
拌し、次いで上記のとおり調製用ＨＰＬＣで直接精製し
た（Ｒｔ＝約２６分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍
結乾燥させて、黄色の固形物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ ＭＳ １２７７．４７測定値（１２７５．２８計算
値）。
ォレートの合成を下記のとおり実施した。次に、ＤＭＦ
（１ｍＬ）中のＮ10−トリフルオロアセチルプテロイン
酸（５ｍｇ、１２．２５マイクロモル）をイソブチルク
ロロホルマート（４．７μＬ、３当量）とジイソプロピ
ルエチルアミン（８μＬ、４当量）で処理した。反応物
を室温で１時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留
物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、再び蒸発乾固し
た。このように得られた化合物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）
に溶解し、この溶液の一部（０．２ｍＬ）をＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧ−α−グルタマート（２ｍｇ、０．００
２３ミリモル）と混合した。反応物を室温で１６時間攪
拌し、次いで上記のとおり調製用ＨＰＬＣで直接精製し
た（Ｒｔ＝約２６分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍
結乾燥させて、黄色の固形物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ ＭＳ １２７７．４７測定値（１２７５．２８計算
値）。
【００３３】次に、ＨＰＬＣ精製された化合物をＤＭＦ
（０．１ｍＬ）に溶解し、水（０．２ｍＬ）中の０．１
Ｍピペリジンで処理した。反応物を室温で３時間攪拌
し、次いで上記のとおりＨＰＬＣで直接精製した（Ｒｔ
＝約２２分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥さ
せてコンジュゲートを得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
１１８１．４２測定値（１１７９．２７計算値）。
（０．１ｍＬ）に溶解し、水（０．２ｍＬ）中の０．１
Ｍピペリジンで処理した。反応物を室温で３時間攪拌
し、次いで上記のとおりＨＰＬＣで直接精製した（Ｒｔ
＝約２２分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥さ
せてコンジュゲートを得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
１１８１．４２測定値（１１７９．２７計算値）。
【００３４】実施例５
数種の競合アッセイパラメータをコンジュゲート（トレ
ーサー）結合機能の比較評価に関して試験した。具体的
には、これらの基準にはアッセイの精度、アッセイの確
度、アッセイの感度、分別非特異的結合、結合親和性、
および標準曲線の形が含まれる。
ーサー）結合機能の比較評価に関して試験した。具体的
には、これらの基準にはアッセイの精度、アッセイの確
度、アッセイの感度、分別非特異的結合、結合親和性、
および標準曲線の形が含まれる。
【００３５】次に、特定の分析物濃度から得られたＲＬ
Ｕ（相対発光量、後で定義する）の相加平均は、本明細
書ではμと表され、３回の実験から計算された。トレー
サーを含まないアッセイ試薬も、小さな、ただし時には
大きな数のＲＬＵに寄与する。トレーサーを除くすべて
のアッセイ試薬を含む対照反応も平行して行って、トレ
ーサーを含まない試薬のバックグラウンド（本明細書
中、ｎと表す）を確認した。平均ＲＬＵ、μをトレーサ
ーのみから得られたＲＬＵ（本明細書中Ｂと表す：Ｂ＝
μ−ｎ）を表すように補正した。分析物濃度が０．００
である場合、補正された相加平均ＲＬＵ値をＢ0で表し
た。標準ＲＬＵの分析物濃度と検出されたＲＬＵの間
に、非線形の相反関係（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ，ｉｎｖ
ｅｒｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）が存在する。結
果として、その対照をなす相関も分析物濃度と結果とし
て生じる％Ｂ／Ｂ0を関連づけ、
Ｕ（相対発光量、後で定義する）の相加平均は、本明細
書ではμと表され、３回の実験から計算された。トレー
サーを含まないアッセイ試薬も、小さな、ただし時には
大きな数のＲＬＵに寄与する。トレーサーを除くすべて
のアッセイ試薬を含む対照反応も平行して行って、トレ
ーサーを含まない試薬のバックグラウンド（本明細書
中、ｎと表す）を確認した。平均ＲＬＵ、μをトレーサ
ーのみから得られたＲＬＵ（本明細書中Ｂと表す：Ｂ＝
μ−ｎ）を表すように補正した。分析物濃度が０．００
である場合、補正された相加平均ＲＬＵ値をＢ0で表し
た。標準ＲＬＵの分析物濃度と検出されたＲＬＵの間
に、非線形の相反関係（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ，ｉｎｖ
ｅｒｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）が存在する。結
果として、その対照をなす相関も分析物濃度と結果とし
て生じる％Ｂ／Ｂ0を関連づけ、
【数１】
として経験的に表すことができる。式中、ｘは分析物濃
度であり、ｙは％Ｂ／Ｂ0またはＲＬＵのいずれかとし
て生成された測定されたシグナルである｛［Ｒｏｄｂａ
ｒｄ，Ｄａｖｉｄ、「Ｌｉｇａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ」（１９８１）、Ｌａｎｇｏｎ，Ｊ．、Ｃｌａｐｐ，
Ｊ．（Ｅｄｓ．）、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ．４５〜１０
１］、［Ｎｉｘ，Ｂａｒｒｙ、「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（１９９４）、Ｗｉｌ
ｄ，Ｄａｖｉｄ（Ｅｄ．）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１１７〜１
２３］、［Ｐｅｔｅｒｍａｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｈ．、
「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ
−Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、（１９９
１）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．（Ｅｄ．）、ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ｐｐ．４７〜
６５］｝。
度であり、ｙは％Ｂ／Ｂ0またはＲＬＵのいずれかとし
て生成された測定されたシグナルである｛［Ｒｏｄｂａ
ｒｄ，Ｄａｖｉｄ、「Ｌｉｇａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ」（１９８１）、Ｌａｎｇｏｎ，Ｊ．、Ｃｌａｐｐ，
Ｊ．（Ｅｄｓ．）、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ．４５〜１０
１］、［Ｎｉｘ，Ｂａｒｒｙ、「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（１９９４）、Ｗｉｌ
ｄ，Ｄａｖｉｄ（Ｅｄ．）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１１７〜１
２３］、［Ｐｅｔｅｒｍａｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｈ．、
「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ
−Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、（１９９
１）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．（Ｅｄ．）、ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ｐｐ．４７〜
６５］｝。
【００３６】４個のパラメータ、すなわち回帰定数ｂ、
回帰係数ｍ、無限用量でプロジェクトされた漸近的非特
異的結合（ＮＳＢ）（分析物濃度）ｙ∞、および分析物
不在下での漸近的ゼロ用量応答ｙ0をＤＯＳＥＣＡＬ
Ｃ．ＥＸＥ Ｒｅｖ．１．７３プログラム（Ｂａｙｅｒ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｐｏｌ
ｅ、ＭＡ）の反復の、重みをつけない、４パラメータロ
ジスティック（４ＰＬ）分析機能を用いて直接計算し
た。
回帰係数ｍ、無限用量でプロジェクトされた漸近的非特
異的結合（ＮＳＢ）（分析物濃度）ｙ∞、および分析物
不在下での漸近的ゼロ用量応答ｙ0をＤＯＳＥＣＡＬ
Ｃ．ＥＸＥ Ｒｅｖ．１．７３プログラム（Ｂａｙｅｒ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｐｏｌ
ｅ、ＭＡ）の反復の、重みをつけない、４パラメータロ
ジスティック（４ＰＬ）分析機能を用いて直接計算し
た。
【００３７】アッセイの精度 精度は、変動係数率、％
Ｃ．Ｖ．としての標準偏差、σ(n-1 )から求めた。％
Ｃ．Ｖ．は、１００×σ(n-1)／μである。１０％未満
の値が望ましい（Ｆｅｌｄｋａｍｐ，Ｃａｒｏｌｙｎ
Ｓ．、Ｓｍｉｔｈ，ＳｔｕａｒｔＷ．、「Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ」
（１９８７）、Ｃｈａｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｗ．、Ｐｅｒ
ｌｓｔｅｉｎ，ＭａｒｉｅＴ．（Ｅｄｓ．）、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｐｐ．４９〜９５）。
Ｃ．Ｖ．としての標準偏差、σ(n-1 )から求めた。％
Ｃ．Ｖ．は、１００×σ(n-1)／μである。１０％未満
の値が望ましい（Ｆｅｌｄｋａｍｐ，Ｃａｒｏｌｙｎ
Ｓ．、Ｓｍｉｔｈ，ＳｔｕａｒｔＷ．、「Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ」
（１９８７）、Ｃｈａｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｗ．、Ｐｅｒ
ｌｓｔｅｉｎ，ＭａｒｉｅＴ．（Ｅｄｓ．）、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｐｐ．４９〜９５）。
【００３８】アッセイの確度 ４ＰＬモデルに関する誤
差率（％Ｓ）として表された確度を％Ｓ＝１００×（Ｂ
−ｙ）／ｙとして計算した。＋５〜−５％の間の値が許
容できる（Ｆｅｌｄｋａｍｐ，Ｃａｒｏｌｙｎ Ｓ．、
Ｓｍｉｔｈ，ＳｔｕａｒｔＷ．、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ」（１９８
７）、Ｃｈａｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｗ．、Ｐｅｒｌｓｔｅ
ｉｎ，ＭａｒｉｅＴ．（Ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ、ｐｐ．４９〜９５）。
差率（％Ｓ）として表された確度を％Ｓ＝１００×（Ｂ
−ｙ）／ｙとして計算した。＋５〜−５％の間の値が許
容できる（Ｆｅｌｄｋａｍｐ，Ｃａｒｏｌｙｎ Ｓ．、
Ｓｍｉｔｈ，ＳｔｕａｒｔＷ．、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ」（１９８
７）、Ｃｈａｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｗ．、Ｐｅｒｌｓｔｅ
