CN102796824A - 凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用 - Google Patents
凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102796824A CN102796824A CN201210321302XA CN201210321302A CN102796824A CN 102796824 A CN102796824 A CN 102796824A CN 201210321302X A CN201210321302X A CN 201210321302XA CN 201210321302 A CN201210321302 A CN 201210321302A CN 102796824 A CN102796824 A CN 102796824A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aptamers
- nanometer silver
- zymoplasm
- pbs
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims abstract description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 95
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 94
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims abstract description 64
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims abstract description 64
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 46
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 46
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 46
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 44
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 44
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 88
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 44
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 31
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 claims description 30
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 20
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 10
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 9
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 8
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 8
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 6
- -1 biotin modified nanosilver Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 4
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004638 bioanalytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012455 bioassay technique Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002389 environmental scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了凝血酶的检测试剂,它包括磁珠-纳米银-适配体复合材料以及纳米银荧光探针;其中,所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料,以链霉亲和素修饰的磁珠为内核,表面键合适配体和生物素修饰的纳米银;所述的纳米银荧光探针以纳米银球为内核,银球外表面键合有荧光分子链、适配体分子链和掺杂分子链。本发明还公开了包含上述试剂的检测试剂盒及其应用。本发明的磁珠-纳米银-适配体复合材料具有很好的分离和富集的能力,而且适配体相对于抗体具有合成简单,易于修饰,成本低等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用。
背景技术
定量分析检测低丰度蛋白标志物对于疾病的预防和诊断是非常重要的。在医疗诊断和生物分析技术中,荧光分析一直是占有主导地位的技术,利用金属纳米结构可以改变荧光特性而发展的荧光检测技术是一种新兴的分析检测技术。适配体作为一种新颖的捕获试剂,可以与金属离子、代谢物、蛋白质和细胞反应,与抗体相比,它具有独特的优势,容易合成及易于化学修饰,稳定性好,无毒。适配体修饰的纳米材料将成为一种有前途的功能纳米材料用于生命分析中。磁性纳米颗粒由于其磁性和易于被生物分子修饰的特点,作为生物分子分离平台而受到广泛的关注。目前为止,很少有同时进行分离,富集和检测蛋白质的集成平台见诸报道,磁珠/纳米银/适配体复合材料集合了磁珠的分离特性,纳米银的荧光增强特性以及适配体的识别特性,是一种新型的分析富集试剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题,是提供一种凝血酶的检测试剂。
本发明还要解决的技术问题,是提供包含上述试剂的检测试剂盒。
本发明最后要解决的技术问题,是提供上述检测试剂盒的应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
凝血酶的检测试剂,它包括磁珠-纳米银-适配体复合材料(简称磁珠-纳米银-适配体)以及纳米银荧光探针;
其中,所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料,以链霉亲和素修饰的磁珠为内核,表面键合适配体和生物素修饰的纳米银,其中,所述的适配体和生物素修饰的纳米银是以直径为10~30nm的纳米银球为内核,银球外表面键合有适配体分子链I和生物素分子链;
其中,所述的适配体分子链I为:
5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG;
其中,所述的生物素分子链为:
5’-SH-AAAAA AAAAA AAAAA-生物素;
所述的适配体和生物素修饰的纳米银具有能和磁性纳米粒子结合的特性以及识别蛋白质分子的特性。通过巯基的自组装在纳米银表面连接上适配体分子和生物素分子。所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料是在链霉亲和素修饰的磁珠表面,通过链霉亲和素和生物素的相互作用,连接生物素修饰的纳米银制备而成。
其中,所述的纳米银荧光探针以直径为10~30nm的纳米银球为内核,银球外表面键合有荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链;
其中,所述的荧光分子链为:
5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Cy3;
其中,所述的适配体分子链II为:
5’-SH-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT;
其中,所述的掺杂分子链为:
5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAA。
所述的纳米银荧光探针具有荧光特性且能特异性识别目标蛋白质分子。通过巯基的自组装在纳米银表面连接上荧光分子,适配体分子及掺杂分子。
上述凝血酶的检测试剂的制备方法,它包括:
(1)磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法,包括如下步骤:
(1a)在冰浴条件下,将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(1b)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比(1~10):(1~10)加入步骤(1a)得到的纳米银溶液中,静置10-24小时,生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1;
其中,所述的适配体分子链I,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的生物素分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由生物素标记;
(1c)向步骤(1b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置3~10小时;
(1d)向步骤(1c)得到的混合体系中加入1~5mol/L氯化钠溶液,静置2~4小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1~4次,使氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L;
(1e)将步骤(1d)得到的混合体系静置24~72小时,取上清液;
(1f)将步骤(1e)得到的上清液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤1~4次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1~5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银;
(1g)将步骤(1f)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液1.3nmol/L与0.25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合,置摇床中37℃反应1小时,磁分离,1×PBST清洗2~4次,最后1×PBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料;
(2)纳米银荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
(2a)在冰浴条件下,将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比(1~10):(1~10):(2~20)加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中,静置10-24小时,荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1;
其中,所述的荧光分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由荧光分子Cy3标记;
其中,所述的适配体分子链II,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的掺杂分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰;
(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置3~10小时;
(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入1~5mol/L氯化钠溶液,静置2~4小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1~4次,使氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L;
(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置24~72小时,取上清液;
(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤1~4次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1~5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。
步骤(1b)中,生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比优选为3:1;静置时间优选为18小时;生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为优选为288;
步骤(1c)和步骤(2c)中,1×PBS为包含如下物质的水溶液:137mM NaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4.12H2O,2mM KH2PO4;静置时间优选为6h。
步骤(1d)和步骤(2d)中,氯化钠溶液的浓度优选为2mol/L;氯化钠的终浓度优选为0.2mol/L;静置时间优选为3h。
步骤(1e)和(2e)中,静置时间优选为48h。
步骤(1f)和(2f)中,所述的离心条件为10000~20000rpm条件下离心10~30分钟,优选15000rpm条件下离心15分钟。所述的1×PBSM配方为1×PBS和1mmol/L MgCl2。
步骤(1g)中,1×PBST配方为1×PBS中加入0.05(v/v)%Tween-20。
步骤(2b)中,荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比优选为1:1:2;静置时间优选为18小时;荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比优选为288。
上述凝血酶的检测试剂在制备检测凝血酶试剂中的应用。当有目标分子凝血酶存在时,由于两种适配体分子可以特异性结合凝血酶的两个结合位点,形成夹心结构磁珠-纳米银-适配体/凝血酶/纳米银探针,不同浓度的凝血酶导致不同含量的夹心结构的产生,从而产生不同的荧光信号强度。
一种检测凝血酶的试剂盒,该试剂盒包含如下试剂:磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针、PBS缓冲液、tween-20、凝血酶。
上述检测凝血酶的试剂盒在检测凝血酶中的应用。
利用检测凝血酶的试剂盒检测凝血酶含量的具体方法,依次顺序包括如下步骤:
(1)配制溶液:
磁珠-纳米银-适配体复合材料:0.25mg/ml,2mL;
纳米银荧光探针:1.3nmol/L,2mL;
稀释液:1×PBS,10ml;
洗涤液:1×PBS溶液中,按0.05%的体积比加入tween-20溶液,50ml;
检测蛋白:配制不同浓度的凝血酶标准品;
(2)将磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针与凝血酶标准品等体积混合,置摇床中37℃反应15分钟,磁分离,干燥后用1×PBS缓冲液稀释,1×PBS缓冲液的加入体积为磁分离后混合体系总体积的5~20%;
(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上,1μl/点;
(4)待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度凝血酶标准品对应不同的荧光信号强度,得到凝血酶的标准曲线;
(5)将待测样品替换步骤(2)中的凝血酶标准品,重复步骤(2)和(3),待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,根据得到的荧光信号强度和步骤(4)得到的标准曲线计算样品中凝血酶的含量。
图1为磁珠-纳米银-适配体的制备以及夹心结构分析凝血酶的示意图。
有益效果:本发明建立了以磁性纳米粒子-纳米银-适配体复合物为分离富集载体,凝血酶为检测目标,同时修饰有适配体和荧光分子的纳米银为检测探针的新型集富集分离与检测为一体的高灵敏生物分析方法。当凝血酶浓度在0.39ng/ml-25ng/ml,荧光信号强度与浓度具有指数关系,当凝血酶浓度在0.39-3.12ng/ml之间,荧光信号强度与浓度具有线性关系,检测限为78pg/ml。此方法也具有很好的特异性,其他蛋白质如人血清白蛋白,溶菌酶及人免疫球蛋白对该方法的干扰非常小。磁性纳米粒子-纳米银-适配体复合物高效的分离特性结合纳米荧光探针灵敏的检测特性,实现了对目标蛋白质凝血酶的高灵敏分离富集及检测。
此外,本发明方法是一种集分离富集检测于一体的分析方法,分离材料与荧光信号分子作为一个整体直接被检测。该分析方法与其他基于适配体检测凝血酶的荧光分析方法相比,具有检测限低,分析时间短的优势。
附图说明
图1为磁珠-纳米银-适配体的制备以及夹心结构分析凝血酶的示意图。
图2为紫外-可见表征图。
图3为扫描电镜显微镜表征图。
图4对凝血酶的分析检测。
图5特异性试验。
图6重复性试验。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法。
(1a)在冰浴条件下,将10mmol/L硝酸银溶液逐滴加入20mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(1b)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比3:1加入步骤(1a)得到的纳米银溶液中,静置18小时,生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为288:1;
其中,所述的适配体分子链I,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的生物素分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由生物素标记;
(1c)向步骤(1b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液(1×PBS配方:137mMNaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4.12H2O,2mM KH2PO4,以下相同),使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置6小时;
(1d)向步骤(1c)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液,静置3小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤3次,使氯化钠的终浓度为0.2mol/L;
(1e)将步骤(1d)得到的混合体系静置48小时,取上清液;
(1f)将步骤(1e)得到的上清液经离心(离心条件15000rpm条件下离心15分钟)去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤3次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.2倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液(1×PBSM配方为1×PBS和1mmol/L MgCl2,以下相同)重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银;
(1g)将步骤(1f)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液1.3nmol/L与0.25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合,置摇床中37℃反应1小时,磁分离,1×PBST(1×PBST配方为1×PBS中加入0.05(v/v)%Tween-20,以下相同)清洗3次,最后1×PBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料;
实施例2:磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法。
(1a)在冰浴条件下,将2mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(1b)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比1:10加入步骤(1a)得到的纳米银溶液中,静置10小时,生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为100:1;
其中,所述的适配体分子链I,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的生物素分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由生物素标记;
(1c)向步骤(1b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置3小时;
(1d)向步骤(1c)得到的混合体系中加入1mol/L氯化钠溶液,静置2小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1次,使氯化钠的终浓度为0.1mol/L;
(1e)将步骤(1d)得到的混合体系静置24小时,取上清液;
(1f)将步骤(1e)得到的上清液经离心(离心条件为10000rpm条件下离心30分钟)去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤1次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银;
(1g)将步骤(1f)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液1.3nmol/L与0.25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合,置摇床中37℃反应1小时,磁分离,1×PBST清洗2次,最后1×PBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料;
实施例3:磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法。
(1a)在冰浴条件下,将20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入30mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(1b)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比10:1加入步骤(1a)得到的纳米银溶液中,静置24小时,生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为1000:1;
其中,所述的适配体分子链I,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的生物素分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由生物素标记;
(1c)向步骤(1b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置10小时;
(1d)向步骤(1c)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液,静置4小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次,使氯化钠的终浓度为0.3mol/L;
(1e)将步骤(1d)得到的混合体系静置72小时,取上清液;
(1f)将步骤(1e)得到的上清液经离心(离心条件为20000rpm条件下离心10分钟)去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤4次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银;
(1g)将步骤(1f)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液1.3nmol/L与0.25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合,置摇床中37℃反应1小时,磁分离,1×PBST清洗4次,最后1×PBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料;
实施例4:纳米银荧光探针的制备方法。
(2a)在冰浴条件下,将10mmol/L硝酸银溶液逐滴加入20mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比1:1:2加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中,静置18小时,荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为288:1;
其中,所述的荧光分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由荧光分子Cy3标记;
其中,所述的适配体分子链II,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的掺杂分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰;
(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置6小时;
(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液,静置3小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤3次,使氯化钠的终浓度为0.2mol/L;
(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置48小时,取上清液;
(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心(离心条件为15000rpm条件下离心15分钟)去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤2次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的2倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。
实施例5:纳米银荧光探针的制备方法。
(2a)在冰浴条件下,将2mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比1:10:20)加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中,静置10小时,荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为100:1;
其中,所述的荧光分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由荧光分子Cy3标记;
其中,所述的适配体分子链II,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的掺杂分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰;
(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置3小时;
(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入1mol/L氯化钠溶液,静置2小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1次,使氯化钠的终浓度为0.1mol/L;
(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置24小时,取上清液;
(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心(离心条件为10000rpm条件下离心10分钟)去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤1次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。
实施例6:纳米银荧光探针的制备方法。
(2a)在冰浴条件下,将20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入30mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比10:1:2加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中,静置24小时,荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为1000:1;
其中,所述的荧光分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由荧光分子Cy3标记;
其中,所述的适配体分子链II,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的掺杂分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰;
(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置10小时;
(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液,静置4小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次,使氯化钠的终浓度为0.3mol/L;
(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置72小时,取上清液;
(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心(离心条件为20000rpm条件下离心30分钟)去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤4次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。
实施例7:检测凝血酶的试剂盒。
一种检测凝血酶的试剂盒,该试剂盒包含如下试剂:磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针、PBS缓冲液、tween-20、凝血酶。
实施例8:利用检测凝血酶的试剂盒检测凝血酶含量的方法。
(1)配制溶液:
磁珠-纳米银-适配体复合材料:0.25mg/ml,2mL;
纳米银荧光探针:1.3nmol/L,2mL;
稀释液:1×PBS,10ml;
