CN108721248A - 一种pH响应型纳米银组装体的制备方法、产物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种pH响应型纳米银组装体的制备方法,包括如下步骤:1)将硝酸银溶解在油胺和油酸中,升温还原反应,经不良溶剂沉淀,得到银纳米粒子;2)将两亲性高分子溶于良溶剂,加入具有pH响应性基团的修饰剂,室温下搅拌反应,透析后得到pH响应的两亲性高分子;3)采用薄膜分散法或乳化溶剂挥发法,将步骤1)中得到的银纳米粒子组装修饰到步骤2)中得到的pH响应的两亲性高分子,得到pH响应型纳米银组装体。本发明还涉及该制备方法所得的pH响应型纳米银组装体及其应用。该pH响应型纳米银组装体具备良好的抗菌性能,不仅可以有效抑制耐药菌的生长,且对细菌生物膜具有抑制和破坏的作用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米银复合材料制备领域,具体涉及一种pH响应型纳米银组装体的制备方法、产物及应用。
背景技术
抗菌药物在保障我国公共卫生安全中扮演着重要角色。然而,由于抗菌药物的不合理使用,我国细菌耐药形势严峻。
细菌在生物组织中常以生物膜的形式存在,是细菌在生长过程中为适应生存环境而形成的一种与浮游细菌相对应的形式,被认为是造成细菌耐药的重要因素之一。细菌生物膜结构复杂、成分多样,通过多种机制参与到细菌耐药的形成,包括渗透限制学说、营养限制学说、表达耐药表型学说、生物膜环境不均一性学说等。
生物膜细菌通过细菌粘附、细菌增殖、生物膜的形成以及细菌从生物膜中解吸附这一系列过程的循环,在生物体内引起持续性大范围感染。许多难愈性、感染性疾病,包括囊泡性纤维化肺炎、骨髓炎等,均与生物膜相关;由手术缝合、人造血管、机械心脏瓣膜等医疗器械引起的感染也是以生物膜的形式发展。细菌生物膜为临床疾病治疗带来了巨大挑战。
由于细菌的新陈代谢等原因,生物膜的pH值呈弱酸性。尽管此时需要较高的抗菌活性,但在酸性条件下,大部分抗生素的生物活性显著降低。因此,单一抗菌药物难以有效杀灭生物膜细菌以及由此产生的耐药菌。现临床上通过联合使用抗菌药物来抑制和破坏生物膜结构,但常常需要加大药物使用剂量以达到目的,存在促进细菌耐药的安全隐患。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种pH响应型纳米银组装体的制备方法、产物及应用,该pH响应型纳米银组装体具备良好的抗菌性能,不仅可以有效抑制耐药菌的生长,且对细菌生物膜具有抑制和破坏的作用。
本发明所提供的技术方案为:
一种pH响应型纳米银组装体的制备方法,包括如下步骤:
1)将硝酸银溶解在油胺和油酸中,升温还原反应,经不良溶剂沉淀,得到银纳米粒子;
2)将两亲性高分子溶于良溶剂,加入具有pH响应性基团的修饰剂,室温下搅拌反应,透析后得到pH响应的两亲性高分子;所述pH响应基团为咪唑、哌啶、氨基、酰胺键、腙键的一种或多种;
3)采用薄膜分散法或乳化溶剂挥发法,将步骤1)中得到的银纳米粒子组装修饰到步骤2)中得到的pH响应的两亲性高分子,得到pH响应型纳米银组装体。
上述技术方案中,pH响应型纳米银组装体是由具有抗菌作用的银纳米粒子和pH响应的两亲性高分子经过组装得到的银纳米复合材料,具有抗耐药细菌和抗生物膜细菌的作用。在感染部位的弱酸性环境中,pH响应的两亲性高分子发生质子化作用,嵌段亲疏水性发生改变造成组装体结构的改变,使更多的小尺寸银纳米粒子得以释放与暴露在酸性环境中,银纳米粒子解离速度加快,在靶部位快速释放出银离子,渗透生物膜,起到抑制与破坏细菌生物膜的作用;而到达正常组织的pH响应型纳米银组装体则不会受破坏,毒性较低。
优选的,所述步骤1)中还原反应温度为150~200℃;所述硝酸银、油胺和油酸的投料比为100~200mg:0.1~1mL:1~10mL;所述不良溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和丙酮中的一种或多种。
进一步优选,所述步骤1)中将硝酸银溶解在油胺和油酸中,真空条件下在60~80℃下搅拌0.5~3h;将混合物升温至150~200℃,升温时间20~120分钟,温度稳定后保持0~15分钟,经不良溶剂沉淀,得到银纳米粒子。
优选的,所述步骤2)中两亲性高分子选自聚乙二醇-聚天冬氨酸卞酯、聚乙二醇-聚天冬氨酸卞酯-聚丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、泊洛沙姆中的一种或多种。
优选的,所述步骤2)中良溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、环丁砜中的一种或多种。
优选的,所述步骤2)中修饰剂选自1-(3-氨基丙基)咪唑、组氨酸、1-(2-氨基乙基)哌啶、4-氨基哌啶、N,N-二乙基乙二胺、二苯甲酮腙中的一种或多种。
优选的,所述步骤3)中薄膜分散法的具体过程:将银纳米粒子分散在良溶剂中,加入pH响应的两亲性高分子,于室温下搅拌,减压蒸发形成薄膜,水化,得到pH响应型纳米银组装体。进一步优选,搅拌10~120min;所述水化使用pH缓冲液,优选为磷酸缓冲液。所述良溶剂选自三氯甲烷、二氯甲烷、环己烷、正己烷和二氧六环中的一种或多种。
优选的,所述步骤3)中乳化溶剂挥发法的具体过程:将银纳米粒子分散在良溶剂中,室温条件下搅拌并加入到pH响应的两亲性高分子的水溶液中,超声形成乳剂,减压蒸发,得到pH响应型纳米银组装体。进一步,所述pH响应的两亲性高分子的水溶液的溶剂优选使用pH缓冲溶液,优选为磷酸缓冲溶液。所述良溶剂选自三氯甲烷、二氯甲烷、环己烷、正己烷和二氧六环中的一种或多种。
优选的,所述步骤3)中银纳米粒子与pH响应的两亲性高分子的质量投料比为1:1~30。通过调节控制两者的质量投料比,既可以实现对pH响应的灵敏度,即于细菌感染部位实现pH介导的组装分解,亦可控制纳米银组装体中装载的银纳米粒子的数量。
本发明提供一种如上述的制备方法制备所得的pH响应型纳米银组装体。所述pH响应型纳米银组装体包括pH响应的两亲性高分子和银纳米粒子;所述银纳米粒子的尺寸为1~10nm;所述pH响应型纳米银组装体的尺寸为100~500nm。
本发明还提供一种如上述的pH响应型纳米银组装体在抗耐药细菌或抗细菌生物膜中的应用。
同现有技术相比,本发明的有益效果体现在:
(1)本发明所涉及的制备方法的反应体系温和,条件可控,具有良好的临床转化可能性。
(2)本发明中的pH响应型纳米银组装体,将纳米银组装与解散、银离子释放与pH响应性结合起来。在感染部位的弱酸性环境中,pH响应的两亲性高分子发生质子化作用,嵌段亲疏水性发生改变造成组装体结构的改变,使更多的小尺寸银纳米粒子得以释放与暴露在酸性环境中。而弱酸性环境能够加速银纳米粒子表面腐蚀,解离速度加快,在靶部位快速释放出大量银离子,渗透生物膜,起到抑制与破坏细菌生物膜的作用;而到达正常组织的pH响应型纳米银组装体则不会受破坏,毒性较低。
附图说明
图1为实施例1中制备的银纳米粒子的TEM图;
图2为实施例5中制备的pH响应型纳米银组装体在pH=7.4和pH=5.5时的TEM图;
图3为实施例5中制备的pH响应型纳米银组装体在pH=7.4和pH=5.5时的动态光散射粒度分布图;
图4为应用例1中经不同浓度的pH响应型纳米银组装体处理后,浮游细菌的生长曲线图;
图5为应用例2中与不同浓度的pH响应型纳米银组装体孵育后,生物膜细菌残留量的对比图;
图6为应用例3中与不同浓度的pH响应型纳米银组装体孵育后,生物膜细菌活性的对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。
实施例1:银纳米粒子的制备
将170mg硝酸银与0.5mL油胺,4.5mL油酸混合,真空条件下在70℃下搅拌1.5小时,以1℃/min的速度将混合物升温至180℃,当体系温度到达180℃时保持该温度2分钟,快速冷却,加入甲醇与乙醇的混合溶液进行沉淀,离心得到银纳米粒子。对银纳米粒子用透射电镜进行形貌表征,结果如图1所示,粒径约为3~5nm。
实施例2:银纳米粒子的制备
将170mg硝酸银与1mL油胺,5mL油酸混合,真空条件下在70℃下搅拌2小时,以10℃/min的速度将混合物升温至180℃,当体系温度到达180℃时,快速冷却,加入甲醇与乙醇的混合溶液进行沉淀,离心得到银纳米粒子,得到的银纳米粒尺寸在6~8nm。
实施例3:聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-聚丙氨酸的制备
将0.6g聚乙二醇-聚天冬氨酸卞酯-聚丙氨酸溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺,加入1mL 1-(3-氨基丙基)咪唑,在氩气保护下于室温条件反应12h。随后,将反应液加入到25mL0.1N的稀盐酸中,并转移至透析袋(截留分子量为3500)中,以0.01N的稀盐酸为透析介质进行透析。最后,冻干得到聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-聚丙氨酸固体。
实施例4:聚乙二醇-(聚天冬氨酸-哌啶)的制备
将0.5g聚乙二醇-聚天冬氨酸卞酯溶于5mL二甲基亚砜,加入1mL 1-(2-氨基乙基)哌啶,在氩气保护下于室温条件反应12h。随后,将反应液加入到25mL 0.1N的稀盐酸中,并转移至透析袋(截留分子量为3500)中,以0.01N的稀盐酸为透析介质进行透析。最后,冻干得到聚乙二醇-聚(天冬氨酸-哌啶)固体。
实施例5:pH响应型纳米银组装体的制备
薄膜分散法:将1.5mg银纳米粒子(按照实施例1制备得到)分散在氯仿中,边搅拌边加入3mg聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-聚丙氨酸(按照实施例3制备得到)的乙醇溶液(氯仿:乙醇=1:1,v/v),于室温下搅拌1小时,减压蒸发除去有机溶剂,形成薄膜;继续加入2mL磷酸缓冲液(pH=7.4)水化,得到pH响应型纳米银组装体。另外,取部分加入0.1N盐酸调节pH至5.5。
使用透射电镜对得到的pH响应型纳米银组装体在pH=7.4和pH=5.5进行形貌表征,结果如图2所示,结果显示,该种pH响应型纳米银组装体具有良好的pH响应性。
利用动态光散射分析在pH=7.4和pH=5.5时pH响应型纳米银组装的粒度分布,结果如图3所示,结果证明,该种pH响应型纳米银组装体在不同pH条件下结构发生改变。
实施例6:pH响应型纳米银组装体的制备
乳化溶剂挥发法:将30mg聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-聚丙氨酸(按照实施例3制备得到)分散在磷酸缓冲液(pH=7.4)中,室温条件下边搅拌边加入2mg银纳米粒子(按照实施例1制备得到)的氯仿溶液(磷酸缓冲液:氯仿=10:1,v/v),超声5分钟形成均一稳定乳剂,减压蒸发除去有机溶剂,得到pH响应型纳米银组装体。
实施例7:pH响应型纳米银组装体的制备
将30mg聚乙二醇-(聚天冬氨酸-哌啶)(按照实施例4制备得到)分散在磷酸缓冲液(pH=7.4)中,室温条件下边搅拌边加入2mg银纳米粒子(按照实施例1制备得到)的氯仿溶液(磷酸缓冲液:氯仿=10:1,v/v),超声5分钟形成均一稳定乳剂,减压蒸发除去有机溶剂,得到pH响应型纳米银组装体。
应用例1:pH响应型纳米银组装体对浮游耐药菌的杀伤抑制作用
取对数生长期的金葡萄球菌(对部分抗生素具有耐药性),用新鲜的液体培养基将菌液稀释至OD570=0.01,接种于96孔板内,100μl/孔。取pH响应型纳米银组装体(按照实施例5制备得到),用新鲜培养液稀释至不同浓度(0μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL和500μg/mL),加入到菌液混合,100μl/孔,于37℃恒温振荡培养箱内培养。培养18h,每隔30分钟测定光密度OD570值。
通过绘制18小时内细菌的生长曲线,比较不同浓度的pH响应型纳米银组装体对浮游耐药菌的作用,结果如图4所示,pH响应型纳米银组装体对浮游耐药菌具有一定的抑制作用,其最小抑菌浓度为50μg/mL。
应用例2:pH响应型纳米银组装体对耐药菌生物膜的杀伤抑制作用
取对数生长期的金葡萄球菌(对部分抗生素具有耐药性),用新鲜的液体培养基将菌液稀释至OD570=0.1,接种于96孔板内,200μl/孔,于37℃恒温培养箱内静置培养48小时,每24小时更换新鲜培养液。
细菌形成生物膜后,弃去培养液,取pH响应型纳米银组装体(按照实施例5制备得到),用新鲜培养液稀释至不同浓度(50μl/ml、200μl/ml和400μl/ml),加入生物膜中,200μl/孔,于37℃恒温培养箱内静置培养。同时,以相同浓度的市售万古霉素作为对照组。
24小时后,小心吸出培养液,用磷酸缓冲液对生物膜进行漂洗,洗去浮游细菌及从生物膜中解吸附的细菌。向96孔板内加入结晶紫溶液(200μl/孔),于37℃下孵育15分钟,吸出染液,用磷酸缓冲液进行漂洗,洗去多余染料,每孔加入180μl乙酸溶液(30%,v/v),振荡摇匀后,测定其光密度OD600值。
计算每一样品组4个孔OD值的平均值,利用平均值按如下公式计算细菌生物膜中细菌残留率(Total Bioburden,%)。
生物膜中细菌残留率%=样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100%(Total Bioburden%=ODsample/ODcontrol×100%)。
结果如图5所示,经pH响应型纳米银组装体处理后,生物膜中细菌残留率下降。
应用例3:pH响应型纳米银组装对耐药菌生物膜的杀伤抑制作用
取对数生长期的金葡萄球菌(对部分抗生素具有耐药性),用新鲜的液体培养基将菌液稀释至OD570=0.1,接种于96孔板内,200μl/孔,于37℃恒温培养箱内静置培养48小时,每24小时更换新鲜培养液。
细菌形成生物膜后,弃去培养液,取pH响应型纳米银组装体(按照实施例5制备得到),用新鲜培养液稀释至不同浓度(50μl/ml、200μl/ml和400μl/ml),加入生物膜中,200μl/孔,于37℃恒温培养箱内静置培养。同时,以相同浓度的市售万古霉素作为对照组。
24小时后,小心吸出培养液,用生理盐水对生物膜进行漂洗,洗去浮游细菌及从生物膜中解吸附的细菌。向96孔板内加入生理盐水(200μl/孔),刃天青(5μg/孔),于37℃下静置孵育45~60分钟,用荧光酶标仪测定其荧光值。计算每一样品组4个孔荧光值的平均值,利用平均值按如下公式计算细菌生物膜中细菌活性(Viability,%)。
生物膜中细菌活性%=样品组荧光值的平均值/空白对照组荧光值的平均值×100%。
结果如图6所示,经pH响应型纳米银组装体处理后,生物膜中细菌活性显著,且效果优于万古霉素。
以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改,补充和等同替换等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将硝酸银溶解在油胺和油酸中,升温还原反应,经不良溶剂沉淀,得到银纳米粒子;
2)将两亲性高分子溶于良溶剂,加入具有pH响应性基团的修饰剂,室温下搅拌反应,透析后得到pH响应的两亲性高分子;所述pH响应基团为咪唑、哌啶、氨基、酰胺键、腙键的一种或多种;
3)采用薄膜分散法或乳化溶剂挥发法,将步骤1)中得到的银纳米粒子组装修饰到步骤2)中得到的pH响应的两亲性高分子,得到pH响应型纳米银组装体。
2.根据权利要求1所述的pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中还原反应温度为150~200℃;所述硝酸银、油胺和油酸的投料比为100~200mg:0.1~1mL:1~10mL;所述不良溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和丙酮中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中两亲性高分子选自聚乙二醇-聚天冬氨酸卞酯、聚乙二醇-聚天冬氨酸卞酯-聚丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、泊洛沙姆中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中良溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、环丁砜中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中修饰剂选自1-(3-氨基丙基)咪唑、组氨酸、1-(2-氨基乙基)哌啶、4-氨基哌啶、N,N-二乙基乙二胺、二苯甲酮腙中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中薄膜分散法的具体过程:将银纳米粒子分散在良溶剂中,加入pH响应的两亲性高分子,于室温下搅拌,减压蒸发形成薄膜,水化,得到pH响应型纳米银组装体。
7.根据权利要求1所述的pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中乳化溶剂挥发法的具体过程:将银纳米粒子分散在良溶剂中,室温条件下搅拌并加入到pH响应的两亲性高分子的水溶液中,超声形成乳剂,减压蒸发,得到pH响应型纳米银组装体。
8.根据权利要求6或7所述的pH响应型纳米银组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中银纳米粒子与pH响应的两亲性高分子的质量投料比为1:1~30。
9.如权利要求1~8任一所述的制备方法制备所得的pH响应型纳米银组装体。
10.如权利要求9所述的pH响应型纳米银组装体在抗耐药细菌或抗细菌生物膜中的应用。
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