CN112730338A - 一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针及其SPR免疫检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫学分析检测技术领域内一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针及其SPR免疫检测的方法。本发明首先以氯金酸为金源,硝酸银为银源,超纯水作为溶剂,过氧化氢为刻蚀溶剂,合成了多孔Ag@Au核壳纳米粒子复合材料,再利用MUA将Ag@Au核壳纳米粒子表面羧基功能化,然后将二级抗体(Ab2)固定于其表面得到多孔结构的双信号放大探针p‑Ag@Au‑Ab2。在采用该探针进行肿瘤标志物的SPR检测,在SPR的芯片表面固定一级抗体Ab1,用牛血清蛋白封闭再结合检测抗原,并将p‑Ag@Au‑Ab2与抗原结合,再通入苯胺和H2O2的混合溶液,多孔的p‑Ag@Au‑Ab2核壳纳米粒子具有过氧化物酶模拟酶性质,可在SPR芯片表面催化H2O2氧化苯胺反应生成聚苯胺,形成二次SPR信号放大。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学分析检测技术领域,特别涉及一种基于Ag@Au的双信号纳米放大探针及SPR免疫检测的方法。
背景技术
表面等离子体共振传感是基于表面等离子体共振SPR这一光学现象发展的。Liedberg等人于1983年发现金属表面附近的质量累积会影响金属与电介质交界面的折射率,而SPR信号对折射率变化很敏感,首次开发了表面等离子体共振传感器研究结合反应。SPR传感器为研究分子结合提供了一种快速、实时、高选择性和高灵敏性的测定方法;SPR可在分子水平上分析生物及药物分子之间的相互作用,如:蛋白质、DNA、脂质到小分子、噬菌体及病毒等,SPR 传感器还可以研究其相互作用而应用于临床医学、药物筛选、食品安全及环境检测领域。SPR 传感器电化学分析技术和免疫检测技术相结合,因制作简单、损耗小及高选择性和实时性等优点而备受关注。
夹心免疫分析是利用抗体与待测抗原发生特异性结合时,根据待测物浓度对SPR信号变化的影响关系实现免疫检测的灵敏度。现有技术中,改进SPR灵敏度的方法有两种,一种是对芯片表面改性,提高界面生物相容性,一种是引入纳米粒子信号放大探针技术。常用的纳米材料,如以氧化石墨烯将芯片基底改性,利用双锥金、磁性纳米粒子引入探针检测人体免疫球蛋白分子,引起的SPR信号迁移相对较低,灵敏度相对较低,检测限相对较高。
发明内容
本发明针对现有技术中SPR传感器免疫检测中提高SPR信号灵敏度度中存在的问题,提供一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针,利用多孔结构的Ag@Au核壳纳米粒子,在苯胺在催化过氧化氢的作用下生成聚苯胺,实现二次信号放大以提高灵敏度。
本发明的目的是这样实现的,一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针,其特征在于,通过如下步骤备制得到:
第一步,氯金酸为金源,硝酸银为银源,超纯水作为溶剂,过氧化氢为刻蚀溶剂,合成多孔核壳纳米粒子p-Ag@Au;
第二步,利用11-巯基十一烷酸MUA将p-Ag@Au核壳纳米粒子表面羧基功能化,然后将二级抗体Ab2,固定于其表面得到多孔结构的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2。
进一步地,第一步中,多孔核壳纳米粒子p-Ag@Au的合成方法为:将超纯水加热至100℃后,边搅拌边加入抗坏血酸 ,1min后,加入氯化钠溶液、硝酸银溶液和柠檬酸钠的混合溶液,继续搅拌并于100℃保持1h,用超纯水离心洗涤后,将固相微粒分散于超纯水中得到Ag纳米颗粒水溶胶;将所得Ag纳米颗粒水溶胶超声30min,边搅拌边加入氨水溶液和氯金酸并加热回流30min,待冷却至室温,以11000rpm离心,超纯水洗涤数次后获得Ag@Au核壳纳米粒子;最后,将Ag@Au核壳纳米粒子超声分散均匀到H2O2中,磁力搅拌下,经H2O2刻蚀得到多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au;第二步中,将多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au超声分散于PBS磷酸缓冲溶液中,加11-巯基十一烷酸MUA搅拌,在多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au表面修饰羧基,接着以EDC和NHS活化羧基,然后再加入二级抗体 