JP2023130343A - 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その内容が、参照によって全体的に本明細書に組み込まれる、2015年8月4日出願の米国仮特許出願第62/201,051号の優先権の利益を主張する。
本発明は、試料中の標的分析物を検出するためのシステムおよび方法に関する。特に、本発明は、試料中の微量の標的分析物を検出することができる、局在プラズモン共鳴ベースの分析物検出システムを提供する。
現在のイムノアッセイおよび生体分子結合アッセイでは、典型的に、アッセイを実行するために、複数のステップおよび精巧な装置が必要とされる。そのような不均一アッセイを実行することに関与する感度の欠如および複雑性は、標識化されていない特異的結合パートナーから標識化されたものを分離するための特定のニーズから生じる。
[本発明1001]
(a)試料を第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートと混合する工程であって、第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートは、結合パートナーに連結された複合金属ナノ構造を含み、該結合パートナーは、試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合し、第1の検出コンジュゲートと、該分析物と、第2の検出コンジュゲートとの間での複合体の形成が可能である、工程;
(b)該複合体を、紫外-可視-赤外スペクトル内の波長範囲の光源に曝露する工程;ならびに
(c)該複合体からの光学シグナルを測定する工程であって、光学シグナルの変化が試料中の標的分析物の存在を示す、工程
を含む、試料中の標的分析物の検出方法。
[本発明1002]
光学シグナルが、反射率、吸光度スペクトル、散乱スペクトルまたは発光スペクトルである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
光学シグナルの変化が、スペクトルピーク波長シフトおよび/または全スペクトル波長シフトを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
全スペクトル波長シフトが差スペクトルである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
標的分析物のナノグラム量の存在が検出される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
標的分析物のピコグラム量の存在が検出される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
標的分析物のフェムトグラム量の存在が検出される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
工程(a)が、分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレート、臨床分析器、フローチャンバー、光ファイバーの先端上または透明ゲルにおいて実行される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
複合金属ナノ構造が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケルおよび亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
複合金属ナノ構造のそれぞれが、第1の金属のコアおよび第2の金属のコーティングを含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
複合金属ナノ構造のそれぞれが、金コーティングおよび銀コアを含む、本発明1009の方法。
[本発明1012]
複合金属ナノ構造のそれぞれが、銀コーティングおよび金コアを含む、本発明1009の方法。
[本発明1013]
複合金属ナノ構造のそれぞれが、第1の金属および第2の金属の合金である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
複合金属ナノ構造が、球形ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノスター、ナノシェル、ナノロッド、ナノアイランド、ナノドット、ナノワイヤーまたはそれらの組合せから選択される幾何構造を有する、本発明1001の方法。
[本発明1015]
結合パートナーが生体高分子である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
生体高分子が、抗体またはその断片、抗原、レセプター、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、グリコペプチド、リポタンパク質または核タンパク質を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
生体高分子が抗体である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
生体高分子が抗原である、本発明1016の方法。
[本発明1019]
第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートが、抗体である結合パートナーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記抗体が、標的分析物の異なるエピトープに結合する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
標的分析物が、タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸、ホルモン、糖タンパク質、ポリサッカライド、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、薬物分子、ハプテンおよび化学物質から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1022]
標的分析物が、病原性抗原、または病原性抗原に対する抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
病原性抗原がウイルス性抗原である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
