CN104569424B - 一种发夹型dna探针及其定量检测凝血酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种发夹型DNA探针及其定量检测凝血酶的方法，所述发夹型DNA探针内嵌有凝血酶适配体，其结构碱基序列为：5’-GAATTC？TTAAA？GGTTGGTGTGGTTG？GAATTC-3’，？GGTTGGTGTGGTTG？G为所述凝血酶的适配体序列，5’-GAATTC和3’-CTTAAG所配对形成的部分为所述发夹型DNA茎环结构的茎部分。在Tris-HCl缓冲液体系中，将发夹型DNA溶液与凝血酶在37℃下恒温反应，然后加入CTBA溶液与之反应，再加入MB溶液，室温下彻底混合反应，最后在荧光分光光度计上测试该探针对凝血酶的分析检测性能。本发明的发夹型DNA探针简便和特异性强，能有效地进行凝血酶的定量检测，有较宽的线性范围。

Description

一种发夹型DNA探针及其定量检测凝血酶的方法
技术领域
本发明涉及分析化学与分子生物学光谱分析领域，尤其涉及一种发夹型DNA分子探针的设计以及该探针在凝血酶检测中的共振光散射技术应用。
背景技术
凝血酶（thrombin）是一种重要的多功能活性蛋白，在许多的生理学和病理学过程中，如血凝固、血栓症、炎症、血管新生、肿瘤生长和转移等都发挥着关键的作用。对于一些与异常血液凝固有关的疾病，如肺部转移性肿瘤等，凝血酶也可以被用作治疗剂和生物标记物。如今在临床分析上，蛋白质检测手段主要依赖抗体的使用。尽管常见的检测手段也可以实现凝血酶的定量检测，但仍然存在一些如需要酶标记、使用放射性物质、过程耗时和使用复杂的仪器设备等各种不方便之处。基于此，发展一种新的，同时兼有选择性和简便性的检测蛋白质方法显得尤为重要。
适配体是一种能与不同的目标物，如蛋白质或药物产生特异性结合的单链DNA或RNA分子。与传统上的复杂的分子识别体系相比，适配体由于其易于合成受到越来越多的关注和研究。同时，其具有的出色的稳定性，广泛的适用性和突出的选择性等优点都使适配体成为在医学诊断，环境监测和生物分析上的一种非常理想的分析工具。
发夹型DNA（H-eTBA）由于具有茎环结构，因此其在杂交过程中拥有很高的特异性。该性质使得发夹型DNA很容易地将与其互补DNA链中的单点突变或不匹配的DNA片段识别出来。也就是说，发夹型DNA结构能被用于提高基于DNA探针设计的传感器的选择性。
亚甲基蓝（MB）是其中一种较为普遍的吩噻嗪类染料，其与单链（ss）和双链（ds）DNA的静电作用力不同。带有正电荷的MB分子能通过静电作用力积聚在带负电荷的双链DNA的双螺旋结构表面。相反地，单链DNA与MB分子并不具备该性质。同时，MB与DNA分子的不同积聚程度还会影响体系的光谱学性质。显然，MB分子这种对于单链和双链DNA的独特性质使其在基于DNA分子设计的蛋白质分析过程中可以作为一种指示物来应用。
共振光散射（RLS）技术是在1993年由Pasternack等提出的、在普通荧光分光光度计上进行的检测技术，最早应用于生化分析中，因其具有简便、快速、灵敏度高等一系列的优点，并被应用于其它领域，如：生化分析、药物分析、纳米材料等。共振光散射技术是利用光散射现象所建立的一种测试方法。共振光散射是一种弹性光散射，指的是当光束通过某种介质时，从入射光方向以外所观察得到的现象，该现象广泛地存在于光与粒子的作用当中。当介质中的电子受到光电磁波的电场振动，因此形成偶极振子，偶极振子从而向各个方向发射电磁波，即为光散射波。显然，散射波会随着介质粒径大小而产生不同。光散射信号能够很容易地通过传统的荧光分光光度计，利用激发和发射波长的同步扫描来测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发夹型DNA探针及其定量检测凝血酶的方法解决现有技术存在的问题。
