CN114713822B - CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用 - Google Patents

CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114713822B
CN114713822B CN202210344531.7A CN202210344531A CN114713822B CN 114713822 B CN114713822 B CN 114713822B CN 202210344531 A CN202210344531 A CN 202210344531A CN 114713822 B CN114713822 B CN 114713822B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
agau
nano
star
cypa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210344531.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114713822A (zh
Inventor
蓝婷
黄庆利
赵扬
杜昱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xuzhou Medical University
Original Assignee
Xuzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xuzhou Medical University filed Critical Xuzhou Medical University
Priority to CN202210344531.7A priority Critical patent/CN114713822B/zh
Publication of CN114713822A publication Critical patent/CN114713822A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114713822B publication Critical patent/CN114713822B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F9/00—Making metallic powder or suspensions thereof
    • B22F9/16—Making metallic powder or suspensions thereof using chemical processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用。本发明以Au@Ag纳米星为牺牲模板，HAuCl4溶液为刻蚀剂，通过电偶置换反应合成内部具有独立闭合间隙的Au@AgAu蛋黄壳纳米星，接着，将CV分子锚定在纳米颗粒的区域内，然后，再在外层用了二氧化硅作为涂层，最后，通过与CYPA抗体的孵育，得到CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针，该探针利用抗原抗体之间的特异性结合来显著增强SERS的信号强度，可以检测出低水平浓度的CYPA抗原。本发明纳米探针用于检测肿瘤标志物CYPA，具有高灵敏度、快速简便的特点，可在卵巢癌肿瘤早期诊断的临床应用中推广应用。

Description

CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学癌症标志物检测技术领域，尤其涉及一种CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
卵巢癌是女性生殖器官肿瘤中较为常见类型之一，其发展的早期，临床症状较为隐蔽不易被重视，因而大多数患者进展至晚期才得以发现，错过最佳治疗时机。此外，卵巢癌的易产生、易复发和耐药性强等难题，使其致死性大大提高。
近年来，许多学者将目光转移到用纳米探针来进行疾病的早期检测与诊断。目前，被公共所认可的卵巢癌肿瘤标志物屈指可数，糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、人附睾蛋白4(Humanepididymisprotein 4，HE4)是其中具有代表性的两个，但是两者对于早期卵巢癌患者的特异性和灵敏度不高。已有研究发现，卵巢癌患者血浆中的CYPA多肽丰度大幅上升，而对照组健康人中并没有升高的迹象，在晚期患者中CYPA呈阳性反应的比例更高。此外，CYPA在浆液性卵巢癌组织中的表达高于癌旁组织并与患者的临床分期和淋巴结转移有着显著的联系。以上这些都表明了CYPA过度表达与卵巢癌的发生和发展密切相关。
表面增强拉曼光谱(SERS)是一种具有分子特异性的分析技术，它可以将原本微弱的拉曼信号进行放大，实现理想中的超灵敏分析。根据目前各学者的进展，可以将SERS活性基底的拉曼信号增强机制可分为电磁机制(EM)和化学机制(CM)，其中占绝大部分的为电磁增强机制，引起的局域电磁场增强是拉曼信号增强的主要机制。凭借着超高的灵敏度，SERS已在医疗诊断、化学、生物、环境等领域得到了广泛的研究和应用。
