CN111471105A - 新冠病毒银治疗性中和抗体制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，具体涉及一种用于治疗2019‑nCoV银治疗性中和抗体，是含有Ag NPs‑Ab复合纳米材料，其中，Ag NPs表示纳米银颗粒；Ab表示抗新冠病毒单克隆抗体，本发明制备了Ag NPs‑Ab复合纳米材料，本发明将Ag NPs靶向运输到2019‑nCoV新冠病毒感染部位，提高病毒细胞对纳米粒的摄取作用，利用Ag纳米颗粒的生物学毒性，从而实现对2019‑nCoV新冠病毒患者的治疗作用，具有抗病毒性、强效杀菌、渗透性强、无耐药性等特点，且已在小鼠上试验成功，下一步可以在人体抗新冠病毒临床中试验中应用，为人类对抗新冠病毒的临床使用提供了一种很好的方法。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种用于治疗新冠病毒银治疗性中和抗体制备及应用。
背景技术
近年来研究发现，纳米银具有独特的抗病毒、抗细菌作用。纳米银(Nano Silver)就是将粒径做到纳米级的金属粉末状银单质，粒径小于100nm，一般在25-50nm之间；纳米银的性能与其粒径有直接关系，当纳米银粒径大多在25纳米左右，对大肠杆菌、淋球菌、沙眼衣原体等数十种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，而且不会产生耐药性。用纳米银和精梳棉纤维制成的棉袜，具备很好的抗菌防臭的效果。研究发现，粒径越小，杀菌性能越强。如抗菌类医药及医疗器械，抗菌塑料及橡胶制品，抗菌纺织品及服装鞋袜，抗菌涂料、陶瓷和玻璃，绿色抗菌涂料都采用了纳米银。
纳米银的抗菌特点：纳米（nm）是继微米之后的目前最小的一种计量单位，一纳米为百万分之一毫米，即毫微米，也就是十亿分之一米。纳米银，是利用前沿纳米技术将银纳米化，纳米技术出现，使银在纳米状态下的杀菌能力产生了质的飞跃，极少的纳米银就可产生强大的杀菌作用，可在数分钟内杀死650多种细菌，广谱杀菌且无任何的耐药性，能够促进伤口的愈合、细胞的生长及受损细胞的修复，无任何毒性反应，对皮肤也未发现任何刺激反应，这给广泛应用纳米银来抗菌开辟了广阔的前景，是最新一代的天然抗菌剂，银具有独特的抗病毒、抗细菌作用。
纳米银的抗病毒特点：近年来研究表明，将银单质纳米化后形成的纳米银具有高效广谱的抗病毒作用。其作用机制为：1）纳米银可与病毒核酸结合，改变病毒DNA或RNA结构，干扰DNA 或RNA的合成，使病毒失去活性。2）纳米银对病毒的机械性吸附和固定作用。3）纳米银可以结合病毒表面蛋白的保守空间结构，抑制病毒与受体相互作用，阻止病毒对宿主细胞的感染，对病毒进行直接灭活作用。
由于2019-nCoV新型冠状病毒疾病的症状主要是病毒入侵有的身体，使得患者痛苦非常，且死亡率比较高，因此，开发能精准诊治疗2019-nCoV的新策略已迫在眉睫，利用纳米银颗粒来治疗2019-nCoV新冠病毒，如何将银纳米颗粒靶向引导到感染部位，是本领域技术人员亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种新冠病毒银治疗性中和抗体的制备与应用。
本发明的技术方案概述如下：
本发明的新冠病毒银治疗性中和抗体，包括含有Ag NPs-Ab复合纳米材料，其中：
所述冠状病毒是2019-nCoV；
所述Ag NPs是纳米银颗粒；
所述Ab是抗新冠病毒单克隆抗体；
所述单克隆抗体是抗新冠病毒单克隆抗体；
所述Ag NPs-Ab复合纳米材料的制备方法包括如下步骤：
1）制备Ag NPs溶液：
加入K2CO3溶液，并与纳米银颗粒溶液混合，使pH 值调节至9.0；
2）合成Ag NPs-Ab复合纳米材料：
将抗新冠病毒单克隆抗体浓缩液加入到Ag NPs溶液中，搅拌，采用封闭液洗涤，离心，收集沉淀得到Ag NPs-Ab。
优选的，所述制备方法步骤1）中：
所述K2CO3溶液浓度是10—15mg/mL；
所述纳米银颗粒溶液浓度是0.05—0.2 mg/mL。
优选的，所述制备方法步骤2）中：
所述抗新冠病毒单克隆抗体浓缩液的浓度是0.05—0.2 mg/mL；
所述搅拌的温度是20-30 ℃，时间是0.5—2 h；
所述封闭液是1 %牛血清蛋白BSA溶液，pH值是7.4，封闭0.5—2 h；
所述离心的条件为：12000—18000 r/min，离心10—30 min。
优选的，所述Ag NPs-Ab复合纳米材料的厚度是10-30 nm。
优选的，所述的新冠病毒银治疗性中和抗体在抗新冠病毒医学临床中应用。
本发明突出的实质性特点和显著的进步是：
1.抗病毒性。本发明的新冠病毒银治疗性中和抗体，由于银单质纳米化后形成的纳米银具有高效广谱的抗病毒作用，本发明利用银具有独特的抗病毒、抗细菌功能，目的是将纳米银抗病毒、抗细菌特点应用到医学中来，特别是发挥纳米银独特的抗细菌活性，即它可以选择性地破坏病毒细胞内线粒体呼吸链，达到抑制病毒细胞生长的作用，将其可能的作用机制：1）纳米银可与病毒核酸结合，改变病毒DNA或RNA结构，干扰DNA 或RNA的合成，使病毒失去活性；2）纳米银对病毒的机械性吸附和固定作用；3）纳米银可以结合病毒表面蛋白的保守空间结构，抑制病毒与受体相互作用，阻止病毒对宿主细胞的感染，对病毒进行直接灭活作用。本发明制备的Ag NPs-Ab复合纳米材料，将Ag NPs靶向运输到病毒细胞部位，提高病毒细胞对该纳米粒的摄取作用，利用Ag纳米颗粒的生物学毒性，以毒攻毒，从而实现对病毒细胞破坏而达到对患者的治疗作用。
2.强效杀菌：本发明人在研究中发现，Ag可在数分钟内杀死650多种细菌，纳米银颗粒与病原菌的细胞壁/膜结合后，能直接进入病毒细胞体内，迅速与氧代谢酶的巯基（-SH）结合，使酶失活，阻断呼吸代谢使其窒息而死，其独特的杀菌机理，使得纳米银颗粒在低浓度就可迅速杀死新冠病毒细胞。
3.渗透性强：纳米银颗粒具有超强的渗透性，可迅速渗入皮下2mm杀灭病毒和病毒细胞，特别对新冠病毒的细胞引起的较深处的组织感染均有良好的杀灭作用，且抗病毒持久。
4.无耐药性：纳米银属于非抗菌素杀菌剂，纳米银能杀灭新冠病毒等各种致病微生物，比抗菌素更强，本发明采用Ag NPs-Ab复合纳米材料的厚度是10-30 nm，通过纳米银颗粒独特抗菌机理可迅速直接杀死病毒细胞，使其丧失繁殖能力，因此，无法生产耐药性的下一代，能有效避免因耐药性而导致反复发作久治不愈。
5.临床上的应用：本发明将Ag NPs靶向运输到2019-nCoV新冠病毒患者的感染部位，提高病毒细胞对纳米粒的摄取作用，利用Ag纳米颗粒的生物学毒性，从而实现对2019-nCoV新冠病毒的治疗作用，本实验已经在食蟹猴上试验成功，绝大部分经治疗后的新冠肺炎食蟹猴血清中含有针对新冠病毒抗原Spike1-RBD蛋白的特异性单克隆抗体，且血清中抗体效价评估很高，下一步可以在人体抗新冠病毒临床中试验应用，为人类对抗新冠病毒的临床使用提供了一种很好的方法。这样，将会给许多挣扎在新冠病毒病疾病中的患者带来福音。相信银纳米靶向治疗新冠病毒不仅会提高治愈的疗效，改善了患者的生存质量，有效的防止新冠病毒在人体内扩散以及愈后的复发，实现“让病毒变少”更“让病毒变无”，给众多的还在新冠病毒的痛苦中挣扎的患者注入了新的希望。
附图说明
图1为银治疗性中和抗体（Ag NPs-Ab）和新冠病毒（2019-nCoV）一起与人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）孵育后的结果图。
其中：
A：2019-nCoV + BEAS-2B；
B：Ag NPs + BEAS-2B；
C： 2019-nCoV + Ab + BEAS-2B；
D：2019-nCoV+ Ag NPs-Ab + BEAS-2B。
图2为新冠病毒肺炎模型动物食蟹猴经银治疗性中和抗体治疗后，血清中抗体效价评估结果。
图3为20个恢复期新冠肺炎食蟹猴抗体库质量分析。
具体实施方式
下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
本实施例中，本发明的新冠病毒银治疗性中和抗体，包括含有Ag NPs-Ab复合纳米材料，其中：所述冠状病毒是2019-nCoV；所述Ag NPs是纳米银颗粒；所述Ab是抗新冠病毒单克隆抗体。
一.Ag NPs-Ab的制备：
1）取2 mL浓度为0.1 mg/mL纳米银颗粒溶液，加入浓度为13.8 mg/mL的K2CO3溶液，使混合液pH 值调节至9.0。
2）取30 μL浓度为1 mg/mL抗新冠病毒单克隆抗体浓缩液逐滴加入上述Ag NPs溶液中，室温搅拌1 h后，用pH为7.4，1%的牛血清蛋白（BSA）溶液室温封闭1 h，16000 r/min高速冷冻离心15 min去除上清液，最后用pH为7.4，0.5%的牛血清蛋白（BSA）溶液洗涤2次，收集沉淀。
二.复合纳米材料的活性研究：
采用复合纳米材料与细胞靶向结合，在96 孔板中用制备的Ag NPs-Ab悬浮液的完全培养基与2019-nCoV、人正常肺上皮细胞BEAS-2B共孵育后，以BEAS-2B为对照，分别培养12 h后，显微镜观察银治疗性中和抗体靶向性。
参看如附图1所示，图1为银治疗性中和抗体（Ag NPs-Ab）和新冠病毒（2019-nCoV）一起与人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）孵育后的结果图。
其中：
A： 2019-nCoV + BEAS-2B；B：Ag NPs + BEAS-2B；C： 2019-nCoV + Ab + BEAS-2B；D：2019-nCoV+ Ag NPs-Ab + BEAS-2B。
三.体内抗2019-nCoV研究：
食蟹猴造模：选择20只食蟹猴，培育2019-nCoV，感染食蟹猴，观察3天。
抗新冠病毒治疗：培育2019-nCoV，感染食蟹猴；采取随机数字表的方法，将新冠病毒肺炎模型动物食蟹猴随机分为4组，每组5只；利用CT图像分析，观察其肺部，出现明显病灶时，将Ag NPs-Ab由静脉注射到感染2019-nCoV的食蟹猴体内。
参看如附图2所示，图2为新冠病毒肺炎模型动物食蟹猴经银治疗性中和抗体治疗后，血清中抗体效价评估结果。
H1-10（Healthy Sample）为健康食蟹猴血清，NCP1-20（2019-nCoV PatientSample）为新冠肺炎食蟹猴用银治疗性中和抗体治疗2周后血清。
结果显示：绝大部分经治疗后的新冠肺炎食蟹猴血清中含有针对新冠病毒抗原Spike1-RBD蛋白的特异性单克隆抗体，且效价很高。
参看如附图3所示，图3为20个恢复期新冠肺炎食蟹猴抗体库质量分析。
利用银治疗性中和抗体治疗两周后新冠肺炎食蟹猴的外周血样本构建的20个抗体库，质量控制分析结果显示：抗体库有效性好。
四.新冠病毒银治疗性中和抗体在抗新冠病毒医学临床中应用：
采用含有Ag NPs-Ab复合纳米材料靶向治疗2019-nCoV新型冠状病毒细胞增殖抑制剂或治疗2019-nCoV新型冠状病毒的药物。
本发明并不局限于前述的具体实施方式，本发明扩展到任何本说明书中披露的新特征或新的组合，以及披露的任一新方法或过程的步骤或新的组合。
Claims (5)
1.一种新冠病毒银治疗性中和抗体，其特征在于：包括含有Ag NPs-Ab复合纳米材料，其中：
所述冠状病毒是2019-nCoV；
所述Ag NPs是纳米银颗粒；
所述Ab是抗新冠病毒单克隆抗体；
所述单克隆抗体是抗新冠病毒单克隆抗体；
所述Ag NPs-Ab复合纳米材料的制备方法包括如下步骤：
1）制备Ag NPs溶液：
加入K2CO3溶液，并与纳米银颗粒溶液混合，使pH 值调节至9.0；
2）合成Ag NPs-Ab复合纳米材料：
将抗新冠病毒单克隆抗体浓缩液加入到Ag NPs溶液中，搅拌，采用封闭液洗涤，离心，收集沉淀得到Ag NPs-Ab。
2.根据权利要求1所述的新冠病毒银治疗性中和抗体，其特征在于：所述制备方法步骤1）中：
所述K2CO3溶液浓度是10—15mg/mL；
所述纳米银颗粒溶液浓度是0.05—0.2 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的新冠病毒银治疗性中和抗体，其特征在于：所述制备方法步骤2）中：
所述抗新冠病毒单克隆抗体浓缩液的浓度是0.05—0.2 mg/mL；
所述搅拌的温度是20-30 ℃，时间是0.5—2 h；
所述封闭液是1 %牛血清蛋白BSA溶液，pH值是7.4，封闭0.5—2 h；
所述离心的条件为：12000—18000 r/min，离心10—30 min。
4.根据权利要求1所述的新冠病毒银治疗性中和抗体，其特征在于：所述Ag NPs-Ab复合纳米材料的厚度是10-30 nm。
5.根据权利要求1所述的新冠病毒银治疗性中和抗体，其特征在于：所述的新冠病毒银治疗性中和抗体在抗新冠病毒医学临床中应用。
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