Ab2,4℃条件下低温下搅拌,再通过低温10000转/分的高速离心分离后,得到多孔结构的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2,并分散于PBS中,于4℃低温储藏。
更进一步地,第二步中,所述多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au在PBS磷酸缓冲溶液中的分散浓度为0.5-2mg/mL,MUA的浓度为100mM/L,EDC和NHS的浓度为10mg/mL,二级抗体(Ab2)的浓度为1mg/mL;其中,p-Ag@Au、MUA、EDC和NHS的摩尔投料量比为7:1:5:6;所述低温为4℃,离心转速及时间为10000r和30~60min。
本发明的多孔结构的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2,一方面多孔核壳纳米粒子孔p-Ag@Au具有高比表面积,良好的生物相容性和优异的光学及电学性质等优点,能够在界面上固定更多的二级抗体,也可以与SPR金膜之间的电磁耦合的综合作用促进SPR 信号增大,以提高检测的灵敏性。
为便于实现本发明的SPR免疫检测的目的,本发明还提供一种采用上述多孔结构的双信号纳米放大探针p-Ag@Au-Ab2 进行SPR免疫检测的方法,包括如下步骤:
第1步,将清洗干净的SPR芯片装入表面等离子体共振检测分析仪,并以一定的流速将PBS磷酸盐缓冲溶液通入检测池使检测仪的偏移信号基线平稳;
第2步,将一级抗体Ab1固定于SPR芯片表面,并用牛血清蛋白溶液进行封闭;
第3步,向检测池中注入已知浓度的抗原溶液和一级抗体Ab1与,使SPR芯片表面实现一级抗体Ab1与抗原的结合;
第4步,将向检测池注入适当浓度的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2,使其与SPR表面的抗原结合,并通过检测仪输出稳定的共振角偏移信号;
第5步,向检测池中分别注入苯胺和H2O2的,进行进一步的信号放大,再通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR信号稳定,通过检测仪输出稳定的共振角偏移信号曲线a;
第6步,重新取样与第3步中相同抗原的不同浓度的抗原溶液的样品数份,分别重复第1步~第5步的过程,分别得到共振角偏移信号曲线b、c、d、e、f、g;
第7步,以曲线a、b、c、d、e、f、g对应的共振偏移角的峰值为纵作标,以各曲线对应的抗原的浓度为横作标,绘制拟合抗原的标准样品曲线;
第8步,重复第1步~第5步的过程,进行未知浓度抗原的检测,根据输出的共振角偏移信号曲线对应的偏移角的峰值按第7步的标准样品曲线确定待检测的抗原的浓度。
本发明的检测方法,通过在SPR的芯片表面修饰金黄色葡萄糖球菌蛋白以固定一级抗体Ab1,用牛血清蛋白封闭再结合检测抗原,进一步结合多孔结构的双信号纳米放大探针p-Ag@Au- Ab2,再通入苯胺和H2O2的混合溶液,多孔Ag@Au核壳纳米粒子具有过氧化物酶模拟酶性质,可在SPR芯片表面催化H2O2氧化苯胺反应生成聚苯胺,形成二次SPR信号放大。基于p-Ag@Au-Ab2探针所制得的表面等离子体共振免疫传感器,在磷酸缓冲溶液体系中,可快速简便地实现对蛋白分子的高灵敏度检测。
为便于清洁芯片,第一步中,SPR芯片的清洗方法为:将体积比为1:1:3为H2O2、氨水和超纯水的混合溶液加热至90~100℃,投入SPR芯片投入混合液中浸泡10~15分钟,然后用超纯水和乙醇交替冲洗SPR芯片2~3次,再用氮气将吹干,以清洗SPR芯片。