要通过SERS实现灵敏分析，SERS活性基底的设计至关重要。现有的活性基底大部分是贵金属Au、Ag，也有一些非贵金属纳米材料，例如石墨烯、半导体材料、过渡金属等作为基底，但是对于大多数非贵金属材料而言，其导带电子密度通常较低，振荡频率位于红外区域，价带的电子密度很高，振荡频率在紫外区，因此其电磁场增强作用一般较弱，在SERS效应中贡献较低。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用。
本发明是这样实现的，一种CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)以Au@Ag纳米星为牺牲模板，以HAuCl4溶液为刻蚀剂，通过电偶置换反应制备得到Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液；
(2)将所述Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液与CV混合反应制备得到Au@AgAu@CV纳米星溶液；
(3)将所述Au@AgAu@CV纳米星溶液与APTES混合反应制备得到Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液；
(4)将所述Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液与CYPA抗体孵育，得到CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针。
优选地，在步骤(1)中，所述Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液的制备过程为：往试管中加入30mL 0.1M的CTAB、308.886μL 10mg/ml HAuCl4、300μL 0.1M的AA和30μL 1M的NaOH，再加入6mL Au@Ag纳米星溶液，30℃水浴反应12h，10000rpm离心10min，去上清，得到管底的Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液。
优选地，在步骤(1)中，所述Au@Ag纳米星溶液的制备过程为：
往试管中加入30mL 0.25mM的氯金酸溶液以及30μL 1M的盐酸溶液进行搅拌，再加入300μL制备好的金星种子液，随后加入300μL 3mM的AgNO3溶液和150μL 100mM的AA溶液，待变色后加入2mL 0.1M的CTAB，混匀，10000rpm离心10min，去上清，得到管底的CTAB-Au纳米星溶液；
将上述制备的CTAB-Au纳米星溶液分散于20mL 80mM CTAC溶液中，充分混匀，在10000rpm下离心10min，去上清，将管底剩余悬浊液重复一次上述分散、混匀、离心和去上清过程，得到CTAC-Au纳米星溶液；
往所述CTAC-Au纳米星溶液中加入12mL 0.08M的CTAC溶液、1500μL 0.01M的AgNO3溶液、75μL 0.1M的AA溶液，混匀，65℃水浴反应4.5h，在10000rpm离心10min，去上清，得到管底的Au@Ag纳米星溶液。
优选地，在步骤(2)中，所述Au@AgAu@CV纳米星溶液的制备过程为：将2mL 0.5mM的CV加入到所述Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液中，再加去离子水定量至10mL，摇晃状态下反应24h，10000rpm离心10min，去上清，得到管底的Au@AgAu@CV纳米星溶液。
优选地，在步骤(3)中，所述Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液的制备过程为：将所述Au@AgAu@CV纳米星溶液充分溶解到30mL乙醇中，再加入30μL含10％wt APTES的乙醇共两次，搅拌过夜，10000rpm离心10min，去上清，再加入去离子水定量至500μL，得到Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液。
优选地，在步骤(4)中，所述CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针的制备程为：往试管中加入100μL Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液，再加入700μLpH 7.4的PBS和100μL 10μg/mL的CYPA抗体，4℃孵育24h，期间隔2、3小时摇晃试管，孵育后加100μL 3％wt的牛血清蛋白BSA，4℃孵育6h后封闭，10000rpm离心10min，去上清，加PBS定量，得到CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针。
本发明进一步公开了上述制备方法得到的CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针。
本发明进一步公开了上述CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针在制备卵巢癌肿瘤检测药物中的应用。
