JPH11322796A - 色素標識タンパク質複合体およびその製造方法 - Google Patents
色素標識タンパク質複合体およびその製造方法Info
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- JPH11322796A JPH11322796A JP10132418A JP13241898A JPH11322796A JP H11322796 A JPH11322796 A JP H11322796A JP 10132418 A JP10132418 A JP 10132418A JP 13241898 A JP13241898 A JP 13241898A JP H11322796 A JPH11322796 A JP H11322796A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多数の色素で標識された色素標識タンパク質
複合体を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明による色素標識タンパク質複合体
は、ジスルフィド結合によってタンパク質と結合した抗
体からなるタンパク質複合体が、次式（ただし、Ｒ1お
よびＲ2は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、Ｍは
水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
で示されるシアニン系色素で標識されたものである。 【化１】
複合体を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明による色素標識タンパク質複合体
は、ジスルフィド結合によってタンパク質と結合した抗
体からなるタンパク質複合体が、次式（ただし、Ｒ1お
よびＲ2は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、Ｍは
水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
で示されるシアニン系色素で標識されたものである。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質と結合
した抗体からなるタンパク質複合体をシアニン系色素で
標識した色素標識タンパク質複合体およびその製造方法
に関する。
した抗体からなるタンパク質複合体をシアニン系色素で
標識した色素標識タンパク質複合体およびその製造方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗体を色素で標識した色素標識抗体は、
試料液中に含まれる抗原と特異的に反応し、かつ視認性
があるため、例えば、免疫学的抗原抗体反応を利用し
て、試料液中に含まれる検体の検出を行う免疫センサに
使用され、各種医療機関での診断に活用されている。抗
体を標識する色素としては、高いモル吸光係数を有し、
反応性の高いシアニン系標識色素が使用される場合が多
い（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ＶＯＬ.４ Ｎｏ.２,ｐｐ１０５−１１１,１９９３）。
試料液中に含まれる抗原と特異的に反応し、かつ視認性
があるため、例えば、免疫学的抗原抗体反応を利用し
て、試料液中に含まれる検体の検出を行う免疫センサに
使用され、各種医療機関での診断に活用されている。抗
体を標識する色素としては、高いモル吸光係数を有し、
反応性の高いシアニン系標識色素が使用される場合が多
い（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ＶＯＬ.４ Ｎｏ.２,ｐｐ１０５−１１１,１９９３）。
【０００３】このようなシアニン系色素は、その官能基
が抗体のアミノ基またはカルボキシル基と反応して共有
結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色
素が結合する。このようにして作製されたシアニン系色
素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば免疫クロマ
トグラフィーに導入されて、妊婦の尿中にのみ存在する
ヒト絨毛性ゴナドトロピン等の微量成分を検出するのに
有効に用いられている。
が抗体のアミノ基またはカルボキシル基と反応して共有
結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色
素が結合する。このようにして作製されたシアニン系色
素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば免疫クロマ
トグラフィーに導入されて、妊婦の尿中にのみ存在する
ヒト絨毛性ゴナドトロピン等の微量成分を検出するのに
有効に用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】通常、抗体には、数百
から数千個のアミノ基またはカルボキシル基が存在す
る。しかし、抗体は３次元の立体構造を有するため、こ
れらの中で反応に関与できるのは５０個程度であると考
えられ、１分子の抗体に対して、色素５０分子が結合す
るのが限界であった。従って、この色素標識抗体を免疫
センサ等に利用した場合、検出対象物の濃度が低いと、
その検出が困難になる問題が生じた。本発明は、上記課
題に鑑み、多数の色素で標識された色素標識タンパク質
複合体およびその製造方法を提供することを目的とす
る。
から数千個のアミノ基またはカルボキシル基が存在す
る。しかし、抗体は３次元の立体構造を有するため、こ
れらの中で反応に関与できるのは５０個程度であると考
えられ、１分子の抗体に対して、色素５０分子が結合す
るのが限界であった。従って、この色素標識抗体を免疫
センサ等に利用した場合、検出対象物の濃度が低いと、
その検出が困難になる問題が生じた。本発明は、上記課
題に鑑み、多数の色素で標識された色素標識タンパク質
複合体およびその製造方法を提供することを目的とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明による色素標識タ
ンパク質複合体は、ジスルフィド結合によってタンパク
質と結合した抗体からなるタンパク質複合体が、式
（１）で示されるシアニン系色素で標識されたものであ
る。
ンパク質複合体は、ジスルフィド結合によってタンパク
質と結合した抗体からなるタンパク質複合体が、式
（１）で示されるシアニン系色素で標識されたものであ
る。
【０００６】
【化４】
【０００７】（ただし、Ｒ1およびＲ2は水素またはアル
キル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、
ｎは１〜４の整数を示す。）
キル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、
ｎは１〜４の整数を示す。）
【０００８】抗体にタンパク質を結合させると、シアニ
ン系色素が結合できる面積が広がるため、タンパク質複
合体に結合するシアニン系色素の数は、抗体単体の場合
よりも多くなる。例えば、抗体１分子あたりに結合する
色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍にすることがで
きる。そのため、得られる色素標識タンパク質複合体
は、視認性に優れる。したがって、本発明による色素標
識タンパク質複合体を、例えば、免疫クロマトグラフィ
ーに用いれば、測定対象物（検体）の濃度が低い場合で
も、検体を高感度に検出できる。また、その高感度か
ら、本発明の色素標識タンパク質複合体は、バイオセン
サーにも適用可能である。また、本発明による色素標識
タンパク質複合体は、前記シアニン系色素のスクシンイ
ミジル基由来のアシル炭素と前記タンパク質複合体のア
ミノ基由来の窒素とが共有結合することにより、前記色
素の骨格がタンパク質複合体に結合している構成である
のが好ましい。
ン系色素が結合できる面積が広がるため、タンパク質複
合体に結合するシアニン系色素の数は、抗体単体の場合
よりも多くなる。例えば、抗体１分子あたりに結合する
色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍にすることがで
きる。そのため、得られる色素標識タンパク質複合体
は、視認性に優れる。したがって、本発明による色素標
識タンパク質複合体を、例えば、免疫クロマトグラフィ
ーに用いれば、測定対象物（検体）の濃度が低い場合で
も、検体を高感度に検出できる。また、その高感度か
ら、本発明の色素標識タンパク質複合体は、バイオセン
サーにも適用可能である。また、本発明による色素標識
タンパク質複合体は、前記シアニン系色素のスクシンイ
ミジル基由来のアシル炭素と前記タンパク質複合体のア
ミノ基由来の窒素とが共有結合することにより、前記色
素の骨格がタンパク質複合体に結合している構成である
のが好ましい。
【０００９】本発明による色素標識タンパク質複合体の
製造方法は、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中
でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に抗体を添
加してタンパク質複合体を作製する工程、およびこの緩
衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して
前記タンパク質複合体を標識する工程を含む。また、中
性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を
還元する工程、この緩衝液中に式（１）で示されるシア
ニン系色素を添加して前記還元されたタンパク質を標識
する工程、およびこの緩衝液中に前記抗体を添加する工
程を含む構成でもよい。還元されたタンパク質と抗体と
を結合させる工程の前に、抗体を中性または弱アルカリ
性のリン酸緩衝液中で、式（２）で示すようなスクシン
イミジルピリジルジチオプロピオネートを用いて標識す
る工程を含ませてもよい。いずれの方法においても、リ
ン酸緩衝液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲が好まし
い。
製造方法は、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中
でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に抗体を添
加してタンパク質複合体を作製する工程、およびこの緩
衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して
前記タンパク質複合体を標識する工程を含む。また、中
性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を
還元する工程、この緩衝液中に式（１）で示されるシア
ニン系色素を添加して前記還元されたタンパク質を標識
する工程、およびこの緩衝液中に前記抗体を添加する工
程を含む構成でもよい。還元されたタンパク質と抗体と
を結合させる工程の前に、抗体を中性または弱アルカリ
性のリン酸緩衝液中で、式（２）で示すようなスクシン
イミジルピリジルジチオプロピオネートを用いて標識す
る工程を含ませてもよい。いずれの方法においても、リ
ン酸緩衝液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲が好まし
い。
【００１０】
【化５】
【００１１】本発明の色素標識タンパク質複合体に用い
ることができる抗体は、特に制限されず、その由来やサ
ブクラス等に関係なく使用できる。例えば、イムノグロ
ブリン（Ｉｇ）として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、
マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩ
ｇＭ、ラットＩｇＡ、ラットＩｇＥ、ラビットＩｇＧ、
ラビットＩｇＭ、ラビットＩｇＡ、ラビットＩｇＥ、ヤ
ギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヤギＩｇＥ、ヤギＩｇＡ、ヒツ
ジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ヒツジＩｇＡ、ヒツジＩｇＥ
等が挙げられる。これらの抗体は、市販品として入手し
ても、直接その動物から採取してもよい。
ることができる抗体は、特に制限されず、その由来やサ
ブクラス等に関係なく使用できる。例えば、イムノグロ
ブリン（Ｉｇ）として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、
マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩ
ｇＭ、ラットＩｇＡ、ラットＩｇＥ、ラビットＩｇＧ、
ラビットＩｇＭ、ラビットＩｇＡ、ラビットＩｇＥ、ヤ
ギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヤギＩｇＥ、ヤギＩｇＡ、ヒツ
ジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ヒツジＩｇＡ、ヒツジＩｇＥ
等が挙げられる。これらの抗体は、市販品として入手し
ても、直接その動物から採取してもよい。
【００１２】抗体に結合するタンパク質は、抗体として
の機能を発揮しないタンパク質であればよい。また、水
溶性に富むものであればより好ましい。例えば、血清由
来のアルブミン等は、抗体の反応を阻害しないうえに、
高い水溶性を有しているので好適である。
の機能を発揮しないタンパク質であればよい。また、水
溶性に富むものであればより好ましい。例えば、血清由
来のアルブミン等は、抗体の反応を阻害しないうえに、
高い水溶性を有しているので好適である。
【００１３】式（１）で示されるシアニン系色素は、肉
眼で確認することが容易な赤色系統の色素で、共役炭素
の数が少ないため、シアニン系色素の中では最も水溶性
に富んでいる。式（１）において、Ｘで示されるハロゲ
ンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素
が挙げられる。また、Ｍで示される金属としては、リチ
ウム、ナトリウムおよびカリウム等が挙げられる。
眼で確認することが容易な赤色系統の色素で、共役炭素
の数が少ないため、シアニン系色素の中では最も水溶性
に富んでいる。式（１）において、Ｘで示されるハロゲ
ンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素
が挙げられる。また、Ｍで示される金属としては、リチ
ウム、ナトリウムおよびカリウム等が挙げられる。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下に、抗体とシアニン系色素の
結合反応のメカニズムを説明する。
結合反応のメカニズムを説明する。
【００１５】
【化６】
【００１６】まず、式（３）に示すように、抗体に対
し、スクシンイミジル基を有するシアニン系色素を配合
すると、前記色素のスクシンイミジル基のエステル結合
部分に、抗体のアミノ基が接近する。そして、式（４）
に示すように、前記アミノ基と前記エステル結合部分と
が反応し、前記アミノ基から水素原子が一個奪われる。
そして、このアミノ基から脱離した水素原子は、前記ス
クシンイミジル基のスクシンイミドと結合する。スクシ
ンイミドはスクシンイミジル基からヒドロキシスクシン
イミドとなって脱離し、これと同時に、前記スクシンイ
ミジル基の残りの部分と、前記水素原子が一個奪われた
アミノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によ
って前記色素と前記抗体とが結合する。
し、スクシンイミジル基を有するシアニン系色素を配合
すると、前記色素のスクシンイミジル基のエステル結合
部分に、抗体のアミノ基が接近する。そして、式（４）
に示すように、前記アミノ基と前記エステル結合部分と
が反応し、前記アミノ基から水素原子が一個奪われる。
そして、このアミノ基から脱離した水素原子は、前記ス
クシンイミジル基のスクシンイミドと結合する。スクシ
ンイミドはスクシンイミジル基からヒドロキシスクシン
イミドとなって脱離し、これと同時に、前記スクシンイ
ミジル基の残りの部分と、前記水素原子が一個奪われた
アミノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によ
って前記色素と前記抗体とが結合する。
【００１７】また、以下に、式（１）で示されるシアニ
ン系色素の合成経路の一例を示す。
ン系色素の合成経路の一例を示す。
【００１８】
【化７】
【００１９】まず、ヒドラジノベンゼンスルホン酸
（５）とイソプロピルメチルケトンとを酸性溶媒に溶解
し加熱することによってインドレニウムスルホネート
（６）を作製する。そして、インドレニウムスルホネー
ト（６）のアルコール溶液に金属水酸化物飽和のアルコ
ール溶液を加えることによって、インドレニウムスルホ
ネートの金属塩（７）を得る。次に、前記金属塩（７）
の有機溶媒溶液にハロゲン化アルキル酸を加えて、加熱
してカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの
金属塩（８）を得る。ハロゲン化アルキル酸の炭素数
は、水への溶解性を考え、１〜４が好ましい。そして、
前記金属塩（８）とＮ−カルボキシエチル−３，３−ジ
メチルインドレニンを塩基性有機溶媒に溶解し、加熱す
ることによってカルボン酸誘導体（９）を作製し、最後
に、カルボン酸誘導体（９）の有機溶媒溶液中に、ヒド
ロキシコハク酸イミドと、縮合剤としてジシクロヘキシ
ルカルボジイミドとを加えて攪拌することにより、式
（１）で示されるシアニン系標識色素を得る。
（５）とイソプロピルメチルケトンとを酸性溶媒に溶解
し加熱することによってインドレニウムスルホネート
（６）を作製する。そして、インドレニウムスルホネー
ト（６）のアルコール溶液に金属水酸化物飽和のアルコ
ール溶液を加えることによって、インドレニウムスルホ
ネートの金属塩（７）を得る。次に、前記金属塩（７）
の有機溶媒溶液にハロゲン化アルキル酸を加えて、加熱
してカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの
金属塩（８）を得る。ハロゲン化アルキル酸の炭素数
は、水への溶解性を考え、１〜４が好ましい。そして、
前記金属塩（８）とＮ−カルボキシエチル−３，３−ジ
メチルインドレニンを塩基性有機溶媒に溶解し、加熱す
ることによってカルボン酸誘導体（９）を作製し、最後
に、カルボン酸誘導体（９）の有機溶媒溶液中に、ヒド
ロキシコハク酸イミドと、縮合剤としてジシクロヘキシ
ルカルボジイミドとを加えて攪拌することにより、式
（１）で示されるシアニン系標識色素を得る。
【００２０】なお、式（１）、式（８）および式（９）
で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、例え
ばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、式
（１）、式（７）〜（９）で示される各化合物に含まれ
る金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウ
ムなどがあげられる。
で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、例え
ばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、式
（１）、式（７）〜（９）で示される各化合物に含まれ
る金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウ
ムなどがあげられる。
【００２１】
【実施例】以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明を
より詳細に説明する。 《実施例１》 （１）マウスＩｇＧのスクシンイミジルピリジルジチオ
プロピオネート標識 ５ｍｇ（３．３×１０-5ｍｍｏｌ）のマウスＩｇＧ（以
下、ＩｇＧと略す。）を２ｍｌのリン酸緩衝液（以下、
ＰＢＳという。）に溶解した。これを室温で攪拌しなが
ら、０．５２ｍｇ（１．６７×１０-3ｍｍｏｌ）のスク
シンイミジルピリジルジチオプロピオネート（以下、Ｓ
ＰＤＰとする。）のエタノール溶液０．１ｍｌを滴下し
た。滴下したＳＰＤＰのエタノール溶液中には、０．５
２ｍｇ（１．６７×１０-3ｍｍｏｌ）のＳＰＤＰが含ま
れていた。この後、室温で３０分間攪拌した後、セファ
ロースゲル（ファルマシア社製；セファデックスＧ２５
Ｍカラム）を用いて濾過し、約６ｍｌのＳＰＤＰ標識Ｉ
ｇＧ（以下、ＩｇＧ−ＳＰＤＰとする。）のＰＢＳ溶液
を得た。得られた溶液の濃度及び抗体に対するＳＰＤＰ
の結合分子数を次のように計算して求めた。
より詳細に説明する。 《実施例１》 （１）マウスＩｇＧのスクシンイミジルピリジルジチオ
プロピオネート標識 ５ｍｇ（３．３×１０-5ｍｍｏｌ）のマウスＩｇＧ（以
下、ＩｇＧと略す。）を２ｍｌのリン酸緩衝液（以下、
ＰＢＳという。）に溶解した。これを室温で攪拌しなが
ら、０．５２ｍｇ（１．６７×１０-3ｍｍｏｌ）のスク
シンイミジルピリジルジチオプロピオネート（以下、Ｓ
ＰＤＰとする。）のエタノール溶液０．１ｍｌを滴下し
た。滴下したＳＰＤＰのエタノール溶液中には、０．５
２ｍｇ（１．６７×１０-3ｍｍｏｌ）のＳＰＤＰが含ま
れていた。この後、室温で３０分間攪拌した後、セファ
ロースゲル（ファルマシア社製；セファデックスＧ２５
Ｍカラム）を用いて濾過し、約６ｍｌのＳＰＤＰ標識Ｉ
ｇＧ（以下、ＩｇＧ−ＳＰＤＰとする。）のＰＢＳ溶液
を得た。得られた溶液の濃度及び抗体に対するＳＰＤＰ
の結合分子数を次のように計算して求めた。
【００２２】まず、得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２
８０ｎｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は、１．２
５であった。次に、この溶液に、０．０２５ｍｌの１０
０ｍＭのジチオスレイトール（以下、ＤＴＴとする。）
水溶液を加え、１分間静置した後、３４３ｎｍでの吸光
度を測定した。得られた吸光度は０．３９であった。Ｉ
ｇＧには３４３ｎｍに吸収がないので、観測された３４
３ｎｍの吸光はＤＴＴ還元によって放出されたチオピリ
ドンに由来するものである。この放出チオピリドンはＳ
ＰＤＰのピリジルジチオ基が還元されたもので、この濃
度は抗体に結合しているＳＰＤＰの濃度に等しい。従っ
てＳＰＤＰの濃度［ＳＰＤＰ］は、次のように求めるこ
とができる。ただし、チオピリドンの３４３ｎｍにおけ
るモル吸光係数を８．０８×１０3とした。 ［ＳＰＤＰ］＝０．３９／（８．０８×１０3）＝４．
８３×１０-5（Ｍ）
８０ｎｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は、１．２
５であった。次に、この溶液に、０．０２５ｍｌの１０
０ｍＭのジチオスレイトール（以下、ＤＴＴとする。）
水溶液を加え、１分間静置した後、３４３ｎｍでの吸光
度を測定した。得られた吸光度は０．３９であった。Ｉ
ｇＧには３４３ｎｍに吸収がないので、観測された３４
３ｎｍの吸光はＤＴＴ還元によって放出されたチオピリ
ドンに由来するものである。この放出チオピリドンはＳ
ＰＤＰのピリジルジチオ基が還元されたもので、この濃
度は抗体に結合しているＳＰＤＰの濃度に等しい。従っ
てＳＰＤＰの濃度［ＳＰＤＰ］は、次のように求めるこ
とができる。ただし、チオピリドンの３４３ｎｍにおけ
るモル吸光係数を８．０８×１０3とした。 ［ＳＰＤＰ］＝０．３９／（８．０８×１０3）＝４．
８３×１０-5（Ｍ）
【００２３】また、観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇ
Ｇに由来するものであるが、結合しているＳＰＤＰが２
８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＩ
ｇＧの濃度［ＩｇＧ］を求めると次のようになる。但
し、ＩｇＧに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ280，
IgGとし、ＳＰＤＰの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数
を５．１×１０3、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸
光係数を２．１０×１０5とした。 Ａｂ280，IgG ＝１．２５−（４．８３×１０ー5×５．
１×１０3）＝１．００ ［ＩｇＧ］＝１．００／（２．１０×１０5）＝４．７
８×１０-6（Ｍ） したがって、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＰＤＰの
分子数は次のようになった。 [ＳＰＤＰ]／［ＩｇＧ］=４．８３×１０-5／４．７８
×１０-6＝１０．１(個)
Ｇに由来するものであるが、結合しているＳＰＤＰが２
８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＩ
ｇＧの濃度［ＩｇＧ］を求めると次のようになる。但
し、ＩｇＧに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ280，
IgGとし、ＳＰＤＰの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数
を５．１×１０3、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸
光係数を２．１０×１０5とした。 Ａｂ280，IgG ＝１．２５−（４．８３×１０ー5×５．
１×１０3）＝１．００ ［ＩｇＧ］＝１．００／（２．１０×１０5）＝４．７
８×１０-6（Ｍ） したがって、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＰＤＰの
分子数は次のようになった。 [ＳＰＤＰ]／［ＩｇＧ］=４．８３×１０-5／４．７８
×１０-6＝１０．１(個)
【００２４】（２）ウシ血清アルブミンのジチオスレイ
トールによる還元 １１０ｍｇのウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡとい
う。）を１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、これに１ｍｌのＰ
ＢＳに溶解した７７ｍｇのＤＴＴを加えて室温で１５分
間攪拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを
用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ（ＳＨｆｒｅ
ｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
トールによる還元 １１０ｍｇのウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡとい
う。）を１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、これに１ｍｌのＰ
ＢＳに溶解した７７ｍｇのＤＴＴを加えて室温で１５分
間攪拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを
用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ（ＳＨｆｒｅ
ｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
【００２５】（３）タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤ
Ｐ−ＢＳＡ）の作製 得られたＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）溶液は、速やかに上記
で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（６ｍｌ）と
混合し、４℃で２０時間静置した。未反応のＢＳＡを除
くため、ＰＢＳに防腐剤としてナトリウムアジドを添加
した溶液（以下、ＰＢＳ・Ａｚという。）２０リットル
（５リットル×４）に対して透析し、約２５ｍｌのＩｇ
Ｇ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。
Ｐ−ＢＳＡ）の作製 得られたＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）溶液は、速やかに上記
で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（６ｍｌ）と
混合し、４℃で２０時間静置した。未反応のＢＳＡを除
くため、ＰＢＳに防腐剤としてナトリウムアジドを添加
した溶液（以下、ＰＢＳ・Ａｚという。）２０リットル
（５リットル×４）に対して透析し、約２５ｍｌのＩｇ
Ｇ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。
【００２６】（４）タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤ
Ｐ−ＢＳＡ）の色素標識 式（１）で示す色素１２２．７ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに
溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以
下、ＳＬＩＣ１とする。）を調製した。ただし、式
（１）におけるＸはヨウ素、Ｍはカリウム、炭素数ｎは
２のものを用いた。そして、ＳＬＩＣ１を、（３）で得
られたＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ溶液（総タンパク量を
３．１８×１０-4ｍｍｏｌとする）にゆっくりと滴下し
た。この後、４℃で２０時間静置した後、未反応の色素
分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透
析して、約２６ｍｌのＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体
のＰＢＳ溶液を得た。得られたＳＬＩＣ１標識タンパク
質複合体の、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ
１の分子数を次のように計算して求めた。
Ｐ−ＢＳＡ）の色素標識 式（１）で示す色素１２２．７ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに
溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以
下、ＳＬＩＣ１とする。）を調製した。ただし、式
（１）におけるＸはヨウ素、Ｍはカリウム、炭素数ｎは
２のものを用いた。そして、ＳＬＩＣ１を、（３）で得
られたＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ溶液（総タンパク量を
３．１８×１０-4ｍｍｏｌとする）にゆっくりと滴下し
た。この後、４℃で２０時間静置した後、未反応の色素
分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透
析して、約２６ｍｌのＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体
のＰＢＳ溶液を得た。得られたＳＬＩＣ１標識タンパク
質複合体の、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ
１の分子数を次のように計算して求めた。
【００２７】得られた溶液の４３０ｎｍにおける吸光度
を測定した。吸光度は８０であった。ＩｇＧ−ＳＰＤＰ
−ＢＳＡは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測され
た吸光は結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。し
たがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のよう
に求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎ
ｍにおけるモル吸光係数を１×１０5とする。 ［ＳＬＩＣ１］＝８０／１×１０5＝８．０×１０
-4（Ｍ） ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇ
Ｇの濃度［ＩｇＧ］を１．０６×１０-6Ｍ（ＳＰＤＰ標
識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとす
る。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩ
Ｃ１の分子数を求めると次のようになる。 [ＳＬＩＣ１]／[ＩｇＧ]＝８．０×１０-4／１．０６×
１０-6＝７５５（個）
を測定した。吸光度は８０であった。ＩｇＧ−ＳＰＤＰ
−ＢＳＡは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測され
た吸光は結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。し
たがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のよう
に求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎ
ｍにおけるモル吸光係数を１×１０5とする。 ［ＳＬＩＣ１］＝８０／１×１０5＝８．０×１０
-4（Ｍ） ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇ
Ｇの濃度［ＩｇＧ］を１．０６×１０-6Ｍ（ＳＰＤＰ標
識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとす
る。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩ
Ｃ１の分子数を求めると次のようになる。 [ＳＬＩＣ１]／[ＩｇＧ]＝８．０×１０-4／１．０６×
１０-6＝７５５（個）
【００２８】《実施例２》 （１）ＩｇＧのＳＰＤＰ標識 実施例１で示した方法に従って、ＩｇＧのＳＰＤＰ標識
を行った。全体量は６ｍｌ、ＩｇＧ濃度は４．１０×１
０-6Ｍ、そしてＩｇＧ１分子あたりのＳＰＤＰの分子数
は１１．５個であった。
を行った。全体量は６ｍｌ、ＩｇＧ濃度は４．１０×１
０-6Ｍ、そしてＩｇＧ１分子あたりのＳＰＤＰの分子数
は１１．５個であった。
【００２９】（２）ＢＳＡ−ＳＬＩＣ１の作製 １１０ｍｇ（１．６２×１０-3ｍｍｏｌ）のＢＳＡを１
０ｍｌのＰＢＳに溶解した。次に、これを室温で撹拌し
ながら、ＳＬＩＣ１をゆっくりと１ｍｌ滴下した。ただ
し、滴下したＳＬＩＣ１中には、実施例１と同様の色素
が、１６２．７ｍｇ（０．１６２ｍｍｏｌ、１００等
量）が含まれていた。この後、４℃で一晩攪拌した後、
２０リットル（５リットル×４）のＰＢＳ・Ａｚに対し
て透析し、６ｍｌのＳＬＩＣ１標識ＢＳＡのＰＢＳ溶液
を得た。溶液の濃度、およびＢＳＡ１分子あたりに結合
しているＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求め
た。
０ｍｌのＰＢＳに溶解した。次に、これを室温で撹拌し
ながら、ＳＬＩＣ１をゆっくりと１ｍｌ滴下した。ただ
し、滴下したＳＬＩＣ１中には、実施例１と同様の色素
が、１６２．７ｍｇ（０．１６２ｍｍｏｌ、１００等
量）が含まれていた。この後、４℃で一晩攪拌した後、
２０リットル（５リットル×４）のＰＢＳ・Ａｚに対し
て透析し、６ｍｌのＳＬＩＣ１標識ＢＳＡのＰＢＳ溶液
を得た。溶液の濃度、およびＢＳＡ１分子あたりに結合
しているＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求め
た。
【００３０】得られた溶液の２８０ｎｍ、および４３０
ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度はそれぞれ９．
６、および５９．０であった。ＢＳＡは４３０ｎｍに吸
収を持たないので、観測された４３０ｎｍの吸光はＢＳ
Ａに結合したＳＬＩＣ１に起因するものである。したが
って、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求
めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍに
おけるモル吸光係数を１×１０5とする。 ［ＳＬＩＣ１］＝５９．０／１×１０5＝５．９×１０
-4（Ｍ）
ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度はそれぞれ９．
６、および５９．０であった。ＢＳＡは４３０ｎｍに吸
収を持たないので、観測された４３０ｎｍの吸光はＢＳ
Ａに結合したＳＬＩＣ１に起因するものである。したが
って、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求
めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍに
おけるモル吸光係数を１×１０5とする。 ［ＳＬＩＣ１］＝５９．０／１×１０5＝５．９×１０
-4（Ｍ）
【００３１】また、観測された２８０ｎｍの吸光はＢＳ
Ａに由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ１が
２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いて
ＢＳＡの濃度［ＢＳＡ］を求めると次のようになる。た
だし、ＢＳＡに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡ
ｂ280，BSAとし、ＳＬＩＣ１の２８０ｎｍにおけるモル
吸光係数を９．８×１０3、ＢＳＡの２８０ｎｍにおけ
るモル吸光係数を４．３６×１０4とする。 Ａｂ280，BSA＝９．６−（５．９×１０-4×９．８×１
０3）＝３．８１８ ［ＢＳＡ］＝３．８１８／４．３６×１０4＝８．７６
×１０-5（Ｍ） したがって、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ１
の分子数は次のようになる。 [ＳＬＩＣ１]/[ＢＳＡ]＝５．９×１０-4／８．７６×
１０-5＝６．７（個）
Ａに由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ１が
２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いて
ＢＳＡの濃度［ＢＳＡ］を求めると次のようになる。た
だし、ＢＳＡに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡ
ｂ280，BSAとし、ＳＬＩＣ１の２８０ｎｍにおけるモル
吸光係数を９．８×１０3、ＢＳＡの２８０ｎｍにおけ
るモル吸光係数を４．３６×１０4とする。 Ａｂ280，BSA＝９．６−（５．９×１０-4×９．８×１
０3）＝３．８１８ ［ＢＳＡ］＝３．８１８／４．３６×１０4＝８．７６
×１０-5（Ｍ） したがって、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ１
の分子数は次のようになる。 [ＳＬＩＣ１]/[ＢＳＡ]＝５．９×１０-4／８．７６×
１０-5＝６．７（個）
【００３２】（３）ＢＳＡ−ＳＬＩＣ１のＤＴＴ還元 前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１溶液（１１０ｍｇ、１３ｍ
ｌ）に、１ｍｌのＰＢＳに溶解した１００ｍｇのＤＴＴ
（最終濃度５０ｍＭ）を加えて室温で１５分間攪拌し
た。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲ
ル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ−ＳＬＩＣ１（ＳＨｆｒ
ｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
ｌ）に、１ｍｌのＰＢＳに溶解した１００ｍｇのＤＴＴ
（最終濃度５０ｍＭ）を加えて室温で１５分間攪拌し
た。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲ
ル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ−ＳＬＩＣ１（ＳＨｆｒ
ｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
【００３３】（４）色素標識タンパク質複合体の作製 前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１（ＳＨｆｒｅｅ）溶液と、前
述のＳＰＤＰ標識ＩｇＧ溶液とを混合し、４℃で一晩攪
拌した後、２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析
し、未反応のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１を除いた。約３０ｍｌ
の色素標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。得ら
れたＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体１分子あたりのＳ
ＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
述のＳＰＤＰ標識ＩｇＧ溶液とを混合し、４℃で一晩攪
拌した後、２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析
し、未反応のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１を除いた。約３０ｍｌ
の色素標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。得ら
れたＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体１分子あたりのＳ
ＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
【００３４】得られた溶液の４３０ｎｍにおける吸光度
を測定した。吸光度は３０．２であった。ＩｇＧは４３
０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光はＢＳＡ
に結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。したがっ
て、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求め
ることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにお
けるモル吸光係数を１×１０5とする。 ［ＳＬＩＣ１］＝３０．２／１×１０5＝３．０２×１
０-4（Ｍ） ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇ
Ｇの濃度［ＩｇＧ］を８．２０×１０-7Ｍ（ＳＰＤＰ標
識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとす
る。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩ
Ｃ１の分子数を求めると次のようになる。 [ＳＬＩＣ１]／[ＩｇＧ]＝３．０２×１０-4／８．２０
×１０-7＝３６８（個）
を測定した。吸光度は３０．２であった。ＩｇＧは４３
０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光はＢＳＡ
に結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。したがっ
て、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求め
ることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにお
けるモル吸光係数を１×１０5とする。 ［ＳＬＩＣ１］＝３０．２／１×１０5＝３．０２×１
０-4（Ｍ） ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇ
Ｇの濃度［ＩｇＧ］を８．２０×１０-7Ｍ（ＳＰＤＰ標
識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとす
る。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩ
Ｃ１の分子数を求めると次のようになる。 [ＳＬＩＣ１]／[ＩｇＧ]＝３．０２×１０-4／８．２０
×１０-7＝３６８（個）
【００３５】
【発明の効果】上記のように、本発明による色素標識タ
ンパク質複合体は、タンパク質１分子あたりに結合して
いる色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍になる。そ
のため、例えば、これを免疫クロマトを利用したセンサ
ーに導入すると、高感度のセンサーを作製することがで
きる。
ンパク質複合体は、タンパク質１分子あたりに結合して
いる色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍になる。そ
のため、例えば、これを免疫クロマトを利用したセンサ
ーに導入すると、高感度のセンサーを作製することがで
きる。
Claims (4)
- 【請求項１】 ジスルフィド結合によってタンパク質と
結合した抗体からなるタンパク質複合体が、式（１）で
示されるシアニン系色素で標識された色素標識タンパク
質複合体。 【化１】 （ただし、Ｒ1およびＲ2は水素またはアルキル基、Ｘは
ハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の
整数を示す。） - 【請求項２】 前記シアニン系色素のスクシンイミジル
基由来のアシル炭素と前記タンパク質複合体のアミノ基
由来の窒素との共有結合により前記色素の骨格がタンパ
ク質複合体に結合している請求項１記載の色素標識タン
パク質複合体。 - 【請求項３】 中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液
中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に抗体を
添加してタンパク質複合体を作製する工程、およびこの
緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加し
て前記タンパク質複合体を標識する工程を含むことを特
徴とする色素標識タンパク質複合体の製造方法。 【化２】 （ただし、Ｒ1およびＲ2は水素またはアルキル基、Ｘは
ハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の
整数を示す。） - 【請求項４】 中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液
中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に式
（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記還元さ
れたタンパク質を標識する工程、およびこの緩衝液中に
前記抗体を添加する工程を含むことを特徴とする色素標
識タンパク質複合体の製造方法。 【化３】 （ただし、Ｒ1およびＲ2は水素またはアルキル基、Ｘは
ハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の
整数を示す。）
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13241898A JP3601972B2 (ja) | 1998-05-14 | 1998-05-14 | 色素標識タンパク質複合体およびその製造方法 |
| KR1019990016353A KR100332425B1 (ko) | 1998-05-14 | 1999-05-07 | 색소표식단백질복합체 및 그 제조방법 |
| EP99108597A EP0957364B1 (en) | 1998-05-14 | 1999-05-07 | Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same |
| DE69902419T DE69902419T2 (de) | 1998-05-14 | 1999-05-07 | Farbstoff-markierte Proteinkonjugat und Verfahren zu seiner Herstellung |
| US09/310,851 US6300480B1 (en) | 1996-11-08 | 1999-05-13 | Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same |
| CN99106743A CN1122533C (zh) | 1998-05-14 | 1999-05-13 | 色素标记蛋白质复合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13241898A JP3601972B2 (ja) | 1998-05-14 | 1998-05-14 | 色素標識タンパク質複合体およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11322796A true JPH11322796A (ja) | 1999-11-24 |
| JP3601972B2 JP3601972B2 (ja) | 2004-12-15 |
Family
ID=15080920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13241898A Expired - Lifetime JP3601972B2 (ja) | 1996-11-08 | 1998-05-14 | 色素標識タンパク質複合体およびその製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0957364B1 (ja) |
| JP (1) | JP3601972B2 (ja) |
| KR (1) | KR100332425B1 (ja) |
| CN (1) | CN1122533C (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011506673A (ja) * | 2007-12-14 | 2011-03-03 | バイオティウム， インコーポレイテッド | 蛍光性化合物 |
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|---|---|---|---|---|
| CA2463678A1 (en) * | 2000-10-17 | 2002-04-25 | Besst-Test Aps | Assay for directly detecting a rs virus related biological cell in a body fluid sample |
| JP2002303629A (ja) * | 2001-04-06 | 2002-10-18 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 免疫クロマトデバイス及びそれを用いた被検物質測定方法 |
| CN102618060A (zh) * | 2012-03-17 | 2012-08-01 | 江南大学 | 一种不对称菁染料的制备及其用于牛血清白蛋白检测的方法 |
| CN105203518A (zh) * | 2015-10-08 | 2015-12-30 | 三峡大学 | 一类荧光试剂，制备方法及其应用 |
| CN106483295A (zh) * | 2016-06-13 | 2017-03-08 | 苏州泽科生物科技有限公司 | 一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团试剂盒 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE441042B (sv) * | 1976-09-08 | 1985-09-02 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett att pavisa rheumatoida faktorer |
| WO1994003631A1 (en) * | 1992-08-10 | 1994-02-17 | Biometric Imaging Inc. | Differential separation assay methods and test kits |
| IL106887A (en) * | 1993-09-02 | 1997-02-18 | Yissum Res Dev Co | Pharmaceutical and diagnostic compositions and a method for drug targeting |
| US5714386A (en) * | 1996-01-11 | 1998-02-03 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cy7-allophycocyanin conjugates for use in multiplex fluorescence detection assays |
| US5922618A (en) * | 1996-03-04 | 1999-07-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled antibody conjugate and preparation method thereof |
-
1998
- 1998-05-14 JP JP13241898A patent/JP3601972B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-05-07 DE DE69902419T patent/DE69902419T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-07 KR KR1019990016353A patent/KR100332425B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-05-07 EP EP99108597A patent/EP0957364B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-13 CN CN99106743A patent/CN1122533C/zh not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011506673A (ja) * | 2007-12-14 | 2011-03-03 | バイオティウム， インコーポレイテッド | 蛍光性化合物 |
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|---|---|
| DE69902419T2 (de) | 2003-07-17 |
| CN1122533C (zh) | 2003-10-01 |
| KR19990088119A (ko) | 1999-12-27 |
| CN1235848A (zh) | 1999-11-24 |
| KR100332425B1 (ko) | 2002-04-13 |
| JP3601972B2 (ja) | 2004-12-15 |
| EP0957364A2 (en) | 1999-11-17 |
| EP0957364B1 (en) | 2002-08-07 |
| EP0957364A3 (en) | 2000-01-12 |
| DE69902419D1 (de) | 2002-09-12 |
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