ｉｎ，ＭａｒｉｅＴ．（Ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ、ｐｐ．４９〜９５）。
【００３９】アッセイの感度 プロジェクトされた検出
可能な分析物の最低濃度を、本明細書中では感度と呼
び、ゼロ用量応答からの２個の標準偏差で予想される分
析物濃度として求めた。
可能な分析物の最低濃度を、本明細書中では感度と呼
び、ゼロ用量応答からの２個の標準偏差で予想される分
析物濃度として求めた。
【００４０】分別非特異的結合 競合アッセイの分別非
特異的結合（ｆＮＳＢ）を、無限用量ｙ∞でのｙのプロ
ジェクトされた漸近的下限と合計化学発光シグナルイン
プットＴとの商として計算した。分別ＮＳＢは、コンジ
ュゲートと固相上の結合タンパク質または抗体の間に特
に好ましい結合会合を含まない、固相に対するコンジュ
ゲートの結合相互作用の尺度である。高いｆＮＳＢは望
ましくなく、いくつかの異なる因子の１つまたは複数か
ら生じる可能性がある。その因子とは、コンジュゲート
の過度の疎水性により増強された疎水性相互作用、コン
ジュゲートの電荷密度または極性により促進されたイオ
ン性または極性相互作用、および／または特異的である
が、望ましくない生物結合相互作用である。ＮＳＢがか
なり上昇してもアッセイ精度が影響を受けない場合は、
用量応答曲線の外見上の傾きは、Ｂ0が検出器の線形限
界を超えるとより急激に減少する。
特異的結合（ｆＮＳＢ）を、無限用量ｙ∞でのｙのプロ
ジェクトされた漸近的下限と合計化学発光シグナルイン
プットＴとの商として計算した。分別ＮＳＢは、コンジ
ュゲートと固相上の結合タンパク質または抗体の間に特
に好ましい結合会合を含まない、固相に対するコンジュ
ゲートの結合相互作用の尺度である。高いｆＮＳＢは望
ましくなく、いくつかの異なる因子の１つまたは複数か
ら生じる可能性がある。その因子とは、コンジュゲート
の過度の疎水性により増強された疎水性相互作用、コン
ジュゲートの電荷密度または極性により促進されたイオ
ン性または極性相互作用、および／または特異的である
が、望ましくない生物結合相互作用である。ＮＳＢがか
なり上昇してもアッセイ精度が影響を受けない場合は、
用量応答曲線の外見上の傾きは、Ｂ0が検出器の線形限
界を超えるとより急激に減少する。
【００４１】コンジュゲート結合親和性 コンジュゲー
ト結合機能を比較評価するために競合アッセイ％Ｂ0／
Ｔを行った。得られた商を比較すると、各コンジュゲー
トが分析物結合タンパク質または抗体に有する相対的結
合親和性が示される。
ト結合機能を比較評価するために競合アッセイ％Ｂ0／
Ｔを行った。得られた商を比較すると、各コンジュゲー
トが分析物結合タンパク質または抗体に有する相対的結
合親和性が示される。
【００４２】フォレートアッセイ − フォレート結合
アッセイでのアクリジニウムエステル−フォレートおよ
びアクリジニウムエステル−プテロアートコンジュゲー
ト結合機能の評価 このアッセイでは、アクリジニウム
エステル−フォレートコンジュゲート（上記では、トレ
ーサーと呼んだ）とフォレート含有標準（ＢａｙｅｒＤ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｐｏｌｅ、
ＭＡ）からのフォレートは、常磁性粒子固相に共有結合
的に結合した、ウシフォレート結合タンパク質の制限量
をめぐって競合する。フォレート標準は、０．００、
２．６６、６．５２、１２．８、２４．７、５２．７ｎ
Ｍの濃度のフォレートを含有した。フォレート標準１５
０μｌ、ＤＴＴ試薬５０μｌ、および放出剤７５μｌを
含む反応混合物を２．５分間３７℃でインキュベートし
た。各反応物に固相２００μｌを加え、２．５分間３７
℃でインキュベートした。最後にトレーサー１００μｌ
（２８０ｆモル）を加え、２．５分間３７℃でインキュ
ベートした。永久磁石のアレイ上に固相を集め、脱イオ
ン水で洗浄して結合していないトレーサーを除去した。
化学発光反応が上述のように開始した。化学発光データ
はＡＣＳ：１８０によって検出した光子として集め、相
対発光量（ＲＬＵ）で表した。
アッセイでのアクリジニウムエステル−フォレートおよ
びアクリジニウムエステル−プテロアートコンジュゲー
ト結合機能の評価 このアッセイでは、アクリジニウム
エステル−フォレートコンジュゲート（上記では、トレ
ーサーと呼んだ）とフォレート含有標準（ＢａｙｅｒＤ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｐｏｌｅ、
ＭＡ）からのフォレートは、常磁性粒子固相に共有結合
的に結合した、ウシフォレート結合タンパク質の制限量
をめぐって競合する。フォレート標準は、０．００、
２．６６、６．５２、１２．８、２４．７、５２．７ｎ
Ｍの濃度のフォレートを含有した。フォレート標準１５
０μｌ、ＤＴＴ試薬５０μｌ、および放出剤７５μｌを
含む反応混合物を２．５分間３７℃でインキュベートし
た。各反応物に固相２００μｌを加え、２．５分間３７
℃でインキュベートした。最後にトレーサー１００μｌ
（２８０ｆモル）を加え、２．５分間３７℃でインキュ
ベートした。永久磁石のアレイ上に固相を集め、脱イオ
ン水で洗浄して結合していないトレーサーを除去した。
化学発光反応が上述のように開始した。化学発光データ
はＡＣＳ：１８０によって検出した光子として集め、相
対発光量（ＲＬＵ）で表した。
【００４３】フォレートアッセイの精度 アッセイの
間、フォレートコンジュゲートのすべてについて精度は
十分であり、％Ｃ．Ｖ．は、用量応答曲線の全体にわた
り１０％未満であった。コンジュゲート間の総体的な精
度に有意な差異はなかった。
間、フォレートコンジュゲートのすべてについて精度は
十分であり、％Ｃ．Ｖ．は、用量応答曲線の全体にわた
り１０％未満であった。コンジュゲート間の総体的な精
度に有意な差異はなかった。
【表１】
【００４４】フォレートアッセイの確度 予想された４
ＰＬ値との誤差率（％Ｓ）として示される確度は、４種
のフォレートコンジュゲートすべてで許容可能であり、
用量応答曲線の全体にわたり±５％以内である。これら
のコンジュゲート間の全体的確度に差異はなかった。
ＰＬ値との誤差率（％Ｓ）として示される確度は、４種
のフォレートコンジュゲートすべてで許容可能であり、
用量応答曲線の全体にわたり±５％以内である。これら
のコンジュゲート間の全体的確度に差異はなかった。
【表２】
【００４５】フォレートアッセイの感度 フォレートア
ッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−
フォレートコンジュゲートで得られた。プロジェクトさ
れた検出可能な分析物の最低濃度は、０．００ｎＭフォ
レート用量応答、Ｂ0−２σ( n-1)からの２個の標準偏差
での両方のフォレート濃度から決定された。ＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲートは、検
出可能なフォレートの最低濃度を示し、次は、ＮＳＰ−
ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートコンジュゲートであ
り、その次はＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアート
コンジュゲートであった。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プ
テロアートトレーサーは、比較的低いＢ 0、削減された
動的範囲、および高い分別ＮＳＢ（ｆＮＳＢ）の結果と
して、最低感度のコンジュゲートであった。トレーサー
構造の差異は、感度に対する影響度にしたがって、下記
のようにランク付けすることができる。トレーサー構造
中のプテロアートをフォレートで置き換えると、ＮＳＰ
−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートトレーサーの結果
とＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートトレーサー
の結果を比較した場合、アッセイの感度は少なくとも
２．７倍上昇した。これは、フォレートアッセイの感度
に関するトレーサーと分析物の構造的類似性が相対的に
重要であることを反映している。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｈ
ＥＧ−アミンをグルタマートγ−カルボキシラートを介
してフォレートに結合させることは、α−カルボキシラ
ートを介するコンジュゲーションには好ましい。なぜな
ら、γ−カルボキシラート結合は、α−カルボキシラー
ト異性体と比較してアッセイの感度を２．２倍に上げる
からである。同様に、プテロアートトレーサーの疎水性
ＨＤ−スペーサーアームを親水性ＨＥＧ−スペーサーア
ームに置き換えることにより、フォレートアッセイの感
度が１．４倍上昇した。
ッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−
フォレートコンジュゲートで得られた。プロジェクトさ
れた検出可能な分析物の最低濃度は、０．００ｎＭフォ
レート用量応答、Ｂ0−２σ( n-1)からの２個の標準偏差
での両方のフォレート濃度から決定された。ＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲートは、検
出可能なフォレートの最低濃度を示し、次は、ＮＳＰ−
ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートコンジュゲートであ
り、その次はＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアート
コンジュゲートであった。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プ
テロアートトレーサーは、比較的低いＢ 0、削減された
動的範囲、および高い分別ＮＳＢ（ｆＮＳＢ）の結果と
して、最低感度のコンジュゲートであった。トレーサー
構造の差異は、感度に対する影響度にしたがって、下記
のようにランク付けすることができる。トレーサー構造
中のプテロアートをフォレートで置き換えると、ＮＳＰ
−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートトレーサーの結果
とＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートトレーサー
の結果を比較した場合、アッセイの感度は少なくとも
２．７倍上昇した。これは、フォレートアッセイの感度
に関するトレーサーと分析物の構造的類似性が相対的に
重要であることを反映している。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｈ
ＥＧ−アミンをグルタマートγ−カルボキシラートを介
してフォレートに結合させることは、α−カルボキシラ
ートを介するコンジュゲーションには好ましい。なぜな
ら、γ−カルボキシラート結合は、α−カルボキシラー
ト異性体と比較してアッセイの感度を２．２倍に上げる
からである。同様に、プテロアートトレーサーの疎水性
ＨＤ−スペーサーアームを親水性ＨＥＧ−スペーサーア
ームに置き換えることにより、フォレートアッセイの感
度が１．４倍上昇した。
【表３】
【００４６】ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−フォレートまたはプテ
ロアートコンジュゲート分別非特異的結合 分別ＮＳＢ
（以下、「ｆＮＳＢ」と呼ぶ）は、親水性ＨＥＧ−スペ
ーサーをコンジュゲート構造に導入することにより有意
に減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコ
ンジュゲートのｆＮＳＢは、他のプテロアートまたはフ
ォレートベースのコンジュゲートのｆＮＳＢよりも少な
くとも２．２倍高かった。疎水性ＨＤスペーサーは、Ｎ
ＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコンジュゲートと
固相の非特異的疎水性相互作用を増強させた。親水性Ｈ
ＥＧ−スペーサーのコンジュゲート構造への導入はｆＮ
ＳＢを減少させ、それはＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテ
ロアート、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレート、
およびＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートで明ら
かである。後者２種のフォレートベースのコンジュゲー
トのｆＮＳＢのわずかな上昇は、グルタマート部分で導
入された疎水性のわずかな上昇を反映している可能性が
ある。
ロアートコンジュゲート分別非特異的結合 分別ＮＳＢ
（以下、「ｆＮＳＢ」と呼ぶ）は、親水性ＨＥＧ−スペ
ーサーをコンジュゲート構造に導入することにより有意
に減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコ
ンジュゲートのｆＮＳＢは、他のプテロアートまたはフ
ォレートベースのコンジュゲートのｆＮＳＢよりも少な
くとも２．２倍高かった。疎水性ＨＤスペーサーは、Ｎ
ＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコンジュゲートと
固相の非特異的疎水性相互作用を増強させた。親水性Ｈ
ＥＧ−スペーサーのコンジュゲート構造への導入はｆＮ
ＳＢを減少させ、それはＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテ
ロアート、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレート、
およびＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートで明ら
かである。後者２種のフォレートベースのコンジュゲー
トのｆＮＳＢのわずかな上昇は、グルタマート部分で導
入された疎水性のわずかな上昇を反映している可能性が
ある。
【００４７】プテロアートおよびフォレートベースのコ
ンジュゲートのコンジュゲート結合親和性 親水性ＨＥ
Ｇ−スペーサーとフォレート部分全体の正しい配向は、
％Ｂ 0／Ｔを高めるために重要な構造的性質である。Ｎ
ＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲート
の％Ｂ0／Ｔは、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアート
コンジュゲートの％Ｂ0／Ｔよりも３．５倍高く、親水
性ＨＥＧ−スペーサーの導入とγ−グルタマートカルボ
キシルを介する結合のいずれもがより高い結合値に必要
なことを示している。ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロア
ートとＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートの結合値
の比較は、ＨＥＧ−スペーサーがＨＤ−スペーサーに関
して全体で３．５倍の増加の２．２倍を与えたことを示
している。結合のさらなる１．６倍の増加は、フォレー
トに結合したγ−グルタマートカルボキシル導入の結果
である。α−グルタマートカルボキシル結合がγ−グル
タマートカルボキシル結合と置き換わったとき、１．２
倍のさらにわずかな増加が見られた。
ンジュゲートのコンジュゲート結合親和性 親水性ＨＥ
Ｇ−スペーサーとフォレート部分全体の正しい配向は、
％Ｂ 0／Ｔを高めるために重要な構造的性質である。Ｎ
ＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲート
の％Ｂ0／Ｔは、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアート
コンジュゲートの％Ｂ0／Ｔよりも３．５倍高く、親水
性ＨＥＧ−スペーサーの導入とγ−グルタマートカルボ
キシルを介する結合のいずれもがより高い結合値に必要
なことを示している。ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロア
ートとＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートの結合値
の比較は、ＨＥＧ−スペーサーがＨＤ−スペーサーに関
して全体で３．５倍の増加の２．２倍を与えたことを示
している。結合のさらなる１．６倍の増加は、フォレー
トに結合したγ−グルタマートカルボキシル導入の結果
である。α−グルタマートカルボキシル結合がγ−グル
タマートカルボキシル結合と置き換わったとき、１．２
倍のさらにわずかな増加が見られた。
【００４８】フォレート用量応答曲線の形 ％Ｂ／Ｂ0
対フォレート濃度の用量応答曲線は、ＨＥＧ−スペーサ
ーの親水性の増大が、用量応答曲線の最初の傾きを増加
させることによってアッセイの感度を高めるために重要
であることを示している。高用量応答も同じ理由により
向上している。なぜなら、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテ
ロアートコンジュゲートの高い％Ｂ／Ｂ0は、他の比較
したコンジュゲートより少なくとも１０パーセントポイ
ント高いからである。
対フォレート濃度の用量応答曲線は、ＨＥＧ−スペーサ
ーの親水性の増大が、用量応答曲線の最初の傾きを増加
させることによってアッセイの感度を高めるために重要
であることを示している。高用量応答も同じ理由により
向上している。なぜなら、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテ
ロアートコンジュゲートの高い％Ｂ／Ｂ0は、他の比較
したコンジュゲートより少なくとも１０パーセントポイ
ント高いからである。
【００４９】実施例６
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジュゲートの合
成を下記のとおり実施した。トブラマイシン（１．４５
ｍｇ、３．３マイクロモル）を１：１、ＤＭＦ／０．１
ＭカルボナートｐＨ９（１ｍＬ）に溶解し、５分間隔で
周期的に加えられるＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステル
（２ｍｇ、３．３マイクロモル）のＤＭＦ（０．２ｍ
Ｌ）溶液で処理した。反応物を室温で２時間、次いで４
℃でさらに２４〜３６時間攪拌した。生成物をＣ１８カ
ラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を使用し、ＭｅＣＮ／
０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ５の１０％から６０％の勾配
（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣにより、流量２．３
ｍＬ／分および２６０ｎｍのＵＶ検出で精製した。コン
ジュゲートを１７〜１８分で溶離した。コンジュゲート
を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、白色の無定形の
固形物を得た。ＥＳ ＭＳ ９４３．７測定値（９４３
計算値）。
成を下記のとおり実施した。トブラマイシン（１．４５
ｍｇ、３．３マイクロモル）を１：１、ＤＭＦ／０．１
ＭカルボナートｐＨ９（１ｍＬ）に溶解し、５分間隔で
周期的に加えられるＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステル
（２ｍｇ、３．３マイクロモル）のＤＭＦ（０．２ｍ
Ｌ）溶液で処理した。反応物を室温で２時間、次いで４
℃でさらに２４〜３６時間攪拌した。生成物をＣ１８カ
ラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を使用し、ＭｅＣＮ／
０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ５の１０％から６０％の勾配
（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣにより、流量２．３
ｍＬ／分および２６０ｎｍのＵＶ検出で精製した。コン
ジュゲートを１７〜１８分で溶離した。コンジュゲート
を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、白色の無定形の
固形物を得た。ＥＳ ＭＳ ９４３．７測定値（９４３
計算値）。
【００５０】実施例７
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧグルタラートＮＨＳエステル
の合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（１〜２ｍＬ）
中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ（２０ｍｇ、２３マイク
ロモル）をグルタル酸無水物（４．２ｍｇ、１．５当
量）とジイソプロピルエチルアミン（１２μＬ、３当
量）で処理した。反応物を室温で攪拌した。約６時間
後、追加のグルタル酸無水物（３．２ｍｇ）を加え、反
応を一晩継続した。生成物をＣ１８カラム（２０×２５
０ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭ
ｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用い
る調製用ＨＰＬＣにより、流量１６ｍＬ／分および２６
０ｎｍのＵＶ検出で精製した。生成物を含むＨＰＬＣ画
分（Ｒｔ＝約２０〜２１分）を凍結乾燥して、黄色の固
形物を得た。収量７．３ｍｇ（３２％）。ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ ＭＳ ８７３．５測定値（８７０計算値）。
の合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（１〜２ｍＬ）
中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ（２０ｍｇ、２３マイク
ロモル）をグルタル酸無水物（４．２ｍｇ、１．５当
量）とジイソプロピルエチルアミン（１２μＬ、３当
量）で処理した。反応物を室温で攪拌した。約６時間
後、追加のグルタル酸無水物（３．２ｍｇ）を加え、反
応を一晩継続した。生成物をＣ１８カラム（２０×２５
０ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭ
ｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用い
る調製用ＨＰＬＣにより、流量１６ｍＬ／分および２６
０ｎｍのＵＶ検出で精製した。生成物を含むＨＰＬＣ画
分（Ｒｔ＝約２０〜２１分）を凍結乾燥して、黄色の固
形物を得た。収量７．３ｍｇ（３２％）。ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ ＭＳ ８７３．５測定値（８７０計算値）。
【００５１】ＤＭＦ（１ｍＬ）中のこの化合物（７．３
ｍｇ、８．４マイクロモル）をＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（４．８ｍｇ、５当量）とジシクロヘキシルカル
ボジイミド（８．７ｍｇ、５当量）で処理した。反応物
を室温、窒素下で攪拌した。約１６時間後、反応物をガ
ラスウールで濾過し、生成物を上述のとおりＨＰＬＣで
単離した（Ｒｔ＝約２３〜２４分）。生成物を含むＨＰ
ＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量
２．３ｍｇ（２８％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ ９７
０．８２測定値（９６７．１計算値）。
ｍｇ、８．４マイクロモル）をＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（４．８ｍｇ、５当量）とジシクロヘキシルカル
ボジイミド（８．７ｍｇ、５当量）で処理した。反応物
を室温、窒素下で攪拌した。約１６時間後、反応物をガ
ラスウールで濾過し、生成物を上述のとおりＨＰＬＣで
単離した（Ｒｔ＝約２３〜２４分）。生成物を含むＨＰ
ＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量
２．３ｍｇ（２８％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ ９７