本发明克服现有技术的不足，提供一种CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用。本发明CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针的制备技术原理在于：由于Ag和Au的晶格常数非常接近，生成的Au原子倾向于沉积在Au@Ag纳米星的表面进而形成一个薄壳，本发明以Au@Ag纳米星为牺牲模板，HAuCl4溶液为刻蚀剂，通过电偶置换反应合成Au@AgAu蛋黄壳纳米星，此时Au纳米星核心和AuAg合金壳之间形成了一个内部闭合独立的间隙，由于内间隙引起的金星与外层合金壳之间的强等离子体耦合进而产生强烈的局域电场，极大地增加了拉曼信号强度；接着，本发明将CV分子锚定在纳米颗粒的区域内，用过共轭作用让电子转移到所测得目标分子，使得SERS信号增强，CV作为信号分子，在缺失的情况下将几乎检测不出拉曼信号；然后，再在外层用了二氧化硅作为涂层，二氧化硅对环境的变化不敏感，有极好的化学惰性，可以提高拉曼信号的准确性、增加纳米结构的稳定性，还可以减少CV的流失，促进CYPA抗体的附着，在缺失硅层保护的情况下，整个纳米颗粒结构易被破坏，CV也容易流失，造成灵敏度和准确度的下降甚至消失；最后，偶联在CYPA之后利用抗原抗体之间的特异性结合来显著增强SERS的信号强度，可以检测出低水平浓度的CYPA抗原。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针用于检测肿瘤标志物CYPA，具有高灵敏度、快速简便的特点，可在卵巢癌肿瘤早期诊断的临床应用中推广应用。
附图说明
图1(a)是Au纳米星的透射电镜图(TEM)，图1(b)是Au@Ag纳米星的透射电镜图(TEM)，图1(c)是多个Au@AgAu蛋黄壳纳米星聚集的透射电镜图(TEM)，图1(d)是单个Au@AgAu蛋黄壳纳米星的透射电镜图(TEM)；
图2是AuNS、Au@Ag NS、Au@AgAu YSNS的紫外-可见吸收光谱；其中，Au NS为Au纳米星，Au@Ag NS为Au@Ag纳米星，Au@AgAuYSNS为Au@AgAu蛋黄壳纳米星；
图3是AuNS、Au@AgNS、Au@AgAuYSNS的SERS光谱(此时CV终浓度为10-6M)；其中，AuNS为Au纳米星，Au@AgNS为Au@Ag纳米星，Au@AgAuYSNS为Au@AgAu蛋黄壳纳米星；
图4是人血清中CYPA的浓度为10-2到10-7μg/L范围内的SERS光谱(此时CV终浓度为0.1mM)；
图5是人血清中CYPA的浓度为10-2到10-7μg/L中取1618cm-1峰位处的增强峰强度所作的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2溶液的制备
1、试剂
氯金酸(HAuCl4·4H2O)、柠檬酸钠、硝酸银(AgNO3)、抗坏血酸(AA)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、结晶紫(CV)、PBS缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、CYPA蛋白抗体、人血清
2、溶液的配制
(1)用超纯水分别溶解氯金酸固体粉末、AgNO3、抗坏血酸，定量，分别得到0.25mM氯金酸溶液、3mM AgNO3溶液、100mM抗坏血酸溶液，放置在黑暗处待用。
配制0.5mM CV溶液：在托盘天平上称取质量为0.00293g的结晶紫粉末，倒入试管内，再加入14.366mL去离子水，摇匀后放置避光处。
3、制备Au纳米星
先将电热恒温油浴锅搅拌器打开预热至120～130℃，取一只洁净试管装取15mL1％柠檬酸盐溶液待用，准备一只圆底烧瓶取配置好的0.01M的四水氯金酸溶液4.118mL，再在圆底瓶中加入95.88mL去离子水，放入磁力搅拌子。将圆底烧瓶安装入油锅搅拌器中，用铝箔封口，等烧瓶内溶液沸腾后加入先前准备的15mL柠檬酸盐溶液，仍旧用铝箔封口，等再次沸腾15min后得金星种子液，冷却可装管避光4℃保存。
取锥形瓶一只，向内加入30mL的0.25mM的氯金酸溶液，30μL的1M HCl放入磁力搅拌子在搅拌器上以700rpm进行搅拌，再加入300μL上述制备的金星种子液，随后用取液枪吸取300μL 3mM的AgNO3溶液和150μL 100mM的AA，计时30秒，看到溶液颜色由浅红变为蓝黑色即可将溶液倒入离心管中。再在离心管中加入0.1M的CTAB，摇匀后放入高速离心机，以转速6000rpm离心15min，结束后取出离心管，去上清液后在管底的悬浊液中加入少量去离子水洗涤，超声溶解1～2分钟后，再次以转速6000rpm离心15min，去上清液，管底剩余悬浊液即为Au纳米星溶液。
4、制备Au@Ag纳米星
将上述制备的Au纳米星溶液分散于20mL 80mM CTAC溶液中，充分混匀后放入高速离心机，以转速10000rpm离心10min，取出后去上清液，管底剩余悬浊液再分散于20mL 80mMCTAC溶液，充分混匀后再次放入高速离心机，以转速10000rpm离心10min，，从而使得Au纳米星表面CTAB全部替换为CTAC。去上清液。
将所得悬浊液依次加入12mL 0.08M的CTAC溶液、1500μL 0.01M的AgNO3溶液、75μL0.1M的AA溶液，摇匀后放置于65℃水浴锅中进行4.5h的水浴，水浴结束后，放入高速离心机，以转速10000rpm离心10min，取出后去上清液，管底剩余悬浊液再加入少量去离子水洗涤，超声溶解1～2min后，再次以转速10000rpm离心10min，去上清液，管底剩余悬浊液即为Au@Ag纳米星溶液。
5、制备Au@AgAu蛋黄壳纳米星
取一只空试管依次加入30mL 0.1M的CTAB、308.886μL 10mg/ml HAuCl4、300μL0.1M的AA和30μL 1M的NaOH，最后加入6mL上述Au@Ag纳米星溶液，放入水浴锅中，用30℃水浴12h。水浴结束后，放入高速离心机，以转速10000rpm离心10min，取出后去上清液，管底剩余悬浊液加入少量去离子水洗涤，超声溶解1～2min后，再次以转速10000rpm离心10min，去上清液，管底剩余悬浊液即为Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液。
6、制备Au@AgAu@CV
将提前配置好的0.5mM CV溶液加入到上述所得的Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液，加入去离子水，使得CV的终浓度为0.1mM，然后将溶液放置在摇床上以250rpm的速度摇晃24h。摇晃结束后放入高速离心机，以转速10000rpm离心10min，取出后去上清液，管底剩余悬浊液即为Au@AgAu@CV纳米星溶液。
7、制备Au@AgAu@CV@SiO2
取一洁净锥形瓶，倒入30mL纯净乙醇，将上述Au@AgAu@CV纳米星溶液分散30mL乙醇中超声1～2min，再放入磁力搅拌子，调整磁力搅拌器以300rpm的速度对溶液搅拌。随后加入30μL含10％(质量分数)APTES的乙醇，等其搅拌2h后再次加入30μL含10％(质量分数)APTES的乙醇。使其搅拌7～8小时后放入高速离心机，以转速10000rpm离心10min，取出后去上清液，加入少量去离子水洗涤，超声溶解1～2min后，再次以转速10000rpm离心10min，去上清液，加去离子水，使终体积为500μL，得Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液。
8、制备CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2
接着取100μL Au@AgAu@CV@SiO2溶液，再加入700μL pH为7.4的PBS和100μL 10μg/ml的CYPA抗体，放入4℃冰箱孵育24h，期间隔2、3小时将试管摇晃，使其不沉淀。孵育过后，加3％(质量分数)牛血清蛋白BSA 100μL，放入4℃冰箱孵育6h，进行封闭，此时抗体的终浓度为1μg/mL。
封闭结束后，放入高速离心机，以转速10000rpm离心10min，取出后去上清液，再加入PBS使其总体积为1mL，此时已经获得CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2溶液。
二、性能检测
1、Au纳米星、Au@Ag纳米星和Au@AgAu蛋黄壳纳米星结构的透射电子显微镜(Transmission ElectronMicroscope，TEM)图像
本发明通过TEM图像可以清晰的看到：Au纳米星NS和Au@Ag拉曼信号太弱，不可能实现下述高灵敏性的CYPA的检测，而当金星外面的银壳被金完全侵蚀掉后，形成了一种内部是金星、外表是AuAg合金层的蛋黄壳纳米星结构，即Au@AgAu。如图1(a)中明确观察到的，Au纳米星分布较为均匀，单分散性也较好。图1(b)表明，Au@Ag纳米星在保持良好核壳结构的同时，也能延续较好的单分散性。如图1(c)、(d)所示的Au@AgAu蛋黄壳纳米星具有空心结构和核壳结构，有较大表面和空隙和中空的外壳，由于内间隙引起的金星与外层合金壳之间的强等离子体耦合进而产生强烈的局域电场，极大地增加了拉曼信号强度，因而有更好的性能。
2、Au纳米星、Au@Ag纳米星和Au@AgAu蛋黄壳纳米星的紫外-可见吸收光谱的表征
通过记录紫外-可见光吸光度光谱进一步表征了制备的Au@AgAu，图2显示了不同纳米颗粒的紫外可见吸光度光谱其中可以看到Au纳米星的吸收峰在825nm左右，而Au@Ag的吸收峰与Au纳米星相比，发生了蓝移，在475nm左右。
再将Au@AgAu的吸收峰与Au@Ag吸收峰相比，红移至650nm左右，这一系列吸收峰的这一系列吸收峰的变化表明蛋黄壳纳米星的成功制备。
3、Au纳米星、Au@Ag纳米星和Au@AgAu蛋黄壳纳米星的SERS光谱检测
用结晶紫作为拉曼报告染料偶联各个纳米颗粒，测出各纳米颗粒的SERS活性，做出了三种纳米颗粒的SERS光谱，如图3所示，可以选取1618cm-1所对应的拉曼强度进行对比，可以明显看出与Au纳米星相比，Au@Ag纳米星的拉曼信号增强不明显，而Au@AgAu这种蛋黄壳纳米星的拉曼信号有着显著提高。
三、抗原-抗体的特异性识别实验
吸取100μL CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2溶液至小玻璃瓶中，再加入100μL人血清，放置37℃保温箱中反应2小时后，即可利用拉曼光谱仪测定(参考文献：SERS-BasedImmunoassay Enhanced with Silver Probe for Selective Separation and DetectionofAlzheimer’s Disease Biomarkers)。
本发明利用所设计的Au@AgAu@CV@SiO2作为SERS材料，通过抗原-抗体进行特异性识别，检测已知CYPA浓度的人血清，通过SERS测试发现，CYPA浓度与SERS增强峰之间具有一定线性关系。随着CYPA浓度的降低，相应的SERS强度也在降低。接着本发明检测了人血清中CYPA的浓度从10-7到10-2μg/mL的一系列SERS光谱，如图4所示。为了准确证明人血清中CYPA对SERS强度的影响，本发明监测了位于1618cm-1处的SERS峰位的强度。如图5所示，随着抗原浓度从10-7μg/mL增加到10-2μg/mL，SERS光谱中1618cm-1峰位处的SERS强度由256.4261逐渐增加到了906.1805(a.u.)，所得的标准曲线是y＝131.13x+1194.6(R2＝0.98293)。