为便于将一级抗体固定于SPR芯片表面,第二步的具体方法为:向第一步结束的检测池中注入金黄色葡萄球菌蛋白SPA与PBS磷酸盐缓冲溶液的混合溶液,待偏移信号平稳后,继续注入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定;然后再向检测池中注入一级抗体Ab1与SPA结合反应,待偏移信号平稳,再通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定; 最后向检测池中注入牛血清蛋白溶液封闭SPR芯片表面,待偏移信号稳定,再通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定。
进一步地,所述一级抗体Ab1为浓度为100μg/mL的溶液,牛血清蛋白溶液的浓度为200μg/mL,溶剂均为浓度0.01mol/L的PBS磷酸盐缓冲溶液。
进一步地,所述金黄色葡萄球菌蛋白SPA与PBS的混合溶液的浓度为100~120μg/mL,PBS磷酸盐缓冲溶液的浓度0.01mol/L。
进一步地,所述PBS磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L,所述PBS磷酸盐缓冲溶液的注入流速为5μL/min。
进一步地,第4步中,双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2以PBS磷酸盐缓冲溶液为溶剂分散,探针的分散浓度为10~15μg/mL,PBS磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L。
第5步中,苯胺的浓度为30m mol/L和, H2O2的浓度为5m mol/L,溶剂均为0.01mol/L的 PBS磷酸盐缓冲溶液。
附图说明
图1为本发明的p-Ag@Au-Ab2的制备流程及其采用该多孔结构的双信号纳米放大探针p-Ag@Au-Ab2进行SPR免疫检测的流程图。
图2A-2C分别为本发明制备的Ag、Ag@Au、p-Ag@Au纳米粒子的电镜图。
图2D为本发明制备的p-Ag@Au核壳纳米粒子的高倍透射电镜图。
图3为采用本发明的双信号纳米放大探针p-Ag@Au-Ab2进行多种已知浓度的HIgG的SPR免疫检测时偏移信号曲线图。
图4为根据图3的偏移信号与HIgG的浓度拟合的标准样品曲线。
图5为比较例中以HIgG为抗原的肿瘤标志物进行SPR免疫检测时采用不同的探针进行信号放大的偏移曲线图。
具体实施方式
实施例1
本实施例首先制备用于免疫检测HIgG的基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针,按图1中虚线框内的流程,在三颈烧瓶中加入46.6mL超纯水加热至100℃后,边搅拌边加入100μL抗坏血酸(58.3mM),继续保温1min,接着加入30μL氯化钠溶液(0.1M)、2.4mL硝酸银溶液(0.02M)、1.0mL柠檬酸钠溶液(34.0mM)混合均匀的溶液,搅拌加热至100℃并保持1h,待溶液自然冷却后,用超纯水洗涤离心分离后用水重新分散得到Ag纳米颗粒水溶胶;将所得Ag纳米颗粒水溶胶超声分散30min,边搅拌边加入0.1mL氨水溶液(0.02M)和100μL氯金酸溶液(1wt%)并加热回流30min,待冷却至室温,以11000rpm离心分离得到的固相,用超纯水洗涤多次获得Ag@Au核壳纳米颗粒;将Ag@Au核壳纳米颗粒超声分散均匀,磁力搅拌下,经30μL的H2O2刻蚀得到多孔核壳纳米粒子p-Ag@Au,该p-Ag@Au核壳纳米粒子平均粒径为45nm。
制备基于多孔Ag@Au核壳纳米粒子信号放大的表面等离子体共振免疫传感器具体包括以下步骤:
将1mg多孔核壳纳米粒子p-Ag@Au超声分散于2ml磷酸缓冲溶液(PBS)中,加入100μL MUA(100mM/L)搅拌,在p-Ag@Au表面修饰羧基,接着加入100μL EDC(10mg/ml)和70μL NHS(10mg/ml)活化羧基,加入100μL 的二级抗体Goat anti-HIgG (Ab2),4℃下低温搅拌,再在低温下进行10000rpm的高速离心,继续分散于10ml的 PBS中,得到多孔的探针p-Ag@Au-Ab2,于4℃低温储藏。
由图2A可清晰看出Ag的粒径大约为40nm,图2B为包裹Au壳后,Ag@Au的粒径为50nm,图2C为经过氧化氢刻蚀后,所得的多孔核壳纳米粒子p-@Au,粒径为45nm左右。图2D为p-Ag@Au的高倍透射电镜图,可确切看出Ag和Au的晶格。综合上述,可证明成功制备了p-Ag@Au纳米粒子。
实施例2