ウイルス性抗原が、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIVウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよび狂犬病ウイルスから選択されるウイルスに由来する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
病原性抗原が細菌性抗原である、本発明1022の方法。
[本発明1026]
細菌性抗原が、エーリキア(Ehrlichia)、ボレリア(Borrelia)、アナプラズマ(Anaplasma)、サルモネラ(Salmonella)、バチルス(Bacillus)およびリケッチア(Rickettsia)から選択される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
細菌性抗原が、エーリキア・カニス(Ehrlichia canis)、エーリキア・シャフェンシス(Ehrlichia chafeensis)、エーリキア・エウィンギイ(Ehrlichia ewingii)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、アナプラズマ・プラティス(Anaplasma platys)、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Anaplasma phagocytophilum)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)およびリケッチア・リケッチイ(Rickettsia rickettsii)から選択される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
病原性抗原が真菌性抗原または寄生虫性抗原である、本発明1022の方法。
[本発明1029]
真菌性抗原または寄生虫性抗原が、イヌ糸状虫、ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)、熱帯熱マラリア原虫、アフリカトリパノソーマ症、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)から選択される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
工程(a)の混合が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコールおよびポリアスパラギン酸から選択されるポリマー材料の存在下で実行される、本発明1001の方法。
[本発明1031]
ポリマー材料がポリエチレングリコールである、本発明1030の方法。
[本発明1032]
工程(a)の混合が、ポリサッカライドの存在下で実行される、本発明1001の方法。
[本発明1033]
ポリサッカライドが、マルトデキストリン、コーンシロップおよびポリグルコースから選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
ポリサッカライドがマルトデキストリンである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
反応混合物中のマルトデキストリンの最終濃度が約2%~約20%重量/体積である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
反応混合物中のマルトデキストリンの最終濃度が約5%~約10%重量/体積である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
工程(a)の混合がブロッキング剤の存在下で実行される、本発明1001の方法。
[本発明1038]
ブロッキング剤が、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンおよびガンマ-グロブリンから選択される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
ブロッキング剤がウシ血清アルブミンである、本発明1038の方法。
[本発明1040]
反応混合物中のウシ血清アルブミンの最終濃度が約1%~約5%重量/体積である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合可能な結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第1の検出コンジュゲートと;
試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合可能な結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第2の検出コンジュゲートと
を含む、分析物検出デバイスであって、
第1の検出コンジュゲートおよび/または第2の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造が、複合金属ナノ構造である、
分析物検出デバイス。
[本発明1042]
分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレートまたはフローチャンバーである、本発明1041の分析物検出デバイス。
[本発明1043]
分析用ローターである、本発明1042の分析物検出デバイス。
[本発明1044]
分析用ローターが、1つまたはそれ以上の反応チャンバーを含み、該反応チャンバーに、第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートが配置される、本発明1043の分析物検出デバイス。
[本発明1045]
第1の検出コンジュゲートおよび/または第2の検出コンジュゲートが凍結乾燥されている、本発明1041の分析物検出デバイス。
[本発明1046]
試験試料を受容するように構成されている、本発明1041の分析物検出デバイス。
[本発明1047]
第1の検出コンジュゲートと、前記分析物と、第2の検出コンジュゲートとの複合体を、紫外-可視-赤外スペクトル内の波長範囲において光源に曝露するように構成されている、本発明1041の分析物検出デバイス。
[本発明1048]
前記デバイスが、前記複合体からの光学シグナルを測定するようにさらに構成されており、光学シグナルの変化が、前記試料中の標的分析物の存在を示す、本発明1047の分析物検出デバイス。
本発明は、複合金属ナノ構造標識結合パートナーによって、LSPRベースのアッセイにおける有意な増幅が達成可能であるという発見に、部分的に基づく。したがって、本発明は、生体分子に連結された複合金属ナノ構造を含む複数の検出コンジュゲートを利用する、分析物検出方法を提供する。
