CN105203518A - 一类荧光试剂，制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物大分子探针领域，特别涉及测定血清蛋白及鉴别其变性与否的荧光试剂及方法。本发明的特征在于应用一种氟硼杂环结构有机化合物，作为荧光试剂，在中性磷酸盐缓冲溶液中，加入血清蛋白，通过化合物荧光光谱特征辨别血清蛋白是否变性。该方法中，探针试剂的浓度范围1~2μM,能对1μM的牛血清蛋白进行识别，并能鉴别其是否变性。该方法操作简单，灵敏，成本低廉，荧光试剂浓度低，在生物大分子识别及结构检测方面具有重要的应用价值。

Description

一类荧光试剂，制备方法及其应用

技术领域

发明涉及到一类荧光试剂及其制备方法，并将其应用于血清蛋白浓度及鉴别其是否变性上，属于生物大分子含量及结构研究领域。

背景技术

BOPIM-NR在水中的荧光强度非常微弱，一旦进入到血清蛋白(SerumAlbumin,SA)结构中，就会发出较为强烈的绿色荧光，且荧光强度与SA浓度之间存在很好的剂量关系，可以作为一种灵敏的SA识别探针试剂。当SA完全变性，化合物的荧光发射谱发生明显变化，波长蓝移达到15nm以上，峰型也会发生明显变化，可以以此鉴别SA的变性，并监测其变性过程。此类方法属首次报道，鉴别方法较为直观，具有操作简单，灵敏度高和成本低廉等特点，值得推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光试剂，该试剂的结构式为：

标记为BOPIM-NR。

所述的荧光试剂BOPIM-NR的结构以核磁共振(NMR)谱鉴定：H¹NMR(400MHz,CDCl3):δ8.35(d,J＝5.6Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),7.54(m,4H),7.34(t,J＝6.6Hz,1H),6.72(m,4H),2.98(s,6H),2.96(s,6H).C¹³NMR(100MHz,CDCl3)：δ148.91,148.59,144.79,144.08,143.27,140.00,133.35,128.51,127.88,122.49,120.76,117.90,116.28,111.30,111.10,39.54,39.29。产品纯度95％以上，产率20％。

本发明还提供一种荧光试剂的合成方法，具体为：

1)称取取代氨基苯甲醛，2-氰基吡啶，以及醋酸铵入微波反应器的三颈瓶中，温度设定为150～200℃，半小时后形成棕色溶液；

2)将该棕色溶液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃取剂，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体；

3)在充氮气条件下，将上述橙色固体，三乙胺，加入二氯甲烷溶剂中，在冰盐浴滴加三氟化硼乙醚后再在室温条件下搅拌过夜，母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得到红棕色粉末状固体即为荧光试剂，标记为BOPIM-NR，具体合成路线为：

上述的步骤1)中，对(N,N-二甲基)苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1：2-3：4-7；步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1：4-6。

进一步优选为步骤1)中，对取代氨基苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1：2.5：5；步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1：5.5。

本发明的另一目的在于提供一种操作简单，灵敏度高和成本低廉的荧光探针法测定血清蛋白(SA)浓度及鉴别其是否变性的方法。

所述的血清蛋白变性包括高温变性、化学变性、超声变性等一切物理及化学因素诱导的蛋白质结构的改变。

具体检测方法如下：

(1)测定溶液的配制

称量BOPIM-NR，加入1,4-二氧六环助溶，再加入10mL磷酸盐缓冲液，得到2.0×10^-6mol/L的溶液，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存，同时，将正常或变性的牛血清蛋白，以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10_- ⁴mol/L溶液备用；

(2)荧光测定方法

取BOPIM-NR溶液加入石英荧光比色皿中，加入血清蛋白储备液10～100μL，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到BOPIM-NR在SA存在时的荧光光谱；

(3)定量测定血清蛋白含量

通过BOPIM-NR在不同浓度牛血清蛋白存在时的荧光光谱，固定发射波长485nm，读取荧光强度，应用以下方程：

$\frac{1}{I-I_0}=\frac{1}{(I_1-I_0)}+\frac{1}{(I_1-I_0)K\[SA\]}$

式中：I₀、I和I₁分别为没有SA存在、有SA存在以及SA的浓度无限大时BOPIM的荧光强度。以1/(I-I₀)对1/[SA]作图，建立得到标准曲线。测定BOPIM-NR在未知样品中的荧光强度，通过标准曲线得到SA含量。

(4)SA变性鉴别方法

根据荧光试剂BOPIM-NR的荧光发射波长和峰型进行鉴别，在正常牛血清蛋白中，BOPIM-NR的荧光发射波长在较长波长(约485nm)，峰型对称；当血清蛋白变性后，化合物在其中的荧光发射波长蓝移20nm，至465nm，峰型不再对称。

荧光测定时溶液配制缓冲液所用水均为二次蒸馏水或更高纯度的水。

所述的磷酸盐缓冲液为由NaCl8g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄1.44g(如果是Na₂HPO₄·12H₂O，则3.63g)溶于1000mL水中配制而成。

本发明使用的荧光试剂合成路线简单，原料成本低廉，反应条件相对温和，产率较高，产物分离方法较为简单，产物纯度可达到99％以上，试剂存放条件温和，产品稳定，不宜光解或分解。

本发明使用的荧光试剂合成工艺条件易控制，易实现路线放大或工业化，设备要求不苛刻，反应产生废弃物少，污染小，废弃物易处理。

采用本类荧光试剂容易实现在水体系中进行SA定量测定，而现行的荧光试剂大多水溶性较差，难于实现；测量的机制主要是基于此类化合物具有易扭转的分子内电荷转移特性，进入到血清蛋白的疏水腔中，化合物结构和荧光性质会发生转化，从而实现对生物大分子的特性识别。

用于定量测量的标准曲线线性关系良好，适用于低含量SA的定量测定(10^-6M以下)。对SA变性的鉴别方法直观，简洁，直接通过荧光光谱可以得出正确结论。从文献调研结果来看，本鉴别方法是目前最直观的SA变性鉴别方式。

附图说明

图1为荧光试剂在不同介质中的荧光图，其中，图1-1为水体系中；图1-2为在BSA体系中。

图2为BOPIM-NR在不同浓度BSA中的荧光光谱。C_BSA从1到10的浓度依次为1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM,10μM。

图3为BSA定量测定用标准曲线

图4.BOPIM-NR在正常BSA与热变性BSA的荧光图谱，其中，a为正常BSA的荧光光谱图，b为热变性的荧光光谱图。

图5.正常BSA与超声破碎后的BSA的荧光图谱，a为正常BSA的荧光光谱图，b为超声破碎后的BSA的荧光图谱。

图6.BOPIM-NR在正常BSA与尿素致变性的BSA的荧光图谱，其中，a为正常BSA的荧光光谱图，b为加尿素后的BSA的荧光图谱。

图7荧光试剂BOPIM-NR在BSA体系中温育温育不同时间时荧光发射波长

图8BOPIM-NR在经不同方式处理的BSA中的荧光发射波长变化

具体实施方式

下述试验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实施例1

由N,N-二甲基苯甲醛，氰基吡啶，三氟化硼等为主要原料经两步反应合成得到。合成步骤：

称量对二甲基苯甲醛1.5g(0.01mol)，2-氰基吡啶2.6g(0.025mol)，以及醋酸铵3.9g(0.05mol)加入微波反应器的三颈瓶中，温度设定为170℃，半小时后形成棕色溶液。母液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃取剂，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体。在充氮气条件下，称量橙色固体1.53g(4mmol)，三乙胺(6ml)，加入二氯甲烷(25ml)做溶剂，冰盐浴滴加3.2g(2.8ml，22mmol)三氟化硼乙醚，在室温条件下搅拌过夜。母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得到红棕色粉末状固体BOPIM-NR。

(1)BOPIM-NR定量测定BSA含量，其方法如下：

称量BOPIM-NR0.00862g，准确加入1,4-二氧六环0.1mL和10mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2～7.4)，得到2.0×10^-6mol/L的溶液，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同时，将牛血清蛋白(BSA)以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10^-4mol/L溶液备用。

取BOPIM-NR溶液2mL加入石英荧光比色皿中，依次加入BSA溶液10～100μL，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，激发和发射狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到BOPIM-NR在不同浓度BSA存在时的荧光光谱，见图2。

读取BOPIM-NR在不同浓度BSA存在时、发射波长485nm的荧光强度，应用以下方程：

$\frac{1}{I-I_0}=\frac{1}{(I_1-I_0)}+\frac{1}{(I_1-I_0)K\[BSA\]}$

式中：I₀、I和I₁分别为没有BSA存在、有BSA存在以及BSA的浓度无限大时BOPIM的荧光强度。以1/(I-I₀)对1/[BSA]作图，建立得到标准曲线，见图3。

据实验数据得到的校正方程如下：

$\frac{1}{I-I_0}=7.6350\×{10}^{-5}+6.7032\×{10}^{-4}\×\frac{1}{\[BSA\]}$

测定BOPIM-NR在未知样品中的荧光强度，通过标准曲线得到BSA含量。

(2)BSA热变性的鉴别

将正常的BSA溶液在80℃水浴中加热10分钟以上，冰水浴中骤冷，取出待用。取BOPIM-NR溶液2mL加入石英荧光比色皿中，加入处理后BSA溶液80μL，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，激发和发射狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到荧光光谱。同时测定正常BSA的荧光光谱。谱图如见图4。可见，BSA热变性后，BOPIM-NR在其中的荧光光谱形状发生明显变化，发射波长从485nm蓝移至465nm，光谱强度明显增强。Δλ＝20nm，足于鉴别。

(3)超声破碎引起BSA变性的图谱鉴别

将正常的BSA溶液在细胞破碎仪中超声破碎20分钟，取出待用。取BOPIM-NR溶液2mL加入石英荧光比色皿中，加入处理后BSA溶液80μL，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，激发和发射狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到荧光光谱。同时测定正常BSA的荧光光谱。谱图如图5所示。结果表明：在超声破碎仪中处理，也会导致BSA变性，BOPIM-NR在其中的荧光发射峰从正常BSA中的485nm蓝移至467nm，Δλ＝20nm，足于通过荧光峰扫描进行鉴别。

(4)化学变性BSA的鉴别

将8MUrea加入到BSA溶液中，20min后。取BOPIM-NR溶液2mL加入石英荧光比色皿中，加入处理后BSA溶液80μL，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，激发和发射狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到荧光光谱。同时测定正常BSA的荧光光谱。谱图如图6所示。结果表明：8M的Urea会导致BSA变性，BOPIM-NR在其中的荧光发射峰从正常BSA中的485nm蓝移至470nm，Δλ＝15nm，足于通过荧光峰扫描进行鉴别。

实施例2

荧光试剂的合成如下，具体方法如实施例1。

称量对二甲基苯甲醛1.5g(0.01mol)，2-氰基吡啶2.6g(0.025mol)，以及醋酸铵3.9g(0.05mol)加入微波反应器的三颈瓶中，温度设定为170℃，半小时后形成棕色溶液。母液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃取剂，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体。在充氮气条件下，称量橙色固体1.53g(4mmol)，三乙胺(6ml)，加入二氯甲烷(25ml)做溶剂，冰盐浴滴加3.2g(2.8ml，22mmol)三氟化硼乙醚，在室温条件下搅拌过夜。母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得到红棕色粉末状固体BOPIM-NR。

BSA变性过程的监测

配制20份左右80μLBSA+2mLBOPIM-NR的混合溶液，分别在60℃水浴中温育不同时间后，置于冰水浴中迅速冷却，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，激发和发射狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到荧光光谱，读取其荧光发射波长。按照同样的方法，做65℃，67℃下的温育实验。三个不同温度下，BOPIM-NR在BSA中的荧光发射波长随时间的变化如图7所示。可见，60℃水浴中BOPIM-NR在BSA中的荧光发射波长并不随时间改变，而65℃，67℃水浴中BOPIM-NR在BSA中的荧光发射波长随着时间迅速降低，4分钟即会降低到470nm以下，此时从发射波长判断，BSA已经发生变性，67℃，下，BSA变性更快。