本实施例,分别选用已知浓度分别为0.01μg/mL,0.05μg/mL,0.08μg/mL,0.1μg/mL,0.3μg/mL,0.5μg/mL,1.0μg/mL HIgG标准样品,采用实施例1制备的双信号放大纳米探针p-Ag@Au-Ab2 进行HIgG表面等离子体共振免疫传感器检测。本实施例中所用的PBS磷酸盐缓冲溶液的浓度均为0.01mol/L,进行表面等离子体共振免疫检测是PBS的流速均匀为5μL/min。
首先进行SPR芯片清洗,将体积比为1:1:3为H2O2、氨水和超纯水的混合溶液加热至100℃混合均匀,将若干片SPR芯片投至混合液中浸泡10分钟,然后用超纯水和乙醇交替冲洗SPR芯片2~3次,再用氮气将吹干,以清洗SPR芯片。
第一步,再取一片将清洗干净的SPR芯片装入表面等离子体共振检测分析仪,并以5μL/min的流速将PBS磷酸盐缓冲溶液通入检测池使检测仪的偏移信号基线平稳;
第2步,向第一步结束的检测池中注入浓度为100μg/mL金黄色葡萄球菌蛋白SPA与PBS磷酸盐缓冲溶液的混合溶液,待偏移信号平稳后,继续以5μL/min 的流速注入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定;然后再向检测池中注入100μg/mL的Rabbit anti-HIgG一级抗体Ab1与SPA结合反应,待偏移信号平稳,再以5μL/min 的流速通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定; 最后向检测池中注入200μg/mL的牛血清蛋白溶液封闭SPR芯片表面,待偏移信号稳定,再以5μL/min 的流速通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定,至此,完成本步的将一级抗体Ab1固定于SPR芯片表面,并用牛血清蛋白溶液进行封闭;
第3步,向检测池中注入浓度为0.01μg/mL的HIgG抗原和Rabbit anti-HIgG一级抗体,使SPR芯片表面实现一级抗体与抗原的结合;
第4步,将向检测池注入浓度为10μg/mL的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2,使其与SPR表面的HIgG抗原合,并持续以5μL/min 的流速通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定通过检测仪输出稳定的共振角偏移信号;
第5步,向检测池中分别注入苯胺(30mM)和H2O2(5mM)的混合溶液,进行进一步的信号放大,并持续以5μL/min 的流速通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR信号稳定,并通过检测仪输出稳定的共振角偏移信号曲线a; 如图3所示
第6步,再分别取样浓度为0.05μg/mL,0.08μg/mL,0.1μg/mL,0.3μg/mL,0.5μg/mL,1.0μg/mL HIgG标准样品,分别重复第1步~第5步的过程,分别得到共振角偏移信号曲线b、c、d、e、f、g;
第7步,以图3的曲线a、b、c、d、e、f、g对应的共振偏移角的峰值为纵作标,以各曲线对应的HIgG的浓度为横作标,绘制拟合HIgG的标准样品曲线如图4所示。该标准曲线可以用于未知浓度的HIgG的检测。
未知HIgG浓度的SPR免疫检测中,按本实施例第1步~第5步的过程,在第3步注入的抗原替换为未知浓度的HIgG样品,最后通过第5步检测仪输出稳定的共振角偏移信号曲线中的偏移角峰值根据图4的HIgG的标准样品曲线,确定HIgG的浓度。
本实施例中,为进一步实施上述检测方法的可靠性,按上述第1步~第5步的过程进行了人血清实际样品中HIgG的检测,并对未经处理的实际血清样本进行加标回收分析。回收率范围为93.3%-105.5%,说明该传感器在实际血清样本中可以准确检测HIgG,加标回收检测结果如表1所示。
表1.HIgG实际样品的测定
样本 | 加标浓度(μg/mL) | 检测浓度(μg/mL) | 回收率(%) |
1 | 0.10 | 0.09 | 94.6 |
2 | 0.30 | 0.28 | 93.3 |
3 | 0.60 | 0.63 | 105.5 |
4 | 0.80 | 0.77 | 96.3 |
5 | 1.00 | 1.03 | 103.2 |
对比例
按实施例2中第1步~第5步的过程,分别进行如下对比实施过程:
首先进行比较例1以抗原浓度为1μg/mL HIgG,通入p-Ag@Au-Ab2与HIgG结合后,通过检测仪输出的偏移曲线如图5的曲线a所示,SPR角度偏移值为0.081度,进一步通入苯胺和H2O2进行信号放大,SPR角度偏移值为0.249度;
再进行比较例2同样以抗原浓度为1μg/mL HIgG,仅通入p-Ag@Au-Ab2进行信号放大的SPR角度偏移值为0.080度,而未进行第5步的进一步信号放大,通过检测仪输出的偏移曲线如图5的曲线b所示,与曲线a中经二次信号放大的最终平稳的偏移角输出值相对,曲线a线二次信号放大后偏移角放大为曲线b的约3倍。
进行比较例3时,同样以抗原浓度为1μg/mL HIgG,在第4步中,用Ab2代替p-Ag@Au-Ab2,经第5步的二次进行信号放大,输出的偏移信号曲线如图5的曲线c 所示,SPR角度偏移值仅为0.022度。
进行比较例4时,未通过HIgG抗原,并在第3步中,以0.01M PBS 代替HIgG,经p-Ag@Au-Ab2和第5步的苯胺和H2O2进行信号放大,输出的偏移信号曲线如图5的曲线d 所示, SPR角度偏移值仅为0.028度。
因此,综合以上比较例的对比实施,可以证明本发明的p-Ag@Au-Ab2核壳纳米粒子双信号放大探针的表面等离子体共振免疫传感器检测HIgG的可行的,同样可以用于其它肿瘤标志物蛋白分子或人体免疫蛋白分子浓度的检测中,实际检测中只需适应性变化一级抗体Ab1,二级抗体Ab2与待检测的作为抗原分子的标志物;并且采用本发明的基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针及其SPR免疫检测的方法,通过双信号纳米放大探针的二次信号放大作用,检测的灵敏度明显提高。
Claims (10)
1.一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针,其特征在于,通过如下步骤备制得到:
第一步,氯金酸为金源,硝酸银为银源,超纯水作为溶剂,过氧化氢为刻蚀溶剂,合成的多孔核壳纳米粒子p-Ag@Au;
第二步,利用11-巯基十一烷酸MUA将p-Ag@Au核壳纳米粒子表面羧基功能化,然后将二级抗体Ab2,固定于其表面得到多孔结构的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2。
2.根据权利要求1所述的基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针,其特征在于,
第一步中,多孔核壳纳米粒子p-Ag@Au的合成方法为:将超纯水加热至100℃后,边搅拌边加入抗坏血酸 ,1min后,加入氯化钠溶液、硝酸银溶液和柠檬酸钠的混合溶液,继续搅拌并于100℃保持1h,用超纯水离心洗涤后,将固相微粒分散于超纯水中得到Ag纳米颗粒水溶胶;将所得Ag纳米颗粒水溶胶超声30min,边搅拌边加入氨水溶液和氯金酸并加热回流30min,待冷却至室温,以11000rpm离心,超纯水洗涤数次后获得Ag@Au核壳纳米粒子;最后,将Ag@Au核壳纳米粒子超声分散均匀到H2O2中,磁力搅拌下,经H2O2刻蚀得到多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au;
第二步中,将多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au超声分散于PBS磷酸缓冲溶液中,加11-巯基十一烷酸MUA搅拌,在多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au表面修饰羧基,接着以EDC和NHS活化羧基,然后再加入二级抗体 Ab2,4℃条件下低温下搅拌,再通过低温10000转/分的高速离心分离后,得到多孔结构的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2,并分散于PBS中,于4℃低温储藏。