本実施例において、ブランク反応は、抗糸状虫ポリクローナル抗体のコロイドコンジュゲートを含有する溶液、リン酸緩衝塩水などの適切な分散媒体および糸状虫抗原を欠く試料を添加することによって構成される。スペクトル変化を一定期間にわたって記録する。次いで、陽性対照の組は、上記ブランク溶液で使用される反応溶液に既知量の糸状虫抗原を添加することによって構成される。あるいは、ブランク反応を記録し、次いで、既知量の糸状虫抗原を添加して、スペクトル走査におけるシフトを抗原の濃度と関連づける較正曲線を調製する。次いで、この較正曲線を使用して、未知試料中の糸状虫抗原の量を計算する。スペクトル走査におけるシフトとは、(i)λmaxにおける変化、(2)陽性および陰性試料間の差スペクトル、または(3)微分スペクトルを意味する。
サンドウィッチアッセイは、分析物が、特異的結合パートナーにそれぞれの部位が結合する、少なくとも2つの別個の結合部位(抗原のエピトープ)を示す場合に、最も適切である。したがって、本実施例において、CRPの1つのエピトープに対する抗体が、金および/または銀ナノ粒子上に固定され、非オーバーラップエピトープに対する第2の抗体が、コロイド金および/または銀で標識化される。試料中のCRP抗原の量がスペクトル変化の範囲を決定するため、この構成によってCRP抗原の測定が可能となる。第2の抗体が標識化されないが、スペクトル変化が数桁低い場合も、スペクトル変化が観察される。ナノ粒子の金属組成は、反応条件を最適化するように変化されてもよい。
直接競合アッセイまたはサンドウィッチアッセイは、米国特許第5,061,381号明細書、同第5,122,284号明細書、同第5,186,844号明細書、同第5,304,348号明細書、同第5,457,053号明細書および同第5,693,233号明細書に記載されるローターなどの遠心ローター中で実行されてもよい。この場合、対となる2つのモノクローナル抗体または2つ以上のエピトープに結合するポリクローナル抗体混合物のナノ粒子コンジュゲートは、凍結乾燥されたビーズとして添加される。溶液相LSPRアッセイは、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方で機能する。
図4および図9A~9Cに表されたデータは、LSPRシグナルが、ポリエチレングリコールの存在下で実質的に増加することを示す。異なる分子量を有するPEGは、所与のアッセイにおいて所望の選択性を得るために、最適化された濃度で使用されてよい。所与のナノ粒子の組合せおよび/または特異的結合パートナーの組合せに関して最適化された反応条件を得るために、PEGは、ポリビニルピロリドンまたは類似ポリマー材料で置換されてよい。
沈降作用を最小化し、LSPRシグナルを維持する種々の糖および他の薬剤の影響を決定するために、複数の実験を実行した。図16に示されるように、マルトデキストリンは驚くべきことにシグナルを上昇させ、これはBSAの存在によってさらに改善された。対照的に、トレハロース、ソルビトールまたはシクロデキストリンが添加された場合、LSPRシグナルの強度はそれほど強くはなかった(データは示していない)。加えて、マルトデキストリンおよびBSAの添加によって、沈降の問題も解決された(図17)。約50pg/mlのTSHが、特定の量のPEG、BSAおよびマルトデキストリンを用いて検出可能であった(図18)。
本明細書に記載の溶液相プラズモンアッセイなどのプラズモンアッセイで使用するためのナノ材料を合成するために、新規方法が利用された。
Claims (48)
- (a)試料を第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートと混合する工程であって、第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートは、結合パートナーに連結された複合金属ナノ構造を含み、該結合パートナーは、試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合し、第1の検出コンジュゲートと、該分析物と、第2の検出コンジュゲートとの間での複合体の形成が可能である、工程;
(b)該複合体を、紫外-可視-赤外スペクトル内の波長範囲の光源に曝露する工程;ならびに
(c)該複合体からの光学シグナルを測定する工程であって、光学シグナルの変化が試料中の標的分析物の存在を示す、工程
を含む、試料中の標的分析物の検出方法。 - 光学シグナルが、反射率、吸光度スペクトル、散乱スペクトルまたは発光スペクトルである、請求項1に記載の方法。
- 光学シグナルの変化が、スペクトルピーク波長シフトおよび/または全スペクトル波長シフトを含む、請求項1に記載の方法。
- 全スペクトル波長シフトが差スペクトルである、請求項3に記載の方法。
- 標的分析物のナノグラム量の存在が検出される、請求項1に記載の方法。
- 標的分析物のピコグラム量の存在が検出される、請求項1に記載の方法。
- 標的分析物のフェムトグラム量の存在が検出される、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)が、分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレート、臨床分析器、フローチャンバー、光ファイバーの先端上または透明ゲルにおいて実行される、請求項1に記載の方法。
- 複合金属ナノ構造が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケルおよび亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、請求項1に記載の方法。
- 複合金属ナノ構造のそれぞれが、第1の金属のコアおよび第2の金属のコーティングを含む、請求項1に記載の方法。
- 複合金属ナノ構造のそれぞれが、金コーティングおよび銀コアを含む、請求項9に記載の方法。
- 複合金属ナノ構造のそれぞれが、銀コーティングおよび金コアを含む、請求項9に記載の方法。
- 複合金属ナノ構造のそれぞれが、第1の金属および第2の金属の合金である、請求項1に記載の方法。
- 複合金属ナノ構造が、球形ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノスター、ナノシェル、ナノロッド、ナノアイランド、ナノドット、ナノワイヤーまたはそれらの組合せから選択される幾何構造を有する、請求項1に記載の方法。
- 結合パートナーが生体高分子である、請求項1に記載の方法。
- 生体高分子が、抗体またはその断片、抗原、レセプター、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、グリコペプチド、リポタンパク質または核タンパク質を含む、請求項15に記載の方法。
- 生体高分子が抗体である、請求項16に記載の方法。
- 生体高分子が抗原である、請求項16に記載の方法。
- 第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートが、抗体である結合パートナーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体が、標的分析物の異なるエピトープに結合する、請求項19に記載の方法。
- 標的分析物が、タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸、ホルモン、糖タンパク質、ポリサッカライド、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、薬物分子、ハプテンおよび化学物質から選択される、請求項1に記載の方法。
- 標的分析物が、病原性抗原、または病原性抗原に対する抗体である、請求項1に記載の方法。
- 病原性抗原がウイルス性抗原である、請求項22に記載の方法。
- ウイルス性抗原が、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIVウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよび狂犬病ウイルスから選択されるウイルスに由来する、請求項23に記載の方法。
- 病原性抗原が細菌性抗原である、請求項22に記載の方法。
- 細菌性抗原が、エーリキア(Ehrlichia)、ボレリア(Borrelia)、アナプラズマ(Anaplasma)、サルモネラ(Salmonella)、バチルス(Bacillus)およびリケッチア(Rickettsia)から選択される、請求項25に記載の方法。
- 細菌性抗原が、エーリキア・カニス(Ehrlichia canis)、エーリキア・シャフェンシス(Ehrlichia chafeensis)、エーリキア・エウィンギイ(Ehrlichia ewingii)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、アナプラズマ・プラティス(Anaplasma platys)、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Anaplasma phagocytophilum)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)およびリケッチア・リケッチイ(Rickettsia rickettsii)から選択される、請求項26に記載の方法。
- 病原性抗原が真菌性抗原または寄生虫性抗原である、請求項22に記載の方法。
- 真菌性抗原または寄生虫性抗原が、イヌ糸状虫、ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)、熱帯熱マラリア原虫、アフリカトリパノソーマ症、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)から選択される、請求項28に記載の方法。
- 工程(a)の混合が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコールおよびポリアスパラギン酸から選択されるポリマー材料の存在下で実行される、請求項1に記載の方法。
- ポリマー材料がポリエチレングリコールである、請求項30に記載の方法。
- 工程(a)の混合が、ポリサッカライドの存在下で実行される、請求項1に記載の方法。
- ポリサッカライドが、マルトデキストリン、コーンシロップおよびポリグルコースから選択される、請求項32に記載の方法。
- ポリサッカライドがマルトデキストリンである、請求項33に記載の方法。
- 反応混合物中のマルトデキストリンの最終濃度が約2%~約20%重量/体積である、請求項34に記載の方法。
- 反応混合物中のマルトデキストリンの最終濃度が約5%~約10%重量/体積である、請求項35に記載の方法。
- 工程(a)の混合がブロッキング剤の存在下で実行される、請求項1に記載の方法。
- ブロッキング剤が、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンおよびガンマ-グロブリンから選択される、請求項37に記載の方法。
- ブロッキング剤がウシ血清アルブミンである、請求項38に記載の方法。
- 反応混合物中のウシ血清アルブミンの最終濃度が約1%~約5%重量/体積である、請求項39に記載の方法。
- 試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合可能な結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第1の検出コンジュゲートと;
試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合可能な結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第2の検出コンジュゲートと
を含む、分析物検出デバイスであって、
第1の検出コンジュゲートおよび/または第2の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造が、複合金属ナノ構造である、
分析物検出デバイス。 - 分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレートまたはフローチャンバーである、請求項41に記載の分析物検出デバイス。
- 分析用ローターである、請求項42に記載の分析物検出デバイス。
- 分析用ローターが、1つまたはそれ以上の反応チャンバーを含み、該反応チャンバーに、第1の検出コンジュゲートおよび第2の検出コンジュゲートが配置される、請求項43に記載の分析物検出デバイス。
- 第1の検出コンジュゲートおよび/または第2の検出コンジュゲートが凍結乾燥されている、請求項41に記載の分析物検出デバイス。
- 試験試料を受容するように構成されている、請求項41に記載の分析物検出デバイス。
- 第1の検出コンジュゲートと、前記分析物と、第2の検出コンジュゲートとの複合体を、紫外-可視-赤外スペクトル内の波長範囲において光源に曝露するように構成されている、請求項41に記載の分析物検出デバイス。
- 前記デバイスが、前記複合体からの光学シグナルを測定するようにさらに構成されており、光学シグナルの変化が、前記試料中の標的分析物の存在を示す、請求項47に記載の分析物検出デバイス。
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