为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：
一种发夹型DNA探针，具有茎环结构，内嵌有凝血酶适配体，其结构碱基序列如下：5’-GAATTCTTAAAGGTTGGTGTGGTTGGAATTC-3’，GGTTGGTGTGGTTGG为所述凝血酶的适配体序列，5’-GAATTC和3’-CTTAAG所配对形成的部分为所述发夹型DNA茎环结构的茎部分，AATTCTTAAAGGTTGGTGTGGTTGG为与CTBA互补的碱基序列。
一种发夹型DNA探针定量检测凝血酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，在Tris-HCl缓冲液体系中，将发夹型DNA溶液与不同浓度的凝血酶在37℃下恒温反应25min；
步骤二，加入CTBA溶液，然后将混合溶液在37℃下继续培育1h；
步骤三，再加入亚甲基蓝溶液，室温下彻底混合反应；
步骤四，将溶液置于荧光分光光度计上，以相同的激发和发射波长，在225到700nm的范围内进行共振光散射扫描，得到共振光散射光谱以对凝血酶进行定量检测。
进一步地，共振光散射扫描的激发光狭缝宽度为5nm，发射光狭缝宽度为2.5nm，扫描速率为1200nm/min，光电倍增管电压为400V。
更进一步地，共振光散射光谱的线性范围为凝血酶浓度0-630.6μg/L，检出限为11.74μg/L。
更进一步地，Tris-HCl缓冲液体系pH为7.40；发夹型DNA溶液浓度为10μM；CTBA溶液浓度为10μM；亚甲基蓝溶液浓度为5×10-5M；加入的DNA溶液、CTBA溶液和亚甲基蓝溶液体积比为1：1：100。发夹型DNA在检测前先95℃下反应10min后自然冷却到室温。
更进一步地，检测凝血酶的共振光散射方法能有效地辨别出对体系可能会产生干扰的单链DNA的不同形式。如发生单碱基突变和其它变异的DNA片段。
本发明主要设计一内嵌有凝血酶适配体的、具有茎环结构的发夹型DNA片段作为探针，实验结果显示该探针与其它种类的DNA探针相比，能显著提高凝血酶的检测性能。凝血酶探针是根据亚甲基蓝分子与DNA结构的紧密关系来设计的。具体来说，因为在H-eTBA的序列中存在凝血酶的适配体序列，而当不同浓度的凝血酶加入时，该适配体能与凝血酶发生特异性结合，H-eTBA结构随之发生改变，从而在加入CTBA与体系中剩余的、结构未发生改变的H-eTBA进行互补后，得到不同浓度的dsDNA或ssDNA。随后加入的MB溶液因为其与dsDNA和ssDNA的不同作用力，导致该体系产生与凝血酶浓度相对应的RLS信号，据此可以实现对凝血酶的定量检测。牛血清蛋白，胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶原等对所述发夹型DNA探针探针定量检测凝血酶的方法不产生干扰。只有在加入凝血酶时，体系的RLS信号才会有显著的变化，内嵌有适配体序列的DNA探针对于凝血酶检测有着良好的选择性。
与现有技术相比，本发明利用亚甲基蓝分子与DNA结构的独特关系，结合共振光散射光谱技术设计出一种简便和特异性强的探针并将其用于凝血酶的检测，该方法能有效地进行凝血酶的定量检测，且具有较宽的线性范围。特别是在临床上，对于一些可能会受到突变序列干扰分析结果的蛋白质目标物检测，该设计方法有着显著的特异性。
附图说明
图1为发夹型DNA探针定量检测凝血酶的原理图。
图2为不同情况下MB-DNA反应体系的共振光散射强度对比关系图。
图3为反应体系的减色效应示意图。
图4为体系MB浓度对共振光散射强度的优化关系图。
图5为体系pH值对共振光散射强度的优化关系图。
图6为检测不同浓度凝血酶的共振光散射强度信号关系图。
图7为使用单点突变的DNA和完全非特异的适体探针的共振光散射强度对比关系图。
图8为本实验适体探针抗干扰性能测试对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
实施例1
使用荧光分光光度计进行相关检测。内嵌有凝血酶适配体的发夹型DNA结构碱基序列如下：5’-GAATTCTTAAAGGTTGGTGTGGTTGGAATTC-3’。其中，5’-GAATTCTTAAAGGTTGGTGTGGTTGGAATTC-3’，GGTTGGTGTGGTTGG为凝血酶的适配体序列，5’-GAATTC和3’-CTTAAG所配对形成的部分为发夹型DNA茎环结构的茎部分，AATTCTTAAAGGTTGGTGTGGTTGG为与CTBA互补的碱基序列。
实施例2
发夹型DNA探针定量检测凝血酶的方法包括以下步骤：在1.5mL离心管中，分别加入898μL不同浓度的凝血酶溶液以及用Tris-HCl缓冲液（pH7.40）配制的H-eTBA（1μL，10μM，实验前先95℃下反应10min，后自然冷却到室温）溶液。37℃下培育反应25min后，加入CTBA溶液（1μL，10μM），然后将混合溶液在37℃下继续培育1h。最后往离心管中快速加入MB溶液（100μL，5×10-5M），室温下彻底均匀混合反应。体系的总体积为1000μL。最后将溶液置于荧光分光光度计上，以相同的激发和发射波长，在225到700nm的范围内进行共振光散射扫描，得到共振光散射光谱以对凝血酶进行定量检测。共振光散射扫描的激发光狭缝宽度为5nm，发射光狭缝宽度为2.5nm，扫描速率为1200nm/min，光电倍增管电压为400V。对样品进行检测的线性范围为0-630.6μg/L，检出限为11.74μg/L。
发夹型DNA探针定量检测凝血酶的原理如图1所示：在H-eTBA的序列中内嵌有凝血酶的适配体序列，单独存在时能以茎环结构稳定地存在，当加入不同浓度的目标物凝血酶时，由于内嵌在H-eTBA序列中的凝血酶适配体能与凝血酶发生特异性结合，H-eTBA结构随之发生改变，从而在加入CTBA与体系中剩余的、结构未发生改变的H-eTBA进行互补配对后，能得到不同浓度的双链DNA或单链DNA。随后加入的亚甲基蓝溶液由于其与双链DNA和单链DNA的不同作用力，导致该体系分别产生能与一定浓度范围内的凝血酶成线性关系的共振光散射信号，据此可以实现对凝血酶的定量检测。
实施例3
利用一系列的对比实验a-h来对体系的共振光散射光谱图进行表征，而获得不同情况下MB-DNA反应体系的共振光散射强度对比关系图。其中a为MB+H-eTBA+CTBA；b为MB+H-eTBA+CTBA+thrombin；c为MB+H-eTBA；d为MB+CTBA；e为MB+thrombin；f为thrombin；g为MB；h为H-eTBA+CTBA。（其中pH=7.40；MB：5×10-5M；H-eTBA：1μL，10μM；CTBA：1μL，10μM；thrombin：450.5μg/L）。
由图2可见从曲线a到h，其RLS曲线形状几乎保持一致，因此在370nm处的RLS峰可被用作体系的特征吸收峰进行凝血酶的定量检测。如图2所示，MB+H-eTBA+CTBA（曲线a）的RLS信号强度较强，而MB+H-eTBA，MB+CTBA，MB+thrombin，thrombin，MB和H-eTBA+CTBA（插图：曲线c到h）的RLS信号在扫描区间内可以忽略。另一方面，当加入浓度为450.5μg/L的凝血酶时（曲线b），RLS信号值明显下降。根据RLS的理论研究，RLS强度与粒子的数量和粒径成正比例关系。如前所述，由曲线b可以知道，当加入凝血酶时，MB-dsDNA的数量随之减少，引起RLS强度明显的下降。这些现象都与实验推断和RLS的理论相符合。此外，从图2的插图可见，曲线c比曲线d的RLS强度要稍强，这从侧面可以证实H-eTBA单独存在时，其茎环结构中能形成碱基互补的部分与MB分子发生了结合。
实施例4
加入1μL不同浓度CTBA（0.1，1，2，4，8和10μM），其它条件为pH=7.40；MB：5×10-5M；H-eTBA：1μL，10μM。研究在紫外-可见光谱时研究体系的减色效应。
如图3所示，MB-dsDNA体系在666nm处的吸光度随着CTBA浓度的减少而下降。体系出现的减色效应说明了MB分子能通过静电吸引力，积聚在由H-eTBA和CTBA所形成的双螺旋结构表面。与此同时，最大吸收波长并没有发生变化，这也说明了MB分子与dsDNA是在外部产生结合的。
实施例5
不同的MB浓度来研究MB浓度对共振光散射强度的优化对比。MB的浓度分别为1，3，5，7和9×10-5M；其它的条件为H-eTBA：1μL，10μM；CTBA：1μL，10μM；thrombin：180.2μg/L；pH=7.40。实验结果皆为三次重复测量之平均值。
如图4所示，当MB浓度为5×10-5M时，其RLS强度达到最大值。同时，也可以观察到随着MB浓度的增加，因为有更多的MB分子与dsDNA发生反应，RLS强度也在逐步地增大；然而，过大的MB浓度又会使得MB分子之间形成二聚物，不利于MB与dsDNA的结合反应，RLS强度因此而降低。综上所述，实验选用浓度为5×10-5M的MB溶液作为最佳浓度。
实施例6
不同pH值对共振光散射强度的优化对比。pH值分别为：5.45，6.50，7.40，8.40和9.50。其他条件为MB：5×10-5M；H-eTBA：1μL，10μM；CTBA：1μL，10μM；thrombin：180.2μg/L；实验结果皆为三次重复测量之平均值。
如图5所示在pH值范围为5.45到9.50内，当pH值为7.40时，体系的RLS强度达到最大值，因此pH=7.40被选作最佳的实验pH值。
实施例7
不同浓度凝血酶的共振光散射强度信号的优化对比。a-f为凝血酶的浓度分别为0，180.2，360.4，450.5，540.5和630.6μg/L。其余条件：MB：5×10-5M；H-eTBA：1μL，10μM；CTBA：1μL，10μM；pH7.40。在0-630.6μg/L的范围内，RLS强度与凝血酶浓度呈线性关系。实验结果皆为三次重复测量之平均值。
如图6所示，凝血酶浓度越高，体系RLS强度就越低（曲线a到f）。此外，实验选用反应体系在370nm处的RLS吸收峰为凝血酶定量检测的特征峰。另外从图6可以看出，在0到630.6μg/L范围内，凝血酶浓度和RLS强度的变化值成线性关系。回归直线方程为ΔIRLS=7.13Cthrombin+65.47(R2=0.9951)，检出限为11.74μg/L。该结果显示本实验方法对于凝血酶有着良好的检测效果。
实施例8
研究使用单点突变的DNA和完全非特异的适体探针的共振光散射强度对比关系图。实验条件为凝血酶的浓度为：180.2μg/L；H-eTBA：1μL，10μM；CTBA：1μL，10μM；Mis-DNA：1μL，10μM；Non-specificDNA与其互补DNA链浓度均为：1μL，10μM；MB：5×10-5M；pH7.40。
如图7所示，固定凝血酶的浓度为180.2μg/L，进行两个对比实验。在第一个对比中，采用单点突变的DNA片段（Mis-DNA）代替CTBA。在第二个对比实验中，利用全新的、内嵌有完全非凝血酶适配体序列的DNA探针（non-specific），并同时使用另外的碱基序列作为与non-specific互补DNA片段以代替CTBA，以上两个对比实验的步骤与凝血酶的检测步骤一致。如图所示，使用H-eTBA所产生的RLS信号值比使用Mis-DNA的信号要强。由于使用Mis-DNA而产生的、较弱的RLS信号意味着发夹型探针能有效地识别出单点突变的DNA序列。这是因为Mis-DNA不能完全与H-eTBA进行配对，导致能与MB分子发生反应的双链DNA数量减少，从而呈现相对很弱的RLS信号强度。该结果显示，H-eTBA能凭借着它的发夹型茎环结构辨别出反应体系中存在的单点突变的DNA片段。
此外，从图7还可以观察到，当使用non-specific链作为探针时，其所产生的RLS信号与使用H-eTBA所产生的信号接近相同。这是因为在non-specific片段中，并没有凝血酶的适配体，而当加入它的互补DNA片段后，能发生完全的配对结合，因此在加入MB溶液后，该体系能产生较强的RLS信号峰。
实施例9
加入浓度皆为1000μg/L的干扰物：牛血清蛋白，胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶原。凝血酶的浓度为630.6μg/L，其他条件为：MB：5×10-5M；H-eTBA：1μL，10μM；CTBA：1μL，10μM；pH=7.40。通过实验研究本适体探针的抗干扰性能。实验结果皆为三次重复测量之平均值。
如图8所示，只有在加入凝血酶时，体系的RLS信号才会有显著的变化，所有的对比实验结果均显示本实验所设计的，具有特别茎环结构的，内嵌有适配体序列的DNA探针对于凝血酶检测有着良好的选择性。
<110>汕头大学
<120>一种发夹型DNA探针及其定量检测凝血酶的方法
<130>STP1410107CN
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>发夹型DNA（H-eTBA）
<400>1
gaattcttaaaggttggtgtggttggaattc31

Claims (8)

1.一种发夹型DNA探针，具有茎环结构，其特征在于，内嵌有凝血酶适配体，其结构碱基序列如下：5’-GAATTCTTAAAGGTTGGTGTGGTTGGAATTC-3’，GGTTGGTGTGGTTGG为所述凝血酶的适配体序列，5’-GAATTC和3’-CTTAAG所配对形成的部分为所述发夹型DNA茎环结构的茎部分。
2.按照权利要求1所述的发夹型DNA探针定量检测凝血酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，在Tris-HCl缓冲液体系中，将发夹型DNA溶液与不同浓度的凝血酶在37℃下恒温反应25min；
步骤二，加入CTBA溶液，然后将混合溶液在37℃下继续培育1h；
步骤三，再加入亚甲基蓝溶液，室温下彻底混合反应；
步骤四，将溶液置于荧光分光光度计上，以相同的激发和发射波长，在225到700nm的范围内进行共振光散射扫描，得到共振光散射光谱以对凝血酶进行定量检测；
步骤二所述CTBA溶液与所述发夹型DNA的碱基序列AATTCTTAAAGGTTGGTGTGGTTGG互补。
3.根据权利要求2所述的检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤四所述共振光散射扫描，激发光狭缝宽度为5nm，发射光狭缝宽度为2.5nm，扫描速率为1200nm/min，光电倍增管电压为400V。
4.根据权利要求2所述的检测凝血酶的方法，其特征在于，所述共振光散射光谱的线性范围为凝血酶浓度0-630.6μg/L，检出限为11.74μg/L。
5.根据权利要求2-4任一项所述的检测凝血酶的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液体系pH为7.40；所述发夹型DNA溶液浓度为10μM；所述CTBA溶液浓度为10μM；所述亚甲基蓝溶液浓度为5×10-5M。
6.根据权利要求5所述的检测凝血酶的方法，其特征在于，所述发夹型DNA在检测前先95℃下反应10min后自然冷却到室温。
7.根据权利要求2、3、4或6所述的检测凝血酶的方法，其特征在于，能辨别出对体系产生干扰的单链DNA的不同形式。
8.按照权利要求7所述的检测凝血酶的方法，其特征在于，所述产生干扰的单链DNA可为发生单碱基突变和其它变异的DNA片段。
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