目前诊断肿瘤最有效的办法是组织活检，但是由于组织活检受标本的选取与制作、患者风险以及检查成本等因素限制，不适合癌症的早期诊断。此外，一些辅助检查例如透射、电子计算机断层扫描(CT)、超声等虽然可以为肿瘤的诊断提供直接依据，但影像学检查假阳/阴性率较高、成本较高且有些方法辐射剂量较大，同样不适用于临床早期检查。而今用检测肿瘤标志物浓度来诊断癌症也十分热门，常用方法有酶联免疫法和化学发光法，他们对肿瘤标志物的检测限大约在10-4～10-5μg/mL，这使其在肿瘤早期诊断的临床应用受到了很大的限制。但是本发明的最低检测限度可以达到10-7μg/L，相比较而言，极大地弥补了上述两种方法无法检测低浓度癌症标志物的缺点，此外它还具有拥有准确性大、灵敏度高等特点，这种基于SERS的新型免疫测定法有望成为早期检测卵巢癌标志物CYPA的有力工具。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)以Au@Ag纳米星为牺牲模板，以HAuCl4溶液为刻蚀剂，通过电偶置换反应制备得到Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液；
(2)将所述Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液与CV混合反应制备得到Au@AgAu@CV纳米星溶液；
(3)将所述Au@AgAu@CV纳米星溶液与APTES混合反应制备得到Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液；
(4)将所述Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液与CYPA抗体孵育，得到CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液的制备过程为：往试管中加入30mL 0.1M的CTAB、308.886μL 10mg/ml HAuCl4、300μL0.1M的AA和30μL 1M的NaOH，再加入6mL Au@Ag纳米星溶液，30℃水浴反应12h，10000rpm离心10min，去上清，得到管底的Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述Au@Ag纳米星溶液的制备过程为：
往试管中加入30mL 0.25mM的氯金酸溶液以及30μL 1M的盐酸溶液进行搅拌，再加入300μL制备好的金星种子液，随后加入300μL 3mM的AgNO3溶液和150μL 100mM的AA溶液，待变色后加入2mL 0.1M的CTAB，混匀，10000rpm离心10min，去上清，得到管底的CTAB-Au纳米星溶液；
将上述制备的CTAB-Au纳米星溶液分散于20mL 80mM CTAC溶液中，充分混匀，在10000rpm下离心10min，去上清，将管底剩余悬浊液重复一次上述分散、混匀、离心和去上清过程，得到CTAC-Au纳米星溶液；
往所述CTAC-Au纳米星溶液中加入12mL 0.08M的CTAC溶液、1500μL0.01M的AgNO3溶液、75μL 0.1M的AA溶液，混匀，65℃水浴反应4.5h，在10000rpm离心10min，去上清，得到管底的Au@Ag纳米星溶液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述Au@AgAu@CV纳米星溶液的制备过程为：将2mL 0.5mM的CV加入到所述Au@AgAu蛋黄壳纳米星溶液中，再加去离子水定量至10mL，摇晃状态下反应24h，10000rpm离心10min，去上清，得到管底的Au@AgAu@CV纳米星溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液的制备过程为：将所述Au@AgAu@CV纳米星溶液充分溶解到30mL乙醇中，再加入30μL含10％wtAPTES的乙醇共两次，搅拌过夜，10000rpm离心10min，去上清，再加入去离子水定量至500μL，得到Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针的制备程为：往试管中加入100μL Au@AgAu@CV@SiO2纳米星溶液，再加入700μL pH 7.4的PBS和100μL10μg/mL的CYPA抗体，4℃孵育24h，期间隔2、3小时摇晃试管，孵育后加100μL 3％wt的牛血清蛋白BSA，4℃孵育6h后封闭，10000rpm离心10min，去上清，加PBS定量，得到CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针。
7.权利要求1～6任一项所述制备方法得到的CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针。
8.权利要求7所述CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针在制备卵巢癌肿瘤检测药物中的应用。
CN202210344531.7A 2022-03-31 2022-03-31 CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用 Active CN114713822B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210344531.7A CN114713822B (zh) 2022-03-31 2022-03-31 CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210344531.7A CN114713822B (zh) 2022-03-31 2022-03-31 CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114713822A CN114713822A (zh) 2022-07-08
CN114713822B true CN114713822B (zh) 2023-08-18

Family

ID=82241002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210344531.7A Active CN114713822B (zh) 2022-03-31 2022-03-31 CYPA偶联的Au@AgAu@CV@SiO2纳米探针及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114713822B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107219213A (zh) * 2017-08-01 2017-09-29 长沙理工大学 酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚a的方法
CN108279227A (zh) * 2018-02-05 2018-07-13 辽宁大学 一种新型表面增强拉曼光谱基底材料及其制备方法和应用
CN109128152A (zh) * 2018-09-29 2019-01-04 南京农业大学 一种高活性金星@金-银合金拉曼基底材料及其制备方法
KR20190034111A (ko) * 2017-09-22 2019-04-01 한양대학교 에리카산학협력단 이방성 이중금속 나노스타, 이의 나노클러스터 구조체, 제조방법 및 이의 응용
CN109900911A (zh) * 2019-03-11 2019-06-18 西安交通大学 一种运用核壳结构纳米星检测肝癌肿瘤标志物afp的方法
CN112730338A (zh) * 2020-12-22 2021-04-30 扬州大学 一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针及其SPR免疫检测的方法
CN113640240A (zh) * 2021-08-09 2021-11-12 江苏科技大学 一种基于金银纳米星刻蚀的智能手机紫外检测so2的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107219213A (zh) * 2017-08-01 2017-09-29 长沙理工大学 酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚a的方法
KR20190034111A (ko) * 2017-09-22 2019-04-01 한양대학교 에리카산학협력단 이방성 이중금속 나노스타, 이의 나노클러스터 구조체, 제조방법 및 이의 응용
CN108279227A (zh) * 2018-02-05 2018-07-13 辽宁大学 一种新型表面增强拉曼光谱基底材料及其制备方法和应用
CN109128152A (zh) * 2018-09-29 2019-01-04 南京农业大学 一种高活性金星@金-银合金拉曼基底材料及其制备方法
CN109900911A (zh) * 2019-03-11 2019-06-18 西安交通大学 一种运用核壳结构纳米星检测肝癌肿瘤标志物afp的方法
CN112730338A (zh) * 2020-12-22 2021-04-30 扬州大学 一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针及其SPR免疫检测的方法
CN113640240A (zh) * 2021-08-09 2021-11-12 江苏科技大学 一种基于金银纳米星刻蚀的智能手机紫外检测so2的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114713822A (zh) 2022-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tian et al. Highly sensitive detection of exosomes by SERS using gold nanostar@ Raman reporter@ nanoshell structures modified with a bivalent cholesterol-labeled DNA anchor
Cheng et al. SERS-based immunoassay using gold-patterned array chips for rapid and sensitive detection of dual cardiac biomarkers
Feng et al. Gold–platinum bimetallic nanoclusters with enhanced peroxidase-like activity and their integrated agarose hydrogel-based sensing platform for the colorimetric analysis of glucose levels in serum