洗涤液:1×PBS溶液中,按0.05%的体积比加入tween-20溶液,50ml;
检测蛋白:配制不同浓度的凝血酶标准品(0.39ng/ml-25ng/ml);
(2)将磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针与凝血酶标准品等体积混合,置摇床中37℃反应15分钟,磁分离,干燥后用1×PBS缓冲液稀释,1×PBS缓冲液的加入体积为磁分离后混合体系总体积的5~20%(最佳体积为8.3%);
(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上,1μl/点;
(4)待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度凝血酶标准品对应不同的荧光信号强度,得到凝血酶的标准曲线和扫描图,见图4;利用磁珠-纳米银-适配体及纳米银荧光探针对凝血酶进行检测,当凝血酶浓度在0.39ng/ml-25ng/ml之间,荧光信号强度与浓度的对数值之间具有指数相关性,当凝血酶浓度在0.39ng/ml-3.12ng/ml之间,荧光信号强度与浓度的对数值之间具有线性相关性,线性关系好;
(5)将待测样品替换步骤(2)中的凝血酶标准品,重复步骤(2)和(3),待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,根据得到的荧光信号强度和步骤(4)得到的标准曲线计算样品中凝血酶的含量。
实施例9:
制备方法同实施例1,所不同的是,
步骤(1f)得到的适配体和生物素修饰的纳米银,取200μl(1.3nM)测紫外-可见吸收光谱得到图2-a。
将200μl购买的链霉亲和素修饰的磁珠(0.25mg/ml)测紫外-可见吸收光谱得到图2-b。
将步骤(1g)得到的磁珠-纳米银-适配体复合材料,取200μl测紫外-可见吸收光谱得到图2-c。
将步骤(1g)中磁分离得到的上清溶液,取200μl测紫外-可见吸收光谱得到图2-d。
通过紫外可见光谱来表征磁珠-纳米银-适配体的结合程度,生物素和适配体修饰的纳米银在407.5nm处有一尖锐的吸收峰(a),而购买的链霉亲和素修饰的磁珠在300nm-700nm的区间内吸收峰很弱(b),当磁珠表面通过链霉亲和素和生物素的作用连接上大量纳米银颗粒时,纳米银的吸收峰发生很大的变化,大量红移而且吸收峰下降预示着大量纳米银颗粒在磁珠表面的聚集(c),磁分离后的磁珠-纳米银-适配体的上清没有吸收峰(d),说明纳米银全部连接到磁珠表面,磁珠的巨大表面积可以容纳大量的纳米银颗粒。
实施例10:
同实施例1的方法,所不同的是:
步骤(1f)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液,在透射电子显微镜下观察并采集图像见图3-a。
步骤(1g)得到的磁珠-纳米银-适配体,在透射电子显微镜下观察并采集图像见图3c。
同实施例4的方法,所不同的是:
步骤(2f)得到的纳米银荧光探针,在透射电子显微镜下观察并采集图像见图3-b。
透射电子显微镜显示生物素和适配体修饰的纳米银粒子大部分成球形粒径为17.2±3.4nm(采集的粒子数为102个),纳米银荧光探针的粒径为19.1±3.6nm(采集的粒子数为81个),电镜图显示大量的纳米粒子聚集在磁珠表面。
实施例11:特异性实验。
(1)配制溶液,配制凝血酶样品(20ng/ml),溶菌酶(200ng/ml),人免疫球蛋白IgG(20μg/ml),人血清白蛋白(20μg/ml)。
(2)磁珠-纳米银-适配体和纳米银荧光探针分别与凝血酶、溶菌酶、人免疫球蛋白、人血清白蛋白等体积混合,置摇床中37℃反应15分钟,磁分离,干燥后用1×PBS稀释,所加的体积为原来总体积的5%-20%(最佳体积为8.3%)
(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上,1μl/点;
(4)待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同样品对应不同的荧光信号强度。
通过研究了磁珠-纳米银-适配体及纳米银荧光探针对其它蛋白质的分析情况(图5),发现对其它蛋白的荧光信号远远弱于对凝血酶的荧光信号。因此此方法特异性好。
实施例12:重复性实验。
(1)配制溶液,配制8份凝血酶样品(20ng/ml)。
(2)磁珠-纳米银-适配体,纳米银探针与8份凝血酶等体积混合,置摇床中37℃反应15分钟,磁分离,干燥后用1×PBS稀释,所加的体积为原来总体积的5%-20%(最佳体积为8.3%)
(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上,1μl/点;
(4)待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同样品对应不同的荧光信号强度。
曲线b:8次数据的平均值,通过进行重复性实验,发现此方法重复性好,重复的8次实验中,只有一次的数据落偏离平均值较远,7次的数据均在10%误差范围内(图6)。证明此种方法的重现性好。
Claims (7)
1.凝血酶的检测试剂,其特征在于,它包括磁珠-纳米银-适配体复合材料以及纳米银荧光探针;
其中,所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料,以链霉亲和素修饰的磁珠为内核,表面键合适配体和生物素修饰的纳米银,其中,所述的适配体和生物素修饰的纳米银是以直径为10~30nm的纳米银球为内核,银球外表面键合有适配体分子链I和生物素分子链;
其中,所述的适配体分子链I为:
5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG;
其中,所述的生物素分子链为:
5’-SH-AAAAA AAAAA AAAAA-生物素;
其中,所述的纳米银荧光探针以直径为10~30nm的纳米银球为内核,银球外表面键合有荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链;
其中,所述的荧光分子链为:
5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Cy3;
其中,所述的适配体分子链II为:
5’-SH-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT;
其中,所述的掺杂分子链为:
5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAA。
2.权利要求1所述的凝血酶的检测试剂的制备方法,其特征在于,它包括:
(1)磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法,包括如下步骤:
(1a)在冰浴条件下,将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(1b)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比(1~10):(1~10)加入步骤(1a)得到的纳米银溶液中,静置10-24小时,生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1;
其中,所述的适配体分子链I,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的生物素分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由生物素标记;
(1c)向步骤(1b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置3~10小时;
(1d)向步骤(1c)得到的混合体系中加入1~5mol/L氯化钠溶液,静置2~4小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1~4次,使氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L;
(1e)将步骤(1d)得到的混合体系静置24~72小时,取上清液;
(1f)将步骤(1e)得到的上清液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤1~4次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1~5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银;
(1g)将步骤(1f)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液1.3nmol/L与0.25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合,置摇床中37℃反应1小时,磁分离,1×PBST清洗2~4次,最后1×PBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料;
(2)纳米银荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
(2a)在冰浴条件下,将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中,硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3,不断搅拌至反应完全,然后补加硼氢化钠溶液,补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%,继续搅拌至室温,得到纳米银溶液;
(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比(1~10):(1~10):(2~20)加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中,静置10-24小时,荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1;
其中,所述的荧光分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰,3’端由荧光分子Cy3标记;
其中,所述的适配体分子链II,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT,其5’端由巯基修饰;
其中,所述的掺杂分子链,其核苷酸序列为:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰;
(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液,使PBS的终浓度为0.1×PBS,静置3~10小时;
(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入1~5mol/L氯化钠溶液,静置2~4小时,重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1~4次,使氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L;
(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置24~72小时,取上清液;
(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心与重悬的步骤1~4次,PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1~5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。
3.根据权利要求2所述的凝血酶的检测试剂的制备方法,其特征在于,步骤(1f)和步骤(2f)中,所述的离心条件为10000~20000rpm条件下离心10~30分钟。
4.权利要求1所述的凝血酶的检测试剂在制备检测凝血酶试剂中的应用。
5.一种检测凝血酶的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含如下试剂:磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针、PBS缓冲液、tween-20、凝血酶。
6.权利要求5所述的检测凝血酶的试剂盒在检测凝血酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,利用检测凝血酶的试剂盒检测凝血酶含量的具体方法,依次顺序包括如下步骤:
(1)配制溶液:
磁珠-纳米银-适配体复合材料:0.25mg/ml,2mL;
纳米银荧光探针:1.3nmol/L,2mL;
稀释液:1×PBS,10ml;
洗涤液:1×PBS溶液中,按0.05%的体积比加入tween-20溶液,50ml;
检测蛋白:配制不同浓度的凝血酶标准品;
(2)将磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针与凝血酶标准品等体积混合,置摇床中37℃反应15分钟,磁分离,干燥后用1×PBS缓冲液稀释,1×PBS缓冲液的加入体积为磁分离后混合体系总体积的5~20%;
(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上,1μl/点;
(4)待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度凝血酶标准品对应不同的荧光信号强度,得到凝血酶的标准曲线;
(5)将待测样品替换步骤(2)中的凝血酶标准品,重复步骤(2)和(3),待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,根据得到的荧光信号强度和步骤(4)得到的标准曲线计算样品中凝血酶的含量。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210321302.XA CN102796824B (zh) | 2012-09-03 | 2012-09-03 | 凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210321302.XA CN102796824B (zh) | 2012-09-03 | 2012-09-03 | 凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102796824A true CN102796824A (zh) | 2012-11-28 |
CN102796824B CN102796824B (zh) | 2013-08-07 |
Family
ID=47196121
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210321302.XA Active CN102796824B (zh) | 2012-09-03 | 2012-09-03 | 凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102796824B (zh) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103543275A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-01-29 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种基于磁珠快速检测pp65的方法 |
CN103630517A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-03-12 | 南京邮电大学 | 一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法 |
CN104034712A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-10 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 | 一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒 |
CN104569424A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-29 | 汕头大学 | 一种发夹型dna探针及其定量检测凝血酶的方法 |
CN104634754A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-05-20 | 新疆农垦科学院 | 一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法 |
CN106018372A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 济南大学 | 双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器 |
CN106323973A (zh) * | 2016-10-12 | 2017-01-11 | 清华大学 | 液晶液滴、生物传感器及检测凝血酶的方法 |
CN107462704A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-12 | 清华大学深圳研究生院 | 一种生物传感器及其制备方法、靶分子浓度检测方法 |
CN108760657A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-06 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种凝血酶检测方法及其试剂盒 |
CN113295660A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-08-24 | 宁波大学 | 一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法 |
CN117030672A (zh) * | 2023-08-11 | 2023-11-10 | 中国药科大学 | 一种用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004083902A2 (en) * | 2002-10-25 | 2004-09-30 | Georgia Tech Research Corporation | Multifunctional magnetic nanoparticle probes for intracellular molecular imaging and monitoring |
WO2011087916A2 (en) * | 2010-01-15 | 2011-07-21 | Willson Richard C | Force mediated assays |
CN102352311A (zh) * | 2011-06-24 | 2012-02-15 | 湖南师范大学 | 基于适体-金纳米-酶复合物的凝血酶电化学传感器检测法 |
CN102539738A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-07-04 | 南京大学 | 一种适配体修饰的纳米银及其试剂盒与应用 |
-
2012
- 2012-09-03 CN CN201210321302.XA patent/CN102796824B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004083902A2 (en) * | 2002-10-25 | 2004-09-30 | Georgia Tech Research Corporation | Multifunctional magnetic nanoparticle probes for intracellular molecular imaging and monitoring |
WO2011087916A2 (en) * | 2010-01-15 | 2011-07-21 | Willson Richard C | Force mediated assays |
CN102352311A (zh) * | 2011-06-24 | 2012-02-15 | 湖南师范大学 | 基于适体-金纳米-酶复合物的凝血酶电化学传感器检测法 |
CN102539738A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-07-04 | 南京大学 | 一种适配体修饰的纳米银及其试剂盒与应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
《中国科学B辑 化学》 20061231 方禹之等 "基于核酸适配体和纳米材料的凝血酶蛋白特异性识别电化学生物传感器" 第36卷, 第6期 * |
方禹之等: ""基于核酸适配体和纳米材料的凝血酶蛋白特异性识别电化学生物传感器"", 《中国科学B辑 化学》, vol. 36, no. 6, 31 December 2006 (2006-12-31) * |
Cited By (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103543275B (zh) * | 2013-11-07 | 2015-07-22 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种基于磁珠快速检测pp65的方法 |
CN103543275A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-01-29 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种基于磁珠快速检测pp65的方法 |
CN103630517A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-03-12 | 南京邮电大学 | 一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法 |
CN103630517B (zh) * | 2013-11-15 | 2015-12-09 | 南京邮电大学 | 一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法 |
CN104034712A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-10 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 | 一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒 |
CN104569424A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-29 | 汕头大学 | 一种发夹型dna探针及其定量检测凝血酶的方法 |
CN104569424B (zh) * | 2014-12-19 | 2016-06-01 | 汕头大学 | 一种发夹型dna探针及其定量检测凝血酶的方法 |
CN104634754B (zh) * | 2015-01-30 | 2017-09-22 | 新疆农垦科学院 | 一种功能化磁珠分离‑酶联适配体检测食品中土霉素的方法 |
CN104634754A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-05-20 | 新疆农垦科学院 | 一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法 |
CN106018372A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 济南大学 | 双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器 |
CN106018372B (zh) * | 2016-07-19 | 2018-06-05 | 济南大学 | 双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器 |
CN106323973A (zh) * | 2016-10-12 | 2017-01-11 | 清华大学 | 液晶液滴、生物传感器及检测凝血酶的方法 |
CN107462704A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-12 | 清华大学深圳研究生院 | 一种生物传感器及其制备方法、靶分子浓度检测方法 |
CN108760657A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-06 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种凝血酶检测方法及其试剂盒 |
CN108760657B (zh) * | 2018-05-31 | 2021-06-08 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种凝血酶检测方法及其试剂盒 |
CN113295660A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-08-24 | 宁波大学 | 一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法 |
CN113295660B (zh) * | 2021-04-09 | 2023-11-24 | 宁波大学 | 一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法 |
CN117030672A (zh) * | 2023-08-11 | 2023-11-10 | 中国药科大学 | 一种用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针及其应用 |
CN117030672B (zh) * | 2023-08-11 | 2024-04-19 | 中国药科大学 | 一种用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102796824B (zh) | 2013-08-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102796824B (zh) | 凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用 | |
Luan et al. | Ultrabright fluorescent nanoscale labels for the femtomolar detection of analytes with standard bioassays | |
JP7308148B2 (ja) | 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイおよび金属ナノ構造体 | |
CN100367034C (zh) | 免疫胶体金粒子荧光淬灭的测量方法 | |
US9777075B2 (en) | Diagnostic assay using particles with magnetic properties | |
WO2016187588A1 (en) | Plasmonic nanoparticles and lspr-based assays | |
CN110763834A (zh) | 一种检测免疫标志物含量的方法、试剂和试剂盒 | |
CN107462705B (zh) | 一种灵敏度强、可分解的量子点纳米球探针及其制备方法 | |
CN102914646B (zh) | 基于表面等离子体耦合效应的均相多组分免疫分析方法 | |
Wang et al. | Detection of the potential tumor marker of AFP using surface‐enhanced Raman scattering‐based immunoassay | |
KR20130081206A (ko) | 표식화 프로브-수용성 담체 복합체 | |
Wang et al. | Immunoassay for cardiac troponin I with fluorescent signal amplification by hydrolyzed coumarin released from a metal–organic framework | |
Zhang et al. | Towards nanovesicle-based disease diagnostics: a rapid single-step exosome assay within one hour through in situ immunomagnetic extraction and nanophotonic label-free detection | |
EP2952895B1 (en) | Method of producing labeled antibody | |
Diltemiz et al. | A reflectometric interferometric nanosensor for sarcosine | |
Turan et al. | A fluoroimmunodiagnostic nanoplatform for thyroglobulin detection based on fluorescence quenching signal | |
Ma et al. | Progress in nanomaterials-based optical and electrochemical methods for the assays of exosomes | |
Wang et al. | High-sensitivity biosensor based on SERS integrated with dendrimer-assisted boronic acid-functionalized magnetic nanoparticles for IL-6 detection in human serum | |
Tong et al. | Hybridization chain reaction engineered DNA nanopolylinker for amplified electrochemical sensing of biomarkers | |
Chen et al. | Tyramine signal amplification on polystyrene microspheres for highly sensitive quantification of Aflatoxin B1 in peanut samples | |
CN109856076B (zh) | 检测细胞的组合物及检测方法 | |
CN112730338A (zh) | 一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针及其SPR免疫检测的方法 | |
Chen et al. | Biomagnetic glass beads for protein separation and detection based on surface-enhanced Raman scattering | |
CN113588627B (zh) | 一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用 | |
Chuag et al. | Accelerated colorimetric immunosensing using surface-modified porous monoliths and gold nanoparticles |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |