ES2636908T3 - Conjugados de nanopartícula-anticuerpo y procedimientos para producir y usar dichos conjugados - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar una molécula diana en una muestra, que comprende: poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo que se une a la molécula diana; poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o más moléculas de enzima, en el que las moléculas de enzima son capaces de producir al menos un producto capaz de reducir los iones metálicos a metal en un estado de oxidación cero y en el que el segundo anticuerpo se une específicamente al primer anticuerpo; poner en contacto la muestra con un tercer anticuerpo, en el que el tercer anticuerpo es un conjugado de anticuerponanopartícula que comprende dos o más nanopartículas unidas directamente a un anticuerpo a través de un enlace metal-tiol y se une específicamente al segundo anticuerpo; poner en contacto la muestra con un sustrato de las moléculas de enzima y un ion metálico, de manera que se forme un precipitado de metal y se colocalice con la molécula diana; y detectar el precipitado de metal, detectando de este modo la molécula diana.
Description
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DESCRIPCION
Conjugados de nanopartfcula-anticuerpo y procedimientos para producir y usar dichos conjugados Campo
La presente divulgacion se refiere a conjugados de nanopartfcula-anticuerpo, a procedimientos para producir dichos conjugados y a procedimientos para su uso, en particular, en la deteccion de moleculas diana, por ejemplo, usando procedimientos de inmunohistoquimica o hibridacion in situ.
Antecedentes
La inmunohistoquimica (IHC) emplea agentes de union especificos, tales como anticuerpos, para detectar un antigeno de interes que pueda estar presente en una muestra de tejido. La IHC se utiliza ampliamente en aplicaciones clinicas y de diagnostico, por ejemplo, para el diagnostico de enfermedades o trastornos particulares. Por ejemplo, determinados tipos de cancer se pueden diagnosticar basandose en la presencia de una molecula marcadora particular en una muestra obtenida de un sujeto. La IHC tambien se usa ampliamente en investigacion basica para conocer la distribucion y localizacion de biomarcadores en diferentes secciones de tejido.
Las muestras biologicas tambien pueden analizarse usando tecnicas de hibridacion in situ (ISH), por ejemplo, hibridacion in situ con plata (SISH), hibridacion in situ cromogenica (CISH) e hibridacion in situ fluorescente (FISH), en conjunto denominadas ISH. La ISH se diferencia de la IHC en que la ISH detecta acidos nucleicos en secciones de tejido, mientras que la IHC detecta proteinas.
Los sistemas de deteccion con plata actuales se basan en la tecnologia de la peroxidasa de rabano picante (HRP). Para aplicaciones de tincion SISH, las sondas de acidos nucleicos marcadas con haptenos estan dirigidas a secuencias especificas de ADN en los nucleos de tejido. El complejo sonda-diana se visualiza como una senal oscura en el tejido usando un anticuerpo primario anti-hapteno y un anticuerpo secundario conjugado con HRP que actua como enzima cromogenica. La reaccion de visualizacion esta dirigida por la adicion secuencial de acetato de plata, hidroquinona y peroxido de hidrogeno, en la que la HRP cataliza la reduccion del peroxido de hidrogeno, con la posterior oxidacion de la hidroquinona. Aunque no se comprende totalmente, se planteado la hipotesis de que, en este proceso enzimatico redox, algunos electrones pasan a los iones de plata que, a continuacion, se reducen a plata metalica. Los atomos de plata precipitan en las proximidades de la enzima, formando grandes depositos que se pueden visualizar como un punto negro, que senala la presencia de la molecula diana.
En el documento US 5.360.895 se divulgan conjugados de anticuerpo-oro coloidal o fragmento de anticuerpo-oro coloidal. Los conjugados de anticuerpo-oro coloidal se usan en ensayos de deteccion de antigeno con contraste de plata, en los que el anticuerpo funciona como anticuerpo primario o como anticuerpo secundario.
En el documento WO 03/075961 se divulgan nanoparticulas metalicas y su uso como medios de contraste para detectar signos coronarios y otros rasgos vasculares. Los anticuerpos como parte de estos conjugados de nanoparticulas se divulgan como restos diana para dirigir la particula a un objetivo especifico despues de la inyeccion in vivo o para la deteccion de IgG de raton sobre transferencias de nitrocelulosa con conjugados de nanoparticulas de oro de Fab' de cabra anti-IgG de raton.
Lim et al. (Nanotechnology (2008), 19(30): 305102) se refieren a la investigacion de la funcionalizacion de la superficie de nanoparticulas de oro y magneticas recubiertas con cubiertas de oro mediante proteinas y marcadores espectroscopicos para la creacion de nanosondas para su uso en ensayos de dispersion de Raman de superficie mejorada. Los conjugados de anticuerpo-nanoparticula se divulgan como medios para la separacion de proteinas en un campo magnetico.
El documento WO 2004/002508 divulga procedimientos para formar matrices de nanoparticulas de metal, aleacion, semiconductor o magneticas, en las que, en un modo de realizacion, un armazon que comprende polinucleotidos y/o polipeptidos se coloca sobre un sustrato y las nanoparticulas se acoplan al armazon. Los anticuerpos se utilizan solamente para acoplar las nanoparticulas de una manera no covalente al armazon.
El documento EP 1 741 717 divulga nanoestructuras metalicas, especialmente nanoestructuras metalicas no esfericas con una estabilidad de forma mejorada, y procedimientos para preparar estas nanoestructuras metalicas. Tambien se divulgan nanoestructuras metalicas unidas a biomoleculas, tales como fragmentos de anticuerpos, para dirigirlas a celulas cancerosas. Tambien se divulga el uso de anticuerpos secundarios conjugados con nanoestructuras en un ensayo ELISA de tipo sandwich.
En el documento US 2007/269594 se divulgan procedimientos para preparar nanoparticulas de oro pasivadas con tiolato. En un modo de realizacion del procedimiento, las nanoparticulas de oro se unen a proteinas a traves de fragmentos scFv.
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En el documento WO 02/07846 se divulgan procedimientos para la obtencion in vivo de imageries de tejidos de un individuo por resonancia magnetica utilizando un complejo de cobalto extendido como medio de potenciacion de contraste. Tambien se divulgan anticuerpos acoplados a estos complejos para administrar el complejo, es decir, el medio de contraste, a una diana in vivo antes de la prueba de imagen.
Yang et al. (Biosens Bioelectric (2009), 24(8): 2707-2711) divulgan un inmunoensayo de quimioluminiscencia con contraste para la deteccion de D-fetoproteina. La deteccion se realiza en un formato de tipo sandwich, en el que el antigeno de la muestra es capturado primero por un anticuerpo primario inmovilizado sobre la superficie de perlas magneticas y, despues, es reconocido por un segundo anticuerpo marcado con nanoparticulas de oro con doble codificacion.
En el documento US 2004/0265922 se describe un ensayo de inmunohistoquimica, en el que se detecta una diana, CD20, utilizando un anticuerpo primario anti-CD20, un anticuerpo secundario biotinilado que se une al anticuerpo primario y un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (SA-AP). En presencia de AuC13 tamponado, fosfato de acido ascorbico y acetato de plata, la fosfatasa alcalina desfosforila el fosfato de ascorbato, dando como resultado la produccion del agente reductor ascorbato, que luego reduce los iones de oro a oro metalico. El oro metalico sirve como el sitio de nucleacion para la amplificacion adicional de la senal mediante la reduccion de los iones de plata a plata metalica que se deposita como precipitado detectable en el sitio diana.
Qu et al. (Talanta (2008), 76(4): 785-790) divulgan la deteccion de antigeno prostatico especifico (PSA) en suero humano con un sensor inmunologico electroquimico usando nanoparticulas de silice funcionalizada como trazador proteico. En particular, el PSA se detecta en un inmunoensayo de tipo sandwich heterogeneo, en el que un anticuerpo de captura de PSA, que esta inmovilizado en el electrodo de oro mediante reticulacion de glutaraldehido, captura el antigeno del suero humano y el complejo anticuerpo/antigeno se une por nanoparticulas de silice comarcadas con un anticuerpo de deteccion y fosfatasa alcalina. Dirigidos por la fosfatasa alcalina, los iones de plata son reducidos por el acido ascorbico y la plata metalica se deposita en la superficie del electrodo.
Cao et al. (Biosens Bioelectron (2008), 22: 1874-1880) divulgan la deteccion de anticuerpos anti-GAD con un biosensor de resonancia de plasmon superficial (SPR) usando un complejo de enzima-inmuno-oro. El complejo comprende nanoparticulas de oro coloidal (AuNP), peroxidasa de rabano picante (HRP) y anticuerpos anti-IgG. Segun Cao et al., la oxidacion biocatalizada por HRP de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) en presencia de H2O2conduce a la precipitacion de un producto insoluble que mejora la senal obtenida a partir del biosensor de resonancia de plasmon superficial (SPR).
En el documento US 2008/0318249 se divulga la deteccion de diversas moleculas diana en celulas cultivadas y en transferencias, usando un anticuerpo primario especifico de la diana, un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rabano picante (HRP) combinado de nanoparticulas de oro y tiramidas fluorescentes. Las nanoparticulas de oro se localizan mediante microscopia electronica, mientras que el procesamiento dirigido por HRP con tiramidas fluorescentes da lugar a la deposicion de productos de reaccion fluorescentes que posteriormente se visualizan y se localizan mediante microscopia de fluorescencia.
Powell et al. (Human Pathol (2007), 38: 1145-1159) analizan varios procedimientos de autometalografia, es decir, potenciacion de la deposicion de plata u oro catalizada por nanoparticulas de oro en aplicaciones de histopatologia. Los procedimientos descritos en Powell et al. requieren una etapa adicional de amplificacion con tiramida para aumentar el numero de sitios de union del conjugado de estreptavidina-nanoparticula de oro en el sitio diana. Tambien se divulga en Powell et al. el clasico procedimiento de deposicion de plata SISH con HRP (denominado "nuevo procedimiento EnzMet").
Sumario
Los sistemas actuales de deteccion por SISH con HRP tienen varias desventajas, como la tincion inconsistente, la siembra no especifica y la necesidad de un tampon de pH bajo que puede proporcionar un entorno de medios propicio para el crecimiento de hongos. En el presente documento se divulga un novedoso sistema de deteccion con plata sin HRP para la deteccion de moleculas diana (incluyendo, pero sin limitaciones, IHC o ISH). Los procedimientos utilizan un conjugado de anticuerpo-nanoparticula y un conjugado de anticuerpo-enzima que estimulan la reduccion del metal cuando se utilizan con un sustrato apropiado. Sin desear quedar ligado a teoria alguna, se cree que la nanoparticula proporciona un sitio de nucleacion para la deposicion de metal adyacente a la molecula diana. Este procedimiento proporciona sensibilidad y especificidad mejores para la deteccion de proteinas o moleculas de acidos nucleicos diana. La presente divulgacion tambien proporciona nuevos conjugados de anticuerpo-nanoparticula que pueden utilizarse en los procedimientos descritos y en procedimientos de preparacion de dichos conjugados descritos.
Los conjugados de anticuerpo-nanoparticula divulgados en el presente documento incluyen dos o mas nanoparticulas (tales como, oro, paladio, platino, plata, cobre, niquel, cobalto, iridio o una aleacion de dos o mas de los mismos) directamente unidas a un anticuerpo o fragmento del mismo a traves de un enlace de metal-tiol. En ejemplos particulares, la nanoparticula metalica se conjuga con un residuo de cisteina del anticuerpo. En algunos ejemplos, el conjugado incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas nanoparticulas unidas directamente a un anticuerpo. En ejemplos adicionales, las nanoparticulas tienen un diametro de aproximadamente 200 nm o menos (por ejemplo, de
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aproximadamente 0,5 a 200 nm, de aproximadamente 1 nm a 100 nm, de aproximadamente 0,5 nm a 50 nm). En ejemplos particulares, el diametro de las nanoparticulas es menor de aproximadamente 5 nm, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 nm a 5 nm.
Entre los procedimientos de preparacion de los conjugados de anticuerpo-nanoparticula descritos en el presente documento se incluyen la reaccion de una nanoparticula hidrosoluble protegida con arilfosfina complejada con un anticuerpo reducido, para producir un conjugado de anticuerpo-nanoparticula. En algunos ejemplos, la nanoparticula es oro, paladio, platino, plata, cobre, niquel, cobalto, iridio o una aleacion de dos o mas de los mismos (por ejemplo, una nanoparticula de oro o una nanoparticula aleacion de oro-paladio). El material compuesto de arilfosfina-nanoparticula puede incluir una arilfosfina sulfonatada (por ejemplo, una arilfosfina monosulfonatada, bisulfonatada o trisulfonatada, por ejemplo, bis-(sulfonatofenil)fenilfosfina). En algunos ejemplos, el anticuerpo reducido se forma mediante la reaccion de un anticuerpo o fragmento del mismo con un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol) para producir el anticuerpo reducido. En ejemplos particulares, la estequiometria del reactante y/o la duracion de la reaccion se modifican para acoplar dos o mas nanoparticulas (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas nanoparticulas) al anticuerpo reducido. Por ejemplo, la relacion del complejo de arilfosfina-nanoparticula con el anticuerpo reducido se incrementa para aumentar el numero de nanoparticulas unidas al anticuerpo.
En el presente documento tambien se divulgan procedimientos para detectar una molecula diana en una muestra, que incluyen el uso de un conjugado de anticuerpo-nanoparticula (tales como los conjugados de anticuerpo-nanoparticula descritos en el presente documento). En algunos modos de realizacion, el procedimiento incluye poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo que se une a una molecula diana (por ejemplo, una proteina diana o una sonda marcada con hapteno unida a una molecula de acido nucleico); poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que el segundo anticuerpo se une especificamente al primer anticuerpo; poner en contacto la muestra con un tercer anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas, en el que el tercer anticuerpo se une especificamente al segundo anticuerpo; poner en contacto la muestra con un sustrato de la enzima y un ion metalico, de tal manera que se forma un precipitado de metal y se colocaliza con la molecula diana; y detectar el precipitado de metal, detectando de este modo la molecula diana. En realizaciones adicionales, el procedimiento incluye poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que el primer anticuerpo se une a una molecula diana (por ejemplo, una proteina diana o sonda marcada con hapteno unida a una molecula de acido nucleico);
poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o mas
nanoparticulas, en el que el segundo anticuerpo se une especificamente al primer anticuerpo; poner en contacto la muestra con un sustrato de la enzima y un ion metalico, de tal manera que se forma un precipitado de metal y se localiza con la molecula diana; y detectar el precipitado de metal, detectando de este modo la molecula diana.
En algunos modos de realizacion, el conjugado de anticuerpo-nanoparticula incluye una o mas nanoparticulas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas nanoparticulas), en el que la una o mas nanoparticulas incluyen oro, paladio, platino, plata, cobre, niquel, cobalto, iridio, o una aleacion de dos o mas de los mismos. En algunos ejemplos, los procedimientos incluyen los conjugados de anticuerpo-nanoparticula particulares divulgados en el presente documento. En algunos ejemplos, el anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o mas moleculas de enzima) incluye una o mas moleculas de fosfatasa alcalina (AP), Q-galactosidasa, Q-lactamasa, glucosidasa o esterasa. En un ejemplo particular, la molecula de enzima es fosfatasa alcalina y el sustrato de la enzima puede ser fosfato de 5-bromo-3-cloro-4-indolilo, fosfato de acido ascorbico o un fosfato de hidroquinona. En algunos ejemplos, el ion metalico incluye oro, plata, cobre, niquel, platino, paladio, cobalto o iridio.
En algunos modos de realizacion, el procedimiento de deteccion de una molecula diana incluye ademas una etapa de acondicionado con oro, por ejemplo, poner en contacto la muestra con una sal de haluro de oro (por ejemplo, cloruro de oro). En realizaciones adicionales, el procedimiento puede incluir, ademas, una etapa de amplificacion, por ejemplo, poner en contacto la muestra con una sal de plata (por ejemplo, nitrato de plata, oxido de plata, o cloruro de plata). En otros modos de realizacion adicionales mas, el procedimiento tambien incluye una etapa de fijacion, que incluye poner en contacto la muestra con un agente reductor (por ejemplo, tiosulfato de sodio).
Tambien se divulgan kits para la deteccion de moleculas diana utilizando los procedimientos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, el kit puede incluir uno o mas conjugados de anticuerpo-nanoparticula (tales como un conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro), tales como los conjugados de anticuerpo-nanoparticula divulgados en el presente documento. En algunos ejemplos, el kit tambien puede incluir uno o mas anticuerpos acoplados a una o mas moleculas de enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, por ejemplo, 1 a 5 moleculas de fosfatasa alcalina). En ejemplos adicionales, el kit tambien puede incluir uno o mas recipientes que incluyen un sustrato para la enzima conjugada con el anticuerpo y uno o mas iones metalicos (por ejemplo, iones de oro, plata, cobre, niquel, platino, paladio, cobalto o iridio ). El kit puede incluir, opcionalmente, reactivos para etapas adicionales, tales como el acondicionado con oro, amplificacion con plata o fijacion.
Las anteriores y otras caracteristicas de la divulgacion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
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La FIG. 1A es un esquema que muestra un procedimiento de ejemplo de inmunohistoqufmica que utiliza un conjugado de anticuerpo-nanoparticula y los procedimientos divulgados en el presente documento.
La FIG. 1B es un esquema que muestra un procedimiento de ejemplo de hibridacion in situ que utiliza un conjugado de anticuerpo-nanoparticula y los procedimientos divulgados en el presente documento.
La FIG. 2A es una cromatografia de exclusion por tamano de la purificacion de un conjugado de nanoparticula de oro (AuNP)-anticuerpo a partir de los materiales de partida.
La FIG. 2B es un grafico de la absorcion UV-Vis del conjugado de AuNP-anticuerpo purificado mostrado en la figura 2A.
La FIG. 3A es una imagen digital de una electroforesis nativa en gel de poliacrilamida Novex con Bis-Tris al 4-16 % utilizado para evaluar los conjugados de AP-anticuerpo sintetizados con diferentes excesos molares de ester NHS de MAL-dPEG™12; Calle 1: AP; calle 2: anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo; calle 3: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (procedimiento anterior); calle 4: marcadores del peso molecular; calle 5: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 100X MAL, lote 1; calle 6: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP(1:3) 50X MAL; calle 7: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:2) 100X MAL; calle 8: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 100X MAL, lote 2; calle 9: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 200X MAL.
La FIG. 3B es una imagen digital de un gel reductor NuPAGE Novex de poliacrilamida con gel de SDS Tris-Acetato al 3-8 % utilizado para evaluar los conjugados de AP-anticuerpo sintetizados con diferentes excesos molares de ester NHS de MAL-dPEG™12. Calle 1: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 400X MAL; calle 2: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 200X MAL; calle 3: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 100X MAL, lote 2; calle 4: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:2) 100X MAL; calle 5: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 50X MAL; calle 6: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (1:3) 100X MAL conc.; calle 7: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP (recombinante) (1:3); calle 8: conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-AP; calle 9: marcadores de peso molecular.
La FIG. 4 es una serie de imagenes digitales de ISH de xenoinjertos de lineas celulares de tumor de mama (celulas BT- 474 y MCF7) usando una sonda del cromosoma 17. La sonda se detecto mediante SISH con HRP estandar (paneles superiores) o el procedimiento de deteccion con plata-AP divulgado usando el conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro (paneles inferiores).
La FIG. 5 es una serie de imagenes digitales de ISH de tejido de carcinoma de mama con una sonda de cromosoma 17 (izquierda) y una sonda de HER2 (derecha). Las sondas se detectaron mediante SISH con HRP estandar (paneles superiores) o el procedimiento de deteccion con plata-AP divulgado usando el conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro (paneles inferiores).
La FIG. 6 es un par de imagenes digitales de ISH de xenoinjertos de la linea celular Calu usando una ribosonda de HER2 y se detectaron con el procedimiento de deteccion con plata-AP sin el conjugado de AuNP-Ab (izquierda) o con el conjugado de AuNP-Ab (derecha).
Las FIG. 7A y B son un par de graficos que muestran el recuento de copias del cromosoma 17 de dos lectores independientes utilizando el procedimiento "cowboy en una serie de muestras de tejido de cancer de mama. La sonda del cromosoma 17 se detecto usando SISH con hRp o el procedimiento de deteccion con plata-AP divulgado usando un conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro.
Las FIG. 8A y B son un par de graficos que muestran el recuento de copias de HER2 de dos lectores independientes utilizando el procedimiento "cowboy" en una serie de muestras de tejido de cancer de mama. La sonda de HER2 se detecto usando SISH con HRP o el procedimiento de deteccion con plata-AP divulgado usando un conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro.
Las FIG. 9A-F son una serie de imagenes digitales de ISH de tejido de mama (9A-C) o celulas de cancer de mama ZR- 75-1 (9D-F) con una sonda de HER2. La sonda de HER2 se detecto mediante el procedimiento de deteccion con plata- AP divulgado usando el conjugado de AuNP 100 nM-anticuerpo (9A y 9D), conjugado de AuNP 100 nM-anticuerpo (9B y 9E), o conjugado de AuNP 50 nM-anticuerpo (9C y 9F).
La FIG. 10 es una serie de imagenes digitales de IHC de tejido de carcinoma de mama con anticuerpo primario antireceptor de estrogenos (ER), anti-receptor de progesterona (PR) o anti-Ki67 (Ki67). Los anticuerpos primarios se detectaron usando el procedimiento de IHC con plata-AP divulgado usando un conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro, omitiendo las etapas del acondicionado con oro y de fijacion.
La FIG. 11 es una serie de imagenes digitales de IHC de tejido de carcinoma de mama con anticuerpo primario anti-
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HER2 (HER2), anti-receptor de estrogenos (ER), anti-Ki67 (Ki67) o anti-receptor de progesterona (PR). Los anticuerpos primarios se detectaron usando el procedimiento de IHC con plata-AP divulgado usando un conjugado de anticuerpo- nanoparticula de oro, incluyendo una etapa del acondicionado con oro.
La FIG. 12 es una serie de imagenes digitales de IHC de tejido de amigdalas con anticuerpo anti-Bcl-2 que compara la deteccion de DAB con la plata-AP utilizando los procedimientos de conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro divulgados. Tambien se realizo una comparacion de tinciones de contraste junto con el procedimiento con plata-AP.
Descripcion detallada
I. Abreviaturas
AP: fosfatasa alcalina
AuNP: nanoparticula de oro
AuPdNP: nanoparticula de aleacion de oro-paladio
BCIP: fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo
BSPP: bis-(sulfonatofenil)fenilfosfina
DIG: digoxigenina
DNP: dinitrofenilo
DTT: ditiotreitol
HRP: peroxidasa de rabano picante IgG: inmunoglobulina G IHC: inmunohistoquimica ISH: hibridacion in situ.
NP: nanoparticula PdNP: nanoparticula de paladio PtNP: nanoparticula de platino SISH: hibridacion in situ con plata
II. Terminos
A menos que se indique lo contrario, todos los terminos cientificos y tecnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que conocen los expertos en la tecnica a la que pertenece la divulgacion. Las formas del singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" tiene por objeto incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. "Que comprende" significa "que incluye". Por lo tanto, "que comprende A o B" significa "que incluye A" o "que incluye B" o "que incluye A y B."
Los procedimientos y materiales adecuados para la practica o analisis de los modos de realizacion de la invencion divulgada se describen a continuacion. Dichos materiales y procedimientos son unicamente ilustrativos y no estan destinados a ser limitantes. Se pueden usar otros procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. Por ejemplo, los procedimientos convencionales bien conocidos en la tecnica a la que pertenece la divulgacion se describen en diversas referencias generales y mas especificas, incluyendo, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (y suplementos hasta 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4a ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; y Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
Con el fin de facilitar la revision de los diversos modos de realizacion de la divulgacion se proporcionan las siguientes
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explicaciones de terminos especificos:
Fosfatasa alcalina (AP): una enzima hidrolasa que elimina grupos fosfato de una molecula. Un "sustrato de fosfatasa alcalina" es una molecula que incluye un fosfato que pueda eliminar la fosfatasa alcalina. En ejemplos particulares, un sustrato de la AP es una molecula que se convierte en capaz de reducir iones metalicos a un estado de oxidacion metalica (0) despues de la hidrolisis de un grupo fosfato por la AP. Entre los ejemplos de sustratos de la AP se incluyen, aunque sin limitaciones, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP), fosfato de acido ascorbico, fosfato de □-tocoferol, fosfato de sesamol y fosfato de eugenol.
Anticuerpo: un polipeptido que incluye al menos una region variable de cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un epitopo de un antigeno. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o fragmentos de anticuerpos, asi como otros conocidos en la tecnica. En algunos ejemplos, un anticuerpo esta unido o conjugado con otra molecula, por ejemplo, una nanoparticula (por ejemplo, una nanoparticula de oro) o una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina).
Los anticuerpos se componen de una cadena pesada y una cadena ligera, cada una de las cuales tiene una region variable, denominadas la region variable pesada (VH) y la region variable ligera (VL). En conjunto, la region VH y la region VL son responsables de la union al antigeno reconocido por en anticuerpo. Esto incluye inmunoglobulinas intactas y las variantes y porciones de ellas bien conocidas en la tecnica, tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab)'2, proteinas Fv monocatenarias ('scFv'), y proteinas Fv estabilizadas con puentes disulfuro ('dsFv' ). Una proteina scFv es una proteina de fusion en la que una region variable de cadena ligera de una inmunoglobulina y una region variable de cadena pesada de una inmunoglobulina estan unidas por un enlazador, mientras que en la dsFv, las cadenas se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociacion de las cadenas. El termino tambien incluye formas recombinantes, tales como anticuerpos quimericos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecificos). Vease tambien, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, Immunology, 3a Ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un unico clon de linfocitos B o por una celula en la que se han transfectado los genes de las cadenas ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales son producidos por procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, preparando las celulas formadoras de anticuerpos hibridas a partir de una fusion de celulas de mieloma con celulas de bazo inmunes. Estas celulas fusionadas y su progenie se denominan "hibridomas". Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.
Conjugado o bioconjugado: un compuesto que tiene una molecula (por ejemplo, una biomolecula, por ejemplo, un anticuerpo) acoplada efectivamente a otra molecula (por ejemplo, una nanoparticula o una enzima), ya sea directa o indirectamente, por cualquier medio adecuado. En algunos ejemplos, la molecula (por ejemplo, un anticuerpo) puede estar directamente acoplada covalentemente a una nanoparticula (por ejemplo, por un enlace metal-tiol). En otros ejemplos, la molecula (por ejemplo, un anticuerpo) puede acoplarse a una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina), por ejemplo, mediante el uso de una molecula "enlazadora", siempre que el enlazador no afecte negativamente de forma significativa a la actividad de la enzima o a la funcion de la biomolecula. El enlazador es, preferentemente, biocompatible. Los enlazadores moleculares habituales conocidos en la tecnica incluyen un grupo maleimida o succinimida, estreptavidina, neutravidina, biotina, o compuestos similares.
Conjugacion, union o enlace: acoplamiento de una primera unidad a una segunda unidad. Esto incluye, pero sin limitaciones, la union covalente de una molecula a otra molecula (por ejemplo, directamente o por medio de una molecula enlazadora), la union no covalente de una molecula a otra (por ejemplo, union electrostatica) (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.921.496, que divulga procedimientos para la conjugacion electrostatica), la union no covalente de una molecula a otra molecula mediante puentes de hidrogeno, la union no covalente de una molecula a otra molecula mediante fuerzas de van der Waals, y cualquier y todas las combinaciones de tales enlaces.
Colocalizado: que se produce en el mismo lugar o sustancialmente el mismo lugar. En algunos ejemplos, un precipitado de metal (por ejemplo, el metal en estado de oxidacion 0) formado utilizando los procedimientos descritos en el presente documento se colocaliza con una molecula diana cuando se acumula a una distancia maxima de aproximadamente 5 pm de la molecula diana (por ejemplo, 1 pm, 500 nm, 250 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm, 10 nm, 5 nm, 2 nm, 1 nm, o 0,5 nm de la molecula diana).
Contacto: colocacion que permite la asociacion entre dos o mas restos, particularmente la asociacion fisica directa, por ejemplo, tanto en forma solida como en forma liquida (por ejemplo, la colocacion de una muestra biologica, por ejemplo, una muestra biologica fijada a un portaobjetos, en contacto con un anticuerpo o una sonda).
Detectar: determinar si esta presente o ausente un agente (por ejemplo, una senal o una molecula diana particular), por ejemplo, en una muestra. En algunos ejemplos, esto puede incluir, ademas, la cuantificacion. "Deteccion" se refiere a cualquier procedimiento para determinar si algo existe o no existe, por ejemplo, determinar si una molecula diana esta presente en una muestra biologica. Por ejemplo, la "deteccion" puede incluir el uso de un dispositivo mecanico o visual
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para determinar si una muestra exhibe una caracteristica especifica. En determinados ejemplos, la deteccion se refiere a la observacion visual de un anticuerpo unido a una molecula diana, o la observacion de que un anticuerpo no se une a una molecula diana.
Enlace directo: acoplamiento o conjugacion de dos moleculas sin que intervenga un enlazador. En algunos ejemplos, se forma un enlace directo cuando un atomo de una primera molecula (por ejemplo, un anticuerpo) se une a un atomo de una segunda molecula (por ejemplo, una nanoparticula). En algunos ejemplos, el enlace directo es un enlace covalente, por ejemplo, un enlace metal-tiol (por ejemplo, un enlace oro-tiol).
Hapteno: una molecula, tipicamente una molecula pequena, que se puede combinar especificamente con un anticuerpo, pero, por lo general, es sustancialmente incapaz de ser inmunogenica, excepto en combinacion con una molecula vehiculo. Entre los ejemplos de haptenos se incluyen, pero sin limitacion, fluoresceina, biotina, nitroarilos (por ejemplo, dinitrofenilo (DNP)), y digoxigenina. Ejemplos adicionales de oxazol, pirazol, tiazol, nitroarilo, benzofurano, triperpeno, urea, tiourea, rotenoide, cumarina y haptenos ciclolignanos se divulgan en la publicacion de patente de Estados Unidos N.2 2008/0268462.
Hibridacion: formar pares de bases entre regiones complementarias de dos hebras de ADN, ARN, o entre el ADN y el ARN, formando de este modo una molecula duplex. Por tanto, las condiciones de hibridacion que resultan en grados concretos de rigurosidad variaran en funcion de la naturaleza del procedimiento de hibridacion y la composicion y longitud de las secuencias de acido nucleico que hibridan. Generalmente, la temperatura de hibridacion y la fuerza ionica (por ejemplo, la concentracion de Na+) del tampon de hibridacion determinaran la rigurosidad de la hibridacion. Los calculos relativos a las condiciones de hibridacion para la consecucion de determinados grados de rigurosidad se analizan en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (capitulos 9 y 11).
Inmunohistoqui'mica (IHQ): un procedimiento de determinacion de la presencia o distribucion de un antigeno (por ejemplo, una proteina) en una muestra (por ejemplo, una parte o seccion de tejido) mediante la deteccion de la interaccion del antigeno con un agente de union especifico, por ejemplo, un anticuerpo. Una muestra que incluye un antigeno (por ejemplo, un antigeno diana) se incuba con un anticuerpo en condiciones que permiten la union anticuerpo- antigeno. La union anticuerpo-antigeno se puede detectar por medio de un marcador detectable conjugado con el anticuerpo (deteccion directa) o por medio de un marcador detectable conjugado con un anticuerpo secundario, que se produce contra el anticuerpo primario (por ejemplo, deteccion indirecta). Entre los ejemplos de marcadores detectables que se pueden utilizar en la IHC se incluyen, pero sin limitacion, isotopos radiactivos, fluorocromos (tales como fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina y rodamina), y enzimas (tales como peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina). En algunos ejemplos, la union anticuerpo-antigeno se puede detectar mediante metalografia estimulada con enzimas, como se divulga en el presente documento, en la que una enzima conjugada a un anticuerpo cataliza la transformacion de un sustrato en un producto que puede donar electrones para reducir los iones metalicos en solucion, que posteriormente pueden detectarse.
Hibridacion in situ (ISH): un tipo de hibridacion que utiliza una cadena de ARN o ADN complementaria marcada (una sonda) para localizar una secuencia de ADN o ARN especifica o en una parte o seccion de tejido (in situ), o, si el tejido es lo suficientemente pequeno (por ejemplo, semillas de plantas, embriones de Drosophila), en todo el tejido (ISH de embriones completos o "whole mount'). Es distinta de la inmunohistoquimica, que localiza proteinas en secciones de tejido. La ISH de ADN se puede utilizar para determinar la estructura de los cromosomas, por ejemplo, en la medicina de diagnostico para evaluar la integridad cromosomica. La ISH de ARN (histoquimica de hibridacion) se utiliza para medir y localizar ARNm y otros transcritos dentro de las secciones de tejido o "whole mount'.
Para la histoquimica de hibridacion, las celulas y los tejidos de la muestra se tratan, generalmente, para fijar los transcritos diana en su lugar y aumentar el acceso de la sonda a la molecula diana. Como se ha indicado anteriormente, la sonda puede ser un ADN complementario marcado o un ARN complementario (ribosonda). La sonda se hibrida con la secuencia diana a temperatura elevada y, despues, el exceso de sonda se elimina por lavado (despues de hidrolisis previa utilizando ARNasa en el caso de exceso de sonda de ARN sin hibridar). Los parametros de la solucion, tales como la temperatura, la concentracion de sal y/o de detergente, se pueden manipular para eliminar la mayoria o todas las interacciones no identicas (por ejemplo, solo las secuencias que sean sustancialmente complementarias identicas o exactas permaneceran unidas). A continuacion, la sonda marcada que se ha marcado con efectivamente, por ejemplo, con bases radiomarcadas, marcadas con fluorescencia o marcadas con antigeno (por ejemplo, DNP o digoxigenina), se localiza y se puede cuantificar en el tejido usando autorradiografia, microscopia de fluorescencia o inmunohistoquimica, respectivamente. La ISH tambien puede utilizar dos o mas sondas, marcadas con radiactividad o los otros marcadores no radioactivos, tales como marcadores de hapteno, y, tipicamente, se marcan diferencialmente para detectar simultaneamente dos o mas transcritos.
Ion metalico: Cationes que requieren reduccion y electrones para la conversion a metales (estado de oxidacion cero). En ejemplos particulares, los iones metalicos incluyen iones de plata, iones de oro, iones de cobre, iones de niquel, iones de platino, iones de paladio, iones de cobalto o iones de iridio. Los iones metalicos pueden estar en forma de una solucion de una sal metalica, por ejemplo, un nitrato de metal, un haluro de metal, acetato de metal, o perclorato de metal (por ejemplo, nitrato de plata, acetato de plata, fluoruro de plata o perclorato de plata). En otros ejemplos, la sal de
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metal puede incluir un sulfito de metal, fosfato de metal o carbonato de metal.
Nanoparti'cula: una partfcula a nanoescala con un tamano que se mide en nanometros, por ejemplo, una partfcula nanoscopica que tiene al menos una dimension de menos de aproximadamente 200 nm. Entre los ejemplos de nanopartfculas se incluyen, a modo de ejemplo y sin limitaciones, nanopartfculas paramagneticas, nanopartfculas superparamagneticas, nanopartfculas metalicas, materiales de tipo fulereno, nanotubos inorganicos, dendnmeros (tales como con quelatos metalicos unidos de forma covalente), nanofibras, nanocuernos, nanocebollas, nanobarras, nanocuerdas y puntos cuanticos. En ejemplos particulares, una nanopartfcula es una nanopartfcula de metal (por ejemplo, una nanopartfcula de oro, de paladio, de platino, de plata, de cobre, de mquel, de cobalto, de iridio, o una aleacion de dos o mas de los mismos). Las nanopartfculas pueden incluir un nucleo o un nucleo y una envoltura, como en las nanopartfculas de nucleo-envoltura.
Molecula de acido nucleico: un polfmero de desoxirribonucleotido o ribonucleotido incluyendo, sin limitaciones, ADNc, ARNm, ADN genomico y ADN sintetico (por ejemplo, sintetizado qufmicamente). La molecula de acido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria. De modo que cuando tiene una sola hebra, la molecula de acido nucleico puede ser la cadena sentido o la cadena antisentido. Ademas, una molecula de acido nucleico puede ser circular o lineal.
Polipeptido o protei'na: un polfmero en el que los monomeros son restos de aminoacidos que estan unidos mediante enlaces amida. Cuando los aminoacidos son a-aminoacidos, se puede usar el isomero optico L o el isomero optico D. Los terminos “polipeptido”, "peptido" o “protema”, como se usan en el presente documento, se pretende que abarquen cualquier secuencia de aminoacidos y que incluyan secuencias modificadas, tales como glicoprotemas. Con el termino “polipeptido” o "protema" se pretende especfficamente cubrir tanto las protemas naturales como las protemas que se producen de forma recombinante o sintetica.
Sonda: una molecula de acido nucleico aislada unida a un marcador o molecula indicadora detectable, por ejemplo, un hapteno. Entre los marcadores tfpicos se incluyen isotopos radiactivos, sustratos de enzimas, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos (incluyendo, pero sin limitarse al mismo, DNP), y enzimas. Los procedimientos para el marcado e indicaciones para la eleccion de los marcadores adecuados para diversos fines se tratan, por ejemplo, en Sambrook et al. (en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1989) y Ausubel et al. (En Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992).
Un experto en la tecnica apreciara que la especificidad de una sonda particular aumenta con su longitud. Por lo tanto, las sondas se pueden seleccionar de modo que proporcionen una especificidad deseada, y pueden comprender al menos 17, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas nucleotidos consecutivos de la secuencia de nucleotidos deseada. En ejemplos particulares, las sondas pueden tener al menos 100, 250, 500, 600, 1000, o mas acidos nucleicos consecutivos de una secuencia de nucleotidos deseada.
Agente reductor: un elemento o compuesto que reduce otra especie. En la reduccion de otra especie, el agente reductor se oxida y es un donante de electrones. En ejemplos particulares, los agentes reductores incluyen, pero sin limitaciones, ditiotreitol (DTT) y tiosulfato de sodio.
Muestra: el termino "muestra" se refiere a cualquier lfquido, sustancia (o material) semisolida o solida en o sobre el que un objetivo puede estar presente. En particular, una muestra puede ser una muestra biologica o una muestra obtenida de un material biologico. Entre los ejemplos de muestras biologicas se incluyen muestras de tejido y muestras de citologfa. En algunos ejemplos, la muestra biologica se obtiene de un sujeto animal, por ejemplo, un sujeto humano.
Una muestra biologica incluye cualquier muestra solida o fluida obtenida, excretada o secretada por cualquier organismo vivo, incluyendo, sin limitaciones, organismos unicelulares (tales como bacterias, levaduras, protozoos, y amebas, entre otros) y organismos multicelulares (por ejemplo, plantas o animales, incluyendo muestras de un sujeto humano sano o aparentemente sano o de un paciente humano afectado por una afeccion o enfermedad a diagnosticar o investigar, por ejemplo, cancer). Por ejemplo, una muestra biologica puede ser un fluido biologico obtenido, por ejemplo, de sangre, plasma, suero, orina, bilis, ascitis, saliva, lfquido cefalorraqufdeo, humor acuoso o vftreo, o cualquier secrecion corporal, un trasudado, un exudado (por ejemplo, el lfquido obtenido de un absceso o de cualquier otro sitio de infeccion o inflamacion), o fluido obtenido a partir de una articulacion (por ejemplo, una articulacion normal o una articulacion afectada por la enfermedad). Una muestra biologica tambien puede ser una muestra obtenida de cualquier organo o tejido (incluyendo una muestra de biopsia o autopsia, por ejemplo, una biopsia de tumor), un xenoinjerto, o puede incluir una celula (ya sea una celula primaria o celula cultivada) o medio acondicionado por cualquier celula, tejido u organo. En algunos ejemplos, una muestra biologica es un extracto del nucleo. En algunos ejemplos, una muestra biologica es un citoplasma bacteriano. En determinados ejemplos, una muestra es una muestra de control de calidad. En otros ejemplos, una muestra es una muestra de ensayo. Por ejemplo, una muestra de ensayo es una celula, una seccion de tejido o sedimento celular preparado a partir de una muestra biologica obtenida de un sujeto. En un ejemplo, el sujeto es uno que esta en riesgo de sufrir una afeccion o enfermedad concreta o que ya la sufre.
Se une especi'ficamente: la union de un agente que se une, preferentemente, o que sustancialmente solo se une a una diana definida (por ejemplo, un anticuerpo contra un antfgeno especffico o una sonda de acido nucleico a una secuencia de acido nucleico especffica). Con respecto a un antfgeno, "se une especfficamente" se refiere a la asociacion
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preferente de un anticuerpo u otro ligando, en su totalidad o en parte, a un polipeptido especifico. Con respecto a una secuencia de acido nucleico, "se une especificamente" se refiere a la asociacion preferente de una sonda de acido nucleico, en su totalidad o en parte, a una secuencia de acido nucleico especifica.
Sustrato: una molecula sobre la que actua un catalizador, por ejemplo, una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina). En un ejemplo, un sustrato es un sustrato de fosfatasa alcalina, por ejemplo, un fosfato de arilo que tiene la formula RO- PO3H2 o RO-PO32-(Y+)2, en la que R es un grupo arilo e Y+ es un cation (tales como Na+, K+ o Li+). En ejemplos particulares, un sustrato de fosfatasa alcalina es BCIP.
Molecula diana: cualquier molecula cuya la presencia, localizacion y/o concentracion se pueden determinar. Entre los ejemplos de moleculas diana se incluyen proteinas, acidos nucleicos y haptenos, tales como haptenos unidos covalentemente a proteinas o a secuencias de acidos nucleicos. Las moleculas diana se detectan, tipicamente, usando uno o mas conjugados de una molecula de union especifica y un marcador detectable.
III. Conjugados de anticuerpo-nanoparticula
En el presente documento se divulgan conjugados de anticuerpo-nanoparticula y procedimientos para producir tales conjugados. Los conjugados de anticuerpo-nanoparticula pueden usarse en procedimientos para detectar una molecula diana (por ejemplo, una proteina o una molecula de acido nucleico unida a una sonda marcada con haptenos), tales como los procedimientos proporcionados en el presente documento.
A. Conjugados
Los conjugados de anticuerpo-nanoparticula descritos en el presente documento incluyen dos o mas nanoparticulas (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas nanoparticulas, por ejemplo, de 2 a 10 nanoparticulas o de 2 a 7 nanoparticulas) unidas directamente a un anticuerpo a traves de un enlace metal-tiol entre la nanoparticula y un tiol presente en el anticuerpo (por ejemplo, un residuo de aminoacido del anticuerpo, por ejemplo, un residuo de cisteina). En algunos modos de realizacion, los conjugados de anticuerpo-nanoparticula divulgados se utilizan en procedimientos histoquimicos (tales como ISH o IHC) y proporcionan una mayor sensibilidad que los procedimientos convencionales.
En algunos modos de realizacion, las nanoparticulas utilizadas en los conjugados de anticuerpo-nanoparticula divulgados son nanoparticulas metalicas. En algunos ejemplos, las nanoparticulas son de oro, paladio, platino, plata, cobre, niquel, cobalto o iridio. En otros ejemplos, las nanoparticulas son de rutenio, rodio, osmio o hierro. En ejemplos especificos, la nanoparticula es una nanoparticula de oro, una nanoparticula de paladio o una nanoparticula de platino. En otros ejemplos, las nanoparticulas son una aleacion de dos o mas metales (tales como dos o mas de oro, paladio, platino, plata, cobre, niquel, cobalto o iridio). En ejemplos particulares, la nanoparticula es una nanoparticula de aleacion de oro-paladio. En otros ejemplos, la nanoparticula es una nanoparticula de nucleo-envoltura, que tiene un nucleo de metal con una envoltura de un metal diferente (por ejemplo, una nanoparticula de plata incluyendo una envoltura de oro). En algunos ejemplos, la nanoparticula tiene un nucleo metalico que incluye aproximadamente 10-200 atomos, por ejemplo, aproximadamente 100-200, 100-150, 11-100 o 11-70 atomos.
En un ejemplo particular, la nanoparticula es una nanoparticula de oro. En algunos ejemplos, la nanoparticula de oro tiene un nucleo metalico que incluye aproximadamente 10-200 atomos de oro, por ejemplo, aproximadamente 100-200 atomos de oro, aproximadamente 100-150 atomos de oro, aproximadamente 11-100 atomos de oro o aproximadamente 11-70 atomos de oro. En un ejemplo particular, la nanoparticula de oro tiene un nucleo metalico que incluye aproximadamente 100-150 atomos de oro. Las nanoparticulas metalicas y los procedimientos para producir nanoparticulas metalicas son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Nanoparticles: From Theory to Application, Gunther Schmid, ed., Wiley-BCH, 2004.
En algunos ejemplos, las dos o mas nanoparticulas conjugadas con un anticuerpo tienen, cada una, un diametro de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 200 nm (por ejemplo, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 10 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 50 nm). En ejemplos particulares, las nanoparticulas tienen un diametro de aproximadamente 5 nm o menos (por ejemplo, de aproximadamente 5 nm, de aproximadamente 4,5 nm, de aproximadamente 4 nm, de aproximadamente 3,5 nm, de aproximadamente 3 nm, de aproximadamente 2,5 nm, de
aproximadamente 2 nm, de aproximadamente 1,5 nm, de aproximadamente 1 nm o de aproximadamente 0,5 nm o
menos). En otros ejemplos, las nanoparticulas tienen un diametro de al menos aproximadamente 50 nm, por ejemplo, aproximadamente 60 nm, aproximadamente 70 nM, aproximadamente 80 nm, aproximadamente 90 nm,
aproximadamente 100 nm, aproximadamente 110 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 130 nm,
aproximadamente 140 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 160 nm, aproximadamente 170 nm,
aproximadamente 180 nm, aproximadamente 190 nm, aproximadamente 200 nm o mas.
Los conjugados divulgados incluyen dos o mas nanoparticulas ligadas a un anticuerpo. En algunos ejemplos, el anticuerpo puede incluir anticuerpos monoclonales o policlonales, tales como IgA, IgD, IgE, IgG, o IgM; fragmentos de anticuerpos, incluyendo, sin limitaciones, fragmentos proteoliticos de inmunoglobulina [tales como F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH y fragmentos Fab que son conocidos en la tecnica), fragmentos de anticuerpos recombinantes
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(tales como fragmentos sFv, fragmentos dsFv, fragmentos sFv biespecificos, fragmentos dsFv biespecificos, fragmentos F(ab)'2, proteinas Fv de cadena unica ("scFv") y proteinas Fv estabilizadas por puentes disulfuro ("dsFv")). En otros ejemplos, el anticuerpo puede incluir diacuerpos, triacuerpos, y anticuerpos de camelidos; anticuerpos obtenidos mediante ingenieria genetica, tales como anticuerpos quimericos, por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados); anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecificos); y combinaciones de los mismos. En ejemplos particulares, el anticuerpo incluye los llamados "anticuerpos secundarios", que incluyen anticuerpos policlonales con especificidad por inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgA, o IgM) de una especie particular (por ejemplo, conejo, cabra, raton, pollo, oveja, rata, vaca, caballo, burro, hamster, cobaya, o cerdo). En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo, un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo, IgG completa humana, o anticuerpos de raton o de rata. En un ejemplo divulgado en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo. En otros ejemplos, el anticuerpo incluye un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, un anticuerpo anti- dinitrofenilo (DNP), un anticuerpo anti-digoxigenina (DIG), un anticuerpo anti-fluoresceina, un anticuerpo anti-biotina o un anticuerpo anti-benzofurazan).
Los conjugados de anticuerpo-nanoparticula divulgados en el presente documento incluyen un enlace que une directamente el anticuerpo y la nanoparticula (por ejemplo, un enlace formado cuando un atomo de una primera molecula (por ejemplo, un anticuerpo) se une a un atomo de una segunda molecula (por ejemplo, una nanoparticula)). En algunos ejemplos, el enlace directo es un enlace covalente, por ejemplo, un enlace metal-tiol. En algunos ejemplos, un atomo metalico de la nanoparticula esta unido covalentemente a un grupo tiol presente en el anticuerpo, formando un enlace metal-tiol directo entre la nanoparticula y el anticuerpo. En algunos ejemplos, el anticuerpo tiene aproximadamente de 1 a 10 grupos tiol (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grupos tiol), cada uno de los cuales puede formar un enlace metal-tiol con una nanoparticula. En ejemplos particulares, el conjugado de anticuerpo- nanoparticula no incluye un enlazador entre el anticuerpo y la nanoparticula.
En un ejemplo, el grupo tiol presente en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un grupo tiol de un resto del aminoacido cisteina del anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un resto de cisteina presente en un anticuerpo natural o un resto de cisteina que se introduce en el anticuerpo, por ejemplo, usando tecnicas recombinantes, tales como mutagenesis dirigida a sitio). En otros ejemplos, el tiol se puede formar haciendo reaccionar el anticuerpo con un reactivo que introduce un grupo tiol en el anticuerpo (por ejemplo, el reactivo de Traut (2- iminotiolano) o usando un tiol protegido unido al acido carboxilico activado).
Las inmunoglobulinas son proteinas tetramericas compuestas por dos copias identicas de una cadena pesada y dos copias identicas de una cadena ligera. La estructura de cuatro cadenas se mantiene mediante fuertes interacciones no covalentes y puentes disulfuro covalentes entre la mitad amino-terminal de los pares de cadenas pesada-ligera y entre las regiones carboxilo-terminal de las dos cadenas pesadas. Los anticuerpos incluyen puentes disulfuro intercatenarios que unen las cadenas pesadas y ligeras y tambien unen las dos cadenas pesadas. Los anticuerpos tambien incluyen puentes disulfuro intracatenarios que se forman dentro de un polipeptido individual de la cadena ligera o pesada . En algunos ejemplos, las nanoparticulas se conjugan con el anticuerpo en los tioles que se producen mediante la reduccion de disulfuros intracatenarios del anticuerpo. En otros ejemplos, las nanoparticulas se conjugan con el anticuerpo en los tioles que se producen mediante la reduccion de disulfuros intercatenarios del anticuerpo.
B. Procedimientos para la produccion de conjugados de anticuerpo-nanoparticula
En el presente documento tambien se divulgan procedimientos para la produccion de los conjugados de anticuerpo- nanoparticula descritos. Los procedimientos proporcionan conjugacion directa de dos o mas nanoparticulas a un anticuerpo a traves de grupos tiol (por ejemplo, puentes disulfuro nativos reducidos) presentes en el anticuerpo. Los procedimientos incluyen la reaccion de un compuesto de arilfosfina en nanoparticulas (por ejemplo, una nanoparticula protegida con una arilfosfina) con un anticuerpo reducido. La arilfosfina confiere solubilidad en agua y la reactividad de la nanoparticula a los tioles (por ejemplo, los restos de cisteina) presentes en el anticuerpo, lo que facilita el desplazamiento de la arilfosfina. El uso de fosfina tambien elimina la necesidad de utilizar un potente oxidante para activar la nanoparticula para la conjugacion. Finalmente, la conjugacion se puede producir a traves de la reduccion de los enlaces disulfuro existentes en la proteina nativa, lo que permite una reduccion leve y preservacion de la estructura y la funcion del anticuerpo. El numero de nanoparticulas conjugadas con el anticuerpo puede ajustarse mediante la estequiometria del reactante y el numero de tioles reducidos presentes en el anticuerpo. En algunos ejemplos, los procedimientos divulgados producen un conjugado que incluye, aproximadamente, de dos a siete nanoparticulas por anticuerpo, por ejemplo, de aproximadamente tres a siete, o aproximadamente cinco nanoparticulas por anticuerpo. En algunos ejemplos, una preparacion de conjugados de nanoparticulas-anticuerpo incluye un promedio de aproximadamente cinco nanoparticulas por anticuerpo.
Entre los procedimientos divulgados se incluyen la reaccion de un compuesto arilfosfina-nanoparticula con un anticuerpo reducido, para producir un conjugado de anticuerpo-nanoparticula. En algunos modos de realizacion, la nanoparticula es una nanoparticula de metal (por ejemplo, una nanoparticula de oro, de paladio, de platino, de plata, de cobre, de niquel, de cobalto, de iridio, o una aleacion de dos o mas de los mismos). En otros ejemplos, la nanoparticula es una nanoparticula de nucleo-envoltura (por ejemplo, una nanoparticula de plata que incluye una envoltura de oro). En ejemplos particulares, la nanoparticula es una nanoparticula de oro, una nanoparticula de paladio o una nanoparticula de platino. En otros ejemplos, la nanoparticula es una nanoparticula de aleacion de oro-paladio. En algunos ejemplos,
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las nanoparticulas tienen un diametro de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 200 nm (por ejemplo, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 10 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 5 nm). En ejemplos particulares, las nanoparticulas tienen un diametro de aproximadamente 5 nm o menos (por ejemplo,, aproximadamente 5 nm, aproximadamente 4,5 nm, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3,5 nm,
aproximadamente 3 nm, de aproximadamente 2,5 nm, de aproximadamente 2 nm, aproximadamente 1,5 nm,
aproximadamente 1 nm, o aproximadamente 0,5 nm). En otros ejemplos, las nanoparticulas tienen un diametro de al
menos aproximadamente 50 nm, por ejemplo, aproximadamente 60 nm, aproximadamente 70 nM, aproximadamente 80 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 110 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 130 nm, aproximadamente 140 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 160 nm,
aproximadamente 170 nm, aproximadamente 180 nm, aproximadamente 190 nm, aproximadamente 200 nm o mas.
En algunos modos de realizacion, el compuesto arilfosfina-nanoparticula se produce mediante la reaccion de nanoparticulas con una arilfosfina (por ejemplo, una arilfosfina sustituida que permite la solubilidad en agua). En algunos ejemplos, la arilfosfina es soluble en agua a una cantidad de, como minimo, 1 mg/ml (por ejemplo, como minimo 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o mas). En algunos ejemplos, la arilfosfina es una fosfina sulfonatada (por ejemplo, fosfina monosulfonatada, bisulfonatada o trisulfonatada). En un ejemplo particular, la arilfosfina es bis(sulfonatofenil)fenilfosfina. En ejemplos particulares, el complejo arilfosfina-nanoparticula es un complejo arilfosfina- nanoparticula de oro, por ejemplo un complejo bis(sulfonatofenil)fenilfosfina-nanoparticula de oro.
En algunos modos de realizacion, las nanoparticulas de oro se producen en un liquido mediante reduccion de acido cloroaurico (HAuCL). En un ejemplo particular, se puede realizar una reduccion bifasica (tolueno y agua) en borohidruro sodico del acido aurico a una nanoparticula de oro soluble organico de un tamano de aproximadamente 1,5-2 nm. A esto le puede seguir un intercambio de ligando con arilfosfinas sulfonatadas en una solucion de agua y diclorometano, para producir nanoparticulas solubles en agua para conjugar con un anticuerpo. Un experto en la tecnica puede preparar otros complejos de arilfosfina-nanoparticula (por ejemplo, complejos de nanoparticula de paladio, nanoparticula de platino o nanoparticula de oro-aleacion de paladio) usando procedimientos similares y materiales de partida adecuados.
Entre los procedimientos divulgados tambien se incluyen la reaccion de un anticuerpo reducido con un complejo arilfosfina-nanoparticula, para producir un conjugado de anticuerpo-nanoparticula. Entre los anticuerpos que se pueden usar en los procedimientos divulgados se incluyen los analizados anteriormente, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos obtenidos mediante ingenieria genetica (por ejemplo, anticuerpos quimericos, por ejemplo anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) y combinaciones de los mismos. En algunos ejemplos, el anticuerpo incluye los llamados "anticuerpos secundarios", que incluyen anticuerpos policlonales con especificidad por inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgA, o IgM) de una especie particular (por ejemplo, conejo, cabra, raton, pollo, oveja, rata, vaca, caballo, burro, hamster, cobaya o cerdo). En un ejemplo especifico divulgado en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo. En otros ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, un anticuerpo anti-DNP, un anticuerpo anti-DIG, un anticuerpo anti-fluoresceina, un anticuerpo anti-biotina o un anticuerpo anti-benzofurazan). Los anticuerpos estan disponibles comercialmente en numerosas fuentes, incluyendo, pero sin limitacion, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Abeam (Cambridge, MA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Life Technologies/Invitrogen (Carlsbad, CA), R&D Systems (Minneapolis, MN), BiosPacific (Emeryville, CA) y Abnova (Walnut, CA).
Los procedimientos para reducir una proteina, por ejemplo, un anticuerpo, son bien conocidos para los expertos en la materia. Se puede formar un anticuerpo reducido para su uso en los procedimientos divulgados en el presente documento mediante la reaccion de un anticuerpo con un agente reductor para producir un anticuerpo reducido. Entre los procedimientos se incluyen mezclar un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo) con un agente reductor durante un periodo de tiempo suficiente para producir un anticuerpo reducido. El anticuerpo reducido incluye uno o mas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas) grupos tiol disponibles. En algunos ejemplos, los grupos tiol disponibles se producen como resultado de la reduccion de enlaces disulfuro presentes en el anticuerpo nativo (por ejemplo, uno o mas disulfuros intracatenarios o disulfuros intercatenarios). En ejemplos particulares, los grupos tiol disponibles se producen mediante reduccion de, como minimo, un puente disulfuro intracatenario presente en el anticuerpo nativo.
En algunos ejemplos, el agente reductor es un agente reductor monotiol o ditiol (por ejemplo, 2-mercaptoetanol, 2- mercaptoetilamina, cisteina, glutation reducido, ditiotreitol, ditioeritritol, dimercaptoacetato glicol o acido tiogilcolico). En otro ejemplo, el agente reductor es un agente reductor de trialquilfosfina (por ejemplo, tris(2-carboxietil)fosfina). Se pueden determinar la concentracion adecuada del agente reductor y el tiempo para la reaccion mediante titulacion del numero de tioles producidos en una cantidad de tiempo dada con una concentracion concreta del agente reductor a una temperatura adecuada. Un experto en la tecnica puede determinar el numero de tioles disponibles (por ejemplo, mediante ensayo de Ellman; Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77, 1959). En algunos ejemplos, la cantidad de agente reductor es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 M (por ejemplo, de aproximadamente 1 mM a 500 mM, de aproximadamente 5 mM a 100 mM o de aproximadamente 10 mM a 50 mM) y la cantidad de tiempo es de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas (por ejemplo, de aproximadamente 10 minutos a 2 horas o de aproximadamente 20 minutos a 60 minutos). En un ejemplo particular no limitante, se hace reaccionar un anticuerpo
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con ditiotreitol (DTT) aproximadamente 0,5 M durante aproximadamente 25 minutos a 4 °C para producir un anticuerpo reducido.
En algunos ejemplos, el complejo arilfosfina-nanoparticula y el anticuerpo reducido se incuban durante, como minimo, aproximadamente 2 horas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 24, 36, 48, 60, 72 horas o mas). En ejemplos adicionales, la reaccion del complejo arilfosfina-nanoparticula y el anticuerpo reducido se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 28 °C (por ejemplo, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 22 °C). En algunos ejemplos, la reaccion se lleva a cabo a aproximadamente 4 °C. En otros ejemplos, la reaccion se lleva a cabo a la temperatura ambiente (por ejemplo, de aproximadamente 22 °C a aproximadamente 26 °C). En ejemplos particulares, la reaccion se lleva a cabo a aproximadamente 4 °C durante 48 horas o a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. Un experto en la tecnica entendera que el tiempo de reaccion y la temperatura se pueden variar. Por ejemplo, en reacciones de menor duracion (por ejemplo, de menos de 24 horas) o a una temperatura mas fria (por ejemplo, a 4 °C) se puede producir menos conjugacion de nanoparticulas con anticuerpo mientras que en reacciones de mayor duracion (por ejemplo, de mas de 24 horas) o a una temperatura mas alta (por ejemplo, a temperatura ambiente) se puede producir mas conjugacion de nanoparticulas con anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, el numero de nanoparticulas acopladas al anticuerpo en el conjugado de anticuerpo- nanoparticula se controla ajustando la estequiometria del reactante y/o la duracion de la reaccion. En algunos ejemplos, se pueden producir conjugados con dos o mas nanoparticulas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) acoplados a una molecula de anticuerpo aumentando la cantidad del complejo arilfosfina-nanoparticula incluido en la reaccion con el anticuerpo reducido. Dichos modos de realizacion incluyen aquellos que tienen relaciones que no son de numeros enteros entre nanoparticula y anticuerpo. En algunos ejemplos, el conjugado de anticuerpo-nanoparticula incluye 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 4, 4,5, 5, o mas nanoparticulas por anticuerpo. En otros ejemplos, el conjugado de anticuerpo- nanoparticula incluye un promedio de aproximadamente dos a siete (por ejemplo, de aproximadamente tres a seis o de aproximadamente cinco) nanoparticulas por anticuerpo. En algunos ejemplos, la estequiometria del reactante del complejo arilfosfina-nanoparticula y el anticuerpo reducido es de aproximadamente 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 o mas. En un ejemplo no limitante, la estequiometria de la reaccion es de aproximadamente 5 mg del complejo de arilfosfina-nanoparticula a aproximadamente 1,5 mg de anticuerpo y el conjugado de anticuerpo-nanoparticula resultante incluye aproximadamente 3,5 nanoparticulas por anticuerpo. En otro ejemplo no limitante, la estequiometria de la reaccion es de aproximadamente 10 mg del complejo de arilfosfina-nanoparticula a aproximadamente 1,5 mg de anticuerpo y el conjugado de anticuerpo-nanoparticula resultante incluye aproximadamente 5 nanoparticulas por anticuerpo.
En modos de realizacion adicionales, el numero e nanoparticulas acopladas al anticuerpo en el conjugado de anticuerpo-nanoparticula se controla ajustando el numero de tioles reducidos presentes en el anticuerpo reducido en la reaccion. Los expertos en la materia conocen los procedimientos para controlar la reduccion de una proteina. En algunos ejemplos, el tipo o cantidad de agente reductor y/o la duracion de la reaccion de reduccion se ajustan para controlar el grado de reduccion de la proteina. Por ejemplo, aumentando la cantidad de agente reductor y/o la duracion de la reaccion, se reduce un mayor numero de disulfuros en la proteina, de modo que se producen mas tioles reducidos y se permite la conjugacion de un mayor numero de nanoparticulas a una unica molecula de anticuerpo. Por el contrario, disminuyendo la cantidad de agente reductor y/o la duracion de la reaccion, se reduce un menor numero de disulfuros en la proteina, de modo que se producen menos tioles reducidos y se permite la conjugacion de un menor numero de nanoparticulas a una unica molecula de anticuerpo.
IV. Procedimientos de uso de los conjugados anticuerpo-nanoparticula
En el presente documento se divulgan procedimientos para detectar una molecula diana en una muestra, que usan conjugados de anticuerpo-nanoparticula, incluidos los conjugados de anticuerpo-nanoparticula descritos en el presente documento. Los procedimientos incluyen la deteccion de una molecula diana, por ejemplo procedimientos histoquimicos, por ejemplo, procedimientos de inmunohistoquimica (IHC) e hibridacion in situ (ISH). Los conjugados de anticuerpo-nanoparticula pueden aumentar la sensibilidad y/o especificidad de los procedimientos de IHC e ISH con respecto a los procedimientos convencionales.
Los procedimientos descritos en el presente documento usan un conjugado de anticuerpo-nanoparticula como centro de nucleacion para metalografia estimulada por enzimas. En este procedimiento, una enzima cataliza la transformacion quimica de un sustrato en un producto que, posteriormente, puede donar electrones para reducir los iones metalicos en la solucion. Sin desear quedar ligado a teoria alguna, se cree que en los procedimientos divulgados en el presente documento, los atomos metalicos resultantes se nuclean en la superficie de la nanoparticula, lo que aumenta el tamano de la particula a un grado que permite su visualizacion, por ejemplo, mediante microscopia optica. El conjugado de anticuerpo-nanoparticula parece proporcionar un punto especifico del deposito del atomo metalico, lo que da lugar a un aumento de la senal con baja tincion de fondo.
En algunos modos de realizacion, los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo que se une a una molecula diana; poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que el segundo anticuerpo se une especificamente al
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primer anticuerpo; poner en contacto la muestra con un tercer anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas (por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-nanoparticula divulgado en el presente documento), en el que el tercer anticuerpo se une especificamente al segundo anticuerpo; poner en contacto la muestra con un sustrato de la enzima y un ion metalico, de tal manera que se forma un precipitado de metal y se colocaliza con la molecula diana; y detectar el precipitado de metal. La FIG. 1 muestra diagramas esquematicos de procedimientos no limitantes de ejemplo divulgados en el presente documento para realizar IHC (FIG. 1 A) e ISH (FIG. 1B) usando conjugados de anticuerpo-nanoparticula.
En otros modos de realizacion, uno o mas de los anticuerpos usados en los procedimientos divulgados pueden incluir un hapteno (por ejemplo, DNP, DIG, fluoresceina, biotina o benzofurazan) y el anticuerpo que se une especificamente al anticuerpo es un anticuerpo anti-haptenos. En un ejemplo, los procedimientos incluyen poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo que se une a una molecula diana, en el que el primer anticuerpo incluye un hapteno; poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que el segundo anticuerpo se une especificamente al hapteno del primer anticuerpo; poner en contacto la muestra con un tercer anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas, en el que el tercer anticuerpo se une especificamente al segundo anticuerpo; poner en contacto la muestra con un sustrato de la enzima y un ion metalico, de tal manera que se forma un precipitado de metal y se colocaliza con la molecula diana; y detectar el precipitado de metal. En otros ejemplos, el anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima (por ejemplo, el segundo anticuerpo) incluye un hapteno y el anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas es un anticuerpo anti-hapteno que se une especificamente al hapteno del segundo anticuerpo. En algunos modos de realizacion, el primero y/o segundo anticuerpos incluyen un hapteno y el segundo y/o tercer anticuerpos son anticuerpos anti-haptenos. En algunos ejemplos, cuando mas de uno de los anticuerpos usados en los procedimientos divulgados incluye un hapteno, los haptenos son haptenos diferentes.
En otros modos de realizacion, los procedimientos divulgados incluyen poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que el primer anticuerpo se une a una molecula diana; poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas (por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-nanoparticula divulgado en el presente documento), en el que el segundo anticuerpo se une especificamente al primer anticuerpo; poner en contacto la muestra con un sustrato de la enzima y un ion metalico, de tal manera que se forma un precipitado de metal y se colocaliza con la molecula diana; y detectar el precipitado de metal. En modos de realizacion adicionales, los procedimientos incluyen poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que el primer anticuerpo se une a una molecula diana y en el que el primer anticuerpo incluye un hapteno (por ejemplo, DNP. DIG, fluoresceina, biotina o benzofurazan); poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas, en el que el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-hapteno que se une especificamente al hapteno del primer anticuerpo; poner en contacto la muestra con un sustrato de la enzima y un ion metalico, de tal manera que se forma un precipitado de metal y se colocaliza con la molecula diana; y detectar el precipitado de metal.
En algunos ejemplos, un precipitado de metal (por ejemplo, un metal en estado de oxidacion 0) formado usando los procedimientos descritos en el presente documento se colocaliza con una molecula diana. Por ejemplo, el precipitado de metal se acumula a una distancia maxima de aproximadamente 5 DM de la molecula diana (por ejemplo, como maximo, aproximadamente 1 Dm, 500 nm, 250 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm, 10 nm, 5 nm, 2 nm, 1 nm, o 0,5 nm de la molecula diana).
En algunos ejemplos, los procedimientos divulgados son procedimientos para detectar una molecula diana que es una proteina (por ejemplo, los procedimientos de IHC) y el anticuerpo que se une a la molecula diana es un anticuerpo que se une especificamente a uno o mas epitopos en la proteina diana (en ocasiones se denomina anticuerpo "primario"). En otros ejemplos, los procedimientos divulgados son procedimientos para detectar una molecula diana que es una molecula de acido nucleico (por ejemplo, los procedimientos de ISH) y el anticuerpo que se une a la molecula diana es un anticuerpo anti-hapteno que se une especificamente a una sonda de nucleico marcada con hapteno, que se une especificamente a la molecula de acido nucleico diana. Las moleculas diana se analizan en la Seccion VI, mas adelante
En realizaciones adicionales, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden utilizarse junto con procedimientos de deteccion no metalograficos (por ejemplo, procedimientos de deteccion colorimetricos o fluorescentes) para detectar moleculas diana adicionales. En algunos ejemplos, diversos marcadores detectables que pueden detectarse por separado pueden conjugarse con diferentes moleculas de union especificas (por ejemplo, anticuerpos) que se unen especificamente a diferentes dianas para proporcionar un ensayo multiplexado que puede proporcionar la deteccion de multiples dianas en una muestra. Por ejemplo, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden utilizarse para detectar una molecula diana (por ejemplo, una proteina diana o una molecula de acido nucleico) en una muestra. La muestra tambien puede someterse a procedimientos colorimetricos, por ejemplo, usando un anticuerpo conjugado con una enzima que produce un cromogeno cuando se utiliza con un sustrato apropiado (por ejemplo, HRP con 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) o AP con BCIP/nitroazul de tetrazolio (NBT)) para detectar una segunda molecula diana o posteriores. Tambien se puede someter a la muestra a procedimientos de deteccion fluorescentes, por ejemplo, un anticuerpo conjugado con una molecula fluorescente (por ejemplo, fluoresceinas, luminoforos, cumarinas, colorantes BODIPY, resorufinas, rodaminas o puntos cuanticos) para detectar una segunda molecula diana o posteriores. Como alternativa, se podria someter a una muestra a procedimientos de deteccion colorimetricos y/o fluorescentes para detectar una o mas moleculas diana, seguido de los procedimientos divulgados en el presente documento para detectar una molecula diana adicional. Un experto en la tecnica puede
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determinar el orden apropiado para la multiplexacion (por ejemplo, en la mayoria de los ejemplos, IHC antes de ISH) utilizando procedimientos de rutina.
Los procedimientos descritos en el presente documento incluyen la deteccion del precipitado de metal (por ejemplo, el metal en estado de oxidacion cero), por ejemplo, el precipitado de metal nucleado en la superficie de una nanoparticula en los conjugados de anticuerpo-nanoparticula incluidos en los procedimientos divulgados. El precipitado de metal puede detectarse visualmente, por ejemplo,mediante microscopia de campo claro. En algunos ejemplos, el uso del conjugado de anticuerpo-nanoparticula permite la deteccion y cuantificacion de un numero reducido de copias de una molecula de acido nucleico (por ejemplo, una molecula de acido nucleico presente en alrededor de 1-3 copias por celula) o una proteina de baja abundancia sin una etapa de amplificacion de senal convencional (por ejemplo, amplificacion de senal con tiramida, que normalmente es necesaria).
Un experto en la tecnica apreciara que los modos de realizacion de los procedimientos divulgados en el presente documento para la deteccion de una o mas moleculas diana pueden automatizarse. Ventana Medical Systems, Inc. es el cesionario de una serie de patentes de Estados Unidos que divulgan sistemas y procedimientos para realizar analisis automatizados, incluyendo las patentes de Estados Unidos n.° 5.650.327; 5.654.200; 6.296.809; 6.352.861; 6.827.901; y 6.943.029, y las solicitudes publicadas de Estados Unidos n.° 2003/0211630 y 2004/0052685.
A. Conjugados de anticuerpo-enzima
Los procedimientos divulgados incluyen un anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima. En algunos ejemplos, el anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima es un anticuerpo que se une especificamente a un anticuerpo que, a su vez, se une a una molecula diana (a veces conocido como "anticuerpo secundario"). En otros ejemplos, el anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima es un anticuerpo que se une a una molecula diana o una sonda de acido nucleico marcada con hapteno unida a una molecula de acido nucleico diana (a veces conocido como "anticuerpo primario"). En otros ejemplos adicionales mas, las una o mas moleculas de enzima se conjugan con un anticuerpo anti-haptenos (por ejemplo, un anticuerpo anti-DNP, un anticuerpo anti-DIG, un anticuerpo anti-fluoresceina, un anticuerpo anti-biotina o un anticuerpo anti-benzofurazan).
La enzima conjugada al anticuerpo en los procedimientos divulgados es una enzima capaz de transformar un sustrato de enzima sin actividad redox para producir al menos un producto capaz de reducir iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero. En algunos ejemplos, la enzima puede ser una fosfatasa alcalina (AP), fosfatasa acida, □ - galactosidasa, □-lactamasa (por ejemplo, una cefalosporinasa o penicilinasa), glucosidasa (por ejemplo, una a- o □- glucosidasa), o esterasa. El conjugado de enzima-anticuerpo incluye una o mas moleculas de enzima (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas moleculas de enzima). En algunos ejemplos, el conjugado de enzima-anticuerpo incluye aproximadamente 2-10 moleculas de enzima, por ejemplo, aproximadamente 2-8 moleculas de enzima, por ejemplo de 3-5 moleculas de enzima. En ejemplos particulares no limitantes, el conjugado de enzima-anticuerpo incluye dos o tres moleculas de enzima. Los conjugados de anticuerpo-enzima y los procedimientos de produccion de dichos conjugados son bien conocidos en la tecnica. En algunos ejemplos, la enzima se conjuga al anticuerpo con una molecula enlazadora (por ejemplo, un enlazador de maleimida) mediante la reaccion de una molecula de maleimido-enzima con un anticuerpo reducido (por ejemplo, un anticuerpo que tiene al menos un tiol libre, por ejemplo, como minimo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas tioles libres).
En modos de realizacion particulares descritos en el presente documento, la enzima es AP. En algunos ejemplos, la AP es una AP nativa (por ejemplo, AP intestinal, por ejemplo, AP intestinal o AP renal de ternera). La AP nativa se puede purificar utilizando procedimientos bien conocidos en la tecnica y tambien esta disponible comercialmente en muchas fuentes, incluyendo, pero sin limitacion, BioZyme (BBI Enzymes, Madison, WI), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) y US Biological (Swampscott, MA). En otros ejemplos, la AP es una AP recombinante, por ejemplo, una AP recombinante expresada y purificada a partir de un microorganismo (por ejemplo, Escherichia coli o Pichia pastoris). Los procedimientos para expresar y purificar la AP recombinante son bien conocidos en la tecnica. La AP recombinante tambien esta disponible comercialmente, por ejemplo, en Roche Applied Science (Indianapolis, IN), Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). En un ejemplo particular, la AP se modifica con MAL-dPEG™12 NHS (Quanta Biodesign; Powell, OH) para producir una maleimido-AP y un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo de cabra anti-IgG de raton o anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo) se reduce con DTT para producir un anticuerpo tiolado. La maleimido-AP y el anticuerpo tiolado se hacen reaccionar para producir un conjugado de AP-anticuerpo, que puede purificarse y utilizarse en los procedimientos divulgados.
Los procedimientos divulgados incluyen poner en contacto la muestra con un sustrato de enzima y un ion metalico, de tal manera que se forma un precipitado de metal. En ejemplos particulares, la muestra se pone en contacto con el sustrato de enzima y el ion metalico simultaneamente. En otros ejemplos, la muestra se pone en contacto con el sustrato de enzima y el ion metalico secuencialmente. Como se ha analizado anteriormente, las enzimas utilizadas en el conjugado de anticuerpo-enzima son las que son capaces de transformar un sustrato de enzima sin actividad redox para producir, al menos, una especie con actividad redox capaz de reducir iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero. Por tanto, el sustrato de la enzima es un sustrato que puede transformar la enzima concreta incluida en el conjugado de anticuerpo-enzima. En algunos ejemplos, la enzima es AP y el sustrato de la enzima es una molecula que incluye un fosfato que puede eliminar la fosfatasa alcalina, de modo que se genera una especie con actividad redox
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capaz de reducir iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero. Entre los ejemplos de sustratos de la AP se incluyen, pero sin limitacion, fosfatos de indolilo (por ejemplo, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP)), fosfato de acido ascorbico, fosfato de a-tocoferol, fosfato de sesamol, fosfato de eugenol, y derivados de hidroquinona (por ejemplo, fosfato de hidroquinona, naftohidroquinona y antrahidroquinona). En la tecnica se conocen sustratos adicionales de la AP (vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 7.632.652 y 7.642.064). En algunos ejemplos, la muestra se pone en contacto con el sustrato de la enzima de aproximadamente de 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (por ejemplo, de aproximadamente 0,4 mM a 75 mM, de aproximadamente 1 mM a 50 mM o de aproximadamente 2 mM a 20 mM). En un ejemplo particular, la muestra se pone en contacto con BCIP de aproximadamente 0,5 a 3 mM, por ejemplo, BCIP de 1 a 2 mM, por ejemplo BCIP aproximadamente 1,3 mM.
De manera similar, para otras enzimas, el sustrato es un compuesto sin actividad redox que la enzima puede transformar en, al menos, una especie con actividad redox capaz de reducir iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero. Por ejemplo, si la enzima es una P-galactosidasa, el sustrato puede ser un compuesto mono- o di- galactosido (por ejemplo, digalactosilhidroquinona). Si la enzima es una D-lactamasa, el sustrato puede ser un □ - lactama (por ejemplo, una C3' D-lactama, por ejemplo, una cefalosporina). Si la enzima es una glucosidasa, el substrato puede ser un monoglucosido o diglucosido y si la enzima es una esterasa, el sustrato puede ser un monoester o diester. Ejemplos particulares de sustratos de enzimas adecuados para los procedimientos descritos en el presente documento son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° n.° 7.632.652 y 7.642.064). Un experto en la tecnica puede determinar sustratos para una enzima concreta y seleccionar sustratos concretos que produciran la especie con actividad redox.
Como se ha analizado anteriormente, los procedimientos divulgados incluyen un conjugado de enzima-anticuerpo, en el que la enzima transforma un sustrato en una especie con actividad redox capaz de reducir iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero. Sin desear quedar ligado a teoria alguna, se cree que el metal reducido forma un precipitado que se nuclea en la superficie de la nanoparticula presente en la muestra en forma de conjugado de anticuerpo-nanoparticula. Este precipitado o deposito de atomos metalicos aumenta el tamano de la nanoparticula, que se puede detectar despues, por ejemplo, utilizando un microscopio optico. Los iones metalicos para los procedimientos descritos en el presente documento incluyen iones de plata, iones de oro, iones de cobre, iones de niquel, iones de platino, iones de paladio, iones de cobalto o iones de iridio. En los procedimientos descritos en el presente documento, la muestra se pone en contacto con un ion metalico, que puede estar en una solucion. En ejemplos particulares, una sal de metal se disuelve en una solucion. La sal de metal puede incluir un haluro de metal (por ejemplo, un cloruro de metal o fluoruro de metal), un nitrato de metal, un acetato de metal o un perclorato de metal. En otros ejemplos, la sal de metal puede incluir un sulfito de metal, fosfato de metal o carbonato de metal. En un ejemplo particular, la sal de metal es nitrato de plata.
En ejemplos particulares, los procedimientos divulgados en el presente documento utilizan un conjugado de anticuerpo- nanoparticula que incluye nanoparticulas de oro y utilizan iones de plata, que se reducen a un atomo de plata y se depositan en la nanoparticula de oro. En algunos ejemplos, los iones de plata proceden de compuestos de plata (por ejemplo, acetato de plata, nitrato de plata, fluoruro de plata o perclorato de plata). En algunos ejemplos, la muestra se pone en contacto con una solucion que incluye uno o mas compuestos de plata de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M (por ejemplo, de aproximadamente 20 mM a 500 mM o de aproximadamente 50 mM a 100 mM) durante aproximadamente 2 minutos a 90 minutos (por ejemplo, de aproximadamente 2 minutos a 60 minutos, de aproximadamente 4 minutos a 60 minutos o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos). En un ejemplo particular, la muestra se pone en contacto con nitrato de plata aproximadamente 50 mM durante aproximadamente 20 minutos.
B. Conjugados de anticuerpo-nanoparticula
Los procedimientos descritos en el presente documento utilizan un anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas nanoparticulas). En algunos ejemplos, el conjugado de anticuerpo- nanoparticula es uno descrito en el presente documento, en el que el conjugado de anticuerpo-nanoparticula incluye dos o mas nanoparticulas unidas directamente al anticuerpo mediante un enlace metal-tiol. En un ejemplo particular, el conjugado de anticuerpo-nanoparticula es un conjugado que incluye de dos a cinco nanoparticulas de oro por anticuerpo, por ejemplo, cinco nanoparticulas de oro. En otros ejemplos, el conjugado de anticuerpo-nanoparticula es cualquier conjugado de anticuerpo-nanoparticula conocido para un experto en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.360.895, la publicacion de patente de EE. UU. n.° 2006/0246524.
Como se ha analizado anteriormente, en algunos ejemplos, la nanoparticula es una nanoparticula de metal (por ejemplo, una nanoparticula de oro, de paladio, de platino, de plata, de cobre, de niquel, de cobalto, de iridio, o una aleacion de dos o mas de los mismos). En algunos ejemplos, la nanoparticula conjugada al anticuerpo tiene un diametro de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 200 nm (por ejemplo, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 10 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 5 nm). En ejemplos particulares, las nanoparticulas tienen un diametro de aproximadamente 5 nm o menos (por ejemplo,, aproximadamente 5 nm, aproximadamente 4,5 nm, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3,5 nm, aproximadamente 3 nm, de aproximadamente 2,5 nm, de aproximadamente 2 nm, aproximadamente 1,5 nm, aproximadamente 1 nm, o aproximadamente 0,5 nm). En algunos
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ejemplos de los procedimientos descritos en el presente documento, la muestra se pone en contacto con el conjugado de anticuerpo-nanopartfcula de aproximadamente 10 nM a 2 pM (por ejemplo, de aproximadamente 20 nM a 1,5 DM, de aproximadamente 50 nM a 1 DM o de aproximadamente 100 nM a 500 nM) durante de aproximadamente 4 minutos a 60 minutos (por ejemplo, de aproximadamente 8 minutos a 40 minutos, o de aproximadamente 16 minutos a 32 minutos). En un ejemplo particular, la muestra se pone en contacto con 100 nM de un conjugado de anticuerpo- nanopartfcula de oro durante aproximadamente 32 minutos.
C. Acondicionado, amplificacion y fijacion
Los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen, opcionalmente, una etapa de “acondicionado” que incluye poner en contacto la muestra con un haluro de oro (por ejemplo, cloruro de oro). Historicamente, el acondicionado con oro se refiere al tratamiento de una muestra con cloruro de oro (con o sin acido oxalico y tiosulfato) para proteger una capa de plata (por ejemplo, para microscopia inmunoelectronica mejorada con plata). Vease, por ejemplo, Pohl y Stierhof, Microsc. Res. Tech. 42:59-65, 1998; Sawada y Esaki, J. Histochem. Cytochem. 48:493-498, 2000.
En ejemplos particulares de los procedimientos divulgados, la muestra se pone en contacto con un haluro de oro (por ejemplo, cloruro de oro), despues de poner en contacto la muestra con el sustrato de la enzima y el ion metalico. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.632.652 y 7.642.064. Sin desear quedar ligado a teorfa alguna, se cree que el oro se reduce y oxida algunos de los atomos metalicos reducidos (por ejemplo, plata) que se depositan en la superficie de la nanopartfcula del conjugado de anticuerpo-nanopartfcula (por ejemplo, una nanopartfcula de oro), que da como resultado un punto mas oscuro (por ejemplo, el aumento de contraste y/o del tamano de la senal). En algunos ejemplos, el procedimiento incluye poner en contacto la muestra con de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 1 % (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 % a 0,8 %, de aproximadamente 0,1 % a 0,5 % o de aproximadamente 0,1 % a 0,2 %) de cloruro de oro durante aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 90 minutos (por ejemplo, de aproximadamente 2 minutos a 60 minutos, de aproximadamente 4 minutos a 60 minutos o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos). En un ejemplo particular, la muestra se pone en contacto con cloruro de oro al 0,2 % durante aproximadamente 4 minutos.
En algunos modos de realizacion, los procedimientos divulgados tambien incluyen opcionalmente una etapa de amplificacion. La amplificacion puede incluir poner en contacto la muestra con iones metalicos adicionales, proporcionando mas iones metalicos para la reduccion a metal en estado de oxidacion cero y aumentando el precipitado de metal que se puede detectar. En algunos ejemplos, los procedimientos incluyen poner en contacto la muestra con el mismo ion metalico que el utilizado en el contacto de la muestra con el sustrato de enzima y el ion metalico. En algunos ejemplos, el ion metalico esta en la forma de una sal metalica disuelta en una solucion. La sal de metal puede incluir un haluro de metal (por ejemplo, un cloruro de metal o fluoruro de metal) o un nitrato de metal. En un ejemplo particular, el ion metalico es plata (por ejemplo, cuando la muestra se ha puesto en contacto previamente con un sustrato de enzima e iones de plata), por ejemplo en forma de uno o mas compuestos de plata (por ejemplo, nitrato de plata). En algunos ejemplos, la muestra se pone en contacto con una solucion que incluye uno o mas compuestos de plata de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M (por ejemplo, de aproximadamente 20 mM a 500 mM o de aproximadamente 50 mM a 100 mM) durante aproximadamente 2 minutos a 90 minutos (por ejemplo, de aproximadamente 2 minutos a 60 minutos, de aproximadamente 4 minutos a 60 minutos o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos). En un ejemplo particular, la muestra se pone en contacto con nitrato de plata aproximadamente 50 mM durante aproximadamente 4 minutos.
En realizaciones adicionales, los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen, opcionalmente, una etapa de fijacion, que detiene la reaccion de reduccion del metal y elimina todos los iones metalicos no reducidos de la muestra. En algunos ejemplos, la fijacion incluye poner en contacto la muestra con un agente reductor. En algunos ejemplos, los procedimientos incluyen poner en contacto la muestra con de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 5 % de tiosulfato sodico (por ejemplo, de aproximadamente 0,0625 % a 4 %, de aproximadamente 0,1 % a 3 % o de aproximadamente 0,5 % a 2 %) durante aproximadamente 2 minutos a 90 minutos (por ejemplo, de aproximadamente 2 minutos a 60 minutos, de aproximadamente 4 minutos a 60 minutos o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos). En un ejemplo particular, la fijacion incluye poner en contacto la muestra con aproximadamente 2 % de con tiosulfato de sodio durante aproximadamente 4 minutos.
V. Kits
En el presente documento se divulgan kits, que pueden utilizarse para llevar a cabo diversas realizaciones de los procedimientos divulgados. En algunos ejemplos, los kits incluyen un primer anticuerpo conjugado con una o mas nanopartfculas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas nanopartfculas), por ejemplo los conjugados de anticuerpo-nanopartfcula divulgados en el presente documento. En ejemplos particulares, el primer anticuerpo se conjuga con una o mas nanopartfculas de oro, una o mas nanopartfculas de paladio, una o mas nanopartfculas de platino o una o mas nanopartfculas de oro-aleacion de paladio. En algunos ejemplos, los kits tambien incluyen un segundo anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas moleculas de enzima), en los que el primer anticuerpo se une especfficamente al segundo anticuerpo. En algunos ejemplos, el primer anticuerpo y/o el segundo anticuerpo son anticuerpos anti-hapteno. En algunos ejemplos, el
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anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas es un conjugado de anticuerpo-nanoparticula divulgado en el presente documento, por ejemplo un conjugado de anticuerpo-nanoparticula que incluye dos o mas nanoparticulas (por ejemplo, nanoparticulas de oro) directamente unidas al anticuerpo mediante un enlace metal-tiol. En un ejemplo especifico, los anticuerpos se incluyen en recipientes separados.
En algunos ejemplos especificos, el kit incluye un primer anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas nanoparticulas) y un segundo anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de AP (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas, por ejemplo, 3 moleculas de AP), donde el primer anticuerpo se une especificamente al segundo anticuerpo. En algunos ejemplos, el segundo anticuerpo es un "anticuerpo primario" que se une especificamente a una molecula diana (por ejemplo, una proteina diana o un hapteno, donde una sonda marcada con haptenos se une a una molecula de acido nucleico diana). En otros ejemplos, el segundo anticuerpo es un "anticuerpo secundario" que se une especificamente a un anticuerpo primario (por ejemplo, un anticuerpo que reconoce especificamente una proteina diana o un hapteno, donde una sonda marcada con hapteno se une a una molecula de acido nucleico diana).
El kit puede incluir, opcionalmente, componentes adicionales, por ejemplo, un sustrato para la enzima (por ejemplo, BCIP, si la enzima es AP) o una solucion que incluye iones metalicos (por ejemplo, iones de plata, iones de oro, iones de cobre, iones de niquel, iones de platino, iones de paladio, iones de cobalto o iones de iridio). Ademas, el kit puede incluir componentes adicionales distintos de los reactivos identificados anteriormente, incluyendo, pero sin limitacion, reactivos para etapas adicionales de los procedimientos divulgados, por ejemplo, reactivos para el acondicionado con oro (por ejemplo, cloruro de oro), amplificacion con plata (por ejemplo, nitrato de plata) y/o de fijacion (por ejemplo, tiosulfato de sodio). El kit tambien puede incluir anticuerpos (por ejemplo, uno o mas anticuerpos primarios), sondas marcadas con haptenos u otros reactivos necesarios para la realizacion de IHC y/o ISH mediante los procedimientos divulgados en el presente documento. Cada componente de los kits divulgados puede proporcionarse en un recipiente separado. En algunos ejemplos, el kit puede incluir tambien muestras de control, por ejemplo, una o mas muestras de control positivo (por ejemplo, una muestra que se sabe que expresa una diana en particular o que expresa una cantidad conocida o que tiene un numero conocido de copias del gen de una diana en particular) o una o mas muestras de control negativo (por ejemplo, una muestra que se sabe que expresa una diana en particular). En ejemplos particulares, los kits divulgados en el presente documento pueden usarse para detectar dianas en muestras de mamiferos que se sospecha que tienen un trastorno o enfermedad, por ejemplo, cancer o una infeccion.
VI. Muestras y dianas
Las muestras incluyen componentes biologicos y generalmente se sospecha que incluyen (o incluso se sabe que incluyen) una o mas moleculas diana de interes. Las moleculas diana pueden estar en la superficie de las celulas y las celulas pueden estar en una suspension o en una seccion de tejido (por ejemplo, una seccion de tejido incluido en parafina). Las moleculas diana tambien pueden ser intracelulares y se detectan despues de la lisis celular o la penetracion de la celula por una sonda o anticuerpo. Un experto en la tecnica apreciara que el procedimiento de deteccion de moleculas diana en una muestra variara dependiendo del tipo de muestra y de la sonda o anticuerpo utilizado. En la tecnica se conocen procedimientos de preparacion y recogida de muestras.
Las muestras usadas en los procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo un tejido u otra muestra biologica, se pueden preparar usando cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Las muestras incluyen cualquier muestra solida o fluida obtenida, excretada o secretada por cualquier organismo vivo, incluyendo, sin limitacion, organismos unicelulares, por ejemplo, bacterias, levaduras, protozoos y amebas entre otros, organismos multicelulares (por ejemplo, plantas o animales). Por ejemplo, una muestra biologica puede ser un fluido biologico obtenido, por ejemplo, de sangre, plasma, suero, orina, bilis, ascitis, saliva, liquido cefalorraquideo, humor acuoso o vitreo, o cualquier secrecion corporal, un trasudado, un exudado (por ejemplo, el liquido obtenido de un absceso o de cualquier otro sitio de infeccion o inflamacion), o fluido obtenido de una articulacion (por ejemplo, una articulacion normal o una articulacion afectada por la enfermedad). Una muestra biologica tambien puede ser una muestra obtenida de cualquier organo o tejido (incluyendo una muestra de biopsia o autopsia, por ejemplo, una biopsia de tumor) o un xenoinjerto o puede incluir una celula (ya sea una celula primaria o celula cultivada) o medio acondicionado por cualquier celula, tejido u organo. En modos de realizacion particulares, la muestra biologica incluye una seccion de tejido (por ejemplo, la obtenida por biopsia) o una muestra de citologia (por ejemplo, un frotis de Papanicolaou o un frotis de sangre).
Las muestras se pueden obtener de sujetos para el cribado de rutina o de sujetos que se sospecha que tienen un trastorno, por ejemplo, una infeccion, una anomalia genetica o una neoplasia. Los procedimientos descritos tambien se pueden aplicar a las muestras que no tienen anomalias geneticas, enfermedades, trastornos, etc., que se conocen como muestras "normales". Dichas muestras normales son utiles, entre otras cosas, como controles para la comparacion con otras muestras. Las muestras pueden analizarse para muchas finalidades diferentes. Por ejemplo, las muestras pueden usarse en un estudio cientifico o para el diagnostico de una posible enfermedad.
Las muestras descritas en el presente documento se pueden preparar usando cualquier procedimiento conocido o desarrollado mas adelante en la tecnica. Generalmente, las muestras de tejido se preparan mediante fijacion e inclusion del tejido en un medio. En otros ejemplos, las muestras incluyen una suspension celular que se prepara como una monocapa sobre un soporte solido (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio) por ejemplo, mediante extension o
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centrifugado de las celulas sobre el soporte solido. En ejemplos adicionales, en los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar secciones de tejido reciente congelado (por ejemplo, sin fijar).
En algunos ejemplos se utiliza un medio de inclusion. Un medio de inclusion es un material inerte en el que se incluyen los tejidos y/o las celulas para ayudar a preservarlos para futuros analisis. La inclusion tambien permite cortar laminas de las muestras de tejido en secciones finas. Los medios de inclusion incluyen parafina, celoidina, compuesto OCT , agar, plastico o acrilicos.
Muchos medios de inclusion son hidrofobos; por lo tanto, puede ser necesario eliminar el material inerte antes del analisis histologico o citologico, que utilizan principalmente reactivos hidrofilos. El termino desparafinizacion o desparafinado se usa ampliamente en el presente documento para hacer referencia a la eliminacion parcial o completa de cualquier tipo de medio de inclusion de una muestra biologica. Por ejemplo, las secciones de tejido incluidas en parafina se desparafinan pasandolas por disolventes organicos, por ejemplo, tolueno, xileno, limoneno u otros disolventes adecuados.
El procedimiento de fijacion de una muestra puede variar. La fijacion de una muestra de tejido conserva las celulas y los constituyentes del tejido en un estado lo mas cercano posible a la vida y permite realizar procedimientos preparativos sin cambios significativos. La fijacion detiene los procesos de autolisis y descomposicion bacteriana que comienzan tras la muerte celular y estabiliza los constituyentes celulares y del tejido de modo que sean capaces de soportar las etapas posteriores del procesamiento del tejido, por ejemplo, para IHC o ISH.
Los tejidos se pueden fijar mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo perfusion o inmersion en un fijador. Los fijadores se pueden clasificar en agentes de reticulacion (por ejemplo, aldehidos, por ejemplo, formaldehido, paraformaldehido y glutaraldehido, asi como agentes de reticulacion no aldehidicos), agentes oxidantes (por ejemplo, iones y complejos metalicos, por ejemplo, tetroxido de osmio y acido cromico), agentes desnaturalizantes de proteinas (por ejemplo, acido acetico, metanol y etanol), fijadores de mecanismo desconocido (por ejemplo, cloruro de mercurio, acetona y acido picrico), reactivos de combinacion (por ejemplo, fijador de Carnoy, metacam, fluido de Bouin, fijador B5, fluido de Rossman y fluido de Gendre), microondas y otros fijadores (por ejemplo, excepto fijacion en volumen y fijacion con vapor). Los aditivos tambien pueden incluirse en el fijador, por ejemplo, tampones, detergentes, acido tanico, fenol, sales metalicas (por ejemplo, cloruro de cinc, sulfato de cinc, y sales de litio) y lantano.
El fijador de uso mas habitual en la preparacion de muestras para IHC es el formaldehido, generalmente en forma de una solucion de formalina (4 % de formaldehido en una solucion tampon, conocida como formalina tamponada al 10 %). En un ejemplo, el fijador es formalina neutra tamponada al 10 %.
Las muestras pueden incluir multiples dianas que se pueden unir especificamente mediante una sonda o anticuerpo o molecula indicadora. Las dianas pueden ser moleculas de acido nucleico o proteinas. A lo largo de la presente divulgacion, cuando se hace referencia a una proteina diana, se entiende que las moleculas de acido nucleico asociadas a dicha proteina tambien se pueden utilizar como dianas. En algunos ejemplos, la diana es una proteina o molecula de acido nucleico de un patogeno, por ejemplo, un virus, bacteria, o parasito intracelular, por ejemplo, de un genoma viral. Por ejemplo, una proteina diana se puede producir a partir de una secuencia de acido nucleico diana asociado a (por ejemplo, correlacionada con, causalmente implicada en, etc.) una enfermedad.
Una molecula de acido nucleico diana puede variar sustancialmente de tamano. Sin limitacion, la molecula de acido nucleico puede tener un numero variable de restos de acidos nucleicos. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico diana puede tener al menos aproximadamente 10 restos de acido nucleico o al menos aproximadamente 20, 30, 50, 100, 150, 500, 1000 o mas restos. En algunos ejemplos, la molecula de acido nucleico diana es una molecula de acido nucleico "corta", por ejemplo, de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 20 kb (por ejemplo, de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 15 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 20 kb, o de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb). En ejemplos particulares, las moleculas de acido nucleico diana “cortas” incluyen secuencias del genoma viral, por ejemplo HPV o virus de hepatitis. En otros ejemplos, la molecula de acido nucleico diana es una molecula de acido nucleico "larga", por ejemplo, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 500 kb (por ejemplo, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 300 kb, de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 200 kb, o de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 200 kb) o mas. En ejemplos particulares, las moleculas de acido nucleico diana “largas” incluyen genes asociados a la transformacion neoplasica, por ejemplo, EGFR, HER2, C-MYC, ABL, C- MET, TOP2A, BCL, p53 o RBI. La sonda (por ejemplo, una sonda marcada con haptenos) se puede unir a la molecula de acido nucleico diana y proporcionar una senal detectable.
Una molecula de acido nucleico diana tambien puede variar sustancialmente en lo que respecta al numero de copias. Sin limitacion, la molecula de acido nucleico puede estar presente en un numero variable de copias en una muestra concreta. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico diana puede estar presente en una muestra en aproximadamente 1 copia o, al menos, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 150, 500, 1000 o mas copias. En algunos ejemplos, una molecula de acido nucleico diana es un acido nucleico con un "numero de copias bajo", por ejemplo, un acido nucleico que esta presente en de aproximadamente 1 a 100 copias por celula en la muestra, por ejemplo, de aproximadamente 1 a 50 copias, de aproximadamente 1 a 20 copias, de aproximadamente 1 a 10 copias, o de aproximadamente de 1 a 3 copias. En ejemplos particulares, las moleculas de acido nucleico con un numero de
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copias bajo incluyen HER2 y HPV. En algunos ejemplos, la secuencia de acido nucleico diana es tanto una secuencia de acido nucleico "corta" como un acido nucleico con un numero de copias bajo (por ejemplo, HPV).
Del mismo modo, una proteina o polipeptido diana pueden variar sustancialmente de tamano. Sin limitacion, la proteina o polipeptido diana incluiran al menos un epitopo que se une a una sonda o anticuerpo. En algunos modos de realizacion, la proteina o polipeptido pueden incluir al menos dos epitopos que se unen a una sonda o anticuerpo. La sonda o anticuerpo puede unirse al epitopo y proporcionar una senal detectable.
En ejemplos no limitantes especificos, una molecula de acido nucleico diana o una proteina diana (por ejemplo, una proteina producida por un acido nucleico diana (por ejemplo, un acido nucleico genomico diana)) esta relacionada con una neoplasia (por ejemplo, un cancer). En las celulas neoplasicas se han identificado numerosas anomalias cromosomicas (incluidas translocaciones y otros reordenamientos, reduplicacion o delecion), especialmente en las celulas cancerosas, por ejemplo, leucemias de celulas B y de celulas T, linfomas, cancer de mama, cancer de colon, canceres neurologicos y similares. Por lo tanto, en algunos ejemplos, al menos una parte de la molecula diana es una molecula de acido nucleico o una proteina producida por una molecula de acido nucleico (por ejemplo, acido nucleico genomico diana) que esta reduplicado o delecionado en al menos una subpoblacion de celulas de una muestra.
Se sabe que los oncogenes son responsables de varias neoplasias malignas humanas. Por ejemplo, los reordenamientos cromosomicos que afectan al gen SYT situado en la region del punto de ruptura del cromosoma 18ql 1.2 son frecuentes entre los tumores de tejidos blandos de sarcoma sinovial. La translocacion t(l8ql 1.2) puede identificarse, por ejemplo, utilizando sondas con diferentes marcadores: la primera sonda incluye moleculas de acido nucleico generadas a partir de una secuencia de acido nucleico diana que se extiende distalmente desde el gen SYT y la segunda sonda incluye acido nucleico generado a partir de una secuencia de acido nucleico diana que se extiende 3' o proximal al gen SYT. Cuando las sondas que corresponden a estas secuencias de acido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de acido nucleico genomico diana) se usan en un procedimiento de hibridacion in situ, las celulas normales, que carecen de una t(l8ql 1.2) en la region del gen SYT, exhiben dos senales de fusion (generadas por los dos marcadores en proximidad estrecha), lo que refleja las dos copias intactas de SYT. Las celulas anormales con t(18ql 1.2) exhiben una unica senal de fusion.
En otros ejemplos, se selecciona un acido nucleico diana o una proteina diana (por ejemplo, una proteina producida por un acido nucleico diana (por ejemplo, acido nucleico genomico diana)) que es un gen supresor de tumor que esta delecionado (se ha perdido) en las celulas malignas. Por ejemplo, la region p16 (que incluye D9S1749, D9S1747, p16 (INK4A), p14 (ARF), D9S1748, p15 (INK4B) y D9S1752) localizada en el cromosoma 9p21 esta delecionada en ciertos tipos de cancer de vejiga. Las deleciones cromosomicas que implican a la region distal del brazo corto del cromosoma 1 (que abarca, por ejemplo, SHGC57243, TP73, EGFL3, ABL2, ANGPTL1 y SHGC-1322) y la region pericentromerica (por ejemplo, 19pl3-19ql3) del cromosoma 19 (que abarca, por ejemplo, MAN2B1, ZNF443, ZNF44, CRX, GLTSCR2 y GLTSCR1) son rasgos moleculares caracteristicos de ciertos tipos de tumores solidos del sistema nervioso central.
Los ejemplos mencionados anteriormente se proporcionan unicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Los expertos en la tecnica conocen numerosas anomalias citogeneticas que se correlacionan con la transformacion y/o crecimiento neoplasico. Los acidos nucleicos diana o las proteinas diana (por ejemplo, una proteina producida por un acido nucleico diana (por ejemplo, un acido nucleico genomico diana)) que se han correlacionado con la transformacion neoplasica y que son utiles en los procedimientos divulgados, tambien incluyen el gen del EGFR (7p12 por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ nC_000007, nucleotidos 55054219-55242525), el gen de C-MYC (8q24.21; por ejemplo, n.2 de acceso en GENBANK™ NC_000008, nucleotidos 128817498-128822856), D5S271 (5p15.2), gen de la lipoproteina lipasa (LPL) (8p22; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000008, nucleotidos 19841058-19869049), RBI (13q14; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000013, nucleotidos 4777591247954023), p53 (17p13.1; e.g., n.° de acceso en GENBANK™ NC_000017, complemento, nucleotidos 75124647531642)), N-MYC (2p24; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleotidos 151835231-151854620), CHOP (12q 13; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000012, complemento, nucleotidos 56196638-56200567), FUS (16p11.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000016, nucleotidos 31098954-31110601), FKHR (13p14; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000013, complemento, nucleotidos 40027817-40138734), asi como, por ejemplo: ALK (2p23; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleotidos 29269144-29997936), cadena pesada de Ig, CcNDI (11q13; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000011, nucleotidos 69165054-69178423), BCL2 (18q21.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000018, complemento, nucleotidos 58941559-59137593), BCL6 (3q27; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000003, complemento, nucleotidos 188921859-188946169), MALF1, aP1 (1p32-p31; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000001, complemento, nucleotidos 59019051-59022373), TOP2A (17q21-q22; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000017, complemento, nucleotidos 35798321-35827695), TMPRSS (21 q22.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000021, complemento, nucleotidos 41758351-41801948), ErG (21q22.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000021, complemento, nucleotidos 3867567138955488); ETVI (7p21.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000007, complemento, nucleotidos 13897379-13995289), EWS (22q12.2; por ejemplo, n.2 de acceso en GENBANK™ NC_000022, nucleotidos 2799427128026505); FLI1 (11q24.1-q24.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000011, nucleotidos 128069199128187521), PAX3 (2q35-q37; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleotidos 222772851-222871944), PAX7 (1p36.2-p36.12; por ejemplo, n.2 de acceso en GENBANK™ NC_000001, nucleotidos
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18830087-18935219, PTEN (10q23.3; por ejemplo, n.2 de acceso en GENBANK™ NC_000010, nucleotidos 8961317589716382), AKT2 (19q 13.1-q13.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000019, complemento, nucleotidos 45431556-45483036), MYCL1 (1p34.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000001, complemento, nucleotidos 40133685-40140274), REL (2p13-p12; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, nucleotidos 60962256-61003682) y CSFlR (5q33-q35; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000005, complemento, nucleotidos 149413051 -149473128).
En otros ejemplos, un acido nucleico diana o proteina diana se selecciona de un virus u otro microorganismo asociado a una enfermedad o afeccion. La deteccion del acido nucleico diana derivado de virus o de microorganismo (por ejemplo, acido nucleico genomico diana) o proteina diana en una muestra de celula o tejido es indicativa de la presencia del organismo. Por ejemplo, el acido nucleico, peptido, polipeptido o proteina diana pueden seleccionarse del genoma de un virus oncogenico o patogenico, una bacteria o un parasito intracelular (por ejemplo, Plasmodium falciparum y otras especies de Plasmodium, Leishmania (sp.), Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, asi como especies de Toxoplasma, Eimeria, Theileria y Babesia).
En algunos ejemplos, el acido nucleico diana o proteina diana (por ejemplo, una proteina producida por un acido nucleico diana (por ejemplo, acido nucleico genomico diana)) es de un genoma viral. Entre los ejemplos de virus y las correspondientes secuencias genomicas (n.° de acceso en GENBANK™ y RefSeq entre parentesis) se incluyen adenovirus A humano (NC_001460), adenovirus B humano (NC_004001), adenovirus C humano (NC_001405), adenovirus D humano (NC_002067), adenovirus E humano (NC_003266), adenovirus F humano (NC_001454), astrovirus humano (NC_001943), poliomavirus BK humano (V01109; GI:60851) bocavirus humano (NC_007455), coronavirus 229E humano (NC_002645), coronavirus HKUl humano (NC_006577), coronavirus NL63 humano (NC_005831), coronavirus oC43 humano (NC_005147), enterovirus A humano (NC_001612), enterovirus B humano (NC_001472), enterovirus C humano (NC_001428), enterovirus D humano (Nc_001430), eritrovirus V9 humano (NC_004295), virus espumoso humano (NC_00l 736), herpesvirus 1 humano (virus del herpes simple de tipo 1) (NC_001806), herpesvirus 2 humano (virus del herpes simple de tipo 2) (NC_001798), herpesvirus 3 humano (virus de varicela zoster) (NC_001348), virus del herpes simple humano de tipo 1 (virus de Epstein-Barr de tipo 1) (NC_007605), herpesvirus 4 humano de tipo 2 (virus de Epstein-Barr de tipo 2) (NC_009334), herpesvirus humano 5 cepa AD169 (NC_001347), herpesvirus humano 5 cepa Merlin (NC_006273), herpesvirus humano 6A (NC_001664), herpesvirus humano 6B (NC_000898), herpesvirus humano 7 (NC_001716), herpesvirus humano 8 tipo M (NC_003409), herpesvirus humano 8 tipo P (NC_009333), virus de la inmunodeficiencia humana 1 (NC_001802), virus de la inmunodeficiencia humana 2 (NC_001722), metapneumovirus humano (NC_004148), virus del papiloma humano -1 (NC_001356), virus del papiloma humano -18 (NC_001357), virus del papiloma humano -2 (nC_001352), virus del papiloma humano -54 (NC_001676), virus del papiloma humano -61 (NC_001694), virus del papiloma humano -cand90 (NC_004104), virus del papiloma humano RTRX7 (NC_004761), virus del papiloma humano de tipo 10 (NC_001576), virus del papiloma humano de tipo 101 (NC_008189), virus del papiloma humano de tipo 103 (NC_008188), virus del papiloma humano de tipo 107 (Nc_009239), virus del papiloma humano de tipo 16 (NC_001526), virus del papiloma humano de tipo 24 (NC_001683), virus del papiloma humano de tipo 26 (NC_001583), virus del papiloma humano de tipo 32 (NC_001586), virus del papiloma humano de tipo 34 (NC_001587), virus del papiloma humano de tipo 4 (Nc_001457), virus del papiloma humano de tipo 41 (NC_001354), virus del papiloma humano de tipo 48 (NC_001690), virus del papiloma humano de tipo 49 (NCJ001591), virus del papiloma humano de tipo 5 (NC_001531), virus del papiloma humano de tipo 50 (NC_001691), virus del papiloma humano de tipo 53 (NC_001593), virus del papiloma humano de tipo 60 (NC_001693), virus del papiloma humano de tipo 63 (NC_001458), virus del papiloma humano de tipo 6b (NC_001355), virus del papiloma humano de tipo 7 (NC_001595), virus del papiloma humano de tipo 71 (Nc_002644), virus del papiloma humano de tipo 9 (NC_001596), virus del papiloma humano de tipo 92 (NC_004500), virus del papiloma humano de tipo 96 (NC_005134), virus de parainfluenza humano 1 (NC_003461), virus de parainfluenza humano 2 (NC_003443), virus de parainfluenza humano 3 (NC_001796), parechovirus humano (NC_001897), parvovirus 4 humano (NC_007018), parvovirus humano B19 (NC_000883), virus sincitial respiratorio humano (NC_00l 781), rinovirus A humano (NC_001617), rinovirus B humano (NC_001490), spumaretrovirus humano (NC_00l 795), virus linfotropico T 1 humano (NC_001436), virus linfotropico T 2 humano (NC_001488).
En determinados ejemplos, el acido nucleico diana o proteina diana (por ejemplo, una proteina producida por un acido nucleico diana (por ejemplo, acido nucleico genomico diana)) es de un virus oncogenico, por ejemplo, el virus de Epstein-Barr (EBV) o un virus del papiloma humano (HPV, por ejemplo, HPV16, HPV18). En otros ejemplos, la proteina diana producida a partir de una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, secuencia de acido nucleico genomico diana) es de un virus patogenico, por ejemplo, un virus sincitial respiratorio, un virus de hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis C), un coronavirus (por ejemplo, el virus del SRAS), un adenovirus, un poliomavirus, un citomegalovirus (CMV) o un virus del herpes simple (HSV).
La divulgacion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1
Sintesis de un conjugado de nanoparti'cula de oro-anticuerpo Sintesis de AuNP
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Se introdujo agua (30 ml) a la que se habia inyectado N2 en un matraz de 500 ml de fondo redondo equipado con una gran barra de agitacion ovalada y nitrogeno. A continuacion, se anadieron 0,5 g (1,27 mmol) de HAuCL al matraz de reaccion y se agito hasta que se solubilizo toda la sal. A continuacion, se anadieron 30 ml de tolueno a la que se habia inyectado N2; seguido de 0,700 gramos del agente de transferencia de fases, bromuro de tetraoctilamonio (TOABr). La mezcla se agito hasta que el acido aurico se transfirio desde la fase acuosa a la fase organica. Una vez completada la transferencia de fase del acido aurico, se anadieron 1,15 g de trifenilfosfina (TPP) y se agitaron energicamente hasta que aparecio una suspension blanca, momento en el que continuo la agitacion durante 10-15 minutos. Toda la agitacion se realizo a una velocidad que mezclo las capas acuosa y organica.
En un recipiente separado, se prepararon 0,72 g de NaBH4 en 5 ml de agua y se agitaron suavemente hasta que se disolvio todo el agente reductor. La solucion de NaBH4 se anadio rapidamente al matraz de reaccion con agitacion rapida durante 3 horas. El sistema se cerro de forma estanca con un burbujeador para descargar el gas producido en esta reaccion.
Al final de la reaccion, la mezcla de reaccion se transfirio a un embudo de separacion y se separo la capa acuosa. La capa organica se lavo tres veces con 100 ml de agua o hasta que la capa acuosa estaba transparente. En caso de que se formara una emulsion, se anadiria salmuera o citrato trisodico para romperla.
El tolueno se evaporo a presion reducida (evaporador rotatorio) hasta que quedo un solido negro. El material se resuspendio en hexanos (mediante lo cual se deshicieron los agregados) y se transfirio a una frita de vidrio sinterizado fina o media de 250 a 500 ml en un matraz Erlenmeyer de vacio. Los hexanos se retiraron por filtracion del precipitado y se lavaron tres veces con 100 ml de hexanos. A continuacion, el precipitado se lavo cinco veces con 100 ml de agua:metanol en una relacion de 2:1, cinco veces con 100 ml de agua, cinco veces con 100 ml de agua:metanol en una relacion de 3:2 y, despues, cinco veces con 100 ml de agua. Se realizo un lavado final de cinco porciones de 100 ml de hexanos. Para la purificacion adicional, los solidos se transfirieron a un matraz y se volvieron a solvatar en 20 ml de diclorometano. Esto se sometio a ultrasonidos durante 5 minutos y, a continuacion, se anadieron lentamente hexanos hasta que se enturbio la solucion. La solucion se transfirio a tubos de centrifuga y se recogieron los solidos a 2500 rpm. En caso necesario, esta solvatacion y precipitacion se realizo otra vez para purificar aun mas el material.
El espectro de absorcion UV-Vis se midio a 250-750 nm. La absorbancia a 520 nm se inspecciono para determinar si habia una banda pre-SPR. Esto indico una nanoparticula a aproximadamente entre 1,5 nm y 2 nm. Se midio la absorbancia a 460 nm para determinar la concentracion y la cantidad de muestra en solucion utilizando el coeficiente de extincion de 64.000 (cm-1)(M-1).
Conversion de AuNP en nanoparti'culas solubles en agua
Se anadieron AuNP (50 mg) a un matraz de 250 ml de fondo redondo equipado con una gran barra de agitacion ovalada y una via de nitrogeno. A continuacion, se anadieron 20 ml de diclorometano y se agitaron hasta que los AuNP estaban en solucion. Despues, al matraz de reaccion se anadieron 30 ml de agua a la que se habia inyectado N2, seguido de 50 mg de bis-(sulfonatofenil)fenilfosfina (BSPP); la reaccion se agito energicamente durante al menos 24 horas. Si el material no se habia transferido completamente a la fase acuosa, se anadieron otros 50 mg de BSPP y se agito durante otras 24 horas.
Una vez estuvo el material en la fase acuosa, el contenido de la reaccion se transfirio a un embudo de separacion y se elimino la capa organica. La fase acuosa se lavo con 20 ml de diclorometano y despues se filtro a traves de un filtro de 0,2 pm. Se elimino el agua a presion reducida y se almaceno el nanomaterial a -20 °C.
Conjugacion de AuNP con anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra
Se saco del congelador el material de AuNP y se llevo a temperatura ambiente. Se introdujeron 5 mg en un tubo Eppendorf® de 2 ml y se resuspendieron en 1 ml de tampon fosfato (PB) 20 mM a pH 7,4. El material se sometio a ultrasonidos durante 2-3 minutos y, suavemente, se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,2 pm para eliminar los agregados grandes. La solucion eluida se paso a traves de una columna de exclusion por tamanodesalado de tamano PD-10 (equilibrada con PB 20 mM a pH 7,4) para eliminar las moleculas pequenas y las sales.
Se preparo una solucion de ditiotreitol (DTT) mediante la adicion de 7,7 mg de DTT a 100 pl de agua. A continuacion, se introdujeron 1,5 mg de anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra en un tubo Eppendorf® de 2 ml y se anadieron 43,8 pl de solucion de DTT y se mezclaron a 4 °C durante 25 minutos La proteina reducida se separo del exceso de solucion de DTT usando una columna de exclusion por tamano-desalado de tamano PD-10 (equilibrada con PB 20 mM a pH 7,4). Despues, se recogieron diez fracciones de 500 pl y cada fraccion se midio mediante absorcion UV-Vis a 280 nm para determinar el contenido de proteina. Las fracciones que contenian proteina se combinaron y se anadieron a la solucion de AuNP. La solucion se mezclo suavemente a 4 °C durante 48 horas.
Se llevo a cabo una etapa de pre-purificacion de filtracion suave de la reaccion de conjugacion a traves de un filtro de jeringa de 0,2 pm antes de la purificacion final, que se realizo en un purificador AKTA SEC usando una columna de GE
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Superdex® 200 usando PB 20 mM a pH 7,4. El cromatograma se ajusto para medir la absorbancia a 280 nm y 460 nm y se recogieron fracciones de 500 pl. Se recogieron las fracciones debajo del pico principal (FIG. 2A). Despues de combinadas las fracciones, se realizo una filtracion final a traves de un filtro de jeringa de 0,2 pm para una etapa de purificacion final. Se efectuo absorcion en el UV-Vis para caracterizar el material a 280 nm y 460 nm para cuantificar las proporciones de proteina y AuNP y las concentraciones finales de conjugado (FIG. 2B). El conjugado de anticuerpo- nanoparticula resultante incluyo aproximadamente 3,5 nanoparticulas por anticuerpo.
Ejemplo 2
Sintesis de conjugados adicionales de nanoparti'cula-anticuerpo
Se sintetizaron nanoparticulas de platino (PtNP) como se describe en el Ejemplo 1 para las AuNP, excepto que se sustituyo el HAuCU por tetracloroplatinato de potasio. Tambien se sintetizaron nanoparticulas de paladio (PdNP) como se describe en el Ejemplo 1 para las AuNP, excepto que se sustituyo el HAuCU por tetracloropaladato de sodio. Finalmente, se sintetizaron nanoparticulas de oro-aleacion de paladio (AuPdNP) como se describe en el Ejemplo 1 para las AuNP, excepto que se sustituyo el HAuCU por 0,25 g (0,64 mmol) de HAuCU y 0,19 g (0,64 mmol) de Na2PdCU. La purificacion, el intercambio de ligandos y la conjugacion con los anticuerpos para cada uno se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Sintesis y caracterizacion de conjugados de fosfatasa alcalina-anticuerpo
Se produjo un conjugado de AP-anticuerpo mediante reaccion de maleimido-AP con un anticuerpo reducido. El numero de moleculas de AP por enzima se vario ajustando la relacion entre AP y el anticuerpo en la reaccion.
La AP (BBI Enzymes, Madison, WI) se sometio a intercambio de tampones a traves de una columna PD-10 equilibrada con tampon 1 de AP (Na3PO4 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCU 1 mM, ZnCU 0,1 mM, pH 7,5) para eliminar el tampon Tris. A continuacion, la AP se activo para la conjugacion mediante el tratamiento con un exceso molar de 50-100 veces de ester NHS de MAL-dPEG™12 (ester de succinimidilo del acido 1-maleinimido-3-oxo-77,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40- dodecaoxa-4-azatritetracontan-43-oico, Quanta Biodesign, Powell, OH) a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 60 minutos. La cromatografia de exclusion por tamano (SEC) usando una columna de Superdex® 200 10/300 GL equilibrada con tampon 2 de AP (Tris-HCl 0,1M, MgCU 1 mM, ZnCb 0,1 mM, pH 7,5) produjo la maleimido-AP purificada.
El anticuerpo anti-IgG de raton, anti-IgG de conejo, anticuerpo de raton anti-benzofurazan o anticuerpo de raton anti- DNP se incubo con DTT 25 mM a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 25 minutos. Despues de la purificacion a traves de una columna PD-10 de desalado (NaOAc 0,1 M, pH 5, 0), se obtuvo anticuerpo sin DTT con de cuatro a ocho tioles libres.
El anticuerpo tiolado purificado se combino con la maleimido-AP purificada en un exceso molar de tres veces de la maleimido-AP. La mezcla se incubo a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 16-18 horas. La SEC con una columna Superdex® 200 10/300 GL equilibrada con tampon 2 de AP produjo el conjugado de AP-anticuerpo purificado.
Para examinar los tipos de conjugados formados, se sintetizaron conjugados de AP-IgG con diferentes estequiometrias. En la sintesis se utilizaron relaciones de 1 de IgG:1 de AP a 1 de IgG:5 de AP. El conjugado de 1 IgG: 1 de AP se agrego completamente; se observo un precipitado. Cuando el sobrenadante se analizo mediante SEC, se observo un pico correspondiente a los materiales de gran tamano no resueltos por la columna. Las relaciones 1 IgG: 2 AP y 1 IgG: 3 AP dieron algunos materiales agregados, pero mostraron un segundo pico cuando se aislaron y funcionaron excepcionalmente bien en la tincion de tejidos. Estos conjugados funcionaron igual o mejor que un conjugado de AP de control que es una relacion de 1 IgG:1 AP (Ventana Medical Systems, n.° de catalogo: 253-4327). La relacion 1 de IgG:3 de AP a 1 de IgG:5 de AP exhibio mas fosfatasa alcalina sin reaccionar y funciono de manera equivalente al conjugado 1 de IgG: 2 de AP cuando se analizo en tejidos.
Ademas de la variacion de las estequiometrias entre AP e IgG, los conjugados se sintetizaron con una estequiometria diferente entre AP y ester de MAL dPEG™12 NHS(Mal). Una vez que han reaccionado con la IgG reducida, las reacciones se analizaron con SEC. Las reacciones de Mal 50X y 100X de IgG:3 de AP proporcionaron una mejor resolucion y dieron menos material de partida de AP libre-Mal. Otras relaciones mostraron niveles aumentados de agregacion y de complejos de AP-Mal sin reaccionar. En la tincion del tejido funcional, los conjugados de Mal IgG:3 AP 50X y 100X funcionaron mejor que el Mal en exceso 200X y 400X.
El tamano hidrodinamico de los conjugados de IgG-AP se analizo mediante dispersion de luz dinamica. La biodistribucion del tamano de los conjugados se muestra en la Tabla 1. Esto demuestra que el conjugado de IgG-AP hecho con una estequiometria 1:3 es mayor y contiene mas AP que el conjugado de AP de control.
Tabla 1. Analisis por dispersion de luz dinamica de los conjugados de IgG-AP
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- Muestra
- Tamano
- Anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo
- 9,6 nm
- Fosfatasa alcalina
- 7,6 nm
- Conjugado de IgG-AP de control (1 IgG: 1 AP)
- 15,95 nm
- Anticuerpo de cabra antiIgG de conejo:3 AP (sin diluir)
- 21,73 nm
- Anticuerpo de cabra anti IgG de conejo:3 AP (diluido a la concentracion del conjugado de control)
- 17,09 nm
Se realizo un ensayo de comparacion de la actividad enzimatica con tres conjugados de IgG-AP diferentes (dos lotes diferentes de IgG: 3 AP y un lote de IgG: 2 AP) y el conjugado de IgG-AP de control (1 IgG: 1 AP). La actividad enzimatica se midio a 405 nm usando un espectrofotometro Beckman DU-530 UV/VIS, con 4- nitrofenilfosfato como sustrato (vease, por ejemplo, ThermoScientific n.° de cat. TR11103). El conjugado de IgG:3 AP tenia 2,3 veces mas actividad enzimatica que el conjugado de control. El conjugado de IgG:2 AP tenia mayor actividad que el conjugado de control, pero solo la mitad que el del conjugado de lgG:3 AP (Tabla 2). Los dos lotes de IgG:3 AP funcionaron de forma equivalente.
Tabla 2. Ensayo de la actividad enzimatica
- Muestra
- Actividad enzimatica (U/ml)
- Conjugado de IgG-AP de control (1 IgG:1 AP)
- 4464
- Anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo: 3 AP (lote 1)
- 10.414
- Anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo: 3 AP (lote 2)
- 10.354
- Anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo: 2 AP
- 5908
El rendimiento de la AP intestinal bovina nativa se comparo con la AP recombinante producida en Pischia pastoris (Roche Diagnostics, n.° de cat. 03 359 123 001). La AP recombinante tenia un menor numero de isoenzimas y una N- glicosilacion ligeramente diferente en comparacion con la AP nativa. Tanto la AP nativa como recombinante se trataron con enlazador de MAL-dPEG™12 NHS y se purificaron con SEC. Los cromatogramas mostraron perfiles de retencion y elucion similares. Las AP modificadas con el enlazador se acoplaron despues a un anticuerpo de cabra anti-IgG de raton reducido con DTT. Los conjugados de AP-anticuerpo se purificaron mediante SEC y los perfiles de elucion de los conjugados tanto nativos como recombinantes fueron similares. Una evaluacion adicional del conjugado de AP recombinante-anticuerpo mediante tincion con ISH e IHC demostro una intensidad de senal y una especificidad similares en comparacion con el conjugado de AP nativa-anticuerpo. Esto demuestra que la AP recombinante se puede utilizar como alternativa a la AP nativa convencional.
Los conjugados de IgG-AP se analizaron mediante SDS-PAGE nativa y reductora. El conjugado de IgG-AP de control migro como dos bandas principales (de aproximadamente 290 kDa y 530 kDa) en un gel Novex de Bis-Tris al 4-16 % (Invitrogen, n.° de cat. BN2111BX10), mientras que los conjugados de IgG-AP producidos como se ha descrito anteriormente migraron mas lentamente con al menos dos bandas principales (de aproximadamente 450 kDa y 570 kDa) y una banda menor a aproximadamente 500 kDa (FIG. 3A). Los perfiles electroforeticos de los conjugados sintetizados con diferentes excesos molares del ester NHS de MAL-dPEG™12 fueron similares. El conjugado sintetizado con un exceso 2 molar de AP parecia haberse agregado en solucion, a diferencia de los conjugados que se sintetizaron con un exceso 3 molar de AP (FIG. 3A). Esto fue consistente con los datos de la SEC (anteriormente).
Los conjugados tambien se analizaron en un gel reductor NuPAGE Novex SDS de Tris-acetato al 3-8 %. Similar a los resultados de la PAGE nativa, el control del conjugado de IgG-AP migro mas rapido que los nuevos conjugados de AP. Los conjugados de IgG-AP sintetizados por los procedimientos actuales estaban representados por tres bandas principales con pesos moleculares que variaban de aproximadamente 430 a 710 kDa, en consonancia con la estequiometria de conjugacion de 1 IgG: 2 AP (aproximadamente 430 kDa) 1 IgG:3 AP (aproximadamente 570 kDa), y 1 IgG:4 AP (aproximadamente 710 kDa) (FIG. 3B). Los perfiles electroforeticos de los conjugados sintetizados con diferentes excesos molares de ester NHS de MAL-dPEG™12 fueron similares. El conjugado sintetizado con AP recombinante se represento mediante una banda principal a aproximadamente 710 kDa. Esta diferencia puede deberse al diferente patron de ramificacion de la manosa de la AP recombinante, lo que puede facilitar la conjugacion de mas moleculas de AP por anticuerpo y/o crear una estructura secundaria muy estable.
El numero de moleculas de AP por anticuerpo en el conjugado de AP-anticuerpo se determino marcando el anticuerpo
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con un marcador fluorescente. El anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo en tampon fosfato 20 mM (pH 7,4) se combino con ester NHS de Alexa Fluor® 610 (Life Technologies/Invitrogen, Carlsbad, CA) en DMSO y se roto 12-15 horas a temperatura ambiente. El conjugado resultante se purifico usando una columna de exclusion por tamano Superdex® 200 10/300 GL que se equilibro con tampon fosfato 20 mM (pH 7,4). El producto se diluyo en serie en tampon de fosfato y se tomaron lecturas en el UV a 280 y 610 nm. Se calculo el numero de moleculas de Alexa Fluor® 610 por anticuerpo. La sintesis de los conjugados anticuerpo de cabra contra IgG de conejo-Alexa Fluor® se realizo dos veces; se calculo el numero promedio de AP por anticuerpo y se calculo que era 3,15.
La conjugacion del anticuerpo marcado con fluorescencia con AP se realizo como se ha descrito anteriormente, utilizando una relacion de anticuerpo:AP de 1:2 o 1:3. Los conjugados se purificaron usando una columna Superdex® 200 10/300 GL y se calculo el numero de AP por anticuerpo. El conjugado sintetizado con una relacion 1:2 de anticuerpo:AP tenia 1,67 AP por anticuerpo. El conjugado sintetizado con una relacion 1:3 de anticuerpo:AP tenia 2,6 AP por anticuerpo. Esto confirma que se pueden conjugar multiples moleculas de AP con un anticuerpo y que el numero se puede ajustar cambiando la estequiometria de los reactivos.
Ejemplo 4
Hibridacion in situ utilizando conjugados de anticuerpo-nanoparti'cula de oro
Una evaluacion del nuevo kit de deteccion de AP-plata frente a un sistema de deteccion de HRP se realizo utilizando una sonda del cromosoma 17 en lineas celulares de xenoinjerto. La tincion en portaobjetos se realizo en un Instrumento BenchMark® XT automatizado (Ventana Medical Systems, Inc. (VMSI)) usando portaobjetos con xenoinjerto con HER2 3-en-1 (N.° de cat. de VMSI 783-4332). Brevemente, los portaobjetos de tejido incluidos en parafina y fijados con formalina (FFPE) se calentaron a 75 °C durante 4 minutos, se trataron dos veces con EZPrep™ (10X, N.° de cat. de VMSI 950-102) y se cubrieron mediante la aplicacion de cubreobjetos liquido (N.° de cat. de VMSI650-010). Despues de cubrir, los portaobjetos de tejidos se calentaron a 76 °C durante 4 minutos, se aclararon con EZPrep™ y se volvio a aplicar cubreobjetos liquido para la desparafinizacion de los tejidos. El portaobjetos se enfrio a 37 °C, se incubo durante 4 minutos y se aclaro con tampon de reaccion (10X, N.° de cat. de VMSI 950-300).
Una vez aclarado con tampon de reaccion, los portaobjetos de tejidos se calentaron a 95 °C y se pretrataron con solucion de acondicionado celular n.° 1 (CC1, N.° de cat. de VMSI 950-124) para los ciclos de 8, 12 y 8 minutos, donde el cubreobjetos liquido se aplico entre cada aplicacion de CC1/ciclo. Despues de completar un ciclo con CC1, los portaobjetos se calentaron a 37 °C, se incubaron durante 4 minutos y se aclararon una vez con tampon de reaccion. Las muestras de tejido se trataron con proteasa mediante la aplicacion de ISH-Proteasa 3 (N.° de cat. de VMSI 780 a 4.149) durante 4 minutos, se aclararon con tampon de reaccion para eliminar la proteasa y, finalmente, se aclararon con SSC (10X, N.2 de cat. de VMSI 950-110).
A los portaobjetos de tejido tratados con proteasa se anadio solucion de deteccion de hibridacion in situ con plata (VMSI, kit de deteccion ultraView™ SISH n.° 780-001), los portaobjetos se incubaron durante 4 minutos y la sonda de ADN marcada con HER2 DNP (N.° de cat. de VMSI 780-4332) o la sonda del cromosoma 17 (Chrl 7) (N.° de cat. de VMSI 780-4331) se aplico al portaobjetos adecuado. Despues de la aplicacion de la sonda, los portaobjetos se incubaron durante 4 minutos, seguidos de la desnaturalizacion del acido nucleico a 95 °C durante 12 minutos. Despues se aplico el cubreobjetos liquido sobre los portaobjetos y se dejo que se produjera la hibridacion durante 2 horas a 52 °C (sonda de HER2) o 44 °C durante 2 horas (sonda de Chrl7).
Despues de la hibridacion, los portaobjetos se aclararon en SSC, se lavaron tres veces a 72 °C durante 8 minutos cada uno usando 2X SSC, momento en el cual se detuvo el calentamiento de los portaobjetos y se dejo enfriar los portaobjetos. Una vez enfriados, los portaobjetos se aclararon en tampon de reaccion y se calentaron a 37 °C durante 4 minutos, despues de lo cual se aplico anticuerpo de conejo anti-DNP (N.° de cat. de VMSI780-4335), los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos liquido y se incubaron a 37 °C durante 20 minutos. Despues de la incubacion, los portaobjetos se aclararon dos veces con tampon de reaccion, se aplicaron 15 pg/ml de conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina (Ejemplo 3) y los portaobjetos se incubaron otros 32 minutos a 37 °C. Despues de la incubacion, los portaobjetos se lavaron cuatro veces con tampon de reaccion. A continuacion, se aplico conjugado de anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra 100 nM-nanoparticula (ejemplo 1) y los portaobjetos se incubaron a 37 °C durante otros 32 minutos antes de lavar tres veces con tampon de Tris-acetato 0,1 M a pH 9,0.
Para detectar los acontecimientos de hibridacion sonda/diana, se anadio nitrato de plata 50 mM y BCIP 1,3 mM a los portaobjetos y los portaobjetos se incubaron a 37 °C durante 20 minutos despues de cubrir con cubreobjetos liquido. El acondicionado con oro se realizo mediante lavado de los portaobjetos dos veces en tampon Tris, aplicacion de aproximadamente 100 pl de solucion al 0,2 % de cloruro de oro, cubreobjetos e incubacion de los portaobjetos durante 4 minutos a 37 °C. Los portaobjetos se aclararon dos veces en tampon Tris, se volvio a aplicar nitrato de plata, se aplico el cubreobjetos liquido y los portaobjetos se incubaron durante 4 minutos adicionales para efectuar la amplificacion de la senal. Despues de un lavado adicional con tampon Tris, la deposicion de la senal de deteccion se fijo mediante la aplicacion de tiosulfato de sodio a los portaobjetos. Tras una incubacion de 4 minutos con tiosulfato de sodio, los portaobjetos se aclararon en tampon de reaccion y se realizo tincion de contraste mediante la aplicacion y la incubacion con hematoxilina Hematoxylin II (N.° de cat. de VMSI 790 a 2208) y cubreobjetos liquido durante 4 minutos. Se anadio
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Bluing Reagent (N.° de cat. de VMSI 760-2037) despues de lavar la hematoxilina II y el cubreobjetos liquido de los portaobjetos y despues de unos 4 minutos adicionales de incubacion se termino la tincion de contraste.
Una vez completadas la tincion y la tincion de contraste, se retiraron los portaobjetos del instrumento, se lavaron con detergente, se deshidrataron a traves de una serie graduada de soluciones de alcohol y xileno, se aplico un cubreobjetos solido al porta y, finalmente, se vieron los portaobjetos al microscopio de campo claro.
Los portaobjetos tenidos se analizaron para determinar la tincion de fondo/no especifica, la intensidad de la senal y la sensibilidad. En ambos casos, la deteccion de plata utilizando el conjugado de anticuerpo-nanoparticula de oro sintetizado como en el Ejemplo 1 y el conjugado de IgG-AP sintetizado como en el Ejemplo 3 exhibieron una mayor intensidad de la senal con niveles de fondo iguales a los del sistema de deteccion de HRP convencional (FIG. 4). Los dos sistemas tambien se compararon usando tejido de carcinoma de mama con las sondas HER2 y del cromosoma 17. En el caso de la sonda del cromosoma 17, se observo una alta calidad de deteccion, intensidad de la senal y claridad similares en el carcinoma de mama y en los xenoinjertos. Para la sonda de HER2, el nuevo procedimiento supero al sistema de deteccion de HRP convencional con un mayor numero de celulas detectadas y una mayor intensidad de la senal sin fondo apreciable (FIG. 5).
Para determinar el efecto del conjugado de anticuerpo-nanoparticula en la tincion de tejidos, los xenoinjertos Calu se tineron para la sonda de acido ribonucleico HER2 con y sin el conjugado de anticuerpo-nanoparticula en un sistema de SISH con AP. La tincion del portaobjetos se realizo en un Instrumento XT BenchMark® automatizado. Brevemente, los portaobjetos que contenian tejido Calu 3 FFPE se calentaron a 75 °C durante 4 minutos, se trataron dos veces con EZPrep™, y se cubrieron mediante la aplicacion de cubreobjetos liquido. Despues de cubrir, los portaobjetos de tejidos se incubaron a 75 °C durante 16 minutos, se aclararon con EZPrep™ y se volvio a aplicar cubreobjetos liquido para la desparafinizacion de los tejidos. Los portaobjetos se enfriaron a 37 °C, se incubaron durante 4 minutos y se aclararon con SSC. Se aplico una gota (aproximadamente 100 pl) de reactivo RiboPrep™ (VMSI, RiboMap® Kit n.° de cat. 760102) a los portaobjetos, se aplico el cubreobjetos liquido y los portaobjetos se incubaron durante 32 minutos a 37 °C. Despues de la incubacion, los portaobjetos se aclararon en EZPrep ™, se aplico RiboClear ™ (aproximadamente 100 pl, un componente de RiboMap® Kit) y los portaobjetos se incubaron otros 12 minutos a 37 °C despues de la aplicacion de cubreobjetos liquido.
El tampon de reaccion se utilizo para aclarar los portaobjetos dos veces, se volvio a aplicar el cubreobjetos liquido y los portaobjetos se incubaron a 90 °C durante 8 minutos, despues de lo cual se aclararon los portaobjetos y se aplico ISH- Proteasa 3 una vez enfriada la temperatura a 37 °C y los portaobjetos se incubaron durante 4 minutos. Despues de la digestion de la proteasa, los portaobjetos se aclararon tres veces con tampon de reaccion, se aplicaron 100 pl de sonda de ARN marcada con DNP para HER2 junto con solucion de hibridacion de deteccion de SISH, los portaobjetos se incubaron durante 12 minutos a 80 °C y se aplico un cubreobjetos liquido y se dejo proceder la hibridacion durante 6 horas a 65 °C. Despues de la hibridacion, los portaobjetos se enjuagaron con EZPrep ™ y se realizaron tres lavados rigurosos de 0,1 X SSC a 8 minutos por lavado a 75 °C. Despues de los lavados, los portaobjetos se aclararon en EZPrep™ y se aplicaron aproximadamente 100 pl de RiboFix™ (un componente de RiboMap® Kit), se aplico el cubreobjetos liquido y los portaobjetos se incubaron a 37 °C durante 32 minutos.
Se aplicaron a los portaobjetos aproximadamente 100 pl (1 gota) de anticuerpo de conejo anti-DNP, seguido de cubreobjetos liquido, que se incubaron a 37 °C durante 20 minutos adicionales, punto en el que los portaobjetos se lavaron dos veces en tampon de reaccion, se aplicaron 15 pg/ml de conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina recombinante (Ejemplo 3), los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos liquido y la incubacion tuvo lugar a 37 °C durante 32 minutos. Despues de lavar los portaobjetos tres veces en tampon de reaccion, se aplico el conjugado de anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra-nanoparticula de oro 100 nM (Ejemplo 1) y la incubacion continuo durante otros 32 minutos. Los portaobjetos se lavaron en tampon Tris 0,1 M a pH 9,0, se aplicaron nitrato de plata y BCIP, se aplico el cubreobjetos liquido y la incubacion procedio durante 32 minutos. Se aplicaron cloruro de oro y cubreobjetos liquido despues de lavar los portaobjetos con tampon Tris, seguido de 4 minutos de incubacion. Despues de dos lavados de tampon Tris, se volvio a aplicar nitrato de plata, asi como cubreobjetos liquido y los portaobjetos se incubaron 4 minutos mas, seguido de un lavado con tampon Tris. Se aplicaron tiosulfato de sodio y cubreobjetos liquido, los portaobjetos se incubaron durante 4 minutos, se lavaron con tampon de reaccion, se sometieron a tincion de contraste con hematoxilina II, se lavaron y se cubrieron con cubreobjetos para el analisis final con microscopia de campo claro.
La tincion de tejidos mostro que cuando el conjugado de anticuerpo-nanoparticula estaba ausente del sistema de deteccion, la senal era difusa y contenia una tonalidad marron, dificultando la observacion de la senal. Era necesario un aumento mayor para observar la senal y la tincion sin el conjugado de anticuerpo-nanoparticula no detecto todas las senales positivas en el tejido. Sin embargo, cuando el conjugado de anticuerpo-nanoparticula se incluyo en el sistema de deteccion, la senal se hizo nitida y negra. Mas celulas eran positivas y eran mas faciles de diferenciar basandose en el contraste nitido proporcionado por la senal negra y en las senales producidas por la mayor sensibilidad (FIG. 6). Por lo tanto, el conjugado de anticuerpo-nanoparticula mejoro significativamente la sensibilidad del sistema de deteccion basado en AP y el sistema pudo usarse para detectar ribosondas.
Los experimentos anteriores con la sonda de HER2 mostraron la presencia de fondo en el nucleo de la celula (conocido
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como "polvo"). Para determinar si este fondo se debia a la sonda de HER2 o al sistema de deteccion con AP-plata, la rigurosidad de la temperatura de lavado se aumento y vario de 68 °C a 77 °C, 82 °C y 87 °C. A medida que la temperatura de los lavados aumentaba, la formacion de polvo se disipo, lo que implica que la sonda de HER2 contenia una gran cantidad de secuencias no especificas marcadas con DNP que se hibridaron con el ADN y causaron el fondo. Esto apoya aun mas el aumento de la sensibilidad del sistema de deteccion con AP-plata. El sistema de deteccion con AP-plata fue capaz de detectar estas pequenas secuencias haptenadas que estaban unidas no especificamente. Aunque el aumento de la temperatura remedio la cantidad de polvo observado, hizo que algunas sondas unidas especificamente se separaran de su secuencia diana. Un aumento en la temperatura durante los lavados de rigurosidad puede aliviar de este modo la tincion de fondo y no especifica, pero tambien puede disminuir la senal especifica.
Ejemplo 5
Comparacion bioestadistica de SISH con anticuerpo-nanoparti'cula e ISH con HRP
Se usaron treinta casos de cancer de mama para comparar el sistema de deteccion con AP-plata divulgado con el kit de SISH con HRP actual. Se evaluaron secciones en serie de cada caso tanto para HER2 como para el cromosoma 17 (Chrl7) usando el sistema de deteccion con AP-plata y el kit de deteccion de SISH con HRP como se describe en el Ejemplo 4. Una vez tenidos los portaobjetos y cubiertos con cubreobjetos, fueron evaluaron a ciegas por dos lectores de portaobjetos expertos diferentes. Se instruyo a los lectores a que enumeraran los recuentos de copias de HER2 y Chrl7 a traves del "procedimiento cowboy', que requiere que el lector estime el numero medio de copias para cada sonda que se esta observando. Estos numeros se registraron y se utilizaron para el analisis. Si la senal era demasiado escasa o si el tejido observado no podia enumerarse, se considero que la tincion del tejido era inadecuada.
Las puntuaciones de la muestra de tejido para cada lector se muestran en las FIG. 7A y B (Chrl 7) y las FIG. 8A y B (HER2). stos resultados se utilizaron para calcular la relacion de copias de HER2/Chrl 7. Si la relacion de copias era mayor que o igual a 2, la muestra se considero HER2 positiva. Si la muestra de HER2 o Chrl7 se considero inadecuada, la relacion tambien se considero inadecuada. Los resultados se tabularon para mostrar la distribucion del estado de HER2 determinado por los dos lectores (Tablas 3 y 4).
Tabla 3. Tabla de concordancia de los resultados del Lector 1
- Deteccion con Ag y AP
- Inadecuada
- Negativa Positiva Total
- SISH con HRP
- Inadecuada 10 4 3 17
- Negativa
- 1 4 0 5
- Positiva
- 1 0 7 8
- Total
- 12 8 10 30
La Tabla 3 muestra que Lector 1 fue capaz de interpretar las muestras tenidas con el sistema de deteccion con AP-plata que se consideraban inadecuadas cuando se tineron con el kit de SISH con HRP. Siete casos que eran inadecuados para la SISH con HRP pudieron determinarse con el sistema de deteccion con AP-plata, mientras que solo dos casos que eran inadecuados para el sistema de deteccion con AP-plata pudieron analizarse con el kit de SISH con HRP.
Tabla 4. Tabla de concordancia de los resultados del Lector 2
- Deteccion con Ag y AP
- Inadecuada
- Negativa Positiva Total
- SISH con HRP
- Inadecuada 13 1 0 14
- Negativa
- 1 7 2 10
- Positiva
- 0 0 6 6
- Total
- 14 8 8 30
La Tabla 4 muestra que Lector 2 interpreto los portaobjetos tenidos con cada sistema de una forma casi identica, a excepcion de 2 casos, que dieron un resultado negativo con la SISH con HRP, pero positivo con el sistema de deteccion con AP-plata. En cada caso, la discordancia se puede atribuir al procedimiento "cowboy que se le impuso al lector para leer el portaobjetos. Este procedimiento se basa en un enfoque mas liberal de calcular el numero medio de copias haciendo que el lector calcule el numero de cabeza. Por otra parte, no hay ninguna garantia de que los lectores utilizaran exactamente la misma area del tejido al dar sus puntuaciones.
Las puntuaciones dadas por cada lector para cada sistema de deteccion se tabularon para comprobar la reproducibilidad de los resultados entre los dos lectores diferentes. La Tabla 5 muestra que hubo un desacuerdo entre los lectores al observar las muestras de tejido que se tineron con SISH con HRP (kappa = 0,5213). Los lectores
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coincidieron mas en su puntuacion cuando se utilizo el sistema de deteccion con AP-plata (Tabla 6, kappa = 0,6429).
Tabla 5. Comparacion de las puntuaciones de SISH con HRP entre los lectores
- Lector 2
- Inadecuada
- Negativa Positiva Total
- Lector 1
- Inadecuada 12 3 2 17
- Negativa
- 0 5 0 5
- Positiva
- 2 2 4 8
- Total
- 14 10 6 30
Tabla 6. Comparacion de las puntuaciones de deteccion con AP-plata entre los lectores
- Lector 2
- Inadecuada
- Negativa Positiva Total
- Lector 1
- Inadecuada 10 2 0 12
- Negativa
- 1 6 1 8
- Positiva
- 3 0 7 10
- Total
- 14 8 8 30
Ejemplo 6
Hibridacion in situ utilizando conjugados de anticuerpo-nanoparti'cula de aleacion de oro y paladio
La hibridacion in situ de HER2 se llevo a cabo como en el Ejemplo 4, excepto que las muestras de tejido mamario o de la linea celular de cancer de mama ZR-75-1 se incubaron con conjugado de AuNP-anticuerpo 100 nM, conjugado de AuPdNP-anticuerpo 100 nM o conjugado de AuPdNP-anticuerpo 50 nM. La tincion de HER2 utilizando el conjugado de AuPdNP-anticuerpo era especifica, pero era mas debil que la obtenida utilizando el conjugado de AuNP-anticuerpo (FIG. 9A-F).
Ejemplo 7
Inmunohistoquimica utilizando conjugados de anticuerpo-nanoparti'cula de oro
Una evaluacion del nuevo sistema de deteccion con AP-plata frente a un sistema de deteccion con HRP se realizo en tejido de carcinoma de mama usando diversos biomarcadores de proteinas. La evaluacion se llevo a cabo en muestras de tejido de carcinoma ductal infiltrante de mama. Se usaron anticuerpos anti-receptor de estrogenos (ER), anti-Ki-67, y anti-receptor de progesterona (PR) como anticuerpos primarios en el protocolo sin acondicionado con oro.
La tincion de portaobjetos se realizo en un Instrumento XT BenchMark® automatizado como se describe en el Ejemplo 4, a excepcion de los siguientes cambios. Despues de la desparafinizacion, se sometio a los portaobjetos a acondicionado celular estandar con CC1, de tal manera que se sometio a los portaobjetos a una serie de 13 reaplicaciones de cubreobjetos de CC1/liquido a 100 °C, despues de lo cual se dejo que los portaobjetos se enfriaran durante 3 minutos y se aclararon en tampon de reaccion tres veces. Se anadieron anticuerpos primarios a los portaobjetos apropiados para la identificacion de las proteinas diana: anticuerpo de conejo anti-Ki67 (SPl; N.° de cat. de VMSI 790-4325), anticuerpo de conejo anti-ER (SPl; N.° de cat. de VMSI 790-4325), anticuerpo de conejo anti-PR (1E2, N.° de cat. de VMSI 790-4296), anticuerpo de conejo anti-HER2 (4B5, N.° de cat. de VMSI 790-2991) en muestras de tejido mamario y anticuerpo de conejo anti-BCL2 (N.° de cat. de VMSI760-4240) en tejido de las amigdalas y los portaobjetos se incubaron durante 16 minutos a 37 °C despues de la aplicacion de cubreobjetos liquido.
Despues de lavar los portaobjetos con tampon de reaccion dos veces, se anadieron 15 pg/ml de conjugado de anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra-fosfatasa alcalina recombinante (Ejemplo 3) a los portaobjetos. Seguidamente se aplico cubreobjetos liquido y se incubaron durante 16 minutos a 37 °C. A continuacion, se aplico conjugado de anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra-nanoparticula de oro 100 nM (ejemplo 1) como en el ejemplo 4. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron dos veces en tampon Tris acetato 0,1 M a pH 9,0, a continuacion, se aplicaron nitrato de plata y BCIP, se volvio a aplicar cubreobjetos liquido y los portaobjetos se incubaron 16 minutos adicionales. Los portaobjetos se lavaron, se acondiciono el oro con cloruro de oro, se fijo con tiosulfato de sodio (excepto para las muestras mostradas en la FIG. 10) y se realizo tincion de contraste con hematoxilina II como se ha descrito anteriormente. Para la tincion de contraste rojo, se incubo Fast Red nuclear (N.° de cat. de VMSI 280-2119) en los portaobjetos adecuados durante 4 minutos. Los portaobjetos se deshidrataron, se cubrieron con cubreobjetos y se prepararon para visualizar con microscopia de campo claro.
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Todas las muestras mostraron una buena cantidad de senal, aunque habia cierta turbidez de fondo (FIG. 10). Se usaron anticuerpos anti-HER-2/neu, anti-ER, anti-Ki-67 y anti-PR como anticuerpos primarios en el protocolo, incluyendo las etapas de acondicionado con oro y de fijacion. Se observo una senal especifica para todos los anticuerpos primarios (FlG. 11). La etapa de acondicionado con oro mejoro significativamente la calidad de la tincion al eliminar la neblina de fondo e intensificar la senal.
El novedoso sistema de deteccion con plata-AP tambien se evaluo en tejido de carcinoma de mama con una expresion baja de PR. El nuevo sistema se comparo con el kit de deteccion iView™ DAB (VMSI, n.° de cat. 760-091), usando anticuerpo anti-PR(16) como anticuerpo primario. El nuevo sistema ha demostrado una mayor sensibilidad sin fondo apreciable.
Por ultimo, el novedoso sistema de deteccion con AP-plata se evaluo en tejido de las amigdalas. El nuevo sistema se comparo con el kit de deteccion iView™ DAB, usando anticuerpo anti-Bcl-2 como anticuerpo primario (FIG. 12). Se utilizaron tinciones de contraste tanto con Fast Red como con Bluing/hematoxilina con el sistema de deteccion de AP- plata.
Ejemplo 8
Inmunohistoquimica utilizando conjugados de anticuerpo-nanoparti'cula de aleacion de oro y paladio
La inmunohistoquimica se realizo como en el ejemplo 7, a excepcion de que las muestras de tejido se incubaron con conjugado de AuNP-anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra 100 nM, conjugado de AuPdNP-anticuerpo de conejo anti- IgG de cabra 100 nM o conjugado de AuPdNP-anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra 50 nM o conjugado de AuPdNP- anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra 50 nM. La tincion con conjugado de anticuerpo-AuPdNP 100 nM o 50 nM era detectable, pero no tan fuerte como la que se obtiene utilizando el conjugado de AuNP-anticuerpo. La tincion no fue detectable cuando se utilizo conjugado de AuPdNP-anticuerpo 10 nM.
Ejemplo 9
Procedimientos de inmunohistoquimica de ejemplo
Este ejemplo proporciona procedimientos de ejemplo para IHC utilizando los procedimientos divulgados, incluyendo el uso de conjugados de anticuerpo-nanoparticula. Un esquema del procedimiento se muestra en la FIG. 1A. Sin embargo, un experto en la tecnica apreciara que los procedimientos que se desvian de estos procedimientos especificos tambien se pueden utilizar para llevar a cabo con exito procedimientos de IHC usando conjugados de anticuerpo-nanoparticula.
Se preparan muestras de tejido para IHC, incluyendo desparafinizacion y recuperacion del antigeno y/o digestion con proteasas utilizando procedimientos convencionales. La muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario que se une especificamente a una proteina diana (por ejemplo, HER2/neu), seguido de un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (por ejemplo, un anticuerpo secundario conjugado con tres moleculas de AP). A continuacion, la muestra se pone en contacto con un anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas de oro; el anticuerpo es uno que se une especificamente al anticuerpo secundario. A continuacion, la muestra se pone en contacto con un sustrato de AP (por ejemplo, BCIP), seguido de un compuesto de plata (por ejemplo, nitrato de plata). Despues, se somete a la muestra a acondicionado con oro (por ejemplo, tratamiento con cloruro de oro), seguido de fijacion de la senal con un agente reductor (por ejemplo, tiosulfato de sodio). La proteina diana se puede detectar mediante la deteccion del precipitado de metal formado mediante la deposicion de atomos de plata en el sitio de la nanoparticula de oro. El precipitado de metal se puede detectar, por ejemplo, mediante microscopia de campo claro, donde aparece como un deposito negro.
Ejemplo 10
Procedimientos de hibridacion in situ de ejemplo
Este ejemplo proporciona procedimientos de ejemplo para ISH utilizando los procedimientos divulgados, incluyendo el uso de conjugados de anticuerpo-nanoparticula. Un esquema del procedimiento se muestra en la FIG. 1B. Sin embargo, un experto en la tecnica apreciara que tambien se pueden utilizar procedimientos que se desvian de estos procedimientos especificos para llevar a cabo con exito procedimientos de ISH usando conjugados de anticuerpo- nanoparticula.
Se preparan muestras de tejido para ISH, incluyendo desparafinizacion y digestion con proteasas utilizando procedimientos convencionales. La muestra se pone en contacto con una sonda marcada con hapteno que se une especificamente a la molecula de acido nucleico diana (por ejemplo, HER2/neu), seguido de lavados de rigurosidad adecuada. A continuacion, la muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario que se une especificamente al hapteno (por ejemplo, dinitrofenilo), seguido de un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (por ejemplo, un anticuerpo secundario conjugado con tres moleculas de AP). Despues, la muestra se pone en contacto con un anticuerpo conjugado con una o mas nanoparticulas de oro; el anticuerpo es uno que se une especificamente al
anticuerpo secundario. A continuacion, la muestra se pone en contacto con un sustrato de AP (por ejemplo, BCIP), seguido de un compuesto de plata (por ejemplo, nitrato de plata).
A continuacion, la muestra se somete a acondicionado con oro (por ejemplo, tratamiento con cloruro de oro), seguido de 5 la amplificacion de la senal (por ejemplo, mediante tratamiento con un compuesto de plata, por ejemplo, nitrato de plata) y fijacion de la senal con un agente reductor (por ejemplo, tiosulfato de sodio). La molecula de acido nucleico diana se puede detectar mediante la deteccion del precipitado de metal formado mediante la deposicion de atomos de plata en el sitio de la nanoparticula de oro. El precipitado de metal se puede detectar, por ejemplo, mediante microscopia de campo claro, donde aparece como un deposito negro.
10
En vista de las muchas posibles realizaciones a las que se pueden aplicar los principios de la divulgacion, debe reconocerse que las realizaciones ilustradas solo son ejemplos y no se tomaran como limitantes del alcance de la invencion, sino que el alcance de la invencion se define por las siguientes reivindicaciones.
Claims (22)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para detectar una molecula diana en una muestra, que comprende: poner en contacto una muestra con un primer anticuerpo que se une a la molecula diana;poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que las moleculas de enzima son capaces de producir al menos un producto capaz de reducir los iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero y en el que el segundo anticuerpo se une especificamente al primer anticuerpo;poner en contacto la muestra con un tercer anticuerpo, en el que el tercer anticuerpo es un conjugado de anticuerpo- nanoparticula que comprende dos o mas nanoparticulas unidas directamente a un anticuerpo a traves de un enlace metal-tiol y se une especificamente al segundo anticuerpo;poner en contacto la muestra con un sustrato de las moleculas de enzima y un ion metalico, de manera que se forme un precipitado de metal y se colocalice con la molecula diana; ydetectar el precipitado de metal, detectando de este modo la molecula diana.
- 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el segundo anticuerpo comprende ademas un hapteno y el tercer anticuerpo se une especificamente al hapteno del segundo anticuerpo.
- 3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que la molecula diana comprende una sonda de acido nucleico marcada con hapteno que se une especificamente a la molecula diana y en el que el primer anticuerpo se une especificamente a la sonda de acido nucleico marcada con hapteno.
- 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ion metalico comprende ion de plata, ion de oro, ion de cobre, ion de niquel, ion de platino, ion de paladio, ion de cobalto o ion de iridio.
-
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, ademas, poner en contacto la
muestra con una sal de haluro de oro, opcionalmente en el que la sal de haluro de oro comprende cloruro de oro. - 6. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que el procedimiento comprende ademas amplificar la senal, en el quela amplificacion de la senal comprende poner en contacto la muestra con una sal de plata, opcionalmente en el que la sal de plata comprende nitrato de plata, oxido de plata, acetato de plata o perclorato de plata.
-
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, ademas, poner en contacto lamuestra con un agente reductor, opcionalmente en el que el agente reductor comprende tiosulfato de sodio. - 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el segundo anticuerpo comprende un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina G de conejo o se conjuga con tres moleculas de fosfato alcalino.
- 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la enzima comprende una fosfatasa alcalina, una fosfatasa acida, una p-galactosidasa, una p-glucosidasa, una p-lactamasa o una esterasa, opcionalmente en el que la enzima es fosfatasa alcalina y el sustrato de la enzima comprende fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, fosfato de acido ascorbico o un derivado de fosfato de hidroquinona.
- 10. Un procedimiento para detectar una molecula diana en una muestra, que comprende:poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que las moleculas de enzima son capaces de producir al menos un producto capaz de reducir los iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero y en el que el primer anticuerpo se une a la molecula diana;poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo, en el que el segundo anticuerpo es un conjugado de anticuerpo-nanoparticula que comprende dos o mas nanoparticulas unidas directamente a un anticuerpo a traves de un enlace metal-tiol y se une especificamente al tercer anticuerpo;poner en contacto la muestra con un sustrato de las moleculas de enzima y un ion metalico, de manera que se forme un precipitado de metal y se colocalice con la molecula diana; ydetectar el precipitado de metal, detectando de este modo la molecula diana.
- 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que el primer anticuerpo comprende un hapteno y en el que el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-hapteno que se une especificamente al hapteno del primer anticuerpo.
- 12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el conjugado de anticuerpo-nanoparticula510152025303540comprende de dos a siete nanoparticulas, opcionalmente
- 13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que el del anticuerpo.
- 14. El procedimiento de las reivindicaciones 12 o 13, en el que el conjugado de anticuerpo-nanoparticula comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
- 15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el anticuerpo del conjugado de anticuerpo-nanoparticula comprende un anticuerpo de conejo, cabra, raton anti-hapteno.
- 16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la nanoparticula comprende oro, paladio, platino, plata, cobre, niquel, cobalto, iridio o una aleacion de dos o mas de los mismos.
- 17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que la nanoparticula tiene un diametro de 5 nm o menos, opcionalmente en el que la nanoparticula tiene un diametro de 0,5 a 5 nm.
- 18. Un kit para detectar una molecula diana en una muestra, que comprende uno o mas recipientes que comprenden:un primer anticuerpo, en el que el primer anticuerpo es un conjugado de anticuerpo-nanoparticula que comprende dos o mas nanoparticulas unidas directamente a un anticuerpo a traves de un enlace metal-tiol.un segundo anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de enzima, en el que las moleculas de enzima son capaces de producir al menos un producto capaz de reducir los iones metalicos a metal en un estado de oxidacion cero y en el que el primer anticuerpo se une especificamente al segundo anticuerpo; yun sustrato para la una o mas moleculas de enzima y un ion metalico.
- 19. El kit de la reivindicacion 18, que comprende, ademas, un haluro de oro, opcionalmente en el que el haluro de oro comprende cloruro de oro.
- 20. El kit de la reivindicacion 18 o 19, que comprende ademas una sal de plata, opcionalmente en la que la sal de plata comprende nitrato de plata, oxido de plata o cloruro de plata.
- 21. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, que comprende, ademas, un agente reductor, opcionalmente en el que el agente reductor comprende tiosulfato de sodio.
- 22. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, que comprende, ademas, un tercer anticuerpo que se une especificamente a una molecula diana, en el que el segundo anticuerpo se une especificamente al tercer anticuerpo.en el que el conjugado comprende cinco nanoparticulas. metal del enlace metal-tiol se conjuga con un resto de cisteina
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