实施例3

荧光试剂的合成同实施例1。

称量对二甲基苯甲醛1.5g(0.01mol)，2-氰基吡啶2.6g(0.025mol)，以及醋酸铵3.9g(0.05mol)加入微波反应器的三颈瓶中，温度设定为170℃，半小时后形成棕色溶液。母液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃取剂，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体。在充氮气条件下，称量橙色固体1.53g(4mmol)，三乙胺(6ml)，加入二氯甲烷(25ml)做溶剂，冰盐浴滴加3.2g(2.8ml，22mmol)三氟化硼乙醚，在室温条件下搅拌过夜。母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得到红棕色粉末状固体BOPIM-NR。

不同环境中BSA性质鉴定

将BSA采用不同方式处理，如不用温度下温育、超声水浴，超声破碎、不同浓度的尿素处理，采用BOPIM-NR进行鉴别，其发射波长变化列于图8。可以看出，80℃加热、超声破碎仪处理20分钟、8M尿素处理均会使BSA完全变性，BOPIM-NR在其中的发射波长稳定在465-470nm之间，而40℃加热、超声水溶处理、4M尿素处理都不会引起BSA完全变性，BOPIM-NR在其中的发射波长稳定在480-485nm之间。

Claims (9)

1.一类荧光试剂，命名为BOPIM-NR，其特征在于，该试剂的结构通式为：

其中，R₁,R₂是为链烷基，进一步为-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃中的任一种。

2.权利要求1所述试剂的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)称取一定量的取代氨基苯甲醛，2-氰基吡啶，以及醋酸铵入微波反应器的三颈瓶中，温度设定为150～200℃，半小时后形成棕色溶液；

2)将该棕色溶液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃取剂，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体；

3)在充氮气条件下，将上述橙色固体，三乙胺，加入二氯甲烷溶剂中，在冰盐浴滴加三氟化硼乙醚后再在室温条件下搅拌过夜，母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得到红棕色粉末状固体即为荧光试剂，标记为BOPIM-NR，具体合成路线为：

3.根据权利要求3所述的荧光试剂的合成方法，其特征在于，步骤1)中，对取代氨基苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1：2-3：4-7；步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1：4-6。

4.根据权利要求4所述的荧光试剂的合成方法，其特征在于，步骤1)中，对取代氨基苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1：2.5：5；步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1：5.5。

5.权利要求1-5任一项所述的荧光试剂在识别及定量血清蛋白(SerumAlbumin,SA)上的应用或在检测血清蛋白变性与否上的应用。

6.权利要求6所述的血清蛋白主要指牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)。

7.权利要求6所述的血清蛋白变性包括高温变性、化学变性、超声变性等一切物理及化学因素诱导的蛋白质结构的改变。

8.权利要求6所述的应用，其特征在于，具体检测方法如下：

(1)测定溶液的配制

称量BOPIM-NR，加入1,4-二氧六环助溶，再加入10mL磷酸盐缓冲液，得到2.0×10^-6mol/L的溶液，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存，同时，将正常或变性的血清蛋白，以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10^-4mol/L溶液备用；

(2)荧光测定方法

取BOPIM-NR溶液加入石英荧光比色皿中，加入牛血清蛋白储备液10～100μL，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到BOPIM-NR在SA存在时的荧光光谱；

(3)定量测定牛血清蛋白含量

通过BOPIM-NR在不同浓度牛血清蛋白存在时的荧光光谱，固定发射波长485nm，读取荧光强度，应用以下方程：

$\frac{1}{I-I_0}=\frac{1}{(I_1-I_0)}+\frac{1}{(I_1-I_0)K\[SA\]}$

式中：I₀、I和I₁分别为没有SA存在、有SA存在以及SA的浓度无限大时BOPIM的荧光强度，以1/(I-I₀)对1/[SA]作图，建立得到标准曲线，测定BOPIM-NR在未知样品中的荧光强度，通过标准曲线得到SA含量；

(4)SA变性鉴别方法

根据荧光试剂BOPIM-NR的荧光发射波长和峰型进行鉴别，在正常血清蛋白中，BOPIM-NR的荧光发射波长在较长波长方向，峰型对称；当血清蛋白变性后，化合物在其中的荧光发射波长蓝移约20nm，峰型不再对称，以此进行鉴别。

9.根据权利要求8所述的BOPIM-NR溶液配制采用1％(v％)1,4-二氧六环助溶。