０．８２測定値（９６７．１計算値）。
【００５２】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタ
ラート−トブラマイシンコンジュゲートの合成を下記の
とおり実施した。０．１ＭカルボナートｐＨ８．５
（０．３ｍＬ）中のトブラマイシン（１ｍｇ、２．１４
マイクロモル）を毎分２５μＬのアリコートで添加され
たＤＭＦ（０．１５ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥ
Ｇ−グルタラート−ＮＨＳエステル（０．５ｍｇ、０．
５２マイクロモル）で処理した。反応物を室温で１６時
間攪拌し、次いで、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシン
コンジュゲートで前述したとおりにＨＰＬＣ（Ｒｔ＝約
１８分）で直接精製した。収量約０．１ｍｇ。ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳ １３２３．３８測定値（１３２０．
４９計算値）。
ラート−トブラマイシンコンジュゲートの合成を下記の
とおり実施した。０．１ＭカルボナートｐＨ８．５
（０．３ｍＬ）中のトブラマイシン（１ｍｇ、２．１４
マイクロモル）を毎分２５μＬのアリコートで添加され
たＤＭＦ（０．１５ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥ
Ｇ−グルタラート−ＮＨＳエステル（０．５ｍｇ、０．
５２マイクロモル）で処理した。反応物を室温で１６時
間攪拌し、次いで、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシン
コンジュゲートで前述したとおりにＨＰＬＣ（Ｒｔ＝約
１８分）で直接精製した。収量約０．１ｍｇ。ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳ １３２３．３８測定値（１３２０．
４９計算値）。
【００５３】実施例８
トブラマイシンアッセイ−トブラマイシン結合アッセイ
におけるアクリジニウムエステル−トブラマイシンコン
ジュゲート結合機能の評価 このアッセイでは、アクリ
ジニウムエステル−トブラマイシンコンジュゲート（上
記では、トレーサーと呼んだ）とトブラマイシン含有標
準（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗａｌｐｏ
ｌｅ、ＭＡ）からのトブラマイシンは、ネズミＩｇＧ、
常磁性固相に共有結合的に結合したモノクローナル抗体
の制限量をめぐって競合する。トブラマイシン標準は、
０．００、１．０７、２．１４、４．２８、８．５６、
１７．１、２５．７および３４．２μＭの濃度のトブラ
マイシンを含有した。トブラマイシン標準５０μｌ、固
相４００μｌ、およびトレーサー１００μｌを混合して
反応を開始した。反応混合物を７．５分間３７℃でイン
キュベートした。永久磁石のアレイ上に固相を集め、脱
イオン水で洗浄して結合していないトレーサーを除去し
た。化学発光反応が上述のように開始した。データをＡ
ＣＳ：１８０によって検出した光子として集め、ＲＬＵ
で表した。非線形の相反関係が、標準に存在するトブラ
マイシン濃度とＡＣＳ：１８０で検出されたＲＬＵとの
間に存在する。得られたデータをフォレートアッセイデ
ータ処理で上述したとおり処理した。
におけるアクリジニウムエステル−トブラマイシンコン
ジュゲート結合機能の評価 このアッセイでは、アクリ
ジニウムエステル−トブラマイシンコンジュゲート（上
記では、トレーサーと呼んだ）とトブラマイシン含有標
準（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗａｌｐｏ
ｌｅ、ＭＡ）からのトブラマイシンは、ネズミＩｇＧ、
常磁性固相に共有結合的に結合したモノクローナル抗体
の制限量をめぐって競合する。トブラマイシン標準は、
０．００、１．０７、２．１４、４．２８、８．５６、
１７．１、２５．７および３４．２μＭの濃度のトブラ
マイシンを含有した。トブラマイシン標準５０μｌ、固
相４００μｌ、およびトレーサー１００μｌを混合して
反応を開始した。反応混合物を７．５分間３７℃でイン
キュベートした。永久磁石のアレイ上に固相を集め、脱
イオン水で洗浄して結合していないトレーサーを除去し
た。化学発光反応が上述のように開始した。データをＡ
ＣＳ：１８０によって検出した光子として集め、ＲＬＵ
で表した。非線形の相反関係が、標準に存在するトブラ
マイシン濃度とＡＣＳ：１８０で検出されたＲＬＵとの
間に存在する。得られたデータをフォレートアッセイデ
ータ処理で上述したとおり処理した。
【００５４】トブラマイシンアッセイの精度 アッセイ
の間、両方のトブラマイシントレーサーについて精度は
優れており、％Ｃ．Ｖ．は、標準曲線の全体にわたり十
分に１０％未満であった。２つのコンジュゲート間の総
体的な精度に差異はなかった。
の間、両方のトブラマイシントレーサーについて精度は
優れており、％Ｃ．Ｖ．は、標準曲線の全体にわたり十
分に１０％未満であった。２つのコンジュゲート間の総
体的な精度に差異はなかった。
【表４】
【００５５】トブラマイシンアッセイの確度 予想され
た４ＰＬ値との誤差率として示される確度は、両方のト
ブラマイシントレーサーで許容可能であり、ほとんどの
部分が標準曲線の全体にわたり±５％以内である。これ
らのコンジュゲートの総体的な確度に差異はなかった。
た４ＰＬ値との誤差率として示される確度は、両方のト
ブラマイシントレーサーで許容可能であり、ほとんどの
部分が標準曲線の全体にわたり±５％以内である。これ
らのコンジュゲートの総体的な確度に差異はなかった。
【表５】
【００５６】トブラマイシンアッセイの感度 トブラマ
イシンアッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥ
Ｇ−ｇｌｕｔ−トブラマイシンコンジュゲートを用いて
得られた。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−トブ
ラマイシンコンジュゲートを用いるアッセイ結果からの
予想感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジ
ュゲートを用いたものより１．７倍低かった。したがっ
て、本発明者等は、向上したトブラマイシンアッセイの
感度を得るためには、親水性ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−スペー
サーがトブラマイシンコンジュゲート構造に組み込まれ
なければならないと推断した。感度の向上は、ＨＥＧ−
ｇｌｕｔ−スペーサーがコンジュゲートに組み込まれた
ときの勾配がより急になった結果である。
イシンアッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥ
Ｇ−ｇｌｕｔ−トブラマイシンコンジュゲートを用いて
得られた。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−トブ
ラマイシンコンジュゲートを用いるアッセイ結果からの
予想感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジ
ュゲートを用いたものより１．７倍低かった。したがっ
て、本発明者等は、向上したトブラマイシンアッセイの
感度を得るためには、親水性ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−スペー
サーがトブラマイシンコンジュゲート構造に組み込まれ
なければならないと推断した。感度の向上は、ＨＥＧ−
ｇｌｕｔ−スペーサーがコンジュゲートに組み込まれた
ときの勾配がより急になった結果である。
【表６】
【００５７】ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジ
ュゲートの分別非特異的結合 分別ＮＳＢは、親水性Ｈ
ＥＧ−ｇｌｕｔ−スペーサーをコンジュゲート構造に導
入することにより有意に減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−
ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−トブラマイシンコンジュゲートの分
別ＮＳＢは、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジ
ュゲートの分別ＮＳＢよりも２．７倍低かった。
ュゲートの分別非特異的結合 分別ＮＳＢは、親水性Ｈ
ＥＧ−ｇｌｕｔ−スペーサーをコンジュゲート構造に導
入することにより有意に減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−
ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−トブラマイシンコンジュゲートの分
別ＮＳＢは、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジ
ュゲートの分別ＮＳＢよりも２．７倍低かった。
【００５８】トブラマイシンベースのコンジュゲートの
コンジュゲート結合親和性 親水性ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−
スペーサーの導入により、トブラマイシンコンジュゲー
トの％Ｂ0／Ｔは、８．９パーセントポイント低下し
た。
コンジュゲート結合親和性 親水性ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−
スペーサーの導入により、トブラマイシンコンジュゲー
トの％Ｂ0／Ｔは、８．９パーセントポイント低下し
た。
【００５９】トブラマイシン用量応答曲線の形 ％Ｂ／
Ｂ0対トブラマイシン濃度の用量応答曲線は、ＨＥＧ−
ｇｌｕｔ−スペーサーの親水性の増大が、用量応答曲線
の最初の傾きを増加させ、それによってアッセイの感度
を高めることを示している。
Ｂ0対トブラマイシン濃度の用量応答曲線は、ＨＥＧ−
ｇｌｕｔ−スペーサーの親水性の増大が、用量応答曲線
の最初の傾きを増加させ、それによってアッセイの感度
を高めることを示している。
【００６０】実施例９
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリンコンジュゲート
の合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（３ｍＬ）中の
８−カルボキシプロピルテオフィリン（１０ｍｇ、０．
０３８ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２
１．６ｍｇ、０．１８８ミリモル）とジシクロヘキシル
カルボジイミド（３８．８ｍｇ、０．１８８ミリモル）
で処理した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌した。
Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）を使用し、そ
れぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％か
ら６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣ分析によ
り、流量１ｍＬ／分、２６０ｎｍのＵＶ検出で、約５０
％の変換が示された。Ｒｔ（出発材料）＝１０分。Ｒｔ
（生成物）＝１４分。この材料は、次のカップリング反
応に精製することなく使用された。次に、メタノール
（０．２ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ（３．３ｍ
ｇ、０．００５６４ミリモル）をジイソプロピルエチル
アミン（２．９５μＬ、０．０１６９ミリモル）と８−
カルボキシプロピルテオフィリンＮＨＳエステル（１．
５ｍｇ、１当量）の上記ＤＭＦ溶液０．９ｍＬで処理し
た。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いで、Ｃ１８カ
ラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５
％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配