Quyen et al. Self-focusing Au@ SiO 2 nanorods with rhodamine 6G as highly sensitive SERS substrate for carcinoembryonic antigen detection
Li et al. Alkyne-and nitrile-anchored gold nanoparticles for multiplex SERS imaging of biomarkers in cancer cells and tissues
Hu et al. SERS-based magnetic immunoassay for simultaneous detection of cTnI and H-FABP using core–shell nanotags
Lu et al. Rapid, quantitative and ultra-sensitive detection of cancer biomarker by a SERRS-based lateral flow immunoassay using bovine serum albumin coated Au nanorods
Zhao et al. A SERS-based immunoassay for the detection of α-fetoprotein using AuNS@ Ag@ SiO 2 core–shell nanostars
Zou et al. Rapid and simultaneous detection of heart-type fatty acid binding protein and cardiac troponin using a lateral flow assay based on metal organic framework@ CdTe nanoparticles
Tai et al. Gold nanoparticles based optical biosensors for cancer biomarker proteins: a review of the current practices
JP2023130343A (ja) 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅
Hu et al. SERS-based immunoassay using core–shell nanotags and magnetic separation for rapid and sensitive detection of cTnI
CN104977277B (zh) 一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡
CN109239046B (zh) 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法
Emami et al. Comparison of gold nanoparticle conjugated secondary antibody with non-gold secondary antibody in an ELISA kit model
CN109085158B (zh) 一种用于癌细胞及h2o2检测的纸基传感器的构建
Lu et al. Detection of squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer by surface-enhanced Raman scattering-based immunoassay
CN110455769A (zh) 壳为内标的核壳纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析方法
CN110530839A (zh) 一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用
CN112986211A (zh) 一种可靶向触发和自校准的适配体sers传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法
Peng et al. SERS-based sandwich bioassay protocol of miRNA-21 using Au@ Ag core–shell nanoparticles and a Ag/TiO 2 nanowires substrate
Zheng et al. Silver nanoparticles/activated carbon composite as a facile SERS substrate for highly sensitive detection of endogenous formaldehyde in human urine by catalytic reaction
CN108580919B (zh) 银核介孔金纳米结构材料的制备方法、表面增强拉曼检测探针及其应用
CN107817340A (zh) 一种sers技术检测多药耐药蛋白的试剂盒及其应用
Lai et al. Ultrasensitive detection of SARS‐CoV‐2 antigen using surface‐enhanced Raman spectroscopy‐based lateral flow immunosensor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant