CN104237501A - 一种抗体修饰的纳米银及其试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体修饰的纳米银(AgNPs)，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面静电吸附有羊抗鼠IgG抗体。本发明还公开了上述抗体修饰的纳米银的制备方法、包含该抗体修饰的纳米银的试剂盒、及该抗体修饰的纳米银在制备检测鼠IgG的试剂中的应用。本发明的抗体修饰的纳米银(纳米银-抗体)相比商品化的纳米金-抗体具有与目标物反应时间快，显色时间短，检测浓度范围宽且价格便宜的优势。此种纳米银-抗体具有取代纳米金-抗体的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测IgG的抗体修饰的纳米银及其试剂盒与应用。
背景技术
免疫诊断试剂常规应用的检测方法有放射免疫分析(RIA)，酶联免疫吸附分析法(ELISA)，化学发光免疫分析法，纳米标记物免疫分析法。与酶标记物相比，纳米标记物具有良好的化学稳定性和制备可控性，因此基于纳米材料标记的免疫测定技术灵敏度高、特异性强、精密度好、结果准确、操作简便、快速、无污染，该技术正在进入微量物质测定的各个领域。其中，纳米金标记物由于其显色效果突出、检测方便而被广泛应用于各类试纸条，纳米金催化银增强显色反应也被进一步应用于免疫分析中。
近年来，具有优良光学特性的纳米银正被越来越多地应用于蛋白质和DNA等生物分子的检测分析。首先，纳米银相比于纳米金成本更低廉，可以大大降低生产的成本；其次，由于纳米银具有更高的摩尔消光系数，其颜色变化会更灵敏；最后，纳米银具有很强的催化性能。可见，纳米银具有摩尔消光系数高、表面增强拉曼散色效应强和催化活性好等独特的物理化学性能。然而，纳米银标记物用于免疫显色分析的报道并不多，研究和发展纳米银标记物及其相应的显色分析系统是十分有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于IgG检测的抗体修饰的纳米银试剂。
本发明还要解决的技术问题是提供包含上述纳米银材料的试剂盒，用于IgG的检测。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述试剂盒在检测IgG中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种抗体修饰的纳米银，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，纳米银球外表面吸附有羊抗鼠IgG。
本发明还提供了上述抗体修饰的纳米银的制备方法，包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)溶液加入硼氢化钠溶液中，搅拌并逐滴加入硝酸银溶液，继续搅拌至室温，得纳米银溶液；
(2)将羊抗鼠IgG抗体溶液加入至纳米银溶液中，于冰箱中过夜反应；
(3)将步骤(2)反应体系的上清液离心，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤1～3次；最后离心得到的沉淀用1mg/mL BSA溶液重悬即得。
其中步骤(1)中，硝酸银溶液浓度为2-20mmol/L；硼氢化钠溶液的浓度为3-30mmol/L；聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0～5％，优选0.1～1％；硝酸银溶液、硼氢化钠溶液、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)溶液的体积比为1：(1-10)：(0-1)，优选1：(1-10)：(0.1-1)。
步骤(2)中，羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为1-10mg/mL；羊抗鼠IgG抗体溶液与纳米银溶液的体积比为(0.1～10):10。
步骤(3)中，BSA缓冲溶液的浓度为1mg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍。
本发明还提供了上述抗体修饰的纳米银在IgG检测中的应用。
本发明还提供了一种用于检测IgG的试剂盒，包括磷酸盐缓冲液、羊抗鼠IgG、链霉亲和素、银增强试剂A和银增强试剂B、牛血清白蛋白溶液、抗体修饰的纳米银。
本发明还提供了上述用于检测IgG的试剂盒在检测鼠IgG中的应用。
所述应用，包括以下步骤：
(1)配制溶液：
洗涤液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS，加入0.05％体积比的Tween-20即得PBST洗涤液；
探针和样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得1mg/ml BSA；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
目标物：用1mg/ml BSA配制不同浓度的IgG；
探针：用BSA溶液配制所需浓度的探针；
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1：1的混合液；
(2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37℃条件下固定2-4h；
(3)每孔加入10～50μL封闭液，在20-37℃条件下封闭1～3小时，用洗涤液荡洗 5～15min，洗涤3～4次，吹干；
(4)每孔加入20～50μL纳米银-抗体探针，在20-37℃条件下反应10～60分钟，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，并用去离子水冲洗3～4次，吹干；
(5)每孔加入20～50μL显色液，避光反应5～20min，去离子水冲洗3～4遍，吹干；
(6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线，得到IgG的线性范围。
有益效果：利用本发明的纳米银-抗体进行IgG的检测，相比纳米金-抗体，具有灵敏度更高，检测时间更短的优势，且此显色方法操作简单易行，检测结果可视化，无需特殊昂贵的检测仪器，目视即可达到孔内半定量检测；成本低廉，可实现大批量检测，适于推广使用。
本发明通过两种检测IgG的方法的比较，第一种方法是以纳米银-抗体作为检测探针，第二种方法是以纳米金-抗体作为检测探针，证明了纳米银-抗体作为检测探针检测的浓度范围宽，显色时间短，与目标物反应快。
附图说明
图1为本发明抗体修饰的纳米银的制备及检测鼠IgG的原理图；
图2为纳米银及本发明抗体修饰的纳米银的紫外-可见光谱图(UV-Vis)；
图3为本发明抗体修饰的纳米银的透射电镜图(TEM)；
图4纳米金-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为30min；
图5为纳米银-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为30min；
图6纳米金-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为15min；
图7及纳米银-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为15min。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：抗体修饰的纳米银的制备。
在冰浴条件下，首先将2mL0.25％PVP加入至20mL3mmol/L硼氢化钠溶液中,然后将10mL2mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图如图2。
将2mg/mL50μL羊抗鼠IgG抗体加入至0.5mL纳米银溶液中，放于4℃冰箱过夜反应，取上清液离心，14℃15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，每次15min14℃转速为15000r/min，最后离心得到的沉淀用50μL BSA溶液重悬，即得，4℃保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为1mg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的1倍。
实施例2：抗体修饰的纳米银的制备。
在冰浴条件下，首先将2mL1％PVP加入至20mL3mmol/L硼氢化钠溶液中,然后将2mL2mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2一致。
将4mg/mL50μL羊抗鼠IgG抗体加入至0.5mL纳米银溶液中,放于4℃冰箱过夜反应，取上清液离心，14℃15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，每次15min14℃转速为15000r/min，最后离心得到的沉淀用50μL BSA溶液重悬，即得，4℃保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为1mg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的3倍。
实施例3：抗体修饰的纳米银的制备。
在冰浴条件下，首先将2mL0.1％PVP加入至20mL15mmol/L硼氢化钠溶液中,然后将20mL10mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2一致。
将1mg/mL0.5mL羊抗鼠IgG抗体加入至0.5mL纳米银溶液中，放于4℃冰箱过夜反应，取上清液离心，14℃15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，每次15min14℃转速为15000r/min，最后离心得到的沉淀用10μL BSA溶液重悬，即得，4℃保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为1mg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1倍。
实施例4：抗体修饰的纳米银的制备。
在冰浴条件下，首先将2mL5％PVP加入至20mL30mmol/L硼氢化钠溶液中,然后将4mL20mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室 温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2一致。
将10mg/mL10μL羊抗鼠IgG抗体加入至1mL纳米银溶液中，放于4℃冰箱过夜反应，取上清液离心，14℃15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤1次，15min14℃转速为15000r/min，最后离心得到的沉淀用50μL BSA溶液重悬，即得，4℃保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为1mg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍。
实施例5：抗体修饰的纳米银的制备。
在冰浴条件下，将20mL3mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入至40mL2mmol/L硼氢化钠溶液中，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2一致。
将2mg/mL50μL羊抗鼠IgG抗体加入至1mL纳米银溶液中，放于4℃冰箱过夜反应，取上清液离心，14℃15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次，每次15min14℃转速为15000r/min，最后离心得到的沉淀用50μL BSA溶液重悬，即得，4℃保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为1mg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的2倍。
实施例6：用于检测IgG的试剂盒。
用于检测IgG(bs-0296p)的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂：
PBS(SB0627-500mL购自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20(T0777-500mL购自天津科美有限公司)用于配制洗涤液；
羊抗鼠IgG(bs-0296G)购自北京博奥森；
牛血清白蛋白(Roche738328)购自北京博奥森生物技术有限公司；
抗体修饰的纳米银(探针)实施例4或5的方法合成；
银增强试剂A、B(显色液,S5020-100mL,S5145-100mL)购自Sigma-Aldrich；
所有溶液均用高纯水配制。
实施例7：检测IgG的方法I。
利用实施例6的试剂盒检测标准样本中的IgG含量的方法：
(1)探针和样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得1mg/ml BSA；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
目标物：用1mg/ml BSA配制不同浓度的IgG；
对照物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的纳米金-抗体探针；
探针：用1mg/ml BSA配制所需浓度的纳米银-抗体探针。
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1：1的混合液；
(2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37℃条件下固定3h；
(3)每孔加入30μL封闭液，在37℃条件下封闭1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，吹干；
(4)每孔加入30μL纳米银-抗体探针或者纳米金-抗体探针，在37℃条件下反应30分钟，用洗涤液荡洗5，洗涤3次，并用去离子水冲洗3次，吹干；
(5)每孔加入30μL显色液，避光反应纳米银-抗体反应7min,纳米金-抗体显色10min，去离子水冲洗3遍，吹干；
(6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线与通过纳米金-抗体得到的标准曲线进行比较。
本实施例方法中，对两种探针的检测性能进行了考察，结果见图4和5。其中，图4为纳米金-抗体的实验数据；图5为纳米银-抗体的检测。从图中可看出纳米银-抗体探针检测的浓度范围更低。
实施例8：检测IgG的方法II。
利用实施例6的试剂盒检测标准样本中的IgG含量的方法：
(1)探针和样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得1mg/ml BSA；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
目标物：用1mg/ml BSA配制不同浓度的IgG；
对照物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的纳米金-抗体探针；
探针：用1mg/ml BSA配制所需浓度的纳米银-抗体探针。
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1：1的混合液；
(2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37℃条件下固定3h；
(3)每孔加入30μL封闭液，在37℃条件下封闭1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，吹干；
(4)每孔加入30μL纳米银-抗体探针或者纳米金-抗体探针，在37℃条件下反应15分钟，用洗涤液荡洗5，洗涤3次，并用去离子水冲洗3次，吹干；
(5)每孔加入30μL显色液，避光反应纳米银-抗体反应7min,纳米金-抗体显色9min，去离子水冲洗3遍，吹干；
(6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线与通过纳米金-抗体得到的标准曲线进行比较。
本实施例方法中，在减少与目标物反应时间的情况下，对两种探针的检测性能进行了考察，，结果见图6和7。其中，图6为纳米金-抗体的实验数据；图7为纳米银-抗体的检测。从图中可看出纳米银-抗体探针检测的浓度范围更宽，线性关系更好，纳米银-抗体探针相比纳米金-抗体探针具有明显的优势。
Claims (9)
1.一种抗体修饰的纳米银，其特征在于：它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，纳米银球外表面吸附有羊抗鼠IgG。
2.权利要求1所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将聚乙烯吡咯烷酮溶液加入硼氢化钠溶液中，搅拌并逐滴加入硝酸银溶液，继续搅拌至室温，得纳米银溶液；
(2)将羊抗鼠IgG抗体溶液加入至纳米银溶液中，于冰箱中过夜反应；
(3)将步骤(2)反应体系的上清液离心，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤1～3次；最后离心得到的沉淀用1mg/mL BSA溶液重悬即得。
3.根据权利要求2所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，硝酸银溶液浓度为2-20mmol/L；硼氢化钠溶液的浓度为3-30mmol/L；聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0～5％；硝酸银溶液、硼氢化钠溶液、聚乙烯吡咯烷酮溶液的体积比为1：(1-10)：(0-1)。
4.根据权利要求2所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为1-10mg/mL；羊抗鼠IgG抗体溶液与纳米银溶液的体积比为(0.1～10):10。
5.根据权利要求2所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，BSA缓冲溶液的浓度为1mg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍。
6.权利要求1所述的抗体修饰的纳米银在IgG检测中的应用。
7.一种用于检测IgG的试剂盒，其特征在于：包括磷酸盐缓冲液、羊抗鼠IgG、链霉亲和素、银增强试剂A和银增强试剂B、牛血清白蛋白溶液、抗体修饰的纳米银。
8.权利要求7所述的用于检测IgG的试剂盒在检测鼠IgG中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制溶液：
洗涤液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS，加入0.05％体积比的Tween-20即得PBST洗涤液；
探针和样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得1mg/mlBSA；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
目标物：用1mg/ml BSA配制不同浓度的IgG；
探针：用BSA溶液配制所需浓度的探针；
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1：1的混合液；
(2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37℃条件下固定2-4h；
(3)每孔加入10～50μL封闭液，在20-37℃条件下封闭1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，吹干；
(4)每孔加入20～50μL纳米银-抗体探针，在20-37℃条件下反应10～60分钟，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，并用去离子水冲洗3～4次，吹干；
(5)每孔加入20～50μL显色液，避光反应5～20min，去离子水冲洗3～4遍，吹干；
(6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线，得到IgG的线性范围。
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