JP3601972B2 - 色素標識タンパク質複合体およびその製造方法 - Google Patents
色素標識タンパク質複合体およびその製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質と結合した抗体からなるタンパク質複合体をシアニン系色素で標識した色素標識タンパク質複合体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体を色素で標識した色素標識抗体は、試料液中に含まれる抗原と特異的に反応し、かつ視認性があるため、例えば、免疫学的抗原抗体反応を利用して、試料液中に含まれる検体の検出を行う免疫センサに使用され、各種医療機関での診断に活用されている。
抗体を標識する色素としては、高いモル吸光係数を有し、反応性の高いシアニン系標識色素が使用される場合が多い（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＶＯＬ．４ Ｎｏ．２，ｐｐ１０５−１１１，１９９３）。
【０００３】
このようなシアニン系色素は、その官能基が抗体のアミノ基またはカルボキシル基と反応して共有結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色素が結合する。
このようにして作製されたシアニン系色素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば免疫クロマトグラフィーに導入されて、妊婦の尿中にのみ存在するヒト絨毛性ゴナドトロピン等の微量成分を検出するのに有効に用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
通常、抗体には、数百から数千個のアミノ基またはカルボキシル基が存在する。しかし、抗体は３次元の立体構造を有するため、これらの中で反応に関与できるのは５０個程度であると考えられ、１分子の抗体に対して、色素５０分子が結合するのが限界であった。
従って、この色素標識抗体を免疫センサ等に利用した場合、検出対象物の濃度が低いと、その検出が困難になる問題が生じた。
本発明は、上記課題に鑑み、多数の色素で標識された色素標識タンパク質複合体およびその製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明による色素標識タンパク質複合体は、ジスルフィド結合によってタンパク質と結合した抗体からなるタンパク質複合体が、式（１）で示されるシアニン系色素で標識されたものである。
【０００６】
【化４】
【０００７】
（ただし、Ｒ１およびＲ２は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
【０００８】
抗体にタンパク質を結合させると、シアニン系色素が結合できる面積が広がるため、タンパク質複合体に結合するシアニン系色素の数は、抗体単体の場合よりも多くなる。例えば、抗体１分子あたりに結合する色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍にすることができる。そのため、得られる色素標識タンパク質複合体は、視認性に優れる。
したがって、本発明による色素標識タンパク質複合体を、例えば、免疫クロマトグラフィーに用いれば、測定対象物（検体）の濃度が低い場合でも、検体を高感度に検出できる。また、その高感度から、本発明の色素標識タンパク質複合体は、バイオセンサーにも適用可能である。
また、本発明による色素標識タンパク質複合体は、前記シアニン系色素のスクシンイミジル基由来のアシル炭素と前記タンパク質複合体のアミノ基由来の窒素とが共有結合することにより、前記色素の骨格がタンパク質複合体に結合している構成であるのが好ましい。
【０００９】
本発明による色素標識タンパク質複合体の製造方法は、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に抗体を添加してタンパク質複合体を作製する工程、およびこの緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記タンパク質複合体を標識する工程を含む。
また、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記還元されたタンパク質を標識する工程、およびこの緩衝液中に前記抗体を添加する工程を含む構成でもよい。
還元されたタンパク質と抗体とを結合させる工程の前に、抗体を中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中で、式（２）で示すようなスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネートを用いて標識する工程を含ませてもよい。
いずれの方法においても、リン酸緩衝液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲が好ましい。
【００１０】
【化５】
【００１１】
本発明の色素標識タンパク質複合体に用いることができる抗体は、特に制限されず、その由来やサブクラス等に関係なく使用できる。例えば、イムノグロブリン（Ｉｇ）として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ラットＩｇＡ、ラットＩｇＥ、ラビットＩｇＧ、ラビットＩｇＭ、ラビットＩｇＡ、ラビットＩｇＥ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヤギＩｇＥ、ヤギＩｇＡ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ヒツジＩｇＡ、ヒツジＩｇＥ等が挙げられる。これらの抗体は、市販品として入手しても、直接その動物から採取してもよい。
【００１２】
抗体に結合するタンパク質は、抗体としての機能を発揮しないタンパク質であればよい。また、水溶性に富むものであればより好ましい。例えば、血清由来のアルブミン等は、抗体の反応を阻害しないうえに、高い水溶性を有しているので好適である。
【００１３】
式（１）で示されるシアニン系色素は、肉眼で確認することが容易な赤色系統の色素で、共役炭素の数が少ないため、シアニン系色素の中では最も水溶性に富んでいる。
式（１）において、Ｘで示されるハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。また、Ｍで示される金属としては、リチウム、ナトリウムおよびカリウム等が挙げられる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、抗体とシアニン系色素の結合反応のメカニズムを説明する。
【００１５】
【化６】
【００１６】
まず、式（３）に示すように、抗体に対し、スクシンイミジル基を有するシアニン系色素を配合すると、前記色素のスクシンイミジル基のエステル結合部分に、抗体のアミノ基が接近する。
そして、式（４）に示すように、前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応し、前記アミノ基から水素原子が一個奪われる。そして、このアミノ基から脱離した水素原子は、前記スクシンイミジル基のスクシンイミドと結合する。スクシンイミドはスクシンイミジル基からヒドロキシスクシンイミドとなって脱離し、これと同時に、前記スクシンイミジル基の残りの部分と、前記水素原子が一個奪われたアミノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によって前記色素と前記抗体とが結合する。
【００１７】
また、以下に、式（１）で示されるシアニン系色素の合成経路の一例を示す。
【００１８】
【化７】
【００１９】
まず、ヒドラジノベンゼンスルホン酸（５）とイソプロピルメチルケトンとを酸性溶媒に溶解し加熱することによってインドレニウムスルホネート（６）を作製する。そして、インドレニウムスルホネート（６）のアルコール溶液に金属水酸化物飽和のアルコール溶液を加えることによって、インドレニウムスルホネートの金属塩（７）を得る。
次に、前記金属塩（７）の有機溶媒溶液にハロゲン化アルキル酸を加えて、加熱してカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩（８）を得る。ハロゲン化アルキル酸の炭素数は、水への溶解性を考え、１〜４が好ましい。
そして、前記金属塩（８）とＮ−カルボキシエチル−３，３−ジメチルインドレニンを塩基性有機溶媒に溶解し、加熱することによってカルボン酸誘導体（９）を作製し、最後に、カルボン酸誘導体（９）の有機溶媒溶液中に、ヒドロキシコハク酸イミドと、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドとを加えて攪拌することにより、式（１）で示されるシアニン系標識色素を得る。
【００２０】
なお、式（１）、式（８）および式（９）で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、式（１）、式（７）〜（９）で示される各化合物に含まれる金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムなどがあげられる。
【００２１】
【実施例】
以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
《実施例１》
（１）マウスＩｇＧのスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート標識
５ｍｇ（３．３×１０−５ｍｍｏｌ）のマウスＩｇＧ（以下、ＩｇＧと略す。）を２ｍｌのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳという。）に溶解した。これを室温で攪拌しながら、０．５２ｍｇ（１．６７×１０−３ｍｍｏｌ）のスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート（以下、ＳＰＤＰとする。）のエタノール溶液０．１ｍｌを滴下した。滴下したＳＰＤＰのエタノール溶液中には、０．５２ｍｇ（１．６７×１０−３ｍｍｏｌ）のＳＰＤＰが含まれていた。
この後、室温で３０分間攪拌した後、セファロースゲル（ファルマシア社製；セファデックスＧ２５Ｍカラム）を用いて濾過し、約６ｍｌのＳＰＤＰ標識ＩｇＧ（以下、ＩｇＧ−ＳＰＤＰとする。）のＰＢＳ溶液を得た。得られた溶液の濃度及び抗体に対するＳＰＤＰの結合分子数を次のように計算して求めた。
【００２２】
まず、得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２８０ｎｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は、１．２５であった。
次に、この溶液に、０．０２５ｍｌの１００ｍＭのジチオスレイトール（以下、ＤＴＴとする。）水溶液を加え、１分間静置した後、３４３ｎｍでの吸光度を測定した。得られた吸光度は０．３９であった。
ＩｇＧには３４３ｎｍに吸収がないので、観測された３４３ｎｍの吸光はＤＴＴ還元によって放出されたチオピリドンに由来するものである。この放出チオピリドンはＳＰＤＰのピリジルジチオ基が還元されたもので、この濃度は抗体に結合しているＳＰＤＰの濃度に等しい。従ってＳＰＤＰの濃度［ＳＰＤＰ］は、次のように求めることができる。ただし、チオピリドンの３４３ｎｍにおけるモル吸光係数を８．０８×１０３とした。
［ＳＰＤＰ］＝０．３９／（８．０８×１０３）＝４．８３×１０−５（Ｍ）
【００２３】
また、観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するものであるが、結合しているＳＰＤＰが２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を求めると次のようになる。但し、ＩｇＧに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，ＩｇＧとし、ＳＰＤＰの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を５．１×１０３、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．１０×１０５とした。
Ａｂ２８０，ＩｇＧ ＝１．２５−（４．８３×１０ー５×５．１×１０３）＝１．００
［ＩｇＧ］＝１．００／（２．１０×１０５）＝４．７８×１０−６（Ｍ）
したがって、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＰＤＰの分子数は次のようになった。
［ＳＰＤＰ］／［ＩｇＧ］＝４．８３×１０−５／４．７８×１０−６＝１０．１（個）
【００２４】
（２）ウシ血清アルブミンのジチオスレイトールによる還元
１１０ｍｇのウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという。）を１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、これに１ｍｌのＰＢＳに溶解した７７ｍｇのＤＴＴを加えて室温で１５分間攪拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
【００２５】
（３）タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の作製
得られたＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）溶液は、速やかに上記で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（６ｍｌ）と混合し、４℃で２０時間静置した。未反応のＢＳＡを除くため、ＰＢＳに防腐剤としてナトリウムアジドを添加した溶液（以下、ＰＢＳ・Ａｚという。）２０リットル（５リットル×４）に対して透析し、約２５ｍｌのＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。
【００２６】
（４）タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の色素標識
式（１）で示す色素１２２．７ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以下、ＳＬＩＣ１とする。）を調製した。ただし、式（１）におけるＸはヨウ素、Ｍはカリウム、炭素数ｎは２のものを用いた。そして、ＳＬＩＣ１を、（３）で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ溶液（総タンパク量を３．１８×１０−４ｍｍｏｌとする）にゆっくりと滴下した。この後、４℃で２０時間静置した後、未反応の色素分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析して、約２６ｍｌのＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。得られたＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体の、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
【００２７】
得られた溶液の４３０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は８０であった。ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光は結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにおけるモル吸光係数を１×１０５とする。
［ＳＬＩＣ１］＝８０／１×１０５＝８．０×１０−４（Ｍ）
ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を１．０６×１０−６Ｍ（ＳＰＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとする。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を求めると次のようになる。
［ＳＬＩＣ１］／［ＩｇＧ］＝８．０×１０−４／１．０６×１０−６＝７５５（個）
【００２８】
《実施例２》
（１）ＩｇＧのＳＰＤＰ標識
実施例１で示した方法に従って、ＩｇＧのＳＰＤＰ標識を行った。全体量は６ｍｌ、ＩｇＧ濃度は４．１０×１０−６Ｍ、そしてＩｇＧ１分子あたりのＳＰＤＰの分子数は１１．５個であった。
【００２９】
（２）ＢＳＡ−ＳＬＩＣ１の作製
１１０ｍｇ（１．６２×１０−３ｍｍｏｌ）のＢＳＡを１０ｍｌのＰＢＳに溶解した。次に、これを室温で撹拌しながら、ＳＬＩＣ１をゆっくりと１ｍｌ滴下した。ただし、滴下したＳＬＩＣ１中には、実施例１と同様の色素が、１６２．７ｍｇ（０．１６２ｍｍｏｌ、１００等量）が含まれていた。
この後、４℃で一晩攪拌した後、２０リットル（５リットル×４）のＰＢＳ・Ａｚに対して透析し、６ｍｌのＳＬＩＣ１標識ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。溶液の濃度、およびＢＳＡ１分子あたりに結合しているＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
【００３０】
得られた溶液の２８０ｎｍ、および４３０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度はそれぞれ９．６、および５９．０であった。ＢＳＡは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測された４３０ｎｍの吸光はＢＳＡに結合したＳＬＩＣ１に起因するものである。したがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにおけるモル吸光係数を１×１０５とする。
［ＳＬＩＣ１］＝５９．０／１×１０５＝５．９×１０−４（Ｍ）
【００３１】
また、観測された２８０ｎｍの吸光はＢＳＡに由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ１が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＢＳＡの濃度［ＢＳＡ］を求めると次のようになる。ただし、ＢＳＡに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，ＢＳＡとし、ＳＬＩＣ１の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を９．８×１０３、ＢＳＡの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を４．３６×１０４とする。
Ａｂ２８０，ＢＳＡ＝９．６−（５．９×１０−４×９．８×１０３）＝３．８１８
［ＢＳＡ］＝３．８１８／４．３６×１０４＝８．７６×１０−５（Ｍ）
したがって、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ１の分子数は次のようになる。
［ＳＬＩＣ１］／［ＢＳＡ］＝５．９×１０−４／８．７６×１０−５＝６．７（個）
【００３２】
（３）ＢＳＡ−ＳＬＩＣ１のＤＴＴ還元
前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１溶液（１１０ｍｇ、１３ｍｌ）に、１ｍｌのＰＢＳに溶解した１００ｍｇのＤＴＴ（最終濃度５０ｍＭ）を加えて室温で１５分間攪拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ−ＳＬＩＣ１（ＳＨｆｒｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
【００３３】
（４）色素標識タンパク質複合体の作製
前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１（ＳＨｆｒｅｅ）溶液と、前述のＳＰＤＰ標識ＩｇＧ溶液とを混合し、４℃で一晩攪拌した後、２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析し、未反応のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１を除いた。約３０ｍｌの色素標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。得られたＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
【００３４】
得られた溶液の４３０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は３０．２であった。ＩｇＧは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光はＢＳＡに結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにおけるモル吸光係数を１×１０５とする。
［ＳＬＩＣ１］＝３０．２／１×１０５＝３．０２×１０−４（Ｍ）
ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を８．２０×１０−７Ｍ（ＳＰＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとする。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を求めると次のようになる。
［ＳＬＩＣ１］／［ＩｇＧ］＝３．０２×１０−４／８．２０×１０−７＝３６８（個）
【００３５】
【発明の効果】
上記のように、本発明による色素標識タンパク質複合体は、タンパク質１分子あたりに結合している色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍になる。そのため、例えば、これを免疫クロマトを利用したセンサーに導入すると、高感度のセンサーを作製することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質と結合した抗体からなるタンパク質複合体をシアニン系色素で標識した色素標識タンパク質複合体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体を色素で標識した色素標識抗体は、試料液中に含まれる抗原と特異的に反応し、かつ視認性があるため、例えば、免疫学的抗原抗体反応を利用して、試料液中に含まれる検体の検出を行う免疫センサに使用され、各種医療機関での診断に活用されている。
抗体を標識する色素としては、高いモル吸光係数を有し、反応性の高いシアニン系標識色素が使用される場合が多い（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＶＯＬ．４ Ｎｏ．２，ｐｐ１０５−１１１，１９９３）。
【０００３】
このようなシアニン系色素は、その官能基が抗体のアミノ基またはカルボキシル基と反応して共有結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色素が結合する。
このようにして作製されたシアニン系色素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば免疫クロマトグラフィーに導入されて、妊婦の尿中にのみ存在するヒト絨毛性ゴナドトロピン等の微量成分を検出するのに有効に用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
通常、抗体には、数百から数千個のアミノ基またはカルボキシル基が存在する。しかし、抗体は３次元の立体構造を有するため、これらの中で反応に関与できるのは５０個程度であると考えられ、１分子の抗体に対して、色素５０分子が結合するのが限界であった。
従って、この色素標識抗体を免疫センサ等に利用した場合、検出対象物の濃度が低いと、その検出が困難になる問題が生じた。
本発明は、上記課題に鑑み、多数の色素で標識された色素標識タンパク質複合体およびその製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明による色素標識タンパク質複合体は、ジスルフィド結合によってタンパク質と結合した抗体からなるタンパク質複合体が、式（１）で示されるシアニン系色素で標識されたものである。
【０００６】
【化４】
（ただし、Ｒ１およびＲ２は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
【０００８】
抗体にタンパク質を結合させると、シアニン系色素が結合できる面積が広がるため、タンパク質複合体に結合するシアニン系色素の数は、抗体単体の場合よりも多くなる。例えば、抗体１分子あたりに結合する色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍にすることができる。そのため、得られる色素標識タンパク質複合体は、視認性に優れる。
したがって、本発明による色素標識タンパク質複合体を、例えば、免疫クロマトグラフィーに用いれば、測定対象物（検体）の濃度が低い場合でも、検体を高感度に検出できる。また、その高感度から、本発明の色素標識タンパク質複合体は、バイオセンサーにも適用可能である。
また、本発明による色素標識タンパク質複合体は、前記シアニン系色素のスクシンイミジル基由来のアシル炭素と前記タンパク質複合体のアミノ基由来の窒素とが共有結合することにより、前記色素の骨格がタンパク質複合体に結合している構成であるのが好ましい。
【０００９】
本発明による色素標識タンパク質複合体の製造方法は、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に抗体を添加してタンパク質複合体を作製する工程、およびこの緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記タンパク質複合体を標識する工程を含む。
また、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記還元されたタンパク質を標識する工程、およびこの緩衝液中に前記抗体を添加する工程を含む構成でもよい。
還元されたタンパク質と抗体とを結合させる工程の前に、抗体を中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中で、式（２）で示すようなスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネートを用いて標識する工程を含ませてもよい。
いずれの方法においても、リン酸緩衝液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲が好ましい。
【００１０】
【化５】
本発明の色素標識タンパク質複合体に用いることができる抗体は、特に制限されず、その由来やサブクラス等に関係なく使用できる。例えば、イムノグロブリン（Ｉｇ）として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ラットＩｇＡ、ラットＩｇＥ、ラビットＩｇＧ、ラビットＩｇＭ、ラビットＩｇＡ、ラビットＩｇＥ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヤギＩｇＥ、ヤギＩｇＡ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ヒツジＩｇＡ、ヒツジＩｇＥ等が挙げられる。これらの抗体は、市販品として入手しても、直接その動物から採取してもよい。
【００１２】
抗体に結合するタンパク質は、抗体としての機能を発揮しないタンパク質であればよい。また、水溶性に富むものであればより好ましい。例えば、血清由来のアルブミン等は、抗体の反応を阻害しないうえに、高い水溶性を有しているので好適である。
【００１３】
式（１）で示されるシアニン系色素は、肉眼で確認することが容易な赤色系統の色素で、共役炭素の数が少ないため、シアニン系色素の中では最も水溶性に富んでいる。
式（１）において、Ｘで示されるハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。また、Ｍで示される金属としては、リチウム、ナトリウムおよびカリウム等が挙げられる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、抗体とシアニン系色素の結合反応のメカニズムを説明する。
【００１５】
【化６】
まず、式（３）に示すように、抗体に対し、スクシンイミジル基を有するシアニン系色素を配合すると、前記色素のスクシンイミジル基のエステル結合部分に、抗体のアミノ基が接近する。
そして、式（４）に示すように、前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応し、前記アミノ基から水素原子が一個奪われる。そして、このアミノ基から脱離した水素原子は、前記スクシンイミジル基のスクシンイミドと結合する。スクシンイミドはスクシンイミジル基からヒドロキシスクシンイミドとなって脱離し、これと同時に、前記スクシンイミジル基の残りの部分と、前記水素原子が一個奪われたアミノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によって前記色素と前記抗体とが結合する。
【００１７】
また、以下に、式（１）で示されるシアニン系色素の合成経路の一例を示す。
【００１８】
【化７】
まず、ヒドラジノベンゼンスルホン酸（５）とイソプロピルメチルケトンとを酸性溶媒に溶解し加熱することによってインドレニウムスルホネート（６）を作製する。そして、インドレニウムスルホネート（６）のアルコール溶液に金属水酸化物飽和のアルコール溶液を加えることによって、インドレニウムスルホネートの金属塩（７）を得る。
次に、前記金属塩（７）の有機溶媒溶液にハロゲン化アルキル酸を加えて、加熱してカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩（８）を得る。ハロゲン化アルキル酸の炭素数は、水への溶解性を考え、１〜４が好ましい。
そして、前記金属塩（８）とＮ−カルボキシエチル−３，３−ジメチルインドレニンを塩基性有機溶媒に溶解し、加熱することによってカルボン酸誘導体（９）を作製し、最後に、カルボン酸誘導体（９）の有機溶媒溶液中に、ヒドロキシコハク酸イミドと、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドとを加えて攪拌することにより、式（１）で示されるシアニン系標識色素を得る。
【００２０】
なお、式（１）、式（８）および式（９）で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、式（１）、式（７）〜（９）で示される各化合物に含まれる金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムなどがあげられる。
【００２１】
【実施例】
以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
《実施例１》
（１）マウスＩｇＧのスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート標識
５ｍｇ（３．３×１０−５ｍｍｏｌ）のマウスＩｇＧ（以下、ＩｇＧと略す。）を２ｍｌのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳという。）に溶解した。これを室温で攪拌しながら、０．５２ｍｇ（１．６７×１０−３ｍｍｏｌ）のスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート（以下、ＳＰＤＰとする。）のエタノール溶液０．１ｍｌを滴下した。滴下したＳＰＤＰのエタノール溶液中には、０．５２ｍｇ（１．６７×１０−３ｍｍｏｌ）のＳＰＤＰが含まれていた。
この後、室温で３０分間攪拌した後、セファロースゲル（ファルマシア社製；セファデックスＧ２５Ｍカラム）を用いて濾過し、約６ｍｌのＳＰＤＰ標識ＩｇＧ（以下、ＩｇＧ−ＳＰＤＰとする。）のＰＢＳ溶液を得た。得られた溶液の濃度及び抗体に対するＳＰＤＰの結合分子数を次のように計算して求めた。
【００２２】
まず、得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２８０ｎｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は、１．２５であった。
次に、この溶液に、０．０２５ｍｌの１００ｍＭのジチオスレイトール（以下、ＤＴＴとする。）水溶液を加え、１分間静置した後、３４３ｎｍでの吸光度を測定した。得られた吸光度は０．３９であった。
ＩｇＧには３４３ｎｍに吸収がないので、観測された３４３ｎｍの吸光はＤＴＴ還元によって放出されたチオピリドンに由来するものである。この放出チオピリドンはＳＰＤＰのピリジルジチオ基が還元されたもので、この濃度は抗体に結合しているＳＰＤＰの濃度に等しい。従ってＳＰＤＰの濃度［ＳＰＤＰ］は、次のように求めることができる。ただし、チオピリドンの３４３ｎｍにおけるモル吸光係数を８．０８×１０３とした。
［ＳＰＤＰ］＝０．３９／（８．０８×１０３）＝４．８３×１０−５（Ｍ）
【００２３】
また、観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するものであるが、結合しているＳＰＤＰが２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を求めると次のようになる。但し、ＩｇＧに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，ＩｇＧとし、ＳＰＤＰの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を５．１×１０３、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．１０×１０５とした。
Ａｂ２８０，ＩｇＧ ＝１．２５−（４．８３×１０ー５×５．１×１０３）＝１．００
［ＩｇＧ］＝１．００／（２．１０×１０５）＝４．７８×１０−６（Ｍ）
したがって、ＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＰＤＰの分子数は次のようになった。
［ＳＰＤＰ］／［ＩｇＧ］＝４．８３×１０−５／４．７８×１０−６＝１０．１（個）
【００２４】
（２）ウシ血清アルブミンのジチオスレイトールによる還元
１１０ｍｇのウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという。）を１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、これに１ｍｌのＰＢＳに溶解した７７ｍｇのＤＴＴを加えて室温で１５分間攪拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
【００２５】
（３）タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の作製
得られたＢＳＡ（ＳＨｆｒｅｅ）溶液は、速やかに上記で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（６ｍｌ）と混合し、４℃で２０時間静置した。未反応のＢＳＡを除くため、ＰＢＳに防腐剤としてナトリウムアジドを添加した溶液（以下、ＰＢＳ・Ａｚという。）２０リットル（５リットル×４）に対して透析し、約２５ｍｌのＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。
【００２６】
（４）タンパク質複合体（ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）の色素標識
式（１）で示す色素１２２．７ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以下、ＳＬＩＣ１とする。）を調製した。ただし、式（１）におけるＸはヨウ素、Ｍはカリウム、炭素数ｎは２のものを用いた。そして、ＳＬＩＣ１を、（３）で得られたＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡ溶液（総タンパク量を３．１８×１０−４ｍｍｏｌとする）にゆっくりと滴下した。この後、４℃で２０時間静置した後、未反応の色素分子を除くため２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析して、約２６ｍｌのＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。得られたＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体の、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
【００２７】
得られた溶液の４３０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は８０であった。ＩｇＧ−ＳＰＤＰ−ＢＳＡは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光は結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにおけるモル吸光係数を１×１０５とする。
［ＳＬＩＣ１］＝８０／１×１０５＝８．０×１０−４（Ｍ）
ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を１．０６×１０−６Ｍ（ＳＰＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとする。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を求めると次のようになる。
［ＳＬＩＣ１］／［ＩｇＧ］＝８．０×１０−４／１．０６×１０−６＝７５５（個）
【００２８】
《実施例２》
（１）ＩｇＧのＳＰＤＰ標識
実施例１で示した方法に従って、ＩｇＧのＳＰＤＰ標識を行った。全体量は６ｍｌ、ＩｇＧ濃度は４．１０×１０−６Ｍ、そしてＩｇＧ１分子あたりのＳＰＤＰの分子数は１１．５個であった。
【００２９】
（２）ＢＳＡ−ＳＬＩＣ１の作製
１１０ｍｇ（１．６２×１０−３ｍｍｏｌ）のＢＳＡを１０ｍｌのＰＢＳに溶解した。次に、これを室温で撹拌しながら、ＳＬＩＣ１をゆっくりと１ｍｌ滴下した。ただし、滴下したＳＬＩＣ１中には、実施例１と同様の色素が、１６２．７ｍｇ（０．１６２ｍｍｏｌ、１００等量）が含まれていた。
この後、４℃で一晩攪拌した後、２０リットル（５リットル×４）のＰＢＳ・Ａｚに対して透析し、６ｍｌのＳＬＩＣ１標識ＢＳＡのＰＢＳ溶液を得た。溶液の濃度、およびＢＳＡ１分子あたりに結合しているＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
【００３０】
得られた溶液の２８０ｎｍ、および４３０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度はそれぞれ９．６、および５９．０であった。ＢＳＡは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測された４３０ｎｍの吸光はＢＳＡに結合したＳＬＩＣ１に起因するものである。したがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにおけるモル吸光係数を１×１０５とする。
［ＳＬＩＣ１］＝５９．０／１×１０５＝５．９×１０−４（Ｍ）
【００３１】
また、観測された２８０ｎｍの吸光はＢＳＡに由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ１が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いてＢＳＡの濃度［ＢＳＡ］を求めると次のようになる。ただし、ＢＳＡに由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，ＢＳＡとし、ＳＬＩＣ１の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を９．８×１０３、ＢＳＡの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を４．３６×１０４とする。
Ａｂ２８０，ＢＳＡ＝９．６−（５．９×１０−４×９．８×１０３）＝３．８１８
［ＢＳＡ］＝３．８１８／４．３６×１０４＝８．７６×１０−５（Ｍ）
したがって、ＢＳＡ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ１の分子数は次のようになる。
［ＳＬＩＣ１］／［ＢＳＡ］＝５．９×１０−４／８．７６×１０−５＝６．７（個）
【００３２】
（３）ＢＳＡ−ＳＬＩＣ１のＤＴＴ還元
前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１溶液（１１０ｍｇ、１３ｍｌ）に、１ｍｌのＰＢＳに溶解した１００ｍｇのＤＴＴ（最終濃度５０ｍＭ）を加えて室温で１５分間攪拌した。速やかにセファデックスＧ２５Ｍカラムを用いてゲル濾過し、約２４ｍｌのＢＳＡ−ＳＬＩＣ１（ＳＨｆｒｅｅ）のＰＢＳ溶液を得た。
【００３３】
（４）色素標識タンパク質複合体の作製
前述のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１（ＳＨｆｒｅｅ）溶液と、前述のＳＰＤＰ標識ＩｇＧ溶液とを混合し、４℃で一晩攪拌した後、２０リットルのＰＢＳ・Ａｚに対して透析し、未反応のＢＳＡ−ＳＬＩＣ１を除いた。約３０ｍｌの色素標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液を得た。得られたＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を次のように計算して求めた。
【００３４】
得られた溶液の４３０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は３０．２であった。ＩｇＧは４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光はＢＳＡに結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は次のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにおけるモル吸光係数を１×１０５とする。
［ＳＬＩＣ１］＝３０．２／１×１０５＝３．０２×１０−４（Ｍ）
ＳＬＩＣ１標識タンパク質複合体のＰＢＳ溶液中のＩｇＧの濃度［ＩｇＧ］を８．２０×１０−７Ｍ（ＳＰＤＰ標識以降の各ステップで、ＩｇＧの損失がないものとする。）として、タンパク質複合体１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数を求めると次のようになる。
［ＳＬＩＣ１］／［ＩｇＧ］＝３．０２×１０−４／８．２０×１０−７＝３６８（個）
【００３５】
【発明の効果】
上記のように、本発明による色素標識タンパク質複合体は、タンパク質１分子あたりに結合している色素分子数が擬似的に従来法の約１０倍になる。そのため、例えば、これを免疫クロマトを利用したセンサーに導入すると、高感度のセンサーを作製することができる。
Claims (4)
- ジスルフィド結合によってタンパク質と結合した抗体からなるタンパク質複合体が、式（１）で示されるシアニン系色素で標識された色素標識タンパク質複合体。
- 前記シアニン系色素のスクシンイミジル基由来のアシル炭素と前記タンパク質複合体のアミノ基由来の窒素との共有結合により前記色素の骨格がタンパク質複合体に結合している請求項１記載の色素標識タンパク質複合体。
- 中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に抗体を添加してタンパク質複合体を作製する工程、およびこの緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記タンパク質複合体を標識する工程を含むことを特徴とする色素標識タンパク質複合体の製造方法。
- 中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中でタンパク質を還元する工程、この緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記還元されたタンパク質を標識する工程、およびこの緩衝液中に前記抗体を添加する工程を含むことを特徴とする色素標識タンパク質複合体の製造方法。
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