3.根据权利要求2所述的基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针,其特征在于,第二步中,所述多孔的核壳纳米粒子p-Ag@Au在PBS磷酸缓冲溶液中的分散浓度为0.5-2mg/mL,MUA的浓度为100mM/L,EDC和NHS的浓度为10mg/mL,二级抗体 (Ab2)的浓度为1mg/mL;其中,p-Ag@Au、MUA、EDC和NHS的摩尔投料量比为7:1:5:6;所述低温为4℃,离心转速及时间为10000r和30~60min。
4.一种采用权利要求1或2或3所述的多孔结构的双信号纳米放大探针进行SPR免疫检测的方法,其特征在于,包括如下步骤:
第1步,将清洗干净的SPR芯片装入表面等离子体共振检测分析仪,并以一定的流速将PBS磷酸盐缓冲溶液通入检测池使检测仪的偏移信号基线平稳;
第2步,将一级抗体Ab1固定于SPR芯片表面,并用牛血清蛋白溶液进行封闭;
第3步,向检测池中注入已知浓度的抗原溶液和一级抗体Ab1与,使SPR芯片表面实现一级抗体Ab1与抗原的结合;
第4步,将向检测池注入适当浓度的双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2,使其与SPR表面的抗原结合,并通过检测仪输出稳定的共振角偏移信号;
第5步,向检测池中分别注入苯胺和H2O2的,进行进一步的信号放大,再通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR信号稳定,通过检测仪输出稳定的共振角偏移信号曲线a;
第6步,重新取样与第3步中相同抗原的不同浓度的抗原溶液的样品数份,分别重复第1步~第5步的过程,分别得到共振角偏移信号曲线b、c、d、e、f、g;
第7步,以曲线a、b、c、d、e、f、g对应的共振偏移角的峰值为纵作标,以各曲线对应的抗原的浓度为横作标,绘制拟合抗原的标准样品曲线;
第8步,重复第1步~第5步的过程,进行未知浓度抗原的检测,根据输出的共振角偏移信号曲线对应的偏移角的峰值按第7步的标准样品曲线确定待检测的抗原的浓度。
5.根据权利要求4所述的SPR免疫检测的方法,其特征在于,第一步中,SPR芯片的清洗方法为:将体积比为1:1:3为H2O2、氨水和超纯水的混合溶液加热至90~100℃,投入SPR芯片投入混合液中浸泡10~15分钟,然后用超纯水和乙醇交替冲洗SPR芯片2~3次,再用氮气将吹干,以清洗SPR芯片。
6.根据权利要求4所述的SPR免疫检测的方法,其特征在于,第二步的具体方法为:向第一步结束的检测池中注入金黄色葡萄球菌蛋白SPA与PBS磷酸盐缓冲溶液的混合溶液,待偏移信号平稳后,继续注入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定;然后再向检测池中注入一级抗体Ab1与SPA结合反应,待偏移信号平稳,再通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定; 最后向检测池中注入牛血清蛋白溶液封闭SPR芯片表面,待偏移信号稳定,再通入PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗至SPR偏移信号稳定。
7.根据权利要求6所述的SPR免疫检测的方法,其特征在于,所述一级抗体Ab1为浓度为100μg/mL的溶液,牛血清蛋白溶液的浓度为200μg/mL,溶剂均为浓度0.01mol/L的PBS磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求6所述的SPR免疫检测的方法,其特征在于,所述金黄色葡萄球菌蛋白SPA与PBS的混合溶液的浓度为100~120μg/mL,PBS磷酸盐缓冲溶液的浓度0.01mol/L。
9.根据权利要求4或6所述的SPR免疫检测的方法,其特征在于,所述PBS磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L,所述PBS磷酸盐缓冲溶液的注入流速为5μL/min。
10.根据权利要求6所述的SPR免疫检测的方法,其特征在于, 第4步中,双信号放大探针p-Ag@Au-Ab2以PBS磷酸盐缓冲溶液为溶剂分散,该探针浓度为10~15μg/mL,PBS磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L。
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