（４０分）を用いるＨＰＬＣにより流量１６ｍＬ／分お
よび２６０ｎｍのＵＶ検出で精製した。Ｒｔ（コンジュ
ゲート）＝約２３分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結
乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量４．３ｍｇ（９
１％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ８４０．３９測定
値（８３９．９７計算値）。
の合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（３ｍＬ）中の
８−カルボキシプロピルテオフィリン（１０ｍｇ、０．
０３８ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２
１．６ｍｇ、０．１８８ミリモル）とジシクロヘキシル
カルボジイミド（３８．８ｍｇ、０．１８８ミリモル）
で処理した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌した。
Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）を使用し、そ
れぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％か
ら６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣ分析によ
り、流量１ｍＬ／分、２６０ｎｍのＵＶ検出で、約５０
％の変換が示された。Ｒｔ（出発材料）＝１０分。Ｒｔ
（生成物）＝１４分。この材料は、次のカップリング反
応に精製することなく使用された。次に、メタノール
（０．２ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ（３．３ｍ
ｇ、０．００５６４ミリモル）をジイソプロピルエチル
アミン（２．９５μＬ、０．０１６９ミリモル）と８−
カルボキシプロピルテオフィリンＮＨＳエステル（１．
５ｍｇ、１当量）の上記ＤＭＦ溶液０．９ｍＬで処理し
た。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いで、Ｃ１８カ
ラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５
％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配
（４０分）を用いるＨＰＬＣにより流量１６ｍＬ／分お
よび２６０ｎｍのＵＶ検出で精製した。Ｒｔ（コンジュ
ゲート）＝約２３分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結
乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量４．３ｍｇ（９
１％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ８４０．３９測定
値（８３９．９７計算値）。
【００６１】実施例１０
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンコンジュゲ
ートの合成を下記のとおり実施した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−ＨＥＧ（６．５ｍｇ、０．００８６ミリモル）を、メ
タノール（０．２ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチ
ルアミン（３．９３μＬ、３当量）、次いでＤＭＦ
（１．２ｍＬ）中のカルボキシテオフィリン（２ｍｇ、
１当量）のＮＨＳエステルにより処理した。得られた反
応物を室温で１６時間攪拌した。次いで、反応物をガラ
スウールで濾過し、上述のようにＨＰＬＣで直接精製し
た（Ｒｔ＝２２分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結
乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量＝３．６ｍｇ
（４２％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ １００４．３６
測定値（１００２．１１計算値）。
ートの合成を下記のとおり実施した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−ＨＥＧ（６．５ｍｇ、０．００８６ミリモル）を、メ
タノール（０．２ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチ
ルアミン（３．９３μＬ、３当量）、次いでＤＭＦ
（１．２ｍＬ）中のカルボキシテオフィリン（２ｍｇ、
１当量）のＮＨＳエステルにより処理した。得られた反
応物を室温で１６時間攪拌した。次いで、反応物をガラ
スウールで濾過し、上述のようにＨＰＬＣで直接精製し
た（Ｒｔ＝２２分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結
乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量＝３．６ｍｇ
（４２％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ １００４．３６
測定値（１００２．１１計算値）。
【００６２】実施例１１
ビス（フタルイミド）スペルミンの合成を下記のとおり
実施した。クロロホルム（５ｍＬ）中のスペルミン（２
７５ｍｇ、０．００１３８モル）をＮ−カルブエトキシ
フタルイミド（０．６０８ｇ、０．００２７８モル）で
処理した。反応物を室温で４０分間攪拌し、そのときま
でにＴＬＣ分析（５％水酸化アンモニウム、９５％メタ
ノール）は、完全な変換を示した（Ｒｆ＝０．４２）。
次いで、反応混合物を蒸発乾固させ、その粗製材料をそ
のまま次の反応に用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
４６３．８測定値（４６２．５５計算値）。
実施した。クロロホルム（５ｍＬ）中のスペルミン（２
７５ｍｇ、０．００１３８モル）をＮ−カルブエトキシ
フタルイミド（０．６０８ｇ、０．００２７８モル）で
処理した。反応物を室温で４０分間攪拌し、そのときま
でにＴＬＣ分析（５％水酸化アンモニウム、９５％メタ
ノール）は、完全な変換を示した（Ｒｆ＝０．４２）。
次いで、反応混合物を蒸発乾固させ、その粗製材料をそ
のまま次の反応に用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
４６３．８測定値（４６２．５５計算値）。
【００６３】次に、ビス（フタルイミド）スペルミンジ
スルホナートの合成を実施した。ビス（フタルイミド）
スペルミン（０．４ｇ）を１，３−プロパンスルトン
（４ｇ）と密封管中で混合し、混合物を油浴中、１４０
℃で１６時間加熱した。次いで、反応混合物を室温に冷
却し、残留物を水と酢酸エチルの間に分配した。曇った
水性層を分離させ、酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エ
チル抽出物を廃棄した。水性層を減圧下で濃縮し、粘着
性の固形物を得た。収量０．５３ｇ（８７％）。ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ７０８．６１測定値（７０６．８
４計算値）。
スルホナートの合成を実施した。ビス（フタルイミド）
スペルミン（０．４ｇ）を１，３−プロパンスルトン
（４ｇ）と密封管中で混合し、混合物を油浴中、１４０
℃で１６時間加熱した。次いで、反応混合物を室温に冷
却し、残留物を水と酢酸エチルの間に分配した。曇った
水性層を分離させ、酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エ
チル抽出物を廃棄した。水性層を減圧下で濃縮し、粘着
性の固形物を得た。収量０．５３ｇ（８７％）。ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ７０８．６１測定値（７０６．８
４計算値）。
【００６４】次に、スペルミンジスルホナート（ＳＰＤ
Ｓ）の合成を下記のとおり実施した。ビス（フタルイミ
ド）スペルミンジスルホナート（０．５３ｇ）をメタノ
ール（１５〜２０ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン（０．５
ｍＬ）で処理した。得られた溶液を室温で２４時間攪拌
し、次いで減圧下で濃縮した。残留物を２０％水酸化ア
ンモニウムと８０％メタノール約５ｍＬに溶解し、蒸発
乾固した。このプロセスを１回繰り返した。最後に、残
留物をメタノール（１ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）、およ
びトリエチルアミン（１．５ｍＬ）の混合物に溶解し、
溶液を再び蒸発乾固した。この後に得られた粗生成物
を、溶離剤として１０％水酸化アンモニウム９０％メタ
ノールを用いるシリカゲルの調製用ＴＬＣにより精製し
た。化合物をメタノール中の２５〜３０％水酸化アンモ
ニウムを用いてＴＬＣプレートから抽出し、蒸発乾固し
た。残留物をメタノール（５）、水（５）、およびトリ
エチルアミン（１）の溶液からもう１回蒸発乾固した。
このプロセスを２回繰り返した。最後に、白色の固形物
が得られた。収量０．２ｇ（５７％）。ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳ ４７０．３６（Ｍ＋Ｎａ+）測定値（４４
６．６３）。
Ｓ）の合成を下記のとおり実施した。ビス（フタルイミ
ド）スペルミンジスルホナート（０．５３ｇ）をメタノ
ール（１５〜２０ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン（０．５
ｍＬ）で処理した。得られた溶液を室温で２４時間攪拌
し、次いで減圧下で濃縮した。残留物を２０％水酸化ア
ンモニウムと８０％メタノール約５ｍＬに溶解し、蒸発
乾固した。このプロセスを１回繰り返した。最後に、残
留物をメタノール（１ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）、およ
びトリエチルアミン（１．５ｍＬ）の混合物に溶解し、
溶液を再び蒸発乾固した。この後に得られた粗生成物
を、溶離剤として１０％水酸化アンモニウム９０％メタ
ノールを用いるシリカゲルの調製用ＴＬＣにより精製し
た。化合物をメタノール中の２５〜３０％水酸化アンモ
ニウムを用いてＴＬＣプレートから抽出し、蒸発乾固し
た。残留物をメタノール（５）、水（５）、およびトリ
エチルアミン（１）の溶液からもう１回蒸発乾固した。
このプロセスを２回繰り返した。最後に、白色の固形物
が得られた。収量０．２ｇ（５７％）。ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳ ４７０．３６（Ｍ＋Ｎａ+）測定値（４４
６．６３）。
【００６５】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳの合成
を下記のとおり実施した。スペルミンジスルホナート
（２５ｍｇ、０．０５６ミリモル）を２．０ｍＬの水／
０．２Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．５（１：４）に溶
解し、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（４．７ｍｇ、１／７
当量）、次いでＤＭＦ０．５ｍＬで処理した。反応物を
室温で１６時間攪拌した。Ｃ１８カラム（３．９×３０
０ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭ
ｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用い
るＨＰＬＣ分析により、流量１ｍＬ／分および２６０ｎ
ｍのＵＶ検出でＲｔ＝１４．５分での生成物が示され
た。これを２５×３００ｍｍのカラムを使用し、同じ勾
配を用いる調製用ＨＰＬＣにより単離した。生成物を含
むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得
た。収量２．４ｍｇ（３３％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ ９２６．９測定値（９２４．１７計算値）。
を下記のとおり実施した。スペルミンジスルホナート
（２５ｍｇ、０．０５６ミリモル）を２．０ｍＬの水／
０．２Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．５（１：４）に溶
解し、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（４．７ｍｇ、１／７
当量）、次いでＤＭＦ０．５ｍＬで処理した。反応物を
室温で１６時間攪拌した。Ｃ１８カラム（３．９×３０
０ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭ
ｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用い
るＨＰＬＣ分析により、流量１ｍＬ／分および２６０ｎ
ｍのＵＶ検出でＲｔ＝１４．５分での生成物が示され
た。これを２５×３００ｍｍのカラムを使用し、同じ勾
配を用いる調製用ＨＰＬＣにより単離した。生成物を含
むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得
た。収量２．４ｍｇ（３３％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ ９２６．９測定値（９２４．１７計算値）。
【００６６】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオ
フィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施し
た。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ（５．２ｍｇ、０．０
０５６４ミリモル）をＤＭＦ（０．１６ｍＬ）および
０．１ＭホスファートｐＨ８（４０μＬ）の混合物中に
溶解し、８−カルボキシプロピルテオフィリンＮＨＳエ
ステル（１．５ｍｇ、１当量）のＤＭＦ（０．９ｍＬ）
溶液で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。コ
ンジュゲートを上記のＣ１８カラムの調製用ＨＰＬＣに
より単離した。Ｒｔ（コンジュゲート）＝１５分。生成
物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させた。収量５．６ｍ
ｇ（８５％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ１１７１．８
９測定値（１１７２．４１計算値）。
フィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施し
た。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ（５．２ｍｇ、０．０
０５６４ミリモル）をＤＭＦ（０．１６ｍＬ）および
０．１ＭホスファートｐＨ８（４０μＬ）の混合物中に
溶解し、８−カルボキシプロピルテオフィリンＮＨＳエ
ステル（１．５ｍｇ、１当量）のＤＭＦ（０．９ｍＬ）
溶液で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。コ
ンジュゲートを上記のＣ１８カラムの調製用ＨＰＬＣに
より単離した。Ｒｔ（コンジュゲート）＝１５分。生成
物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させた。収量５．６ｍ
ｇ（８５％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ１１７１．８
９測定値（１１７２．４１計算値）。
【００６７】実施例１２
スペルミンジカルボキシラートの合成を下記のとおり実
施した。クロロホルム（１０ｍＬ）中のスペルミン（２
９６ｍｇ、０．００１４６モル）をＮ−カルブエトキシ
フタルイミド（６５８ｍｇ、２．０５当量）で処理し
た。反応物を室温、窒素下で攪拌した。１．５時間後、
ピリジン（３５３μＬ、３当量）およびジイソプロピル
エチルアミン（７７４μＬ、３当量）と共に無水コハク
酸（０．４４０ｇ、２当量）を加えた。反応物を室温で
１６時間攪拌した。ＴＬＣ分析（９０％クロロホルム、
９％メタノール、１％酢酸）により主要な生成物へのき
れいな変換が示された（Ｒｆ＝０．４３）。次いで、反
応混合物をヒドラジン（０．４５ｍＬ、約１０当量）お
よびメタノール（１０ｍＬ）で処理した。反応物を室温
で攪拌した。１〜２時間後、結晶性の沈殿物が反応混合
物中に現れた。３〜４時間の全反応時間後、反応物を減
圧下で濃縮した。残留物をアセトンに懸濁し、濾過し
た。沈殿物をアセトンですすぎ、トリエチルアミン
（１．５ｍＬ）を含む水（５０ｍＬ）に溶解した。これ
を減圧下で濃縮し、白色の粉末を得た。ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳ ４０３．７測定値（４０２．４９計算
値）。
施した。クロロホルム（１０ｍＬ）中のスペルミン（２
９６ｍｇ、０．００１４６モル）をＮ−カルブエトキシ
フタルイミド（６５８ｍｇ、２．０５当量）で処理し
た。反応物を室温、窒素下で攪拌した。１．５時間後、
ピリジン（３５３μＬ、３当量）およびジイソプロピル
エチルアミン（７７４μＬ、３当量）と共に無水コハク
酸（０．４４０ｇ、２当量）を加えた。反応物を室温で
１６時間攪拌した。ＴＬＣ分析（９０％クロロホルム、
９％メタノール、１％酢酸）により主要な生成物へのき
れいな変換が示された（Ｒｆ＝０．４３）。次いで、反
応混合物をヒドラジン（０．４５ｍＬ、約１０当量）お
よびメタノール（１０ｍＬ）で処理した。反応物を室温
で攪拌した。１〜２時間後、結晶性の沈殿物が反応混合
物中に現れた。３〜４時間の全反応時間後、反応物を減
圧下で濃縮した。残留物をアセトンに懸濁し、濾過し
た。沈殿物をアセトンですすぎ、トリエチルアミン
（１．５ｍＬ）を含む水（５０ｍＬ）に溶解した。これ
を減圧下で濃縮し、白色の粉末を得た。ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳ ４０３．７測定値（４０２．４９計算
値）。
【００６８】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣの合成
を下記のとおり実施した。スペルミンジカルボキシラー
ト（４５ｍｇ、０．１１２ミリモル）を０．１Ｍカルボ
ナートｐＨ９（５Ｎ ＮａＯＨで調整）２ｍＬに溶解
し、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステル（１０．５ｍ
ｇ、０．０１７８ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で
処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。生成物を
Ｃ１８カラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ
０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から４０％
の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣにより、流量
１６ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出、Ｒｔ（生成
物）＝１８分で単離した。生成物を含むＨＰＬＣ画分を
凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量６．７ｍｇ
（４３％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ８７７．５３
測定値（８７８．０１計算値）。
を下記のとおり実施した。スペルミンジカルボキシラー
ト（４５ｍｇ、０．１１２ミリモル）を０．１Ｍカルボ
ナートｐＨ９（５Ｎ ＮａＯＨで調整）２ｍＬに溶解
し、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステル（１０．５ｍ
ｇ、０．０１７８ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で
処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。生成物を
Ｃ１８カラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ
０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から４０％
の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣにより、流量
１６ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出、Ｒｔ（生成
物）＝１８分で単離した。生成物を含むＨＰＬＣ画分を
凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量６．７ｍｇ
（４３％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ８７７．５３
測定値（８７８．０１計算値）。
【００６９】次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ−テオ
フィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施し
た。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ（１ｍｇ、０．００１
１４ミルモル）をＤＭＦ０．１ｍＬに溶解し、ジイソプ
ロピルエチルアミン（２μＬ、２当量）と共に８−カル
ボキシプロピルテオフィリン（１ｍｇ、０．００２６２
ミリモル）を加えた。反応物を室温で１６時間攪拌し、
次いで、Ｃ１８カラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、
それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％
から６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣにより、
流量１６ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出、Ｒｔ（コ
ンジュゲート）＝１８分で直接精製した。生成物を含む
ＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させた。収量１．９ｍｇ（定量
的）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１２７．２４測定
値（１１２６．２５計算値）。
フィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施し
た。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ（１ｍｇ、０．００１
１４ミルモル）をＤＭＦ０．１ｍＬに溶解し、ジイソプ
ロピルエチルアミン（２μＬ、２当量）と共に８−カル
ボキシプロピルテオフィリン（１ｍｇ、０．００２６２
ミリモル）を加えた。反応物を室温で１６時間攪拌し、
次いで、Ｃ１８カラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、
それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％
から６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣにより、
流量１６ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出、Ｒｔ（コ
ンジュゲート）＝１８分で直接精製した。生成物を含む
ＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させた。収量１．９ｍｇ（定量
的）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ １１２７．２４測定
値（１１２６．２５計算値）。
【００７０】実施例１３
このアッセイでは、アクリジニウムエステル−テオフィ
リンコンジュゲート（上記では、トレーサーと呼ばれ
た）とテオフィリン含有標準（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ、Ｗａｌｐｏｌｅ、ＭＡ）からのテオフィ
リンは、常磁性粒子固相に共有結合的に結合した、制限
量のネズミＩｇＧ、モノクローナル抗テオフィリン抗体
をめぐって競合する。テオフィリン標準２０μＬを含む
反応混合物、固相４５０μＬ、およびトレーサー１００
μＬ（５９ｆモル）を３７℃で７．５分間インキュベー
トした。テオフィリン標準は、０．００、６．９４、１
３．９、２７．７、５５．５、１１１、および２２２μ
Ｍの濃度のテオフィリンを含有していた。永久磁石のア
レイ上に固相を集め、脱イオン水で２回洗浄して結合し
ていないトレーサーを除去した。化学発光反応が上述の
ように開始した。データをＡＣＳ：１８０によって検出
した光子として集め、ＲＬＵで表した。非線形の相反関
係が、標準に存在するテオフィリン濃度とＡＣＳ：１８
０で検出されたＲＬＵとの間に存在する。得られたデー
タをフォレートアッセイデータ処理で上述したとおり処
理した。
リンコンジュゲート（上記では、トレーサーと呼ばれ
た）とテオフィリン含有標準（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ、Ｗａｌｐｏｌｅ、ＭＡ）からのテオフィ
リンは、常磁性粒子固相に共有結合的に結合した、制限
量のネズミＩｇＧ、モノクローナル抗テオフィリン抗体
をめぐって競合する。テオフィリン標準２０μＬを含む
反応混合物、固相４５０μＬ、およびトレーサー１００
μＬ（５９ｆモル）を３７℃で７．５分間インキュベー
トした。テオフィリン標準は、０．００、６．９４、１
３．９、２７．７、５５．５、１１１、および２２２μ
Ｍの濃度のテオフィリンを含有していた。永久磁石のア
レイ上に固相を集め、脱イオン水で２回洗浄して結合し
ていないトレーサーを除去した。化学発光反応が上述の
ように開始した。データをＡＣＳ：１８０によって検出
した光子として集め、ＲＬＵで表した。非線形の相反関
係が、標準に存在するテオフィリン濃度とＡＣＳ：１８
０で検出されたＲＬＵとの間に存在する。得られたデー
タをフォレートアッセイデータ処理で上述したとおり処
理した。
【００７１】テオフィリンアッセイの精度 アッセイの
間、テオフィリントレーサーのすべてについて精度は十
分であり、％Ｃ．Ｖ．は、標準曲線の全体にわたり１０
％未満であった。
間、テオフィリントレーサーのすべてについて精度は十
分であり、％Ｃ．Ｖ．は、標準曲線の全体にわたり１０
％未満であった。
【表７】
【００７２】テオフィリンアッセイの確度 予想された
４ＰＬ値との誤差率として示される確度は、テオフィリ
ンコンジュゲートすべてで十分であり、標準曲線全体に
わたり十分に±５％以内である。これらのコンジュゲー
ト間の総体的な確度に差異はなかった。
４ＰＬ値との誤差率として示される確度は、テオフィリ
ンコンジュゲートすべてで十分であり、標準曲線全体に
わたり十分に±５％以内である。これらのコンジュゲー
ト間の総体的な確度に差異はなかった。
【表８】
【００７３】テオフィリンアッセイの感度 テオフィリ
ンアッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ
−テオフィリンコンジュゲートで得られた。ＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィリンおよびＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−ＳＰＤＳ−テオフィリンは、検出可能な最小用量を与
え、それはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリンの用
量よりも大きい。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィ
リンとＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンの場
合に感度が低下しているのは、ゼロ用量で不精度がわず
かに高い結果である可能性がある。
ンアッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ
−テオフィリンコンジュゲートで得られた。ＮＳＰ−Ｄ
ＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィリンおよびＮＳＰ−ＤＭＡＥ
−ＳＰＤＳ−テオフィリンは、検出可能な最小用量を与
え、それはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリンの用
量よりも大きい。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィ
リンとＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンの場
合に感度が低下しているのは、ゼロ用量で不精度がわず
かに高い結果である可能性がある。
【表９】
【００７４】ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−テオフィリンコンジュ
ゲート分別非特異的結合 分別ＮＳＢは、親水性スペー
サーをコンジュゲート構造に導入することにより有意に
減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリン
のｆＮＳＢは、総体的に最も低く、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−
ＨＤ−テオフィリンコンジュゲートのｆＮＳＢよりも
３．７倍低かった。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ−テオ
フィリンコンジュゲートとＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−
テオフィリンコンジュゲートは、それぞれ３．１倍と
２．０倍低いｆＮＳＢを有していた。より高い極性また
は荷電スペーサーはそれぞれのコンジュゲート上により
低いｆＮＳＢを与える。
ゲート分別非特異的結合 分別ＮＳＢは、親水性スペー
サーをコンジュゲート構造に導入することにより有意に
減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリン
のｆＮＳＢは、総体的に最も低く、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−
ＨＤ−テオフィリンコンジュゲートのｆＮＳＢよりも
３．７倍低かった。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ−テオ
フィリンコンジュゲートとＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−
テオフィリンコンジュゲートは、それぞれ３．１倍と
２．０倍低いｆＮＳＢを有していた。より高い極性また
は荷電スペーサーはそれぞれのコンジュゲート上により
低いｆＮＳＢを与える。
【００７５】テオフィリンベースのコンジュゲートのコ
ンジュゲート結合親和性 様々なコンジュゲートの％Ｂ
0／Ｔｓに認め得るほどの差異は見られなかった。
ンジュゲート結合親和性 様々なコンジュゲートの％Ｂ
0／Ｔｓに認め得るほどの差異は見られなかった。
【００７６】テオフィリン用量応答曲線の形 ％Ｂ／Ｂ
0対テオフィリン濃度の用量応答曲線は、スペーサーの
親水性の増大が、用量応答曲線の最初の傾きを増加さ
せ、それにより精度の当量を推定するアッセイの感度を
高めることを示している。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ
−テオフィリンコンジュゲートは、最初の傾きで最も急
な下り勾配を示し、第１ ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ
−テオフィリン；第２ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオ
フィリン；第３ ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリ
ンがこの順番でそれに続く。
0対テオフィリン濃度の用量応答曲線は、スペーサーの
親水性の増大が、用量応答曲線の最初の傾きを増加さ
せ、それにより精度の当量を推定するアッセイの感度を
高めることを示している。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ
−テオフィリンコンジュゲートは、最初の傾きで最も急
な下り勾配を示し、第１ ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ
−テオフィリン；第２ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオ
フィリン；第３ ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリ
ンがこの順番でそれに続く。
【図１】ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートの合成
を示す図である。
を示す図である。
【図２】ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートの合
成を示す図である。
成を示す図である。
【図３】ＤＭＡＥ−プテロアートコンジュゲートの用量
応答曲線を示す図である。
応答曲線を示す図である。
【図４】ヘキサエチレングリコールスペーサーを有する
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−フォレートコンジュゲートの合成を
示す図である。
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−フォレートコンジュゲートの合成を
示す図である。
【図５】アルファリンクフォレートトレーサーの合成を
示す図である。
示す図である。
【図６】トブラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサー
の合成を示す図である。
の合成を示す図である。
【図７】トブラマイシンコンジュゲートの用量応答曲線
を示す図である。
を示す図である。
【図８】ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−テオフィリントレーサーの
合成を示す図である。
合成を示す図である。
【図９】ＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体をカルボキシテオフィ
リンとカップリングさせてトレーサーを形成することを
示す図である。
リンとカップリングさせてトレーサーを形成することを
示す図である。
【図１０】テオフィリンコンジュゲートの用量応答曲線
を示す図である。
を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 デイヴィド、シャープ
アメリカ合衆国マサチューシッツ州02035、
フォクスバラ、クロス・ストリート 61番
(72)発明者 クインピン、ジァン
アメリカ合衆国マサチューシッツ州01532、
ノースバラ、ストラトン・ウエイ 14番
Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB48 BB50 DA80 FB12
FB13 GC15 JA01
2G054 AA10 CA30 CE02 EA01 EA03
GA04 JA00 JA06
Claims (9)
- 【請求項１】 （ａ）親水性修飾剤を有するアクリジニ
ウムエステルを含む、検出可能な化学発光アクリジニウ
ムエステル標識。 - 【請求項２】 （ａ）親水性修飾剤が、非イオン性ポリ
エチレングリコール、ポリイオン性スペルミンジスルホ
ナート、およびポリイオン性スペルミンジカルボキシラ
ートからなる群から選択される修飾剤である、請求項１
に記載の標識。 - 【請求項３】 （ａ）修飾剤がアクリジニウムエステル
を競合部分と共有結合的に結合させる、請求項２に記載
の標識。 - 【請求項４】 （ａ）競合部分が標的分析物、および標
的分析物の誘導体または類似体からなる群から選択され
る、請求項３に記載の標識。 - 【請求項５】 フォレートのアッセイを実施するように
適合され、かつ実施することが可能な、検出可能な化学
発光アクリジニウム標識。 - 【請求項６】 テオフィリンのアッセイを実施するよう
に適合され、かつ実施することが可能である、検出可能
な化学発光アクリジニウム標識。 - 【請求項７】 トブラマイシンのアッセイを実施するよ
うに適合され、かつ実施することが可能である、検出可
能な化学発光アクリジニウム標識。 - 【請求項８】 （ａ）請求項３に記載の標識、（ｂ）競
合部分の結合パートナー、および（ｃ）標識中の競合部
分が結合パートナーに結合していることを含む錯体。 - 【請求項９】 （ａ）標的分析物を含むと推測されるサ
ンプルを、請求項４に記載の標識、および標的分析物の
対応する結合パートナーにさらし、 （ｂ）標識がサンプルからの標的分析物により、対応す
る結合パートナーとの結合相互作用を形成することを競
合的に妨げられ、かつ／または置き換えられる範囲を決
定し、 （ｃ）上記のステップ（ｂ）での決定をサンプルからの
標的分析物の存在または量と対応させることを含むアッ
セイの実施方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/898381 | 2001-07-03 | ||
| US09/898,381 US6664043B2 (en) | 2001-07-03 | 2001-07-03 | Acridinium ester labels having hydrophilic modifiers |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009239298A Division JP4913195B2 (ja) | 2001-07-03 | 2009-10-16 | 親水性修飾剤を有するアクリジニウムエステル標識 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003050204A true JP2003050204A (ja) | 2003-02-21 |
| JP4467869B2 JP4467869B2 (ja) | 2010-05-26 |
Family
ID=25409366
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP2009239298A Expired - Lifetime JP4913195B2 (ja) | 2001-07-03 | 2009-10-16 | 親水性修飾剤を有するアクリジニウムエステル標識 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009239298A Expired - Lifetime JP4913195B2 (ja) | 2001-07-03 | 2009-10-16 | 親水性修飾剤を有するアクリジニウムエステル標識 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1273917B1 (ja) |
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| AU (1) | AU782559B2 (ja) |
| CA (1) | CA2387466A1 (ja) |
| ES (1) | ES2486815T3 (ja) |
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| EP2103923A2 (en) | 2008-03-17 | 2009-09-23 | Hitachi High-Technologies Corporation | Automatic analyzer and analysis system using photomultiplier tube |
| WO2009136613A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | 自動分析装置 |
| DE112010000834T5 (de) | 2009-01-30 | 2012-06-21 | Hitachi High-Technologies Corp. | Automatischer Analysator |
| JP2014051498A (ja) * | 2007-01-31 | 2014-03-20 | Affymax Inc | 修飾基をポリペプチドおよびその他の高分子に結合するための窒素ベースのリンカー |
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| US7309615B2 (en) * | 2002-09-27 | 2007-12-18 | Siemens Medical Solutions Diagnostic | High quantum yield acridinium compounds and their uses in improving assay sensitivity |
| JP2009525946A (ja) | 2005-12-20 | 2009-07-16 | デューク・ユニヴァーシティ | 増強された薬理学的性質を有する活性物質を送達するための方法および組成物 |
| ES2585364T3 (es) * | 2009-11-16 | 2016-10-05 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Compuestos de acridinio que contienen zwitteriones |
| ES2618042T3 (es) * | 2012-07-10 | 2017-06-20 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Síntesis de compuestos de acridinio mediante n-alquilación de acridanos |
| US10202469B2 (en) | 2012-11-30 | 2019-02-12 | Glytech, Inc. | Sugar chain-attached linker, compound containing sugar chain-attached linker and physiologically active substance or salt thereof, and method for producing same |
| FR3000551B1 (fr) * | 2012-12-27 | 2015-06-26 | Biomerieux Sa | Derives de folate, particulierement utiles dans le cadre du dosage de folate(s) |
| EP2997355B1 (en) | 2013-05-14 | 2019-11-20 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Degradable cationic surfactants and use thereof in enhancing chemiluminescence |
| CN112521335A (zh) | 2013-07-08 | 2021-03-19 | 西门子医疗保健诊断公司 | 具有改进的稳定性和快速发光的亲水高量子产率吖啶酯 |
| JP7003144B2 (ja) * | 2017-02-23 | 2022-02-10 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 化学発光アンドロステンジオンコンジュゲート |
| WO2020005920A1 (en) | 2018-06-25 | 2020-01-02 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | N-alkylation of acridans |
| CN109535062B (zh) * | 2019-01-10 | 2021-03-23 | 中北大学 | 一种降冰片烯类两性离子单体及其制备方法 |
| CN110850077A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-28 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 妥布霉素化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
| CN112920399A (zh) * | 2019-12-05 | 2021-06-08 | 广东菲鹏生物有限公司 | 吖啶化合物标记类固醇激素衍生物及其制备方法和应用 |
| CN112684163B (zh) * | 2021-01-29 | 2022-08-09 | 安邦（厦门）生物科技有限公司 | 一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法 |
| ES2952362T3 (es) | 2021-07-29 | 2023-10-31 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Un método y reactivos para mejorar la señal quimioluminiscente |
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|---|---|---|---|---|
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| US5656426A (en) * | 1988-08-01 | 1997-08-12 | Chiron Diagnostics Corporation | Functionaized hydrophilic acridinium esters |
| JPH0286567A (ja) * | 1988-09-21 | 1990-03-27 | Ricoh Co Ltd | シート後処理制御装置 |
| CA1339491C (en) * | 1988-09-26 | 1997-10-07 | Say-Jong Law | Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium ester and uses thereof |
| US5663074A (en) * | 1988-09-26 | 1997-09-02 | Chiron Diagnostics Corporation | Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium ester conjugates and syntheses thereof |
| DE4004296A1 (de) * | 1990-02-13 | 1991-08-14 | Hoechst Ag | Verbesserte markierte haptene, verfahren zu deren herstellung sowie verwendung dieser markierten haptene in immunoassays |
| DE4444002A1 (de) * | 1994-12-10 | 1996-06-13 | Behringwerke Ag | Immunoassays für Haptene und hierfür verwendbare Haptentracer-Antikörper-Komplexe sowie Verfahren zur Herstellung derselben |
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